小麦叶锈菌效应蛋白Pt18906激发TcLr27+31的双层防御反应

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小麦叶锈菌效应蛋白Pt18906激发TcLr27+31的双层防御反应
齐悦1，吕峻元1，张悦1，韦杰1，张娜1，杨文香1，刘大群2

（1河北农业大学植物保护学院小麦叶锈病研究中心/河北省农作物病虫害生物防治技术创新中心/国家北方山区农业工程技术研究中心，河北保定071001；2中国农业科学院研究生院，北京 100081）

摘要：【目的】由小麦叶锈菌（Puccinia triticina）引起的小麦叶锈病是影响小麦生产的主要病害之一，在小麦与叶锈菌互作的过程中病菌向寄主细胞分泌效应蛋白，以调控寄主防御反应、发挥毒性功能。开展对小麦叶锈菌效应蛋白的研究，探索小麦叶锈菌的致病机制，为病害的持续防控提供依据。【方法】以小麦叶锈菌13-5-72与感病品种Thatcher互作的cDNA为模板扩增效应蛋白Pt18906，通过SignalP 4.1、TargetP 1.1、TMHMM 2.0和EffectorP 2.0软件对Pt18906进行序列特征分析，利用在线软件Swiss-Model预测Pt18906的三级结构，利用在线软件SOPMA预测Pt18906的二级结构。采用实时荧光定量PCR对Pt18906的表达模式进行分析，借助于烟草的异源表达系统对Pt18906进行抑制Bax和INF1诱导的细胞程序性死亡（programmed cell death, PCD）能力验证，利用酵母系统验证Pt18906的信号肽是否具有分泌功能，采用氨基酸逐步缺失的方法缺失突变Pt18906，从而确定其功能毒性motif；通过在烟草中瞬时表达Pt18906-GFP融合蛋白，结合质壁分离技术分析Pt18906的亚细胞定位，得出效应蛋白的作用位点；利用瞬时表达技术在以Thatcher为背景的不含抗病基因和含有不同抗病基因的全套近等基因系上开展Pt18906无毒性功能分析；采用细菌三型分泌系统（Type Ⅲ secretion system）介导的瞬时转化分析Pt18906对寄主防御反应的调控。【结果】从小麦叶锈菌13-5-72与感病品种Thatcher互作6 d的转录组文库中获得一个在接种24 h后显著高表达的、基因全长序列672 bp、编码223个氨基酸的候选效应蛋白Pt18906，该效应蛋白缺乏已知的功能结构域和保守基序，工作环境偏碱性，在烟草细胞中瞬时表达Pt18906，Pt18906能够抑制Bax和INF1诱导的细胞程序性死亡，表明该效应蛋白具有毒性功能，并且通过构建缺失突变体明确其28—47位氨基酸对其毒性功能具有重要作用，该效应蛋白定位于细胞核和细胞质，表明其作用于细胞内。Pt18906在单基因系抗病品种TcLr27+31和TcLr42上能够引起过敏性坏死反应，表明该效应蛋白的无毒性，Pt18906能够引起TcLr27+31中胼胝质的积累和活性氧的迸发，胼胝质随注射时间的增加而逐渐积累，活性氧在注射后的10 min达到最高。【结论】位于28—47位的氨基酸决定Pt18906的毒性主要功能，Pt18906能激发小麦TcLr27+31双层防御反应。

关键词：小麦叶锈菌；小麦叶锈病；效应蛋白；胼胝质；活性氧；致病性；防御反应

0 引言
【研究意义】由小麦叶锈菌（Puccinia triticina）引起的小麦叶锈病严重影响小麦生产[1]，该病害在世界范围分布广泛[2]，严重发生时可造成15%—45%甚至更高的经济产量损失[3]。小麦叶锈菌致病性多样化且致病类型频繁发生变异，导致小麦抗叶锈性不断丧失。因此，研究小麦叶锈菌致病的分子机制对控制小麦叶锈病尤为重要。【前人研究进展】植物的免疫机制主要由两层防御体系构成[4]。第一层次防御系统是由植物细胞膜表面的模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）识别病原微生物保守的模式分子（microbial- or pathogen-associated molecular patterns，MAMPs or PAMPs）引发的抗病反应，称之为PTI（PAMPs-triggered immunity）[5]。第二层的防御系统是由植物细胞内的抗病蛋白（disease resistance protein，R protein），主要是NB-LRR类型的抗病蛋白直接或间接地识别病原微生物分泌到植物细胞内的效应因子，引发更为强烈的免疫反应，称之为ETI（effector-triggered immunity）[6]。植物的PTI又称为基础抗性，是植物通过细胞膜表面的受体激酶（receptor-like kinases，RLKs）或受体蛋白（receptorlike proteins，RLPs）感受病原微生物的PAMPs从而触发植物细胞的一系列反应[7]，比如细胞膜离子通道的激活，钙依赖蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases，CPKs）的激活，细胞质内钙离子浓度的变化，胼胝质的积累，MAPK级联反应的激活，病程相关基因PRs的上调表达等。植物的ETI由病原菌分泌到寄主细胞中的一些被称为“效应蛋白”的蛋白触发[8]，效应蛋白能够通过多种方式抑制植物免疫反应，包括抑制PTI[9]，促使病原成功侵染植物[10-13]。ETI往往在受侵染的植物细胞部位产生大量的过氧化物（如H2O2），并且诱导植物的过敏性坏死反应（hypersensitive response，HR）[14]。锈菌是专性寄生真菌，主要通过吸器从寄主细胞内吸收营养，进而有效的在寄主中扩展，产生孢子[15]。病原菌侵染时向寄主细胞分泌效应蛋白[16]，通过效应蛋白调控寄主的免疫防御反应，造成植物感病。锈菌效应蛋白在寄主中的作用机理尚不清楚，基因组、转录基因组测序成为探明锈菌效应蛋白功能的重要研究途径。至今已完成多种植物病原锈菌的基因组测序和转录组测序，包括杨树锈菌（Melampsora larici-populina）[17]、亚麻锈菌（Melampsora lini）[18]、小麦秆锈菌（Puccina graminis f.sp.tritici，Pgt）[19]、小麦条锈菌（Puccinia striiformis f.sp.tritici，Pst）[19-21]和小麦叶锈菌[22]。通过基因组测序，从杨树锈菌的1 898个分泌蛋白中鉴定出1 184个CSEP（candidate effectors protein）[23]；从亚麻锈菌的1 085个分泌蛋白中鉴定出了762个CSEP[24]；在小麦秆锈菌的1 934个分泌蛋白中筛选出1 106个CSEP[19]；在条锈菌CY-32中筛选出2 029个CSEP[25]；在叶锈菌中预测到1 358个效应蛋白[26]。然而，锈菌中已经克隆出的效应蛋白数量非常有限，这些效应蛋白分别来源于亚麻锈菌的AvrM[27]、AvrL567[28]、AvrP123[29]、AvrP4[30]、AvrL2[31]和AvrM14[31]；蚕豆单胞锈菌（Uromyces fabae）的RTP1[32]，小麦秆锈菌的PGTAUSPE-10-1[33]、AvrSr35[34]、AvrSr50[35]和小麦条锈菌的Pst8853[36]、Pst23616[37]、Pstha5a23[38]、Pst87[39]、Pec6[40]、HASP2[41]、Pst30[42]、Hasp58[43]、PstGSRE1[44]、Pst8713、Pst12806[45]和Pst18363[46]。而对小麦叶锈菌效应蛋白的研究仍处于起始阶段。BRUCE等[22]利用6个小麦叶锈菌菌株与小麦互作中的吸器形成阶段开展转录组分析，获得了222 571个锈菌中的序列，共筛选出532个候选效应蛋白；SEGOVIA等[47]在2016年发现Pt3和Pt27可分别在含有抗性基因Lr9或Lr24，Lr26的近等基因系中抑制GUS的表达；2017年，澳大利亚获得了小麦叶锈菌中与抗病基因Lr20对应的候选效应蛋白，但并未开展相关功能的进一步分析。CUOMO等[26]在2017年对小麦秆锈菌、小麦条锈菌和小麦叶锈菌的基因组进行了测序结果比较，发现小麦叶锈菌基因组在这3个基因组中最大（估计为135 Mb），且基因组高度杂合，通过全基因组和RNA-seq在小麦叶锈菌的5个发育阶段中总计预测到1 358个效应子，但是尚无相关功能验证的报道。【本研究切入点】中国小麦叶锈菌受种植小麦品种及地理环境的影响，具有与其他国家菌株不同的致病力，自2012年开始河北农业大学小麦叶锈病研究中心开展了小麦叶锈菌的效应蛋白的预测和相关分析，利用小麦叶锈菌与寄主互作的转录组筛选得到635个候选效应蛋白。其中Pt18906在小麦叶锈菌吸器形成阶段显著高表达，关于该基因的特性及其在致病中的作用尚不明确。【拟解决的关键问题】对小麦叶锈菌效应蛋白Pt18906的基本特性进行分析，测试其在小麦抗叶锈近等基因系中对寄主胼胝质和活性氧（reactive oxygen species，ROS）的影响，明确被诱导发生防御反应的近等基因系，揭示Pt18906在小麦近等基因系中对应的基因，探测该效应蛋白与对应抗叶锈基因的关系，为深入揭示Pt18906在致病中的作用及其调控机理打下基础。

1 材料与方法
试验于2019年在河北农业大学植物保护学院完成。

1.1 供试植物
供试烟草为本氏烟（Nicotiana benthamiana）。39个以Thatcher为遗传背景的小麦抗叶锈病近等基因系包括TcLr1、TcLr2a、TcLr2c、TcLr3、TcLr3Ka、TcLr9、TcLr10、TcLr11、TcLr14a、TcLr16、TcLr17、TcLr18、TcLrB、TcLr24、TcLr26、TcLr30、TcLr2b、TcLr14b、TcLr15、TcLr19、TcLr20、TcLr21、TcLr23、TcLr25、TcLr27+31、TcLr28、TcLr29、TcLr32、TcLr33、TcLr33+34、TcLr36、TcLr38、TcLr41、TcLr42、TcLr44、TcLr45、TcLr50、TcLr51和TcLr53，由CIMMTY惠赠，笔者实验室保存。

1.2 供试菌株及培养条件
大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α购自天根（TIANGEN）公司，使用LB培养基在37℃条件下培养；农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101由中国农业大学孙文献教授惠赠，在28℃条件下培养；酵母突变株为YTK12；荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌株EtHAn 由西北农林科技大学康振生院士惠赠。

1.3 供试载体
烟草瞬时过表达载体PVX病毒载体pGR107由中国农业大学孙文献教授惠赠，信号肽分泌功能验证载体pSUC2和细菌三型分泌系统载体pEDV6由西北农林科技大学康振生院士惠赠。

1.4 Pt18906的克隆和载体构建
以小麦叶锈菌菌株13-5-72（THSN）侵染小麦叶片的RNA反转录产物为模板，克隆效应蛋白基因，分别利用引物（表1）构建到pGR107、pSUC2和pEDV6载体上，构建完成的载体用于烟草瞬时表达、信号肽分泌功能验证、亚细胞定位和利用细菌三型系统开展的免疫反应测定。

表1 本试验所用引物
Table 1 The primers used in this study

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1.5 农杆菌介导的烟草瞬时转化
将构建的ΔSPPT18906-pGR107转入农杆菌感受态细胞GV3101中，倒置培养2 d后挑取阳性克隆接种到含有100 μg·mL-1 Kan和100 μg·mL-1 Rif的5 mL LB培养基中。28℃，200 r/min 摇床中振荡培养2—3 d至菌液浑浊后，用5 mL农杆菌缓冲液（100 mL灭菌水+1 mL MgCl2（10 mmol·L-1）+1 mL 2-（N-吗啉）乙磺酸（10 mmol·L-1））洗涤3次，稀释至OD600=0.3，Bax和INF1稀释至OD600=0.3避光静置2 h；选择6—8周龄本氏烟草植物叶的第2—4叶接种，并使用1 mL的无针注射器渗透入叶中。在注射之前将效应蛋白基因构建体和Bax或INF1构建体以1﹕1比例混合，同时注射，设定为0 h抑制试验；将含有效应蛋白的农杆菌菌株在造成细胞死亡的Bax或INF1构建体前24 h注射烟草，定为24 h抑制试验。在烟草叶上测试效应蛋白，并将该试验重复3次，在5—7 d内观察细胞死亡情况，接种后7 d对叶片进行拍照。

1.6 Pt18906信号肽分泌功能的验证
采用酵母信号肽筛选（yeast signal peptide screen，YSST）验证效应蛋白信号肽的分泌功能。试验中选用的酵母菌株为缺失蔗糖转化酶基因、在以蔗糖为唯一碳源的培养基上不能生长的YTK12。选用的载体质粒为含有色氨酸合成基因和一个缺失信号肽与起始密码子ATG的蔗糖转化酶基因（SUC2）的pSUC2。

1.6.1 酵母感受态的制备与转化 在YPDA固体培养基上28℃活化酵母菌株YTK12；2—3 d后刮取适量的酵母菌，配置反应体系（10XLiAc 36 μL，50%PEG3500 240 μL，鲑鱼精ssDNA（2 ng·mL-1）50 μL，酵母感受态细胞50 μL，pSUC2-效应基因的重组载体5 μL，ddH2O 80 μL），混匀，放置42℃ 50 min；9 000 r/min离心1 min，弃上清；加入150 μL水，吹吸混匀，涂布于SD-Trp的培养基平板上，28℃培养2—3 d。

1.6.2 信号肽分泌功能的检测 将SD-Trp培养基上生长的阳性克隆转接到YPRAA培养基上，28℃倒置培养，如果能在YPRAA培养基上继续生长，则证明候选信号肽序列具有分泌功能；若不能生长则证明候选信号肽序列无分泌功能。

1.7 Pt18906的实时荧光定量分析
将小麦叶锈菌菌株13-5-72（THSN）接种在小麦Thatcher完全展开的第一叶上，黑暗条件下保湿（保湿温度16℃，相对湿度100%），接种后分别采取0、6、12、18、24、36、48、72、96 h和6、9、12 d的样品，将上述12个时间点的样品按照TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit试剂盒提供的方法提取总RNA，反转录成cDNA。使用荧光定量PCR仪（罗氏LightCycler480），以各取样点侵染的叶片cDNA为模板，以叶锈菌夏孢子的肌动蛋白β-Actin为内参基因，进行PCR扩增引物为RTPt18906-F：ATACGATGGTCTGGGTT；RTPt18906-R：TTGTTTT GTCTGGTGGA，每个反应生物学重复3次。PCR反应结果按照2-ΔΔCT法计算目的基因在不同时间点的相对表达量。

1.8 Pt18906抑制Bax诱导的细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）功能motif分析
为进一步确定在候选效应基因中负责抑制PCD过程的功能结构域，采用氨基酸逐步缺失的方法，将缺失部分氨基酸的候选效应基因的序列构建到PVX载体上，利用农杆菌侵染烟草细胞试验来验证突变的候选效应基因对Bax诱导的PCD功能，从而鉴定其功能结构域。

1.9 Pt18906亚细胞定位
将ΔSP Pt18906-pGR107重组载体电转入农杆菌感受态细胞GV3101中，倒置培养2 d后挑取阳性克隆接种到含有相应抗性的5 mL LB培养基中。28℃，200 r/min摇床中振荡培养至菌液浑浊后，用5 mL农杆菌缓冲液洗涤3次；稀释至OD600=0.2，避光静置2 h；选择8叶左右的本氏烟草植物叶的第2—4叶接种，并使用无针注射器渗透入叶中，以GFP为对照。农杆菌注射后2 d，剪取注射的烟草叶片，利用荧光显微镜观察效应蛋白的表达量以及定位；之后撕取烟草叶片下表皮在0.8 mol·L-1的山梨醇中浸泡15 min，荧光显微镜下观察。

1.10 Pt18906的无毒性功能分析
将重组质粒ORFPt18906-pGR107利用农杆菌转化法转到农杆菌GV3101中。Pt18906构建体稀释至OD600=1.0，静置于28℃ 3 h，后用于注射全套的近等基因系。观察效应蛋白在不含抗病基因和含有不同抗病基因的小麦中过表达能否激发过敏性细胞坏死反应（HR）。选取感病材料Thatcher作为对照，在39个小麦抗叶锈病近等基因系中瞬时表达效应蛋白Pt18906，注射5 d后观察表型，7 d拍照，并取样利用DAB进行染色，观察过氧化氢（H2O2）积累情况。

1.11 细菌三型分泌系统介导的小麦瞬时转化
将质粒转化进入荧光假单胞感受态EtHAn中。挑取菌落接种到含50 μg·mL-1庆大霉素和30 μg·mL-1氯霉素抗性的培养基中，菌液浑浊后，用10 mmol·L -1 MgCl2溶液洗涤3次，将处理好的菌液稀释至OD600=1.0，28℃避光放置2 h，用于注射小麦叶片。

Pt18906诱导的胼胝质的观察：采集含有Pt18906载体荧光假单胞菌株EtHAn注射后12、24、36、48和72 h的小麦叶片，将叶片浸泡在脱色液（乙醇和冰醋酸（1﹕1）混合）中，完全脱色后转入水合氯醛中处理过夜；加入0.05%苯胺蓝染液染色，在荧光显微镜下观察胼胝质的积累情况并随机选取50个视野，统计胼胝质的数目。

Pt18906诱导的活性氧的观察：采集EtHAn注射后0、5、10、15、20和30 min的小麦叶片，用1%硝基蓝四氮唑染液染色超氧阴离子，强光下光照4—8 h；使用无水乙醇染色完毕后脱色，在水合氯醛溶液中过夜处理。利用ASSESS软件统计每个叶片的染色面积占总注射叶片面积的百分比，每个样品生物学重复3次。

2 结果
2.1 Pt18906的序列及结构分析
通过克隆获得一个开放阅读框长为672 bp的Pt18906，编码223个氨基酸，具有8个半胱氨酸残基，与小麦叶锈菌BBBD的PTTG_11719同源性达到99%。利用SignalP 4.1在线软件预测，发现该效应蛋白的1—27 aa 为信号肽区域（图1-A）。使用Target P预测编码的蛋白，发现该蛋白不含有线粒体定位信号序列，利用TMHMM 2.0在线软件预测无跨膜结构；利用Pfam在线软件分析该效应蛋白无保守基序；利用MEME在线软件分析目的基因编码的蛋白无保守结构域；Pt18906编码的蛋白等电点（pI）为7.535，证明此效应蛋白的工作环境偏向于碱性；利用在线软件Swiss-Model预测得出效应蛋白的三级结构（图1-B），Pt18906的二级结构含有12.56%的α-螺旋，并且存在13%的延伸链、4.48%的转角和69.96%的无规则卷曲。

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图1 Pt18906的序列分析
Fig.1 Sequence analysis of Pt18906

A：Pt18906信号肽预测Pt18906 signal peptide prediction；B：Pt18906蛋白的三级结构Tertiary structure of Pt18906 protein

2.2 效应蛋白Pt18906抑制Bax和INF1诱导的细胞程序性死亡
为了测试效应蛋白是否能抑制PCD，Bax和INF1在候选效应基因注射后24 h注射到4—6周龄的本氏烟草植物中，注射排布如图2-A。从表型可以看到单独注射载体GFP的位点没有出现PCD现象，证明载体对PCD的产生没有任何影响。注射GFP和Bax/INF1的位点出现坏死，单独注射Bax/INF1的位点在5 d左右出现了坏死，而单独注射Pt18906的位点没有出现坏死，但在注射Pt18906后24 h注射Bax/INF1的位点没有出现坏死，说明该基因抑制了Bax/INF1引起的PCD（图2 B-1/B-3）。为了排除先注射基因可能会占据Bax/INF1诱导PCD的作用位点，将Bax、INF1和效应蛋白按照1﹕1（V/V）混合后注射到烟草叶片中，从表型结果，看到Pt18906依然能够有效抑制住Bax/INF1激发的PCD（图2B-2/B-4）。

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图2 Pt18906抑制Bax和INF1诱导的细胞程序性死亡
Fig.2 Pt18906 inhibits PCD induced by Bax and INF1

A：验证Pt18906抑制Bax和INF1注射模式图Verify that Pt18906 inhibits Bax and INF1 (injection pattern figure)；B：验证Pt18906抑制Bax和INF1诱导细胞程序性死亡的结果（1：注射后24 h有效抑制Bax造成的坏死；2：注射后0 h有效抑制Bax造成的坏死；3：注射后24 h有效抑制INF1造成的坏死；4：注射后0 h有效抑制INF1造成的坏死）Verify that Pt18906 inhibits Bax and INF1-induced PCD (1: The inhibition of Bax-induced PCD 24 h after Pt18906 injection; 2: The inhibition of Bax-induced PCD at 0 h after Pt18906 injection; 3: The inhibition of PCD by INF1 24 h after Pt18906 injection; 4:The effective inhibition of PCD by INF1 0 h after Pt18906 injection)

2.3 Pt18906信号肽分泌功能验证
为检测重组质粒的分泌功能，挑取在SD-Trp培养基上生长的阳性克隆，转接到YPRAA培养基上，检测转化酵母细胞是否能够在YPRAA培养基上能生长。选用大豆疫霉（Phytophthora sojae）中的分泌型效应蛋白Avr1b的信号肽为阳性对照，选用稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）的非分泌性蛋白Mg87为阴性对照。结果发现，含有Avr1b与缺失SUC2的转化子在筛选培养基中能够正常生长，含有Pt18906效应蛋白信号肽及缺失SUC2重组载体的酵母菌株在SD-Trp培养基中能正常生长，分泌型效应蛋白Avr1b能在YPRAA培养基中正常生长，但Pt18906效应蛋白信号肽不能在YPRAA培养基中正常生长，说明效应蛋白的信号肽没有分泌功能，从而确认Pt18906效应蛋白为非分泌型蛋白（图3）。

2.4 Pt18906表达量分析
通过对Pt18906在小麦叶锈菌不同生长发育阶段以及小麦叶片侵染过程的表达趋势进行分析，结果表明候选效应蛋白在0—24 h阶段逐渐上调表达，在24 h达到表达高峰，之后表达量呈现出逐渐下调的趋势（图4）。

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图3 Pt18906信号肽分泌功能验证
Fig.3 Verification of signal peptide secretory function of Pt18906

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图4 Pt18906在小麦叶锈菌13-5-72和Thatcher互作中不同时间点的表达量
Fig.4 Pt18906 expression at different time points in P.triticina 13-5-72 and Thatcher interaction

2.5 效应蛋白Pt18906毒性功能
为探知Pt18906决定相关功能的结构域，构建了6个缺失突变体，包括N-末端缺失20个氨基酸的突变体和C-末端缺失突变体，分别缺失30个（Δ194—224）、60个（Δ164—224）、90个（Δ134—224）和120个（Δ104—224）氨基酸。缺失突变体农杆菌注射烟草的结果发现，从C-末端缺失30、60、90和120个氨基酸的突变体均能抑制细胞坏死，而N-末端缺失20个氨基酸的突变体丧失了抑制细胞坏死的能力（图5）。表明Pt18906效应蛋白28—47位的氨基酸序列对其毒性功能具有重要作用。

2.6 效应蛋白Pt18906的作用位点
利用GFP对Pt18906进行亚细胞定位分析，质壁分离后发现pGR107-GFP载体（对照）在细胞核及细胞质中均有表达，绿色荧光分布在整个细胞内，Pt18906与GFP融合蛋白表达激发的绿色荧光同样充斥整个细胞内（图6），证明效应蛋白Pt18906在细胞内起作用。

2.7 Pt18906的无毒效应
利用农杆菌侵染的方法检测Pt18906在39个小麦抗叶锈病近等基因系中过表达效应蛋白，注射5 d后观察过敏性坏死反应发生的情况。结果发现携带有空载体pGR107的农杆菌株注射没有引起坏死，Pt18906在近等基因系TcLr27+31和TcLr42上出现了坏死反应，用DAB对小麦叶片进行染色，发现出现坏死反应的部位被DAB染成棕褐色（图7），在显微镜下观察到棕褐色，说明有H2O2的存在，表明效应蛋白触发了寄主的防御反应，小麦TcLr27+31和TcLr42中存在与效应蛋白互作的分子靶标。

2.8 Pt18906在寄主上诱导的胼胝质分析
采用细菌的三型分泌系统将效应蛋白递送到小麦中，以MgCl2、EtHAn和转化有pEDV6的荧光假单胞菌作为对照。注射后的0、12、24、36、48、72 h采集组织学样品，与对照相比，Pt18906在小麦中激发了胼胝质的产生，从12 h及可以观察到胼胝质的产生，而且随着时间的延长，胼胝质的积累逐渐增强（图8），表明效应蛋白Pt18906能够促进TcLr27+31胼胝质的积累，触发了寄主的防御反应。

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图5 Pt18906毒性功能结构域分析
Fig.5 Pt18906 virulence functional domain analysis

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图6 Pt18906亚细胞定位
Fig.6 Subcellular localization of Pt18906 in N.benthamiana

Ⅰ：荧光场Epi-fluorescence；Ⅱ：明场Bright-field；Ⅲ：融合场Merged images；GFP发绿色荧光；标尺为100 µm Green means the fluorescence of the GFP.Scale bars are 100 µm

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图7 在小麦中过表达Pt18906激发坏死反应
Fig.7 Overexpression of Pt18906 in wheat stimulates HR

A：在TcLr27+31过表达Pt18906激发坏死Overexpression of Pt18906 in TcLr27+31 stimulates HR；B：在TcLr42过表达Pt18906激发坏死Overexpression of Pt18906 in TcLr42 stimulates HR
1：注射的表型结果Phenotypic results of injection；2：4倍荧光显微镜下的H2O2 The H2O2 under fluorescence microscope (4×)；3：20倍荧光显微镜下的H2O2 The H2O2 under fluorescence microscope (20×)

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图8 在TcLr27+31中瞬时表达Pt18906引起胼胝质的积累
Fig.8 Expression of Pt18906 in TcLr27+31 causes accumulation of callose

A：注射Pt18906后不同时间点胼胝质累积Callose accumulation at different time points after injection of Pt18906；B：胼胝质积累量与注射时间关系Relationship between callose accumulation and injection time

2.9 Pt18906在寄主上诱导的活性氧分析
利用植物组织O2-能被捕获剂NBT进行原位捕获和显色，蓝色的位置代表存在O2-。统计结果显示，与对照MgCl2、EtHan和pEDV6相比，Pt18906激发的活性氧面积更大（图9），并且在效应蛋白注射后活性氧先升高，在注射10 min达到最高，之后降低，表明效应蛋白Pt18906能够引起TcLr27+31活性氧的迸发，触发了寄主的防御反应。

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图9 在TcLr27+31中瞬时表达Pt18906引起活性氧的迸发
Fig.9 Expression of Pt18906 in TcLr27+31 causes ROS bursts

A：注射Pt18906 后不同时间点的活性氧情况ROS at different time points after injection of Pt18906；B：量化注射Pt18906后不同时间点的活性氧情况The ROS at different time points after injection of Pt18906

3 讨论
锈菌作为活体营养寄生真菌可通过形成吸器侵入寄主细胞，参与寄主与病原物之间营养物质和信息的交换与传递。国内外学者已在不同锈菌中鉴定出了多种效应蛋白，这些已鉴定的效应蛋白均为编码未知功能的分泌蛋白，多无明显功能结构域及明确的生化功能。本研究对小麦叶锈菌Pt18906进行序列和结构分析，初步确定其为候选效应蛋白，其可抑制Bax和INF1诱导的细胞坏死。目前对于病原菌效应蛋白序列特征的定义都是基于已经发现的效应蛋白的一些特征来总结的，但是由于病原菌效应蛋白本身的多样性与不保守性，如果根据这些特征来进行效应蛋白的筛选会存在一定的局限性。大麦白粉病菌（Blumeria graminis f.sp.hordei，Bgh）中的无毒基因Avra10和Avrk1[48]编码的均为非分泌型蛋白，如果根据大部分效应蛋白为分泌蛋白的特征来定义效应蛋白，会丢失一些非分泌型的效应蛋白。本研究中效应蛋白Pt18906信号肽无分泌功能，为少数的非分泌型效应蛋白，在胞内起作用。对于非分泌型效应蛋白是如何运输到胞内起作用的，有待于进一步研究。另外该效应蛋白的三级结构含有较高的无规则卷曲（69.96%），推测其可能为具有识别功能的、对其他蛋白质特异的功能性蛋白。Pt18906在24 h表达量最高，此时间点为叶锈菌形成吸器母细胞的关键点，也是寄主有效抵抗病原物的一个关键点，因此推测Pt18906可能在叶锈菌与寄主植物侵入过程中被寄主识别。

关于效应蛋白发挥功能的结构域，不同的效应蛋白存在差异，但多在N端起作用。在对小麦条锈菌的研究中发现，通过氨基酸缺失的方法检测效应蛋白的毒性区域，其中小麦条锈菌Pst82、Pst148、Pst227、Pst8853和Pst9302成熟蛋白N末端10—20位、23位、20—40位、20—30位和20—40位的氨基酸序列分别对其毒性功能具有重要作用[36]。本研究中，同样通过氨基酸逐步确实法对效应蛋白Pt18906进行功能区域验证，发现在N末端缺失28—47位的20个氨基酸的突变体无抑制坏死功能，表明28—47位的AEVQRHAFSRRGKENDKPPP氨基酸序列对Pt18906发挥功能具有重要作用。

植物的免疫机制主要由PTI和ETI两层防御体系构成。季森等[41]利用细菌三型分泌系统将HASP2在小麦中过表达，发现其可以抑制寄主PTI相关胼胝质的积累，同时对HASP2过表达的小麦接种无毒性菌系CYR23后，发现HASP2可以抑制寄主ETI相关活性氧积累和减少细胞坏死面积，推测小麦条锈菌效应蛋白HASP2抑制寄主的免疫反应；王力坤等[42]研究表明，小麦条锈菌效应子Pst30抑制植物的胼胝质和活性氧积累，推测Pst30可抑制寄主植物的PTI和ETI，从而促进自身的侵染；陈增菊等[43]研究发现，小麦条锈菌效应蛋白Hasp58抑制荧光假单胞菌引起的胼胝质积累和活性氧的迸发，推测Hasp58同样可以抑制寄主植物的PTI和ETI，并促进自身的侵染。本试验通过细菌三型分泌系统在TcLr27+31上表达效应蛋白Pt18906，发现Pt18906激发了TcLr27+31胼胝质的积累，且该效应蛋白同样可造成活性氧的积累，进而造成O2-的迸发，说明Pt18906触发了寄主的防御反应PTI和ETI，表明近等基因系TcLr27+31在抵抗小麦叶锈菌的侵染过程中行使多种防御系统。另外，胼胝质积累随效应因子激发时间的延长而增加，由图8可见注射效应因子72 h的积累量显著高于12 h的积累量。而活性氧迸发较胼胝质积累更早发生，是因为在防御反应PTI的过程中也会有活性氧的产生，并且活性氧是体内一类氧的单电子还原产物，是电子在未能传递到末端氧化酶之前漏出呼吸链并消耗大约2%的氧生成的，包括氧的电子还原产物超氧阴离子（O2-）、H2O2、羟基自由基（·OH）以及NO等。文中使用的NBT是用来检测O2-的，O2-极其不稳定，会与H2O结合形成H2O2，在小麦上表达效应蛋白5 d后观察到H2O2（图7）。

在小麦条锈菌效应蛋白的研究中发现PstGSRE1定位于细胞质和细胞核，在胞内起作用，能够抑制寄主活性氧积累，小麦锌指结构转录因子TaLOL2是其靶标蛋白，TaLOL2能够促进小麦活性氧积累，是小麦抗条锈病的正向调控因子，而PstGSRE1通过干扰并阻止TaLOL2进核，抑制寄主免疫反应从而利于病菌的侵染[44]。本研究通过亚细胞定位分析发现Pt18906在细胞内起作用，但其作用靶标及作用方式还有待于进一步研究。

SEGOVIA等[47]发现Pt3和Pt27可分别在含有抗性基因Lr9或Lr24，Lr26的近等基因系表现出对GUS的抑制作用，推测具有对Lr9或Lr24，Lr26的无毒性。本研究发现，效应蛋白Pt18906可促进寄主细胞中胼胝质的积累，在近等基因系TcLr27+31上引起活性氧的迸发，并激发坏死反应，表明Pt18906在TcLr27+31上具有无毒作用，并能够触发寄主TcLr27+31的防御反应PTI和ETI。本研究利用全套的抗叶锈病近等基因系进行效应蛋白相应功能的分析，发现该效应蛋白能够在TcLr27+31和TcLr42上诱导产生坏死反应，在其他测试的进等基因系上无诱导坏死反应，而且缺少近等基因系TcLr27和TcLr31，因此，说明该效应蛋白与Lr27或Lr31，Lr42上发生了直接或间接的作用，但不能确定该基因对应的抗病基因是Lr27或Lr31。本研究只涉及了Pt18906在TcLr27+31上引起的胼胝质以及活性氧情况，而在TcLr42上未进行相关试验，有待于后续完成。

4 结论
效应蛋白Pt18906是一个具有223个氨基酸的小分子蛋白，作用于细胞内，信号肽不具有分泌活性，在与小麦互作的初期发生显著的上调反应。能够有效抑制Bax和INF1激发的细胞程序性死亡，其28—47位氨基酸对其毒性功能具有重要作用。能够激发小麦TcLr27+31胼胝质的积累和活性氧的迸发，TcLr27+31对Pt18906表现免疫反应。

References

[1] RATTU A R, AHMAD I, FAYYAZ M, AKHTAR M A, IRFAN-ULHAQUE, ZAKRIA M, AFZAL S N.Virulence analysis of Puccinia triticinia cause of leaf rust of wheat.Pakistan Journal of Botany, 2009,41(4): 1957-1964.

[2] ROELFS A P, SINGH R P, SAARI E E.Rust Disease of Wheat:Concepts and Methods of Disease Management.Mexico, DF:CMMYT, 1992: 7-14.

[3] KOLMER J A.Genetics of resistance to wheat leaf rust.Annual Review of Phytopathology, 1996, 34: 435-455.

[4] RAMACHANDRAN S R, YIN C T, KUD J, TANAKA K,MAHONEY A K, XIAO F M, HULBERT S H.Effectors from wheat rust fungi suppress multiple plant defense responses.Phytopathology,2017, 107(1): 75-83.

[5] 刘冰玉, 蔡宝珊, 高成江.泛素化调控抗病毒天然免疫的研究进展.中国科学: 生命科学, 2018, 48(11): 1152-1161.LIU B Y, CAI B S, GAO C J.Regulation of innate antiviral immunity by protein ubiquitination.Scientia Sinica Vitae, 2018, 48(11):1152-1161.(in Chinese)

[6] SCHORNACK S, BALLVORA A, GURLEBECK D, PEART J,GANAL M, BAKER B, BONAS U, LAHAYE T.The tomato resistance protein Bs4 is a predicted non-nuclear TIR-NB-LRR protein that mediates defense responses to severely truncated derivatives of AvrBs4 and overexpressed AvrBs3.The Plant Journal,2004, 37(1): 46-60.

[7] THOMMA B P H J, NUMBERGER T, JOOSTEN M H A J.Of PAMPs and effectors: The Blurred PTI-ETI dichotomy.The Plant Cell,2011, 23(1): 4-15.

[8] 李伟兰, 戎伟, 何朝族.一个推测的野油菜黄单胞菌Ⅲ型分泌效应子效应子基因XopXccP对寄主植物的致病性分析.植物病理学报,2014, 44(2): 173-179.LI W L, RONG W, HE C Z.XopXccP, a putative type Ⅲ effector gene of Xanthomonas campestris pv.campestris, is required for pathogenicity on host plants.Acta Phytopathologica Sinica, 2014,44(2): 173-179.(in Chinese)

[9] CHASTAGNER P, ISRAEL A, BROU C.AIP4/Itch regulates notch receptor degradation in the absence of ligand.PLoS ONE, 2008, 3(7):e2735.

[10] ONG L E, INNES R W.AvrB mutants lose both virulence and avirulence activities on soybean and Arabidopsis.Molecular Microbiology,2006, 60(4): 951-962.

[11] LI L, LI M, YU L, ZHOU Z, LIANG X, LIU Z, CAI G, GAO L,ZHANG X, WANG Y, CHEN S, ZHOU J M.The FLS2-associated kinase BIK1 directly phosphorylates the NADPH oxidase RbohD to control plant immunity.Cell Host and Microbe, 2014, 15(3): 329-338.

[12] LU D, WU S, GAO X, ZHANG Y, SHAN L, HE P.A receptor-like cytoplasmic kinase, BIK1, associates with a flagellin receptor complex to initiate plant innate immunity.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, 107(1):496-501.

[13] MONAGHAN J, MATSCHI S, SHORINOLA O, ROVENICH H,MATEI A, SEGONZAC C, MALINOVSKY F G, RATHJEN J P,MACLEAN D, ROMEIS T, ZIPFEL C.The calcium-dependent protein kinase CPK28 buffers plant immunity and regulates BIK1 turnover.Cell Host and Microbe, 2014, 16(5): 605-615.

[14] ZHANG J, LI W, XIANG T, LIU Z, LALUK K, DING X, ZOU Y,GAO M, ZHANG X, CHEN S, MENGISTE T, ZHANG Y, ZHOU J M.Receptor-like cytoplasmic kinases integrate signaling from multiple plant immune receptors and are targeted by a Pseudomonas syringae effector.Cell Host and Microbe, 2010, 7(4): 290-301.

[15] 白志英, 王冬梅, 侯春燕, 刘娜, 韩胜芬, 马利华.小麦叶锈菌侵染过程的显微和超微结构.细胞生物学杂志, 2003, 25(6): 393-397.BAI Z Y, WANG D M, HOU C Y, LIU N, HAN S F, MA L H.Microstructure and ultrastructure infected by wheat rust fungus.Chinese Journal of Cell Biology, 2003, 25(6): 393-397.(in Chinese)

[16] SPERSCHNEIDER J, GARDINER D M, DODDS P N, TINI F,COVARELLI L, SINGH K B, MANNERS J M, TAYLOR J M.EffectorP: Predicting fungal effector proteins from secretomes using machine learning.New Phytologist, 2016, 210(2): 743-761.

[17] TAKKEN F L, GOVERSE A.How to build a pathogen detector:Structural basis of NB-LRR function.Current Opinion in Plant Biology, 2012, 15(4): 375-384.

[18] JAROSE A M, BURDON J J.Host-pathogen interactions in natural populations of Linum marginale and Melampsora lini: II.Local and regional variation in patterns of resistance and racial structure.Evolution, 1991, 45(7): 1618-1627.

[19] DUPLESSIS S, CUOMO C A, LIN Y C, AERTS A, TISSERANT E,VENEAULT-FOURREY C, JOLY D L, HACQUARD S, AMSELEM J, CANTAREL B L, et al.Obligate biotrophy features unraveled by the genomic analysis of rust fungi.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, 108(22):9166-9171.

[20] STASKAWICZ B J, MUDGETT M B, DANGL J L, GALAN J E.Common and contrasting themes of plant and animal diseases.Science,2001, 292(5525): 2285-2289.

[21] CUI H, TSUDA K, PARKER J E.Effector-triggered immunity: From pathogen perception to robust defense.Annual Review of Plant Biology, 2015, 66: 487-511.

[22] BRUCE M, NEUGEBAUER K A, JOLY D L, MIGEON P, CUOMO C A, WANG S, AKHUNOV E, BAKKEREN G, KOLMER J A,FELLERS J P.Using transcription of six Puccinia triticina races to identify the effective secretome during infection of wheat.Frontiers in Plant Science, 2014, 4: Article 520.

[23] HU Z, YAN C, LIU P, HUANG Z, MA R, ZHANG C, WANG R,ZHANG Y, MARTINON F, MIAO D, DENG H, WANG J, CHANG J,CHAI J.Crystal structure of NLRC4 reveals its autoinhibition mechanism.Science, 2013, 341(6142): 172-175.

[24] CATANZARITI A M, DODDS P N, LAWRENCE G J, AYLIFFE M A,ELLIS J G.Haustorially expressed secreted proteins from flax rust are highly enriched for avirulence elicitors.The Plant Cell, 2006, 18(1):243-256.

[25] 杨作民, 解超杰, 孙其信.后条中32时期我国小麦条锈抗源之现状.作物学报, 2003, 29(2): 161-168.YANG Z M, XIE C J, SUN Q X.Situation of the sources of stripe rust resistance of wheat in the post-CY32 era in China.Acta Agronomica Sinica, 2003, 29(2): 161-168.(in Chinese)

[26] CUOMO C A, BAKKEREN G, KHALIL H B, PANWAR V, JOLY D,LINNING R, SAKTHIKUMAR S, SONG X, ADICONIS X, FAN L,et al.Comparative analysis highlights variable genome content of wheat rusts and divergence of the mating loci.G3: Genes, Genomes,Genetics, 2017, 7(2): 361-376.

[27] CATANZARITI A M, DODDS P N, VE T, KOBE B, ELLIS J G,STASKAWICZL B J.The AvrM effector from flax rust has a structured c-terminal domain and interacts directly with the M resistance protein.Molecular Plant-Microbe Interactions, 2010, 23(1):49-57.

[28] DODDS P N, LAWRENCE G J, CATANZARITI A M, AYLIFFE M A,ELLIS J G.The Melampsora lini AvrL567 avirulence genes are expressed in haustoria and their products are recognized inside plant cells. The Plant Cell, 2004, 16(3): 755-768.

[29] GIRALDO M C, VALENT B.Filamentous plant pathogen effectors in action.Nature Reviews Microbiology, 2013, 11: 800-814.

[30] VANDER MERVE M M, KINNEAR M W, BARRETT L G, DODDS P N, ERICSON L, THRALL P H, BURDON J J.Positive selection in AvrP4 avirulence gene homologues across the genus Melampsora.Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, 2009,276(1669): 2913-2922.

[31] ANDERSON C, KHAN M A, CATANZARITI A M, JACK C A,NEMRI A, LAWRENCE G J, UPADHYAYA N M, HARDHAM A R,ELLIS J G, DODDS P N, JONES D A.Genome analysis and avirulence gene cloning using a high-density RADseq linkage map of the flax rust fungus, Melampsora lini.BMC Genomics, 2016, 17(1):667.

[32] OH M, RHA G B, YOON J H, SUNWOO Y, HONG S H, PARK S D.RTP1, a rat homologue of adenovims E1A-associated Protein BS69,interacts with DNA topoisomerase II.Korean Journal of Biological Sciences, 2002, 6(3): 277-282.

[33] PETER B, JOLY D L, DUPLEESSIS S.Effector proteins of rust fungi.Frontiers in Plant Science, 2014, 5: Article 416.

[34] SALCEDO A, RUTTER W, WANG S, AKHUNOVA A, BOLUS S,CHAO S, ANDERSON N, DE SOTO M F, ROUSE M, SZABO L,BOWDEN R L, DUBCOVSKY J, AKHUNOVL E.Variation in the AvrSr35 gene determines Sr35 resistance against wheat stem rust race Ug99.Science, 2017, 358(6370): 1604-1606.

[35] CHEN J, UPADHYAYA N M, ORTIZ D, SPERSCHNEIDER J, LI F,BOUTON C, BREEN S, DONG C, XU B, ZHANG X X, et al.Loss of AvrSr50 by somatic exchange in stem rust leads to virulence for Sr50 resistance in wheat.Science, 2017, 358(6370): 1607-1610.

[36] 汤春蕾.条锈菌与小麦互作中效应蛋白及诱导寄主细胞坏死基因的鉴定与功能分析[D].杨凌: 西北农林科技大学, 2013.TANG C L.Characterization and function analyses of host cell death inducing genes in wheat and Puccinia striiformis interactions[D].Yangling: Northwest A&F University, 2013.(in Chinese)

[37] 宋平, 谭成龙, 郭嘉, 戚拓, 刘芃, 郭军.小麦条锈菌效应蛋白基因PSTG_23616的时空表达特征分析.西北农业学报, 2016, 25(9):1279-1288.SONG P, TAN C L, GUO J, QI T, LIU P, GUO J.Spatial and temporal expression pattern of effector protein gene PSTG_23616 in Puccinia striiformis f.sp.tritici.Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica,2016, 25(9): 1279-1288.(in Chinese)

[38] CHENG Y L, WU K, YAO J N, LI S M, WANG X J, HUANG L L,KANG Z S.PSTha5a23, a candidate effector from the obligate biotrophic pathogen Puccinia striiformis f.sp.tritici, is involved in plant defense suppression and rust pathogenicity.Environmental Microbiology, 2017, 19(5): 1717-1729.

[39] CANTU D, SEGOVIA V, MACLEAN D, BAYLES R, CHEN X M,KAMOUN S, DUBCOVSKY J, SAUNDERS D G, UAUY C.Genome analyses of the wheat yellow (stripe) rust pathogen Puccinia striiformis f.sp.tritici reveal polymorphic and haustorial expressed secreted proteins as candidate effectors.BMC Genomics, 2013, 14:270.

[40] LIU C H, PEDERSEN C, SCHULTZ-LARSEN T, AGUILAR G B,MADRIZ-ORDENANA K, HOVMOLLER M S, THORDALCHRISTENSEN H.The stripe rust fungal effector PEC6 suppresses pattern-triggered immunity in a host species-independent manner and interacts with adenosine kinases.New Phytologist, 2016, doi:10.1111/nph.14034.

[41] 季森, 赵梦鑫, 徐静华, 汤春蕾, 康振生, 王晓杰.小麦条锈菌效应蛋白HASP2抑制寄主免疫反应.植物病理学报, 2019, 49(3):326-333.JI S, ZHAO M X, XU J H, TANG C L, KANG Z S, WANG X J.Wheat stripe rust effector HASP2 inhibits host immune response.Acta Phytopathologica Sinica, 2019, 49(3): 326-333.(in Chinese)

[42] 王力坤, 樊昕, 汤春蕾, 康振生, 王晓杰.条锈菌效应子Pst30抑制植物的胼胝质和活性氧积累.植物病理学报, 2020, 50(2):155-163.WANG L K, FAN X, TANG C L, KANG Z S, WANG X J.Effector Pst30 from Puccinia striiformis f.sp.tritici inhibits callose deposition and ROS accumulation in plant.Acta Phytopathologica Sinica, 2020,50(2): 155-163.(in Chinese)

[43] 陈增菊, 王婷, 汤春蕾, 赵梦鑫, 康振生, 王晓杰.小麦条锈菌效应蛋白Hasp58抑制植物免疫的功能分析.麦类作物学报, 2019,39(2): 239-246.CHEN Z J, WANG T, TANG C L, ZHAO M X, KANG Z S, WANG X J.Functional analysis of Puccinia striiformis f.sp.tritici effector Hasp58 inhibits plant immunity.Journal of Triticeae Crops, 2019,39(2): 239-246.(in Chinese)

[44] QI T, GUO J, LIU P, HE F, WAN C, ISLAM M A, TYLER B M,KANG Z S, GUO J.Stripe rust effector PstGSRE1 disrupts nuclear localization of ROS-promoting transcription factor TaLOL2 to defeat ROS-induced defense in wheat.Molecular Plant, 2019, 12(12):1624-1638.

[45] XU Q, TANG C L, WANG X D, SUN S T, ZHAO J R, KANG Z S,WANG X J.An effector protein of the wheat stripe rust fungus targets chloroplasts and suppresses chloroplast function.Nature Communications,2019, 10: 5517.

[46] YANG Q, HUAI B, LU Y, CAI K, GUO J, ZHU X, KANG Z H, GUO J.A stripe rust effector Pst18363 targets and stabilises TaNUDX23 that promotes stripe rust disease.New Phytologist, 2020, 225(2):880-895.

[47] SEGOVIA V, BRUCE M, JESSICA L, RUPP S, HUANG L,BAKKEREN G, TRICK H N, FELLERS J P.Two small secreted proteins from Puccinia triticina induce reduction of β-glucoronidase transient expression in wheat isolines containing Lr9, Lr24, and Lr26.Canadian Journal of Plant Pathology, 2016, 38(1): 91-102.

[48] RIDOUT C J, SKAMNIOTI P, PORRITT O, SACRISTAN S, JONES J D G, BROWN J K M.Multiple avirulence paralogues in cereal powdery mildew fungi may contribute to parasite fitness and defeat of plant resistance.The Plant Cell, 2006, 18(9): 2402-2414.

Puccinia triticina Effector Protein Pt18906 Triggered Two-Layer Defense Reaction in TcLr27+31

QI Yue1, LÜ JunYuan1, ZHANG Yue1, WEI Jie1，ZHANG Na1, YANG WenXiang1, LIU DaQun2
(1Wheat Leaf Rust Research Center, College of Plant Protection, Agricultural University of Hebei/Technological Innovation Center for Biological Control of Plant Diseases and Insect Pests of Hebei Province/National Engineering Research Center for Agriculture in Northern Mountainous Areas, Baoding 071001, Hebei; 2Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)

Abstract:【Objective】Wheat leaf rust caused by Puccinia triticina (Pt) is one of the main diseases affecting wheat production.In the process of interaction between wheat and Pt, the Pt will secrete some effector proteins to the host cells to regulate the host and play a virulent function.The objective of this study is to carry out the research on Pt effector proteins, explore the pathogenic mechanism of Pt, and to provide a basis for the continuous prevention and control of diseases.【Method】The cDNA of Pt 13-5-72 interacting with susceptible variety Thatcher was used as template to amplify effector protein Pt18906.Sequence features of Pt18906 were analyzed using SignalP 4.1, TargetP 1.1, TMHMM 2.0 and EffectorP 2.0 software.The online software Swiss-Model was used to predict the tertiary structure of Pt18906.The secondary structure of Pt18906 was predicted by online software SOPMA.The expression pattern of Pt18906 was analyzed by RT-qPCR.The verification that Pt18906 inhibited Bax and INF1-induced programmed cell death (PCD) was conducted using Nicotiana benthamiana heterogeneous expression system.The secretion function of Pt18906 signal peptide was verified by the yeast system.The deletion mutation of Pt18906 was used to identify the virulence function motif.Subcellular localization of Pt18906 was analyzed using transient expression of Pt18906-GFP in N.benthamiana cells.Transient expression technology was used to carry out the avirulent function of Pt18906 on a full set of near-isogenic lines that did not contain disease resistance genes and contained different disease resistance genes with Thatcher as the background.The transient transformation of wheat mediated by the TTSS (Type III secretion system) was used to analyze the activity of regulating the host defense response of Pt18906.【Result】A Pt effector Pt18906, significantly upregulated during the interaction between Pt and Thatcher,was obtained from the transcriptome library of interaction between Pt and Thatcher.The full-length ORF sequence with 672 bp was amplified in the cDNA of wheat leaves inoculated by Pt strain 13-5-72.The effector protein lacks known functional domains and motifs.Its working environment is alkaline.Pt18906 could inhibit the PCD induced by Bax from mice and INF1 from Oomycetes by transient expression in N.benthamiana cells, which indicates that the effector protein has virulent function.By constructing deletion mutants, it is clear that the 28-47 amino acids have an important role in its virulent function.The effector protein is located in the nucleus and cytoplasm, which indicates that it acts within the cells.Pt18906 could cause allergic necrosis in the disease-resistant varieties of single gene lines TcLr27+31 and TcLr42, indicating that the effector protein is avirulent.Pt18906 could cause the accumulation of reactive oxygen species (ROS) and callose in TcLr27+31 through transiently expressing using a bacterial type III secretion system.The callose increased gradually with the injection time, and ROS reached the highest level at 10 min after injection.【Conclusion】The main functional domain of Pt18906 is 28-47 amino acids.Pt18906 can trigger the two-layer defense reaction accompanied with the accumulation of callose in wheat TcLr27+31 and oxidative burst.

Key words: Puccinia triticina (Pt); wheat leaf rust; effector protein; callose; reactive oxygen species (ROS); pathogenicity;defense reaction