不同产地刺五加中多糖含量测定、聚类分析及其超声提取...

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不同产地刺五加中多糖含量测定、聚类分析及其超声提取工艺优化Δ

摘 要 目的：建立测定刺五加中多糖含量的方法，并对其进行聚类分析及超声提取工艺优化。方法：采用硫酸-苯酚法测定刺五加中多糖的含量。采用SPSS 23.0软件对17个不同产地刺五加进行聚类分析。采用L9（34）正交试验设计以提取温度、料液比、提取时间为考察因素，多糖含量为考察指标对其超声提取工艺进行优化并验证。结果：葡萄糖质量浓度线性范围为0.007 75～0.151 mg/mL（r＝0.999 1）；定量限、检测限分别为2.854、0.856 μg/mL；精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于2%；加样回收率为98.41%～101.58%（RSD＝1.23%，n＝6）。聚类分析结果显示，17批药材样品可聚为3类，S1、S6、S10、S12、S13聚为一类，S3～S5、S7聚为一类，其余聚为一类。最优超声提取工艺为提取温度55℃、料液比1∶10（g/mL）、提取时间35 min；3次验证试验结果显示，最优工艺所得多糖平均含量为4.36%（RSD＝0.92%，n＝3）。结论：所建含量测定方法操作简便、重复性较好，可用于测定刺五加中多糖含量；优化后的超声提取工艺稳定、可行。
关键词 刺五加；多糖；硫酸-苯酚法；含量测定；正交试验；超声提取工艺；聚类分析
刺五加为五加科植物刺五加[Acanthopanax seuticosus（Rupr.et Maxim.）Harms]的干燥根、根茎或茎，具有益气健脾、补肾安神的功效[1]，是我国东北地区珍贵的药用植物[2]。刺五加中含有多糖、三萜皂苷类、黄酮类、木脂素类、香豆素类等多种活性成分[3-4]。现代研究表明，刺五加中的多糖成分具有调节免疫、抗肿瘤、抗氧化、降血糖等药理作用，现已成为研究的热点[5]。
目前，关于刺五加中多糖的研究多集中在药理作用等方面[6-7]，而对其含量的研究较少。虽然霍文等[8]比较了产自本溪、穆枝、珲春刺五加中多糖的含量，但样本量较少、结论缺乏代表性。此外，刺五加中多糖的提取常采用煎煮法和回流法，但提取时间长、操作繁琐，提取率低[9-10]。有研究认为，与上述提取方法相比，超声提取法具有省时、高效、能耗低等优点，并且可以大幅度地提高多糖的提取率[11]。基于此，本研究采用硫酸-苯酚法测定了刺五加中多糖的含量，并对17个不同产地刺五加进行聚类分析；同时，采用正交试验设计以提取温度、料液比、提取时间为考察因素，多糖含量为考察指标对其超声提取工艺进行优化，旨在为其相关产品的开发利用提供参考。
1 材料
1.1 仪器
H1650型台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；BGZ-240型真空干燥箱（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；FW100型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；Spectra Max M2型多功能酶标仪[美谷分子仪器（上海）有限公司]；KM-822C型超声波清洗器（广州市科洁盟实验仪器有限公司）；AE240型电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。
1.2 药品与试剂
葡萄糖对照品（天津市大茂化学试剂厂，批号：20170801，纯度：≥99%）；浓硫酸、苯酚均为分析纯，水为蒸馏水。
1.3 药材
刺五加药材采自黑龙江省和吉林省的17个不同产地，经黑龙江中医药大学药学院王振月教授鉴定为五加科植物刺五加[Acanthopanax seuticosus（Rupr.et Maxim.）Harms]的茎。将药材样品于45℃烘干至恒定质量，粉碎后过60目筛，备用。药材样品来源见表1。
表1 药材样品来源
Tab 1 Origin information

2 方法与结果
2.1 刺五加中多糖含量测定
采用硫酸-苯酚法测定刺五加中多糖的含量[12]。
2.1.1 供试品溶液的制备 取药材样品1.0 g，置于干燥锥形瓶中，称定质量，超声（功率：480 W，频率：40 kHz，下同）提取，提取温度55℃，料液比1∶10（g/mL，下同），提取时间35 min后，取出放冷，再次称定质量，用水补足减失的质量，混匀，取提取液2 mL，置于离心管中，以4 000 r/min离心10 min，取上清液1.0 mL，置于50 mL量瓶中，加水定容，即得供试品溶液。
2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取经105℃干燥至恒定质量的葡萄糖对照品7.55 mg，置于50 mL量瓶中，加水溶解并定容，制成质量浓度为0.151 mg/mL的对照品溶液。
2.1.3 空白对照溶液 以水为空白对照溶液。
2.1.4 检测波长的确定 精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液各2.0 mL，分别置于10 mL具塞试管中，加苯酚1.0 mL，混匀，加浓硫酸5.0 mL，摇匀后于室温下放置30 min，于200～800 nm波长下进行全波长扫描。另取空白对照溶液2.0 mL，于200～800 nm波长下进行全波长扫描。结果显示，对照品溶液和供试品溶液在490 nm波长处有最大吸收，空白对照溶液在490 nm波长处没有吸收，故选择检测波长为490 nm，详见图1。

图1 紫外吸收光谱图
Fig 1 UV absorption spectra
2.1.5 线性关系考察 分别精密量取“2.1.2”项下对照品溶液0.1、0.2、0.6、1.0、1.4、2.0 mL，置于2 mL具塞试管中，加水稀释至2 mL，得到质量浓度分别为0.007 75、0.015 1、0.045 3、0.075 5、0.105 7、0.151 mg/mL的系列线性关系工作溶液，按“2.1.4”项下方法显色后，于490 nm波长处测定吸光度。以葡萄糖质量浓度（x，mg/mL）为横坐标、吸光度（y）为纵坐标进行线性回归，得多糖回归方程为 y＝8.730 4x+0.026 2（r＝0.999 1），表明葡萄糖质量浓度在0.007 75～0.151 mg/mL范围内线性关系良好。
2.1.6 定量限与检测限考察 取“2.1.2”项下对照品溶液适量，按“2.1.4”项下方法显色后，于490 nm波长处测定吸光度并计算标准偏差。以标准偏差与标准曲线斜率之比的10倍对应的质量浓度作为定量限，以标准偏差与标准曲线斜率之比的3倍对应的质量浓度作为检测限。结果，定量限为2.854 μg/mL，检测限为0.856 μg/mL。
2.1.7 精密度试验 精密量取“2.1.2”项下对照品溶液2.0 mL，按“2.1.4”项下方法显色后，于490 nm波长处连续测定6次吸光度。结果，吸光度的RSD为0.047%（n＝6），表明仪器精密度良好。
2.1.8 稳定性试验 精密量取“2.1.1”项下供试品溶液（编号：S1）2.0 mL，按“2.1.4”项下方法显色后，分别在室温下放置2、4、6、8、12、24 h时于490 nm波长处测定吸光度。结果，吸光度的RSD为0.126%（n＝6），表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定性良好。
2.1.9 重复性试验 取药材样品（编号：S1）1.0 g，共6份，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.4”项下方法显色后，于490 nm波长处测定吸光度并按标准曲线法计算样品中多糖的含量。结果，多糖的平均含量为4.36%，含量的RSD为1.36%（n＝6），表明本方法重复性良好。
2.1.10 加样回收率试验 取已知含量的药材样品（编号：S1），共6份，每份约1.0 g，精密加入葡萄糖对照品44.0 mg，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.4”项下方法显色后，于490 nm波长处测定吸光度并计算加样回收率，结果见表2。
表2 加样回收率试验结果（n＝6）
Tab 2 Results of recovery tests（n＝6）

2.1.11 样品含量测定 取17批药材样品适量，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.4”项下方法显色后，于490 nm波长处测定吸光度并按标准曲线法计算多糖含量，各样品平行操作3次，结果见表3。
2.2 聚类分析
以多糖含量为变量，采用SPSS 23.0软件对数据进行标准化处理，以平方欧氏距离为测度进行聚类分析，结果见图2。由图2可知，17批药材样品可聚为3类，S1、S6、S10、S12、S13聚为一类，刺五加中多糖平均含量为4.26%～4.79%；S3～S5、S7聚为一类，刺五加中多糖平均含量为6.44%～7.91%；其余聚为一类，刺五加中多糖平均含量为5.11%～5.79%。
表3 样品含量测定结果（±s，n＝3）
Tab 3 Results of content determination of samples（±s，n＝3）


图2 聚类分析树状图
Fig 2 Cluster analysis dendrogram
2.3 单因素试验
2.3.1 提取温度对刺五加中多糖含量的影响 取药材样品（编号：S1）1.0 g，置于干燥锥形瓶中，在超声提取30 min，料液比1∶20条件下，考察不同提取温度（25、35、45、55℃）对刺五加中多糖含量的影响，各水平重复操作3次（下同），结果见图3A。由图3A可知，当提取温度为55℃时，刺五加中多糖含量最高，故选择提取温度范围为45～65℃。
2.3.2 料液比对刺五加中多糖含量的影响 取药材样品（编号：S1）1.0 g，置于干燥锥形瓶中，在超声提取30 min，提取温度55℃条件下，考察不同料液比为（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）对刺五加中多糖含量的影响，结果见图3B。由图3B可知，当料液比为1∶20时，刺五加中多糖含量最高，故选择料液比范围为1∶10～1∶30。
2.3.3 提取时间对刺五加中多糖含量的影响 取药材样品（编号：S1）1.0 g，置于干燥锥形瓶中，在提取温度55℃，料液比为1∶20条件下，考察不同提取时间（15、25、35、45、55 min）对刺五加中多糖含量的影响，结果见图3C。由图3C可知，当提取时间为45 min时，刺五加中多糖含量最高，故选择提取时间范围为35～55 min。

图3 单因素试验结果
Fig 3 Results of single factor tests
2.4 刺五加多糖提取工艺优化
2.4.1 正交试验设计 在单因素试验基础上，以提取温度（A）、料液比（B）、提取时间（C）为考察因素，多糖含量为考察指标，采用L（934）正交试验设计优化工艺，因素与水平见表4，正交试验设计方案与结果见表5，方差分析结果见表6。
表4 因素与水平
Tab 4 Factors and levels

表5 正交试验设计方案与结果
Tab 5 Orthogonal test design scheme and results

由表4可知，各因素对刺五加中多糖含量的影响顺序依次为 B＞A＞C，其中 A2＞A1＞A3、B1＞B2＞B3、C3＞C1＞C2。进一步方差分析可知，提取温度和料液比对刺五加中多糖含量影响显著（P＜0.05）。因此，从省时降耗及生产实际出发，在保证提取充分的前提下，综合分析各因素的影响，得最优提取工艺为A2B1C1，即提取温度55℃、料液比1∶10、提取时间35 min。
2.4.2 验证试验 在此最优提取工艺条件下，平行操作3次。结果，刺五加中多糖的平均含量为4.36%（RSD＝0.92%，n＝3），提示该提取工艺稳定、可行。
表6 方差分析结果
Tab 6 Results of variance analysis

注：F0.05（2，2）＝19.0
Note：F0.05（2，2）＝19.0
3 讨论
含量测定结果显示，17个不同产地刺五加中多糖含量存在差异，其中S7（勃利福兴林场）刺五加中多糖的平均含量最高，为7.91%，S12（饶河大顶子山）刺五加中多糖的平均含量最低，4.26%。其原因可能与中药品质的形成除受到植物遗传作用外，还与土壤、海拔、水分、日照和地形等环境因素有关[13-15]。聚类分析结果显示，17批药材样品可聚为3类，S1、S6、S10、S12、S13聚为一类，S3～S5、S7聚为一类，其余聚为一类。这可能与药材生长的地理位置、生态环境有关[15]。
与传统煎煮工艺相比，超声波产生的强烈振动、超快速度、空化效应及搅拌作用等因素均可加速药材中的有效成分的溶出，具有提取效率高、提取时间短、溶剂用量少等优点[16-18]，故本研究参考上述相关文献，采用超声提取法进行提取。
本研究得到的最优提取工艺为提取温度55℃、料液比1∶10、提取时间35 min。在此条件下，刺五加中多糖的平均含量为4.36%，提示工艺稳定、可行。
综上所述，本研究所建含量测定方法操作简便、重复性较好，可用于测定刺五加中多糖含量；优化后的提取工艺稳定、可行。
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