莲草直胸跳甲Halloween基因家族鉴定及表达分析

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莲草直胸跳甲Halloween基因家族鉴定及表达分析
刘亦然，张虹，靳继苏，周忠实，郭建英

（中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193）

摘要：【背景】莲草直胸跳甲（Agasicles hygrophila）是世界恶性入侵杂草空心莲子草（Alternanthera philoxeroides）的专一性生防天敌；莲草直胸跳甲种群动态呈季节性波动趋势，在我国湖南地区其夏季种群数量骤减，导致对空心莲子草的防控效果大大降低。而Halloween基因家族参与昆虫蜕皮激素的合成，影响昆虫生长和繁殖，进而对昆虫种群动态具有一定影响。【目的】揭示Halloween基因家族在莲草直胸跳甲不同发育时期和不同组织中的表达模式，为进一步探究Halloween基因家族在莲草直胸跳甲中的功能打下基础，进而为生防天敌的扩繁提供新思路。【方法】通过筛选莲草直胸跳甲卵巢转录组数据并结合生物信息学分析，找到并克隆其体内Halloween基因家族成员；使用NCBI在线分析其保守结构域，利用MEGA6.0对Halloween家族基因进行多序列比对并构建系统发育树；通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测各基因在莲草直胸跳甲不同发育时期（卵、幼虫、蛹、雌成虫）和雌成虫不同组织（头、胸、中肠、卵巢、脂肪体）中的表达水平。【结果】莲草直胸跳甲中存在 6个Halloween基因家族成员，分别为AhCYP302A1、AhCYP306A1、AhCYP307A1、AhCYP307A2、AhCYP314A1和AhCYP315A1；分析发现其均属于P450超家族且具有一定保守性，其中AhCYP306A1、AhCYP307A1、AhCYP307A2聚为一支，属于P450超家族中CYP2集团，AhCYP302A1、AhCYP314A1、AhCYP315A1聚为一支，属于线粒体集团；同时，AhCYP306A1、AhCYP314A1、AhCYP315A1在5′端存在跨膜区域。6个Halloween基因在莲草直胸跳甲整个生活史及各个组织中均有不同程度的表达。其中，AhCYP302A1在蛹期第6、7天表达量最高，成虫期表达量整体较低；AhCYP306A1在整个生活史中波动表达，以幼虫期第10天表达量最高；AhCYP307A2在末龄幼虫和化蛹初期的表达量较高；以上 3个基因在幼虫期和蛹期的表达量较高。AhCYP307A1在卵期高表达，此后各个时期呈波动下降；AhCYP314A1、AhCYP315A1在成虫期和卵期的表达量相对高于其他两个时期。在头、胸、中肠、卵巢、脂肪体5种组织中，除AhCYP307A1外，Halloween家族其他基因在卵巢中表达量均较高；AhCYP307A1在雌成虫头部显著性高表达。【结论】克隆并鉴定得到6个莲草直胸跳甲Halloween基因家族成员，其在不同发育时期及不同组织中的表达具有一定差异。通过其表达模式推测Halloween基因家族在莲草直胸跳甲幼虫发育及成虫繁殖过程中可能发挥重要作用，对其幼虫蜕皮与成虫卵巢发育均有一定影响。

关键词：莲草直胸跳甲；空心莲子草；蜕皮激素；Halloween基因家族；表达分析；实时荧光定量PCR

0 引言
【研究意义】空心莲子草（Alternanthera philoxeroides）为世界性恶性入侵杂草[1]，原产于南美洲，20世纪30年代传入我国[2]，对我国农林牧渔业产生了巨大危害[1,3-4]。莲草直胸跳甲（Agasicles hygrophila）隶属鞘翅目叶甲科，是空心莲子草的专食性天敌，其幼虫、成虫取食空心莲子草的叶片及嫩茎，控草效果较为显著[5]。蜕皮激素（ecdysone）参与调控昆虫中多种生命活动，如繁殖、滞育、先天免疫等[6-7]。Halloween基因家族是蜕皮激素合成通路中重要成员[8-10]，开展莲草直胸跳甲Halloween家族基因研究，将有助于了解蜕皮激素对昆虫的调控机制，为生防天敌的扩繁提供新思路。【前人研究进展】激素调节贯穿于昆虫的整个生活史，昆虫体内的激素包括保幼激素、蜕皮激素和脑激素等；其中，蜕皮激素最早由BUTENANDT等于 1954年报道[11]，可参与调节昆虫的蜕皮、变态、滞育和繁殖等生理过程[12]，具体包括调节昆虫的细胞增殖、分化与凋亡、蜕皮及变态、神经系统的重塑、滞育及免疫应答等多项生命活动[13]。蜕皮激素的主要活性物质为 20-羟基蜕皮酮（20E），其在昆虫的幼虫期由前胸腺产生，而在昆虫羽化为成虫后，其体内的蜕皮激素由卵巢合成，参与卵巢的发育与繁殖[14]。研究发现，在烟草天蛾（Manduca sexta）和黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）幼虫期蜕皮激素参与启动幼虫不同龄期之间的蜕皮及变态[15]；用 20E处理结扎的家蚕（Bombyx mori）雌蛹，血淋巴中卵黄原蛋白（Vg）含量明显提高，卵巢的发育速度明显加快[16]。在20E生物合成方面的突破性进展是细胞色素 P450超家族编码的Halloween基因家族的发现[17]。如已证实，在黑腹果蝇中 Halloween家族基因表达产物经过一系

列生化反应生成蜕皮激素；同时，当CYP302A1被敲除后，黑腹果蝇出现蜕皮激素滴度降低的现象[18]。此外，在家蚕化蛹前对其 Halloween基因家族成员CYP314A1进行干扰，出现家蚕不能正常化蛹以及雌蛾卵巢发育不正常的现象[19]。在植食性昆虫中，Halloween基因家族主要包括 CYP307（spook）、CYP306A1（phantom）、CYP302A1（disembodied）、CYP315A1（shadow）以及 CYP314A1（shade）[20]；其中，CYP307、CYP306A1、CYP302A1、CYP315A1通过一系列的生化反应参与合成无活性的蜕皮酮，最终由CYP314A1催化合成活性物质20E[20-21]。但不同物种中其体内Halloween基因家族存在一定差异，如瓦螨（Varroa destructor）和烟草天蛾中均只鉴别到3个 Halloween基因家族成员[22-23]。莲草直胸跳甲作为空心莲子草的生防天敌，我国于1987年从美国佛罗里达州引进该跳甲并在江苏、云南、四川和湖南等地释放[24]。田间调查发现，该跳甲成虫和幼虫的虫口密度越大，其控草速度越快，控草效果越显著[25]。【本研究切入点】目前，对于昆虫细胞色素 P450基因的研究主要集中在其对农药的抗药性以及对不利环境的抵抗等方面，迄今在莲草直胸跳甲中未有关于 P450基因参与蜕皮激素合成通路的报道，对其蜕皮激素合成通路中Halloween基因家族的数量、表达模式等尚不清楚。【拟解决的关键问题】田间调查表明，在我国湖南地区，莲草直胸跳甲的种群密度呈季节性波动趋势，夏季数量明显减少[26]，这是环境因素对其卵孵化、幼虫发育、蛹羽化和成虫繁殖影响的综合体现。由于蜕皮激素参与调节昆虫的蜕皮、变态、滞育和繁殖等生理过程[14]，本研究分析参与蜕皮激素合成的Halloween基因家族在莲草直胸跳甲中的表达模式，解析Halloween基因家族对莲草直胸跳甲种群动态的影响，为进一步应用 RNA干扰技术分析其基因功能打下基础，进而为探寻促增莲草直胸跳甲种群数量的方法提供新思路，从而更好地对入侵杂草空心莲子草进行生物防治。

1 材料与方法
1.1 供试植物
空心莲子草根茎于2018年6月采自福建省福州市福建省农业科学院植物保护研究所南通中试基地，携带至河北省廊坊市中国农业科学院植物保护研究所廊坊科研中试基地温室，在塑料盒（30 cm×30 cm×30 cm）中用营养土（黑土∶蛭石=1∶1）栽培，并采用扦插方式扩大栽种规模。空心莲子草茎秆达4—7节间长时用于试验。

1.2 供试昆虫
莲草直胸跳甲成虫于2018年10月采自湖南省长沙市湖南省农业科学院附近，携带至中国农业科学院植物保护研究所廊坊科研中试基地进行室内饲养，饲养温度为（25±1）℃，相对湿度为75%±5%，光周期为12L∶12D，连续饲养3代后用于试验。

1.3 样品采集
为测定Halloween基因在莲草直胸跳甲不同发育阶段的表达量，自产卵第1天起，每隔24 h逐日收集莲草直胸跳甲各个时期的样品，分别包括卵期第0—4天、幼虫第1—13天、蛹期第1—7天和成虫期第1—6、8、10天的雌虫。上述各天数的样品包括2—20个个体，3个生物学重复。

为测定Halloween基因在莲草直胸跳甲不同组织的表达量，将雌成虫在1×PBS磷酸缓冲液（pH 7.4）中进行解剖，分别取头、胸、中肠、卵巢以及脂肪体，每份组织从5—15个个体中收集，3个生物学重复。

收集的所有样品立即在液氮中冷冻，-80℃中保存备用。

1.4 总RNA提取及第一链cDNA合成
利用Trizol法提取莲草直胸跳甲不同发育时期以及各组织的总 RNA。采用超微量紫外分光光度计Nanophoto meter P330（Implen，Germany）和1%琼脂糖凝胶电泳鉴定 RNA的纯度和完整性。参照TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒说明书，RNA定量为1 μg，反转录合成第一链cDNA并于-20℃保存备用。

1.5 目的片段的扩增
将本实验室前期建立的莲草直胸跳甲转录组数据与NCBI库进行比对，得到莲草直胸跳甲中共有6个Halloween基因家族成员，分别为CYP302A1、CYP306A1、CYP307A1、CYP307A2、CYP314A1、CYP315A1，利用Primer Premier 5.0软件设计，Oligo软件分析引物，并由上海生工生物工程公司合成所需引物。以反转录得到的cDNA为模板，用表1中特异性引物进行PCR扩增。扩增体系：10×PCR buffer 2.5μL，dNTPs（2.5 mmol·L-1）0.5 μL，引物（10 μmol·μL-1）1 μL，Taq 酶 0.5 μL，cDNA 模板 0.5 μL，ddH2O 补至25 μL。反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，34个循环；72℃延伸10 min。产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，切取目的条带进行PCR产物回收，连接至PEASTT3载体并转化至大肠杆菌感受态细胞，得到阳性克隆后测序。

1.6 保守性分析与进化分析
通过在线分析软件Emboss Transeq将上述得到的核酸序列转换为氨基酸序列，后将其编码的氨基酸序列在NCBI中进行保守结构域预测以及Blastp分析，分别找到与 Halloween家族基因具有同源性的昆虫Halloween基因序列。使用MEGA6.0软件采用邻接法（neighbor-joining，NJ）进行1 000次重复计算后构建系统进化树。

1.7 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测目的基因的表达水平
根据扩增得到的目的基因设计特异性定量引物，同时选择在莲草直胸跳甲体内表达稳定的 β-actin作为内参基因（表2），并以上述提取的不同发育历期、不同组织的总RNA经反转录得到的cDNA为模板，利用qRT-PCR技术检测莲草直胸跳甲Halloween基因家族成员在不同组织以及不同发育阶段的表达变化。选取TransStart Tip Green qPCR SuperMix荧光定量试剂盒进行实时荧光定量。扩增体系：2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，Passive Reference Dye（50×）0.5 μL，引物（10 μmol·μL-1）0.5 μL，cDNA 1 μL，补充 RNase-free water至 20 μL，扩增程序采用两步法。

1.8 数据分析
利用2-ΔΔCT法对测定出的目的基因的相对表达量进行计算，计算公式：pagenumber_ebook=88,pagenumber_book=2012以该基因表达量最低的时期或组织作为对照，测定的基因表达量定为1。采用R version 3.5.1软件进行数据分析，同一基因在不同日龄间的表达量差异采用单因素方差分析（one-way ANOVA）的LSD法。

表1 用于克隆莲草直胸跳甲中Halloween基因的完整或部分ORF引物
Table 1 Complete or partial ORF primers for the cloning of the Halloween genes in A. hygrophila

pagenumber_ebook=88,pagenumber_book=2012
表2 用于检测莲草直胸跳甲中Halloween基因表达水平所用引物
Table 2 Primers used to detect the expression level of the Halloween genes in A. hygrophila

pagenumber_ebook=88,pagenumber_book=2012
2 结果
2.1 Halloween基因家族系统发育树分析
pagenumber_ebook=89,pagenumber_book=2013
图1 莲草直胸跳甲Halloween基因家族的结构域
Fig. 1 Domain architecture of A. hygrophila Halloween gene family

pagenumber_ebook=89,pagenumber_book=2013
图2 基于氨基酸序列构建的Halloween基因家族的系统进化树（邻接法）
Fig. 2 Phylogenetic tree of the Halloween gene family based on amino acid sequence (neighbor-joining)

基于前期得到的转录组数据并结合NCBI分析，在莲草直胸跳甲中共鉴定得到6个Halloween基因家族成员，设计引物（表 1）扩增得到其中间片段。为了明确莲草直胸跳甲中Halloween基因家族的进化情况，分别进行了结构域分析和系统进化树分析（图1、图 2）。通过分析Halloween家族基因氨基酸序列可以看出其均属于细胞色素P450超家族；AhCYP306A1、AhCYP314A1、AhCYP315A1在5′端存在跨膜区域。由图 2中可以看出，Halloween基因家族各基因可以分别与其他物种对应的基因聚为一支，形成6个分支，表明莲草直胸跳甲中 Halloween基因在漫长的进化过程中符合P450超家族的特点，即具有一定的保守性；6个Halloween基因分开聚成6支，表明它们可能分别存在不同的进化模式并各自具有不同的生物学功能。

2.2 Halloween基因家族时空表达分析
pagenumber_ebook=90,pagenumber_book=2014
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图3 莲草直胸跳甲Halloween基因家族在不同发育时期的相对表达量
Fig. 3 Relative expression of the Halloween gene family at different developmental stages of A. hygrophila

E：卵Egg；L：幼虫Larva；P：蛹Pupa；F：雌成虫Female adult。图中数据为平均值±标准误，柱上不同字母表示同一基因表达量在不同日龄间差异显著（P＜0.05，LSD法） All values are shown as the mean±SE. Different letters on the column indicate that the expression level of the same gene at different ages is significantly different at P＜0.05 by LSD test

2.2.1 不同时期 Halloween基因家族的表达分析由图3可知，Halloween基因家族成员在莲草直胸跳甲不同发育阶段的表达量差异较大。其中，AhCYP302A1的mRNA表达量在1日龄卵期较高，蛹期第6、7天最高，在成虫期急剧下降；AhCYP306A1的mRNA表达量呈波动趋势，在幼虫末龄及蛹前期表达量较高，其中以幼虫第10天表达量最高，显著高于其他时期的表达量；AhCYP307A1表达量在卵期第2、3天最高，之后呈波动下降趋势，在成虫期表达量趋于稳定；AhCYP307A2表达量整体呈波动趋势，其中以蛹期第2天表达量最高；AhCYP314A1在产卵初期的表达量显著高于其他时期，在卵开始发育后的整个生活史中，AhCYP314A1的表达量整体呈先波动下降后波动上升的趋势；AhCYP315A1在卵期第0天表达量最高，之后持续低表达直至雌虫羽化第2天，在雌成虫发育期间均高表达。

2.2.2 不同组织 Halloween基因家族的表达分析对Halloween基因家族6个基因在莲草直胸跳甲雌成虫头、胸、中肠、卵巢、脂肪体 5种组织中表达量的检测表明（图4），Halloween基因家族成员在中肠中表达量均极低。AhCYP302A1在胸部表达量最高，其次为头部和卵巢，但在这 3种组织中的表达量差异不显著。AhCYP306A1在卵巢和脂肪体内高表达，显著高于在头部和中肠的表达量。AhCYP307A1、AhCYP307A2分别在头部和卵巢表达量极高，在其余组织中表达量均较低。AhCYP314A1在卵巢中表达量最高，其次为脂肪体，在头部和中肠中表达量极低。AhCYP315A1在卵巢中表达量最高，在胸部和脂肪体中表达量相近，在中肠表达量最低，仅为在卵巢中表达量的千分之一。

3 讨论
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图4 莲草直胸跳甲Halloween基因家族在不同组织的相对表达量
Fig. 4 Relative expression of the Halloween gene family in different tissues of A. hygrophila

Head：头；Fatbody：脂肪体；Thorax：胸；Midgut：中肠；Ovary：卵巢。图中数据为平均值±标准误，柱上不同字母表示同一基因表达量在不同组织间差异显著（P＜0.05，LSD法）All values are shown as the mean±SE. Different letters on the column indicate that the expression level of the same gene in different tissues is significantly different at P＜0.05 by LSD test

莲草直胸跳甲是入侵杂草空心莲子草的专一性天敌，其成虫和幼虫均取食叶片，若在同一地点连续释放 2—3年，空心莲子草基本可得到控制[28]。目前，在我国湖南长沙等地空心莲子草一年四季均大量发生，而莲草直胸跳甲的种群动态却呈波动趋势。Halloween基因家族作为蜕皮激素合成通路中重要的一支，在昆虫生长发育和繁殖中具有重要作用，因此会对昆虫种群动态产生影响[29]。虽然已在多种昆虫中发现并鉴定Halloween家族基因，但目前尚无有关莲草直胸跳甲中该基因家族的研究报道。

本研究利用RT-PCR技术克隆获得莲草直胸跳甲蜕皮激素合成途径Halloween家族6个基因AhCYP302A1、AhCYP306A1、AhCYP307A1、AhCYP307A2、AhCYP314A1、AhCYP315A1的中间片段，其中 AhCYP306A1、AhCYP307A1、AhCYP307A2属于细胞色素P450超家族中 CYP2集团，AhCYP302A1、AhCYP314A1、AhCYP315A1属于线粒体集团。进化分析发现莲草直胸跳甲中Halloween基因家族具有一定的保守性，表明其在不同昆虫中可能具有相似的功能；但在不同昆虫中Halloween基因家族不同，有些酶在昆虫进化过程中已被消除、复制或发生改变；如CYP307家族中的spot在鳞翅目昆虫以及果蝇科中不存在，但在冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）和埃及伊蚊（Aedes aegypti）中检测到此基因[12]；此外，在莲草直胸跳甲中发现的 CYP307A2，在家蚕以及烟草天蛾中却不存在[30]，表明蜕皮激素的合成路径在不同昆虫中存在物种特异性和进化差异。

蜕皮激素可在昆虫整个生活史中表达[31]。本研究采用实时荧光定量PCR技术测定了Halloween基因在莲草直胸跳甲不同虫态和雌成虫不同组织中的表达量。结果发现，Halloween基因在莲草直胸跳甲各虫态均有表达，这与家蚕中的表达模式相似[19]，表明Halloween基因家族对莲草直胸跳甲整个生活史均有影响。在莲草直胸跳甲中AhCYP302A1、AhCYP306A1、AhCYP307A2在幼虫以及蛹期表达量相对卵期、成虫期较高，表明三者可能主要参与了莲草直胸跳甲的蜕皮过程；其中，AhCYP306A1、AhCYP307A2在末龄幼虫及化蛹初期的表达量显著上调可能为其蜕皮与变态化蛹作准备。AhCYP307A1、AhCYP314A1、AhCYP315A1在成虫以及卵期表达量相对较高，三者可能主要与莲草直胸跳甲的卵巢发育、卵发育等繁殖过程有关；AhCYP307A1在卵期第2、3天高表达以及AhCYP302A1在卵期第1天高表达的模式，推测其可能参与了莲草直胸跳甲卵期的胚胎发育过程，这与黑腹果蝇中缺陷CYP302A1（Dib）以及CYP307A1（Spo）时胚胎发育不正常的现象相符[18]。莲草直胸跳甲Halloween基因家族中的6个成员在同一发育时期、同一组织中表达存在差异，推测其可能在莲草直胸跳甲中所行使的功能不同。如对白背飞虱（Sogatella furcifera）中若虫Halloween基因时空表达分析表明，CYP307A1（Spo）在其2—4龄均有表达，其中在4龄以胸部表达量最高；给白背飞虱饲喂dsSpo后，若虫发育显著延迟，其中24%的若虫停留在3龄[32]。在不同组织中，莲草直胸跳甲中Halloween基因家族除AhCYP307A1外大多在卵巢中高表达，这与NIWA等报道的类固醇类激素参与调节蜕皮动物成虫阶段的生殖过程（如种系发育、先天发育等）[12]以及成虫蜕皮激素的初级来源为卵巢相符[33-34]。昆虫头部作为感知嗅觉、触觉、听觉的部位，AhCYP307A1在莲草直胸跳甲头部的特异性高表达是否表明其与头部行使这些功能有关还有待进一步验证。同样值得关注的是，在一些非内分泌的组织中，如中肠，也检测到Halloween基因的表达，这些组织是否可以作为原发性或继发性合成蜕皮激素的部位有待进一步研究。

4 结论
克隆并鉴定得到莲草直胸跳甲中6个Halloween基因家族成员，分析发现其均属于 P450超家族且具有一定保守性。实时荧光定量PCR结果表明，莲草直胸跳甲6个Halloween基因家族成员的表达在不同发育时期存在差异，但大多在卵巢中高表达；表明其在不同发育时期及不同组织中可能具有不同的功能，根据表达模式推测可能对莲草直胸跳甲的蜕皮与繁殖具有一定影响。

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Identification and Expression Analysis of the Halloween Gene Family in Agasicles hygrophila

LIU YiRan, ZHANG Hong, JIN JiSu, ZHOU ZhongShi, GUO JianYing
(State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193)

Abstract:【Background】Agasicles hygrophila is an effective host-specific biological control agent for the worldwide malignant invasive weed Alternanthera philoxeroides. The population dynamics of A. hygrophila fluctuates during the year. In Hunan Province of China, the population of A. hygrophila decreases dramatically in summer leading to a significant reduction in the control of A.philoxeroides. The Halloween gene family is involved in the synthesis of ecdysone, which affects the growth and reproduction of insects, and then has a certain effect on population dynamics.【Objective】The objective of this study is to reveal the expression patterns of the Halloween gene family at different developmental stages and in different tissues of A. hygrophila, and to provide a theoretical basis for further exploring the roles of Halloween gene family in A. hygrophila and a new idea for the propagation of biological prevention means.【Method】The ovarian transcriptome data were screened with the combination of bioinformatics analysis and Halloween family genes were cloned. Conserved domains were analyzed through NCBI, MEGA6.0 was used for multiple sequence alignment and phylogenetic tree was constructed. Meanwhile, the transcript levels of the six Halloween family genes in A.hygrophila at different developmental stages (egg, larva, pupa, female adult) and in different tissues (head, thorax, midgut, ovary,fatbody) were analyzed by qRT-PCR.【Result】Six members of the Halloween gene family were identified and cloned, namely AhCYP302A1, AhCYP306A1, AhCYP307A1, AhCYP307A2, AhCYP314A1 and AhCYP315A1, respectively. All of them belonged to the P450 superfamily and had certain conservatism. Among them, AhCYP306A1, AhCYP307A1, AhCYP307A2 were grouped into CYP2 group and the other three genes belonged to mitochondrial group. Meanwhile, all of AhCYP306A1, AhCYP314A1,AhCYP315A1 had one transmembrane region at the 5′ end. The six Halloween genes were expressed with different levels at different developmental stages and in different tissues of A. hygrophila. The expression level of AhCYP302A1 was the highest on the 6th to 7th day of pupae stage, but it was lower at the adult stage. The expression level of AhCYP306A1 fluctuated throughout the life cycle of A. hygrophila and it was the highest on the 10th day of larvae stage. Higher expressions of AhCYP307A2 were detected at the late larvae and early pupae stages of A. hygrophila. In brief, these three genes were highly expressed at larvae and pupae stages of A.hygrophila. AhCYP307A1 was highly expressed at the egg stage, and its expression showed fluctuation and decline in subsequent developmental stages. While the expression levels of AhCYP314A1 and AhCYP315A1 were higher in adults and eggs than those in larvae and pupae. Among head, thorax, midgut, ovary and fatbody of A. hygrophila, most of the six Halloween genes were highly expressed in the ovary except AhCYP307A1. AhCYP307A1 had significantly high expression in the head of female adults.【Conclusion】Six Halloween genes were cloned in A. hygrophila, and their expression levels differed at different developmental stages and in different tissues of the insect. By comparing their expression patterns, it is speculated that the Halloween gene family may play important roles in the larval development and adult reproduction of A. hygrophila by affecting its molting and ovary development.

Key words: Agasicles hygrophila; Alternanthera philoxeroides; ecdysone; Halloween gene family; expression analysis; qRT-PCR

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：pagenumber_ebook=85,pagenumber_book=2009

收稿日期：2019-09-27；接受日期：2019-10-29

基金项目：国家自然科学基金面上项目（31572068）、国家科技支撑计划（2015BAD08B03）

联系方式：刘亦然，E-mail：liuyiran0907@163.com。

通信作者郭建英，E-mail：guojianying@caas.cn

（责任编辑 岳梅）