菠萝蜜果醋发酵菌种的选育及发酵特性

奥鹏网院作业

菠萝蜜果醋发酵菌种的选育及发酵特性
何宇宁1,黄 和1,2,*,钟赛意1,刘 海1,秦小明1

(1.广东海洋大学食品科技学院,广东 湛江 524088;2.广东省亚热带果蔬加工科技创新中心,广东 湛江 524000)

摘 要：选育适应菠萝蜜果醋发酵的菌种,提升菠萝蜜果醋的醋酸含量和品质,为菠萝蜜果醋发酵提供新的菌种资源。本实验通过分离纯化和16S rRNA分子生物学鉴定的方法,对自然发酵的菠萝蜜果醋醋醪中醋酸菌进行选育和发酵特性研究。结果表明,从菠萝蜜果醋醋醪中分离鉴定出5 株醋酸菌,分别为Aa723和Aa941(都为Acetobacter pasteurianus)、Aa847(A. fabarum)、Aa747(A. tropicalis)以及Aa844(A. aceti)。其中菌株Aa941发酵性能最佳,在连续发酵96 h后,其最大产酸量为38.70 g/L(温度31 ℃,乙醇体积分数4%),最大醇酸转换率为74.85%(温度30 ℃、乙醇体积分数6%)。另外,该菌株在乙醇体积分数为8%时(温度30 ℃)产酸量和醇酸转换率分别为25.11 g/L和74.10%,在37 ℃时(乙醇体积分数4%)生长良好,产酸量和醇酸转换率分别为19.79 g/L和65.10%,其耐乙醇和耐高温性能优于商业菌种As1.41。醋酸菌Aa941能将菠萝蜜果酒发酵成具有菠萝蜜特征香气的果醋,可作为菠萝蜜果醋发酵的菌种。

关键词：菠萝蜜;果醋;醋酸菌;16S rRNA;发酵特性

菠萝蜜(Artocarpus heterophyllus Lam.),俗称大树菠萝,属于桑科、菠萝蜜属的常青乔木。菠萝蜜的果实柔软可口,香气扑鼻,是一种珍贵的热带水果[1]。研究表明,菠萝果肉营养丰富,富含碳水化合物、蛋白质、氨基酸、多酚、脂肪酸、维生素和矿物质,可作为一些重要营养物质的良好来源[2-3]。同时,菠萝蜜具有抗氧化、抗炎、抗菌、防龋、抗肿瘤和降血糖等多种生物活性[4-7]。目前菠萝蜜种植业面临的最大问题是其易腐性导致的巨大损失。因此,开发菠萝蜜新产品,为栽培者创造更高的收益,具有十分重要的现实意义[8]。菠萝蜜果实含有多种营养物质,其发酵产品也能很好的保存原有的风味和营养成分[9]。

醋酸菌是可将乙醇氧化生成乙酸的一类细菌[10],也是世界酿醋工业的重要微生物[11]。醋酸菌不仅广泛用于生产乙酸、葡萄糖酸、山梨酸以及合成必要的维生素如VC[12-14],还在生化反应糖类和乙醇氧化的研究中扮演重要角色[15-16]。关于菠萝蜜果醋发酵醋酸菌的选育研究相对较少,缺乏可参考数据。李文等[17]从猕猴桃中筛选出一株产酸量大和耐乙醇、耐高温能力强的醋酸菌,可使醋酸产量提升30.54%。陈洋等[18]从醋醅中筛选出菌株FY4,在高乙醇体积分数和高温状态下仍保持高产酸率,并成功用于热带水果的醋酸发酵。目前菠萝蜜果醋的研究鲜见报道,同时缺乏菠萝蜜果醋发酵的专用醋酸菌。

本研究通过菠萝蜜自然发酵与菌种三级筛选、生理生化鉴定、16S rRNA基因序列分析,筛选出适合菠萝蜜果醋发酵的醋酸菌;再通过发酵特性实验,比较选育的菌株与商业菌株As1.41在高乙醇体积分数和高温条件下的产酸能力。最终选育出菠萝蜜发酵果醋专用醋酸菌,提高菠萝蜜果醋产酸量和品质,为菠萝蜜果醋发酵提供优良菌种。

1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料与试剂

菠萝蜜 广东湛江市麻章区湖光镇农贸市场;醋酸菌As1.41 中国工业微生物菌种保藏管理中心;安琪葡萄酒高活性干酵母 湖北安琪酵母股份有限公司。

葡萄糖、酵母膏、琼脂 广东环凯微生物科技有限公司;结晶紫染液、番红染液、碘液、95%乙醇、无水乙醇、酚酞指示剂、NaOH、CaCO3 广东光华科技股份有限公司;Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒、San Prep柱式DNA胶回收试剂盒 生工生物工程(上海)股份有限公司;pUm-T载体试剂盒、dNTP 宝生物工程公司;GeneRuler DNA Ladder Mix Marker 赛默飞世尔科技有限公司。

1.1.2 培养基

基础培养基:葡萄糖1.0%,酵母膏1.0%,pH值自然,121 ℃灭菌20 min,冷却至70 ℃,加入体积分数4.0%无水乙醇;碳酸钙平板分离培养基:葡萄糖1.0%,酵母膏1.0%,CaCO3 2.0%、琼脂1.5%,pH值自然,121 ℃灭菌20 min,冷却至70 ℃,加入体积分数4.0%无水乙醇;斜面保藏培养基:葡萄糖1.0%,酵母膏1.0%,琼脂1.5%,pH值自然,121 ℃灭菌20 min,冷却至70 ℃,加入体积分数4.0%无水乙醇;发酵培养基:葡萄糖2.0%,酵母膏1.0%,pH值自然,121 ℃灭菌20 min,冷却至70 ℃,加入体积分数4.0%无水乙醇。

1.2 仪器与设备
SW-CJ净化工作台 苏州净化设备有限公司;722s紫外-可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;DYY-5电泳仪 北京六一仪器厂;3-18K高速冷冻离心机德国Sigma公司;2720 Themalcyder聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪 美国应用生物系统公司;AUY120电子天平 日本岛津制作所;SPX-250B-2生化培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;HZQ-F160振荡培养箱 北京东联哈尔仪器制造有限公司;HH-6数显恒温水浴锅 国华电器有限公司。

1.3 方法
1.3.1 菠萝蜜果醋自然发酵醋醪制备

将新鲜菠萝蜜果肉洗净,匀浆后装入己灭菌500 mL锥形瓶中,用4 层纱布封口,置于实验室阴暗处,室温环境(25～30 ℃)自然发酵30 d,每隔5 d在无菌环境下取醋醪样品待测。

1.3.2 菠萝蜜果酒发酵液制备

参考张玲等[19]制备菠萝蜜果酒的方法。选取新鲜菠萝蜜,取果肉洗净后切碎,在护色剂中浸泡20 min,取出果肉按料液比1∶1.5(g/mL)加入蒸馏水后匀浆,加入0.1 g/L焦亚硫酸钠,混匀静置2 h,加入0.5 g/L果胶酶,在30 ℃酶解3 h。酶解后的菠萝蜜果浆用蔗糖调节糖度至200 mg/mL,用柠檬酸调节pH值至4.5,100 ℃灭菌7 min。待菠萝蜜果浆冷却后,以5%体积分数接入活化酵母菌,28 ℃发酵6 d后,65 ℃巴氏灭菌30 min。

1.3.3 醋酸菌的筛选

1.3.3.1 菌种一级筛选

采用平板涂布分离法,取1 mL醋醪样品稀释至10-4～10-6,将稀释液涂布在碳酸钙平板分离培养基上,每个稀释度进行2 个重复实验,在30 ℃培养箱中培养2～3 d后观察现象,挑选长势良好,溶钙圈大而清晰的单菌落,进行革兰氏染色镜检,筛选出革兰氏阴性菌。

1.3.3.2 菌种二级筛选

将一级筛选的菌株各取1 环,接种于100 mL基础培养基中,30 ℃、120 r/min振荡培养3 d,5 000 r/min离心10 min后取5 mL上清液用0.1 mol/L NaOH溶液中和至pH 7.0,煮沸后加入4～5 滴FeCl3溶液,有红褐色沉淀生成,表明为产醋酸细菌[20]。

1.3.3.3 菌种三级筛选

将二级筛选的菌株各取1 环,接种于100 mL菠萝蜜果酒中,30 ℃、120 r/min振荡培养5 d,对发酵液的香气进行感官评价。

1.3.4 醋酸菌生理生化实验

取筛选出的菌株和商业菌株As1.41进行生理生化实验[21]。

1.3.5 醋酸杆菌的分子生物学鉴定

1.3.5.1 基因组提取

按照Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书要求,提取筛选得到的5 株醋酸杆菌基因组DNA作为模板DNA。

1.3.5.2 PCR扩增

PCR引物:正向引物5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’,反向引物5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’;PCR反应体系:模板DNA 1 μL,正向引物2 μL,反向引物2 μL,dNTP 2 μL,10×缓冲液5 μL,Taq(5 U/μL)0.5 μL,加入双蒸水调节至50 μL;PCR反应程序: 95 ℃预变性4 min;94 ℃变性30 s,58 ℃退火25 s,72 ℃延伸50 s,35 个循环。

1.3.5.3 PCR产物检测

取5 μL PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳,电泳参数:150 V,100 mA,10～20 min,若胶体上形成清晰条带,则PCR扩增成功。

1.3.5.4 16S rRNA基因片段的测序及分析

委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序工作。利用BLAST程序在NCBI数据库中进行同源性比对分析,选择与目标菌株有较高同源性的模式菌株[22],通过MEGA7.0软件构建系统发育树。

1.3.6 醋酸菌发酵性能实验

1.3.6.1 生长曲线测定

将筛选的醋酸杆菌各挑取1 环接种于100 mL基础培养基中,30 ℃、120 r/min振荡培养,每隔6 h用分光光度计在600 nm波长处测吸光度,以商业菌株As1.41为参照。

1.3.6.2 温度对发酵性能的影响

将筛选的醋酸杆菌活化后分别取1 mL接入100 mL菠萝蜜果酒发酵液中,乙醇体积分数4.0%,分别在25、28、31、34、37 ℃,120 r/min振荡培养96 h,测定醋酸杆菌产酸量、生长量、醇酸转化率,以商业菌株As1.41为参照。

1.3.6.3 乙醇对发酵性能的影响

将筛选的醋酸杆菌活化后分别取1 mL接入100 mL菠萝蜜果酒发酵液中,乙醇体积分数分别为2%、4%、6%、8%、10%,30 ℃、120 r/min振荡培养96 h,测定醋酸杆菌产酸量、生长量、醇酸转化率,以商业菌株As1.41为参照。

1.3.6.4 产酸量测定

参照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》[23]方法进行测定。

1.3.6.5 醇酸转化率测定

参考孙一帆等[24]方法,计算公式如下:

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1.4 数据处理
采用Microsoft Office Excel 2010软件进行数据处理和表格制作,采用Origin 2017软件进行数据图绘制,利用BLAST程序在NCBI数据库对16S rRNA测序结果进行同源性比对分析。每组实验重复3 次,取其平均值进行各数据统计分析。

2 结果与分析
2.1 醋酸菌筛选
2.1.1 一级筛选

由表1可知,经过72 h培养后有14 株菌有较小透明圈,31 株菌周围都有明显透明圈(图1)。对这31 株菌进行革兰氏染色镜检,均为革兰氏阴性菌(图2)。

表1 一级筛选结果
Table 1 Results of primary screening

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注:-.菌落无透明圈;+.菌落周围透明圈较小,不明显;++.菌落周围透明圈较大,较明显。

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图1 平板培养基上菌落形态图
Fig. 1 Colony morphology on medium plates

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图2 菌株革兰氏染色镜检图（16×100）
Fig. 2 Microscopic observation of bacterial strains after Gram staining (16 × 100)

2.1.2 二级筛选

表2 产酸定性实验结果
Table 2 Evaluation of acid production ability

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注:-.无红褐色沉淀;+.生成红褐色沉淀。

由表2可知,一级筛选的31 株菌进行产酸定性实验中,只有15 株菌生成红褐色沉淀。

2.1.3 三级筛选

表3 发酵液感官评价结果
Table 3 Sensory evaluation of fermentation broths

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由表3可知,二级筛选的活化醋酸菌经过5 d连续发酵,15 瓶发酵液由于醋酸菌的不同,呈现出不同的气味,有醋香味、菠萝蜜果香味、馊臭味等,从中筛选出5 株产醋香和菠萝蜜果香的醋酸菌用于后续实验。

2.2 生理生化实验
表4 菌株的生理生化实验结果
Table 4 Results of physiological and biochemical tests of acetic acid bacteria

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注:+.阳性;-.阴性。

根据表4和《伯杰细菌鉴定手册》[21]的描述,初步判断筛选出的5 株疑似醋酸菌Aa723、Aa747、Aa844、Aa847和Aa941均属于醋酸杆菌属。

2.3 16S rRNA鉴定
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图3 醋酸杆菌16S rRNA的PCR产物电泳图
Fig. 3 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of 16S rRNA genes from selected strains

由图3可知,5 株醋酸杆菌的PCR扩增产物的片段大小约为1 500 bp,且条带清澈无弥散,说明PCR扩增成功,可进行下一步的16S rRNA基因片段测序。

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图4 醋酸杆菌的系统发育树
Fig. 4 Phylogenetic tree of acetic acid bacteria

由图4可知,5 株醋酸杆菌在系统发育树中属于4 个不同的种。通过bookstrap检验1 000 次支持该进化树分支可信度,综合各菌株的生理生化特征和形态学结果,可以确定5 株醋酸杆菌:Aa723和Aa941为巴氏醋酸杆菌(A. pasteurianus),Aa847为法布拉姆醋酸杆菌(A. fabarum),Aa747为热带醋酸杆菌(A. tropicalis),Aa844为醋化醋酸杆菌(A. aceti)。其中筛选出的A. fabarum、A. tropicalis、A. aceti均为首次在菠萝蜜果醋醋醪中分离得到。

2.4 醋酸菌发酵性能实验
2.4.1 生长曲线测定

由图5可知,Aa723、Aa847的对数生长期在6～60 h之间,其他菌株的对数生长期为6～48 h。Aa941的生长量最大,OD600 nm值达到1.31,其次分别是As1.41、Aa747、Aa844、Aa847和Aa723,说明Aa941在筛选出的5 株菌株中具有较强的适应能力,且与商业菌株As1.41具有相似的生长曲线。菌种在对数期内具有较强的活力和繁殖能力,同时对外界刺激的应激反应较为灵敏[25],因此,选择48 h为醋酸杆菌种子液培养时间。

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图5 醋酸菌生长曲线
Fig. 5 Growth curves of acetic acid bacteria

2.4.2 温度对发酵性能的影响

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图6 温度对菌株生长量（A）、产酸量（B）和醇酸转化率（C）的影响
Fig. 6 Effect of temperature on OD600 nm (A), acetic acid production (B)and alcohol-acid transform ratio (C) of strains

种属不同的醋酸杆菌有不同的最适生长温度[26]。有研究表明,在一定范围内,随着温度的升高,醋酸杆菌的生长速率和产酸代谢速率呈现先升高后下降的趋势[27-28]。由图6可知,在25～37 ℃范围内,除Aa723外,其他5 株醋酸杆菌的生长量、产酸量和醇酸转换率随着温度先升高后下降。Aa723与Aa941、As1.41分别在25、31 ℃时具有最高的生长量和产酸量,Aa723、Aa747在28 ℃时有最高醇酸转换率。在25～31 ℃范围内,Aa847、Aa941和As1.41的醇酸转换率变化较小,Aa844的生长量和产酸量波动较小,相比较而言,Aa723和Aa747的在该温度范围内敏感性较强。Aa941在31、34、37 ℃时的产酸量均为各醋酸杆菌中最高,分别达到38.70、35.78、19.79 g/L;在37 ℃时,6 个菌株均能保持一定的产酸量,但只有Aa941和As1.41的OD600 nm值能达到0.650以上,且能维持较高的醇酸转换率,分别达到65.10%和63.10%。

对比国内外相关研究,李文等[17]从猕猴桃中筛选出一株耐高温醋酸杆菌WT08(A. pasteurianus),在36 ℃培养72 h,产酸量为10.65 g/L,相同发酵时间,本研究筛选的醋酸杆菌Aa941在37 ℃产酸量为19.79 g/L,明显优于WT08。

2.4.3 乙醇体积分数对发酵性能的影响

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图7 乙醇体积分数对菌株生长量（A）、产酸量（B）和醇酸转化率（C）的影响
Fig. 7 Effect of ethanol concentration on OD600 nm (A), acetic acid production (B) and alcohol-acid transform ratio (C) of strains

乙醇既是醋酸菌生长的能量来源,也是醋酸发酵的底物[29],但高体积分数乙醇将严重抑制醋酸菌的生长和代谢速率[30]。由图7可知,随着乙醇体积分数的上升,各醋酸杆菌的生长量基本呈现下降的趋势,产酸量和醇酸转换率呈先上升后下降趋势;各醋酸杆菌在乙醇体积分数为2%时OD600 nm值最大,均高于0.950;在乙醇体积分数为4%时产酸量最高,说明低体积分数的乙醇不利于醋酸杆菌的产酸代谢。当乙醇体积分数大于8%时,6 株菌的生长值、产酸量和醇酸转换率均受到不同程度的抑制,其中Aa844受到的抑制最为严重,OD600 nm值和产酸量分别低于0.400 g/L和10.00 g/L,只有Aa941和As1.41的生长虽受抑制,但依然保持着较高的产酸量和醇酸转换率。在6 株醋酸菌中,当乙醇体积分数为4%,Aa941的产酸量最大,达到36.50 g/L;乙醇体积分数为6%、8%时,Aa941的产酸量和醇酸转换率均大于其他5 株醋酸菌,分别为30.15 g/L、74.85%和25.11 g/L、74.10%。

对比国内相关研究,张志燕等[31]在香醋醋醅中筛选出优势醋酸菌D-3-4,在乙醇体积分数为5%～11%时,产酸量随着乙醇体积分数上升而下降,产酸量在11%时受到较严重抑制,与本研究结果基本一致。李大为等[32]从自然发酵的苹果醋中分离出一株高耐受性醋酸杆菌B103(A. pasteurianus),产酸量为35.6 g/L,耐受乙醇体积分数为7%,本研究筛选出的醋酸菌Aa941(A. pasteurianus)其乙醇体积分数耐受性和产酸量均高于B103。

3 结 论
本研究通过富集培养、生理生化实验验和16S rRNA分子生物学鉴定的方法,对自然发酵的菠萝蜜果醋醋醪中醋酸菌进行发酵特性研究。结果表明,从菠萝蜜果醋醋醪中分离鉴定出5 株醋酸杆菌,分别为Aa723和Aa941(A. pasteurianus)、Aa847(A. fabarum)、Aa747(A. tropicalis)以及Aa844(A. aceti),其中不同醋酸杆菌对温度和乙醇体积分数的耐受性具有显著性差异。菌株Aa941发酵性能最佳,31 ℃连续发酵96 h,在乙醇体积分数为4%时产酸量最大,达到38.70 g/L;乙醇体积分数为6%时,30 ℃发酵96 h醇酸转化率达到最高,为74.85%。Aa941在8%高乙醇体积分数条件下,30 ℃发酵96 h产酸量和醇酸转换率分别为25.11 g/L和74.10%;在37 ℃高温下生长良好,乙醇体积分数4%发酵96 h产酸量和醇酸转换率分别为19.79 g/L和65.10%,其耐乙醇和耐高温性能优于商业菌种As1.41。醋酸杆菌Aa941能将菠萝蜜果酒发酵成具有菠萝蜜特征香气的果醋,可作为菠萝蜜果醋发酵的菌种,进一步丰富了果醋发酵所需的菌种资源。

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Screening and Fermentation Characteristics of Acetic Acid Bacteria for Production of Jackfruit(Artocarpus heterophyllus Lam.) Vinegar

HE Yuning1, HUANG He1,2,*, ZHONG Saiyi1, LIU Hai1, QIN Xiaoming1
(1. College of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China; 2. Guangdong Provincial Science and Technology Innovation Center for Subtropical Fruit and Vegetable Processing, Zhanjiang 524000, China)

Abstract: In order to obtain a suitable acetic acid bacterial strain for the fermentation of jackfruit vinegar with improved acetic acid content and quality, acetic acid bacteria were isolated and purified from naturally fermented jackfruit vinegar, and identified by molecular biology based on 16S rRNA gene sequence and their fermentation characteristics were studied. The results showed that 5 strains of acetic acid bacteria were identified, including Aa723 and Aa941 (Acetobacter pasteurianus),Aa847 (A. fabarum), Aa747 (A. tropicalis), and Aa844 (A. aceti). Among these strains, Aa941 showed the best fermentation performance. After 96 hours of fermentation, the maximum acid yield of 38.70 g/L was obtained under the conditions of fermentation temperature 31 ℃ and ethanol concentration 4%, as well as the maximum alcohol-acid transform ratio of 74.85% under the conditions of fermentation temperature 30 ℃ and ethanol concentration 6%. Under the conditions of ethanol concentration 8% and fermentation temperature 30 ℃, the acid yield and alcohol-acid transform ratio were 25.11 g/L and 74.10% respectively. Aa941 could grow well under the conditions of fermentation temperature 37 ℃ and ethanol concentration 4%, and the acid yield and alcohol-acid transform ratio were 19.79 g/L and 65.10%, respectively,showing that the ethanol and temperature tolerance of Aa941 are superior to those of the commercial strain As1.41. It was found that strain Aa941 could ferment jackfruit wine into fruit vinegar with the characteristic aroma of jackfruit. Thus, it can be used as a starter culture for jackfruit vinegar fermentation.

Keywords: jackfruit; vinegar; acetic acid bacteria; 16S rRNA; fermentation characteristics