基于RNA-seq 数据的栽培种花生SSR 位点鉴定和标记开发

奥鹏网院作业

基于RNA-seq 数据的栽培种花生SSR 位点鉴定和标记开发
徐志军1，赵胜2，徐磊1，胡小文1，安东升1，刘洋1

（1 中国热带农业科学院湛江实验站/广东省旱作节水农业工程技术研发中心，广东湛江 524013；；2 中国农业科学院农业基因组研究所，广东深圳 518120）

摘要：【目的】鉴定花生RNA-seq 数据中的SSR 位点，明确转录组中SSR 位点的分布和结构特点，开发与花生基因相关联的SSR 标记，为花生重要功能基因的挖掘、等位变异研究和分子标记辅助育种奠定基础。【方法】根据栽培种花生全生育期中22种不同类型的组织RNA-Seq数据，使用MISA软件分析SSR位点分布及特征，采用Primer 3 设计基因关联的SSR 引物，并利用电子PCR 软件对引物的质量进行检测，随机合成38 对引物，进行多态性检测。【结果】从52 280 条转录本中共鉴定19 143 个SSR 位点，分布于14 084 条转录本，发生频率为26.94%。重复单元类型为单核苷酸—五核苷酸，以单核苷酸和三核苷酸为重复单元的SSR 位点数最多，分别占位点总数的39.24%和38.40%。各重复单元优势基序类型分别为A/T、AG/CT、AAG/CTT、AAAG/CTTT 和AACAC/GTGTT，占所在重复单元中的比例分别为97.62%、72.01%、30.96%、24.59%和16.67%。重复单元的重复次数为5—47 次，单个SSR 位点的长度的分布范围为10—47 bp，基序长度主要集中在10—14 bp；复合SSR 位点的长度范围为21—249 bp，以31—40 bp 为主。鉴定的SSR 位点中共有13 477 个SSR 位点可以进行引物设计，其中5 020 条转录本序列对应到特定的基因，共包含5 859 个可进行引物设计的SSR 位点，这些SSR 位点在A 基因组和B 基因组共20 条染色体上不均匀分布，其中B03 染色体上SSR 位点最多，为484 个。对特定基因SSR 引物进行电子PCR 检测，在A.duranensis、A.ipaensis、A.hypogaea 基因组中有效扩增位点分别为4 468、4 929 和10 188 个，有效引物数分别为3 968（67.74%）、4 232（72.25%）和5 174（88.33%）对，在A. hypogaea 基因组中，SSR 引物扩增位点主要以2 个位点为主，其中，有1 477 对引物单位点扩增。根据SSR 引物扩增位点在栽培种花生基因组中的位置信息绘制了SSR位点的物理图谱。在38 对SSR 引物中，共有35 对（92.1%）SSR 引物可以扩增出清晰的条带，其中，有11 对（28.9%）SSR 引物在2 个品种间扩增出差异条带。【结论】鉴定了13 477 个可进行标记开发的SSR 位点，开发、检测了5 859个基因相关SSR 标记，在栽培种花生基因组中具有较高的扩增效率，并构建了基因相关SSR 位点的物理图谱。

关键词：花生；RNA-seq 数据；SSR 位点；基因关联SSR 标记；物理图谱

0 引言
【研究意义】栽培种花生（Arachis hypogaea）是中国主要的油料与经济作物之一，在保证中国食用油和植物蛋白供给、促进农民增收方面具有重要作用。伴随花生基因组学和分子生物学的发展，大量基于分子标记的花生品种鉴定[1-2]、种质资源遗传多样性[3-5]、重要性状的QTL 定位[6-9]、基因挖掘和育种研究[10-14]得以开展。然而，由于花生遗传基础狭窄，SSR 标记多态性较低，基因组较大（约2.7 GB），且结构复杂，现有的SSR 标记，特别是用于高密度遗传图谱构建和重要功能基因挖掘的标记还较为缺乏，限制了花生重要功能基因的解析和应用。【前人研究进展】近年来，SSR 标记因其分布广泛、共显性、多态性好、分辨率高、重复性好等优点而被广泛应用于花生遗传研究和育种实践中。利用基因组文库（如BAC 文库）[15-24]、表达序列标签（expressed sequence tags，EST）文库[25-32]、转录组数据[33-35]、全基因组数据[9, 36-37]和近缘物种（如大豆）[38]中的SSR 序列进行花生SSR 标记的开发，并应用于花生的研究。任小平等[2]利用筛选到的60 对核心SSR 标记构建了100 份花生品种的指纹图谱；张照华等[39]在高油酸育种中利用62 对SSR标记对10 个BC4F2 特定基因型株系进行遗传背景评估，筛选出与亲本中花16 最优的近等基因系材料。除此之外，利用基于SSR 标记的遗传连锁图谱和关联图谱，鉴定出与栽培种花重要农艺性状紧密连锁的QTL，如株高等株型相关性状[6,40-42]、荚果和种子相关性状[7-8,43-44]、抗旱[45]、叶斑病等抗病性[46-47]。在水稻、大豆、玉米等作物上的研究还表明，功能基因中的特异性SSR 标记（或紧密连锁标记）还可以用于分析基因的等位变异和功能变异[48-50]。【本研究切入点】目前，尽管一批栽培种花生重要性状相关QTL 被鉴定出来，但是进入育种应用的还较少，最主要的原因是构建的遗传图谱标记密度还不够高，鉴定的QTL 的遗传距离还较大，标记与基因间的连锁还不够紧密，在实际运用中基因丢失的风险较高。因此，有必要利用现有资源开发更多SSR 标记，对这些重要功能基因进行精细定位和图位克隆。利用野生花生基因组，JOSH等[51]对栽培种花生全生育期中22 种不同类型的组织进行RNA-seq测序，组装了栽培种花生的转录组图谱，包含了花生正常生育条件下最多的基因转录本数据，这些转录本数据中包含了大量还未利用的SSR标记资源，且来自转录组的SSR直接与功能基因的表达相关，是开发功能基因特征标记的潜在资源。【拟解决的关键问题】本研究拟利用已发表的栽培种花生RNA-seq数据，鉴定SSR 位点、开发与基因相关联的SSR 标记，进一步丰富花生SSR 标记，为花生重要功能基因的挖掘、等位变异研究和分子标记辅助育种奠定基础。

1 材料与方法
1.2 RNA-seq 数据处理
根据转录组数据注释信息，将组装序列与基因名称、染色体定位、基因功能等信息进行一一对应。

1.3 SSR 位点挖掘及基因SSR 引物设计
使用MISA 软件（microsatellite identification tool，http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）搜索栽培种花生转录组unigene 中的简单重复序列，并对SSR 重复基序类型进行特征分析。查找标准：单核苷酸基序至少重复次数为10，而2、3、4、5 和6 核苷酸基序最少重复次数分别为6、5、5、5 和5。

使用Primer3.0 软件对SSR 位点进行引物设计，每个SSR 位点分别设计3 组引物，并且满足以下的特征：（1）长度在15—25 bp；（2）PCR 扩增产物长度为100—400 bp；（3）退火温度（Tm 值）在50℃—60℃；（4）GC 的含量在40%—60%；（5）避免出现发夹结构及引物二聚体。

1.4 e-PCR 引物质量检测
使用e-PCR Version: 2.3.9 对设计的引物进行电子PCR 检测，参数设置按照DENG 等[52]方法进行。分别分析来源于栽培种花生转录组的 SSR 引物在A.duranensis、A.ipaensis 和栽培种花生（Tifrunner）全基因组（https://peanutbase.org/）中的扩增情况，统计并记录引物在基因组上的扩增次数，剔除扩增产物长度小于100 bp 或大于500 bp 及特异性不好的引物。使用Tbtools[53]软件对扩增位点在基因组上的位置进行 可视化。

1.5 花生DNA 提取及PCR 检测
选取花生幼嫩叶片，采用改良CTAB 法提取DNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA 浓度与纯度，于-20℃保存备用。38 对随机选取的基因SSR 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（电子附表1）。PCR 反应体系和PCR 程序按照HUANG等[6]方法进行。

表1 栽培种花生RNA-seq SSR 位点分布特征
Table 1 Distribution of RNA-seq SSR locus characteristics in cultivated peanut

pagenumber_ebook=34,pagenumber_book=697
2 结果
2.1 栽培种花生RNA-seq SSR 位点分布及结构特点
栽培种花生22 个组织RNA-seq 深度测序共组装获得52 280 条转录本（总长度75 821 219 bp），其中33 293 条转录本注释到相应基因（注释到A 基因组16 222 个基因，B 基因组17 071 个基因）。利用MISA软件从全部转录本中共鉴定出19 143 个SSR 位点，其中有1 494 个SSR 位点以复合位点的形式存在。在全部转录本中共有14 084 条转录本含有SSR 位点，发生频率为26.94%，平均每3.96 kb 出现一个SSR；3 606条（6.90%）转录本中含有≥2 个SSR 位点，大部分转录本含有2—4 个位点，单条转录本中最多含7 个SSR 位点。在所有鉴定的SSR 位点中，大部分SSR位点分布于转录本序列5′端300 bp 或3′端300 bp 的区域，包括UTR、内含子和CDS 区域。

栽培种花生转录组重复单元类型丰富，单核苷酸到五核苷酸均存在，各重复单元组成的SSR 数量上存在着较大差异（表1）。其中以单核苷酸和三核苷酸为重复单元的SSR 位点数最多，分别占SSR 位点总数的39.24%和38.40%，分布频率为14.37%和14.06%，其中以五核苷酸为重复单元的SSR 位点数最少，仅为48 个。在SSR 位点基序种类方面，不同重复单元在基序种类上存在着丰富的多样性，单核苷酸到五核苷酸基序种类分别为4、12、60、87 和39 种，共202 种，从单核苷酸到四核苷酸基序种类随着重复单元碱基数增加而增加（表1）。

各重复单元优势基序类型随着重复单元增加，在所属重复单元SSR 位点中所占的比例呈下降趋势（表1）。在鉴定出的SSR 位点中，单核苷酸重复单元中，优势基序类型为A/T，为7 334 个，占所有以单核苷酸为重复单元的SSR 位点的97.62%；二核苷酸重复单元中，优势基序类型为AG/CT，占该重复单元位点的72.01%；三核苷酸到五核苷酸重复单元中，优势基序类型依次为30.96%、24.59%和16.67%。

2.2 栽培种花生RNA-seq SSR 重复次数和基序长度
鉴定的SSR 位点各重复单元的重复次数和SSR位点长度存在着明显的差异（表2 和图1）。重复单元的重复次数为5—47（单核苷酸）次，随着重复次数的增加，同一重复单元类型的SSR位点数逐渐减少。其中，单核苷酸重复次数主要集中在10—12 次；二核苷酸重复次数主要集中在6—8 次；三核苷酸重复次数主要集中在5—6 次；四核苷酸和五核苷酸重复次数主要集中在5 次。从整体上看，重复单元的重复次数主要集中在5、6 和10 次，在所有SSR 位点中的分布频率分别为24.24%、18.87%和17.37%。单个SSR 位点的长度的分布范围为10—47 bp，基序长度主要集中在10—14 bp，其中，长度为10 和12 bp 的基序数量最多，分别为2 985 和2 389 个；复合SSR 位点的长度范围为21—249 bp，其中，以长度为31—40 bp 的复合位点最多，随着基序长度增加，复合SSR 位点数呈逐步减少的趋势。

pagenumber_ebook=35,pagenumber_book=698
图1 SSR 基序长度分布
Fig. 1 Distribution of SSR motif length

2.3 栽培种花生SSR 标记的开发
利用primer3.0 软件，对14 084 条转录本中的SSR位点进行引物设计，发现共有13 477 个SSR 位点可以进行引物设计，其中，可以进行引物设计的单个SSR位点有12 515 个，复合SSR 位点962 个。不能进行引物设计的SSR 位点共4 172 个，其中，单个SSR 位点3 797 个，复合SSR 位点375 个；这些SSR 位点中共有1 771 个SSR 位点位于序列5′端50 bp 以内，2 179个SSR 位点位于3′端100 bp 区域内，SSR 位点位于序列起始端和末端，位点一端序列过短或无序列是造成这些位点不能进行引物设计的主要原因。在可以进行引物设计的序列中，共有5 661 条转录本未注释到基因，这些序列中共包含7 305 个SSR 位点，有1 235条序列含有多个位点，单条序列最多含有7 个SSR 位点。

表2 栽培种花生SSR 各重复单元重复次数及分布频率
Table 2 Repetition times and distribution frequency of each SSR repeat unit in cultivated peanut

pagenumber_ebook=36,pagenumber_book=699
根据序列注释信息，共有5 020 条转录本序列对应到特定的基因，共包含5 859 个可进行引物设计的SSR 位点（单一位点和复合位点），基因的平均SSR位点密度为1.17（表3），共设计出17 574 对特定基因SSR 引物（每个位点设计3 对引物）。与基因对应的SSR 位点在A 基因组和B 基因组共20 条染色体上不均匀分布（表3），其中B03 染色体上SSR 位点最多，为484 个；单一位点范围为170（A02）—451（B03），共5 533 个；复合位点范围为9（A01）—33（B03），共326 个。这些包含SSR 位点的基因主要以单位点基因的形式存在（68.75%），单条染色体基因数目为160（A07)—430（B03），其中单位点基因范围为110（A07）—328（B03），多位点基因范围为13（A02)—49（B04）。

2.5 e-PCR 引物质量检测分析
利用一组特定基因SSR 引物（5 859 对），分别以A.duranensis、A.ipaensis 和栽培种花生基因组为模板进行电子PCR。结果（表4）表明，栽培种花生特定基因SSR 引物在A.duranensis、A.ipaensis 和栽培花生基因组中都具有较高的扩增效率，在3 个基因组中的有效扩增位点分别为4 468、4 929 和10 188 个，有效引物数分别为3 968（67.74%）、4 232（72.25%）和5 174（88.33%）对。且这些SSR 引物，在栽培种花生基因组中具有更高的多态性：在A.duranensis 和A.ipaensis 基因组中，引物扩增位点主要以1 个位点为主，在有效引物中的比例分别为93.75%和91.33%；而在栽培种花生基因组中，SSR 引物扩增位点主要以2 个位点为主（62.24%），其次是1 个位点（28.54%），且扩增3 个及以上位点的SSR 引物数要显著高于A.duranensis 和A.ipaensis。在所有检测的引物中，共有3 250（55.47%）对引物在3 个基因组中均可有效扩增，716（12.22%）对可在A.duranensis 和栽培种花生基因组中扩增，978 对可在A.ipaensis 和栽培种花生基因组中扩增，231（3.94%）对仅在栽培种基因组中扩增（图2）。根据SSR 标记在栽培种花生基因组中的扩增情况和扩增位点信息，绘制了SSR 位点物理图谱（图3）。根据QTL 两端标记在基因组上的位置，利用SSR 位点物理图谱，可以为QTL 精细定位提供SSR 标记信息。如图4 所示，80 个基因关联SSR 标记可用于QTL qBWRB02.1 的区间加密。

2.6 SSR 标记扩增及多态性分析
随机合成了38 对SSR 引物在栽培种花生基因组中进行扩增验证，在远杂9102 和花育910 基因组中共有35 对（92.1%）SSR 引物可以扩增出清晰的条带，其中有11 对（28.9%）SSR 引物在2 个品种间扩增出差异条带，有3 个SSR 标记为显性标记，在2 个花生品种中表现为条带有无的多态性（图5）。表明开发的基因关联SSR引物在花生基因组中具有较高的扩增效率和较好的多态性。

表3 可进行引物设计的特异基因SSR 位点统计
Table 3 Statistics of primer design specific gene-associated SSR

pagenumber_ebook=37,pagenumber_book=700
pagenumber_ebook=37,pagenumber_book=700
图2 基因关联SSR 标记在基因组中的扩增分布
Fig. 2 Amplification site distribution of gene-associated SSR markers in peanut genome

pagenumber_ebook=37,pagenumber_book=700
图3 花生SSR 标记位点物理图谱
Fig. 3 Physical map of SSR markers in peanut genome

红线表示基因，蓝线表示正义链上的SSR 位点，绿线表示负义链上的SSR 位点
The red line represents for peanut genes, the blue line represent for SSR locus located on the positive chain, the green line represent for SSR locus located on the negative chain

表4 基因关联SSR 引物e-PCR 扩增位点统计
Table 4 Statistics of gene-associated SSR primer amplified in peanut genome by e-PCR

pagenumber_ebook=38,pagenumber_book=701
pagenumber_ebook=38,pagenumber_book=701
图4 花生青枯病抗性相关QTL 定位
Fig. 4 QTL analysis of bacteria wilt resistance in peanut

红线表示基因，蓝线表示正义链上的SSR 位点，绿线表示负义链上的SSR 位点
The red line represent for peanut genes, the blue line represent for SSR locus located on the positive chain, the green line represent for SSR locus located on the negative chain

pagenumber_ebook=39,pagenumber_book=702
图5 随机SSR 引物在花生品种远杂9102 和花育910 中的扩增情况（部分）
Fig. 5 Randomly SSR markers amplification in Yuanza 9102 and Huayu 910 (part)

M：Marker；Y：远杂9102；H：花育910。13—24：SSR 引物A05D8UNY-1-1、A0686JNN-1-1、A06R0Z7V-1-1、A06RB83Y-1-1、A076T298-1-1、A07F0Y1Z-1-1、A07F4DXF-1-1、A08648HW-2-1、A089H31H-1-1、A08A0WFX-1-1、A091GS41-1-1、A09D2340-1-1
M: Marker; Y: Yuanza 9102; H: Huayu 910. 13-24: SSR marker A05D8UNY-1-1, A0686JNN-1-1, A06R0Z7V-1-1, A06RB83Y-1-1, A076T298-1-1, A07F0Y1Z-1-1, A07F4DXF-1-1, A08648HW-2-1, A089H31H-1-1, A08A0WFX-1-1, A091GS41-1-1, A09D2340-1-1

3 讨论
栽培种花生（2n=AABB）来源于数百万年前野生花生A.duranensis（2n=AA）和A. ipaensis（2n=BB）间的自然杂交、加倍事件，已有研究表明野生花生A基因组和B 基因组具有高度的共线性和一致性[54]。本研究开发的基因关联SSR 引物中，共有62.24%（3 221对）的有效引物具有2 个有效扩增位点，且大部分引物扩增的位点分别分布于栽培种花生A 基因组和B 基因组的同源染色体上，如引物A0101UKP-1-1 的2 个扩增位点，定位到A01 和B01 染色体上的一对等位基因Aradu.01UKP.1 和Araip.K30076.1 的基因序列上；且这些引物可以同时在野生花生A、B 基因组上有效扩增。栽培种花生SSR 标记的这些特性也进一步印证了花生A、B 基因组的高度同源性。

SSR 标记已广泛的应用于作物的遗传多样性分析、指纹图谱构建、杂种鉴定、遗传图谱构建、基因挖掘和育种实践中。来源于转录组的SSR 直接与功能基因的表达相关，鉴定转录组中与基因直接关联的SSR 位点，开发与基因关联的SSR 标记，对于研究基因的等位变异及变异对功能的影响、重要性状关联的基因挖掘和精细定位具有重要意义[55]。本研究鉴定了13 477 个可进行引物设计的SSR 位点，并对5 020 条基因转录本中5 859 个SSR 位点进行了引物设计和电子PCR 检测，进一步丰富了花生SSR标记，为基于分子标记的花生研究提供了可利用的资源。其中有1 147 个基因关联SSR 标记e-PCR 检测只有一个扩增位点，具有一定的特异性，这些SSR 标记经进一步鉴定，有可能开发成基因的特征标记，应用于基因在不同种质中的等位变异研究和基因的功能变异研究。

当前，尽管一批栽培种花生重要性状相关QTL 被鉴定出来，为花生分子标记辅助育种奠定了基础；但实际上，进入育种应用分子标记的还较少，最主要的原因是鉴定的QTL 的遗传距离还较大，标记与基因间的连锁还不够紧密，在实际运用中存在目标性状丢失的风险[36]。利用SSR 位点物理图谱和QTL 两端标记在基因上的位置，可以获得对区间加密的SSR 标记信息。作者前期利用花生抗、感青枯病亲本远杂9102×徐州68-4 构建的RIL 群体，在B02 连锁群上鉴定出一个稳定的QTL qBWRB02.1（或qBWRB02.4，标记区间为AGGS1592-AHTE0775），表型变异解释率为6.91%—18.68%[56]。根据标记AGGS1592、GM2196（AHTE0775 相邻连锁标记）在基因组上的位置信息，将qBWRB02.1 定位于B02 染色体5.53 Mb 区域（包含402 个基因），根据SSR 位点物理图谱，在此区间包含80 个基因关联的SSR 标记（图4）。利用这些SSR标记可对该位点区间进行加密，对花生青枯病抗性基因的进行精细定位，从而大大减少候选基因的数量，为目的基因的图位克隆奠定基础。

4 结论
鉴定了13 477 个可进行标记开发的SSR 位点，开发、检测了5 859 个基因相关SSR 标记，在栽培种花生基因组中具有较高的扩增效率，并构建了基因相关SSR 位点的物理图谱。

References

[1] 尹亮, 李双铃, 任艳, 石延茂, 袁美. 42 个花生品种的SSR 标记指纹图谱构建. 花生学报, 2017, 46(1): 8-13. YIN L, LI S L, REN Y, SHI Y M, YUAN M. Construction of molecular fingerprint for 42 peanut varieties using SSR markers. Journal of Peanut Science, 2017, 46(1): 8-13. (in Chinese)

[2] 任小平, 郑艳丽, 黄莉, 陈玉宁, 周小静, 陈伟刚, 雷永, 晏立英, 万丽云, 廖伯寿, 姜慧芳. 花生SSR 核心引物筛选及育成品种DNA 指纹图谱构建. 中国油料作物学报, 2016, 38(5): 563-571. REN X P, ZHENG Y L, HUANG L, CHEN Y N, ZHOU X J, CHEN W G, LEI y, YAN L Y,WAN L Y, LIAO B S, JIANG H F. Selection of core SSR markers and identification of fingerprint on peanut cultivars. Chinese Journal of Oil Crop Sciences, 2016, 38(5): 563-571. (in Chinese)

[3] REN X P, JIANG H F, YAN Z, CHEN Y, ZHOU X, HUANG L, LEI Y, HUANG J, YAN L, QI Y, WEI W, LIAO B S. Genetic diversity and population structure of the major peanut (Arachis hypogaea L.) cultivars grown in China by SSR markers. PLoS ONE, 2014, 9(2): e88091.

[4] JIANG H F, REN X P, CHEN Y N, HUANG L, ZHOU X J, HUANG J, FROENICKE L, YU J, GUO B, LIAO B S. Phenotypic evaluation of the Chinese mini-mini core collection of peanut (Arachis hypogaea L.) and assessment for resistance to bacterial wilt disease caused by Ralstonia solanacearum. Plant Genetic Resources, 2013, 11(1): 77-83.

[5] JIANG H F, HUANG L, REN X P, CHEN Y N, ZHOU X, XIA Y, HUANG J, LEI Y, YAN L Y, WAN L, LIAO B S. Diversity characterization and association analysis of agronomic traits in a Chinese peanut (Arachis hypogaea L.) mini‐core collection. Journal of Integrative Plant Biology, 2014, 56(2): 159-169.

[6] HUANG L, REN X P, WU B, LI X, CHEN W, ZHOU X, CHEN Y, PANDEY M K, JIAO Y, LUO H, LEI Y, VARSHNEY R K, LIAO B S, JIANG H F. Development and deployment of a high-density linkage map identified quantitative trait loci for plant height in peanut (Arachis hypogaea L.). Scientific Reports, 2016, 6: 39478.

[7] LUO H, PANDEY M K, KHAN A W, GUO J, WU B, CAI Y, HUANG L, ZHOU X, CHEN Y, CHEN W, LIU N, LEI Y, LIAO B, VARSHNEY R K, JIANG H. Discovery of genomic regions and candidate genes controlling shelling percentage using QTL‐seq approach in cultivated peanut (Arachis hypogaea L.). Plant Biotechnology Journal, 2019,17(7):1248-1260.

[8] LUO H, REN X, LI Z, XU Z, LI X, HUANG L, ZHOU X, CHEN Y, CHEN W, LEI Y, LIAO B, PANDEY M K, VARSHNEY R K, GUO B, JIANG X, LIU F, JIANG H F. Co-localization of major quantitative trait loci for pod size and weight to a 3.7 cM interval on chromosome A05 in cultivated peanut (Arachis hypogaea L.). BMC Genomics, 2017, 18(1): 58.

[9] LUO H, XU Z, LI Z, LI X, LV J, REN X, HUANG L, ZHOU X, CHEN Y, YU J, CHEN W, LEI Y, LIAO B, JIANG H. Development of SSR markers and identification of major quantitative trait loci controlling shelling percentage in cultivated peanut (Arachis hypogaea L.). Theoretical and Applied Genetics, 2017, 130(8): 1635-1648.

[10] VARSHNEY R K, THUNDI M, MAY G D, JACKSON S A. Legume genomics and breeding. Plant Breeding Reviews, 2010, 33: 257-304.

[11] VARSHNEY R K, PANDEY M K, JANILA P, NIGAM S N, SUDINI H, GOWDA M V, SRISWATHI M, RADHAKRISHNAN T, MANOHAR S S, NAGESH P. Marker-assisted introgression of a QTL region to improve rust resistance in three elite and popular varieties of peanut (Arachis hypogaea L.). Theoretical and Applied Genetics, 2014, 127(8): 1771-1781.

[12] CHU Y, WU C L, HOLBROOK C C, TILLMAN B L, PERSON G, OZIAS-AKINS P. Marker-assisted selection to pyramid nematode resistance and the high oleic trait in peanut. The Plant Genome, 2011, 4(2): 110-117.

[13] SUKRUTH M, PARATWAGH S A, SUJAY V, KUMARIM V, GOWDA M V C, NADAF H L, MOTAGI B N, LINGARAJU S, PANDEY M K, VARSHNEY R K, BHAT R S. Validation of markers linked to late leaf spot and rust resistance, and selection of superior genotypes among diverse recombinant inbred lines and backcross lines in peanut (Arachis hypogaea L.). Euphytica, 2015, 204(2): 343-351.

[14] JANILA P, VARIATH M T, PANDEY M K, DESMAE H, MOTAGI B N, OKORI P, MANOHAR S S, RATHNAKUMAR A L, RADHAKRISHNAN T, LIAO B, VARSHNEY R K. Genomic tools in groundnut breeding program: Status and perspectives. Frontiers in Plant Science, 2016, 7: 289.

[15] HOPKINS M S, CASA A M, WANG T, MITCHELL S E, DEAN R E, KOCHERT G D, KRESOVICH S. Discovery and characterization of polymorphic simple sequence repeats (SSRs) in peanut. Crop Science, 1999, 39(4): 1243-1247.

[16] HE G, MENG R, NEWMAN M, GAO G, PITTMAN R N, PRAKASH C S. Microsatellites as DNA markers in cultivated peanut (Arachis hypogaea L.). BMC Plant Biology, 2003, 3(1): 3.

[17] FERGUSON M E, BUROW M D, SCHULZE S R, BRAMEL P J, PATERSON A H, KRESOVICH S, MITCHELL S. Microsatellite identification and characterization in peanut (Arachis hypogaea L.). Theoretical and Applied Genetics, 2004, 108(6): 1064-1070.

[18] MORETZSOHN M D C, HOPKINS M S, MITCHELL S E, KRESOVICH S, VALLS J F M, FERREIRA M E. Genetic diversity of peanut (Arachis hypogaea L.) and its wild relatives based on the analysis of hypervariable regions of the genome. BMC Plant Biology, 2004, 4(1): 11.

[19] MORETZSOHN M C, LEOI L, PROITE K, GUIMARÃES P M, LEAL-BERTIOLI S C M, GIMENES M A, MARTINS W S, VALLS J F M, GRATTAPAGLIA D, BERTIOLI D J. A microsatellite-based, gene-rich linkage map for the AA genome of Arachis (Fabaceae). Theoretical and Applied Genetics, 2005, 111(6): 1060-1071.

[20] CUC L M, MACE E S, CROUCH J H, QUANG V D, LONG T D, VARSHNEY R K. Isolation and characterization of novel microsatellite markers and their application for diversity assessment in cultivated groundnut (Arachis hypogaea). BMC Plant Biology, 2008, 8(1): 55.

[21] YUAN M, GONG L, MENG R, LI S, DANG P, GUO B, HE G. Development of trinucleotide (GGC)n SSR markers in peanut (Arachis hypogaea L.). Electronic Journal of Biotechnology, 2010, 13(6): 5-6.

[22] SHIRASAWA K, KOILKONDA P, AOKI K, HIRAKAWA H, TABATA S, WATANABE M, HASEGAWA M, KIYOSHIMA H, SUZUKI S, KUWATA C, NAITO Y, KUBOYAMA T, NAKAYA A, SASAMOTO S, WATANABE A, KATO M, KAWASHIMA K, KISHIDA Y, KOHARA M, KURABAYASHI A, TAKAHASHI C, TSURUOKA H, WADA T, ISOBE S. In silico polymorphism analysis for the development of simple sequence repeat and transposon markers and construction of linkage map in cultivated peanut. BMC Plant Biology, 2012, 12(1): 80.

[23] MACEDO S E, MORETZSOHN M C, M LEAL-BERTIOLI S C, ALVES D M, GOUVEA E G, AZEVEDO V C, BERTIOLI D J. Development and characterization of highly polymorphic long TC repeat microsatellite markers for genetic analysis of peanut. BMC Research Notes, 2012, 5(1): 86.

[24] WANG H, PENMETSA R V, YUAN M, GONG L, ZHAO Y, GUO B, FARMER A D, ROSEN B D, GAO J, ISOBE S, BERTIOLI D J, VARSHNEY R K, COOK D R, HE G. Development and characterization of BAC-end sequence derived SSRs, and their incorporation into a new higher density genetic map for cultivated peanut (Arachis hypogaea L.). BMC Plant Biology, 2012, 12(1): 10.

[25] LUO M, DANG P, GUO B Z, HE G, HOLBROOK C C, BAUSHER M G, LEE R D. Generation of expressed sequence tags (ESTs) for gene discovery and marker development in cultivated peanut. Crop Science, 2005, 45(1): 346-353.

[26] PROITE K, LEAL-BERTIOLI S C, BERTIOLI D J, MORETZSOHN M C, SILVA F R D, MARTINS N F, GUIMARÃES P M. ESTs from a wild Arachis species for gene discovery and marker development. BMC Plant Biology, 2007, 7(1): 7.

[27] LIANG X, CHEN X, HONG Y, LIU H, ZHOU G, LI S, GUO B. Utility of EST-derived SSR in cultivated peanut (Arachis hypogaea L.) and Arachis wild species. BMC Plant Biology, 2009, 9(1): 35.

[28] WANG J, PAN L, YANG Q, YU S. Development and characterization of EST-SSR markers from NCBI and cDNA library in cultivated peanut (Arachis hypogaea L.). Legume Genomics and Genetics, 2010, 1(6): 30-33.

[29] KOILKONDA P, SATO S, TABATA S, SHIRASAWA K, HIRAKAWA H, SAKAI H, SASAMOTO S, WATANABE A, WADA T, KISHIDA Y, TSURUOKA H, FUJISHIRO T, YAMADA M, KOHARA M, SUZUKI S, HASEGAWA M, KIYOSHIMA H, ISOBE S. Large-scale development of expressed sequence tag-derived simple sequence repeat markers and diversity analysis in Arachis spp. Molecular Breeding, 2012, 30(1): 125-138. [30] GUO Y, KHANAL S, TANG S, BOWERS J E, HEESACKER A F, KHALILIAN N, NAGY E D, ZHANG D, TAYLOR C A, STALKER H T, OZIAS-AKINS P, KNAPP S J. Comparative mapping in intraspecific populations uncovers a high degree of macrosynteny between A-and B-genome diploid species of peanut. BMC Genomics, 2012, 13(1): 608.

[31] BOSAMIA T C, MISHRA G P, THANKAPPAN R, DOBARIA J R. Novel and stress relevant EST derived SSR markers developed and validated in peanut. PLoS ONE, 2015, 10(6): e0129127.

[32] HUANG L, WU B, ZHAO J, LI H, CHEN W, ZHENG Y, REN X, CHEN Y, ZHOU X, LEI Y, LIAO B, JIANG H. Characterization and transferable utility of microsatellite markers in the wild and cultivated Arachis species. PLoS ONE, 2016,11(5): e0156633.

[33] ZHANG J, LIANG S, DUAN J, WANG J, CHEN S, CHENG Z, ZHANG Q, LIANG X, LI Y. De novo assembly and characterisation of the transcriptome during seed development, and generation of genic-SSR markers in peanut (Arachis hypogaea L.). BMC Genomics, 2012, 13(1): 90.

[34] PENG Z, GALLO M, TILLMAN B L, ROWLAND D, WANG J. Molecular marker development from transcript sequences and germplasm evaluation for cultivated peanut (Arachis hypogaea L.). Molecular Genetics and Genomics, 2016, 291(1): 363-381.

[35] WANG H M, LEI Y, YAN L Y, WAN L Y, CAI Y, YANG Z F, LÜ J W, ZHANG X J, XU C W, LIAO B S. Development and validation of simple sequence repeat markers from Arachis hypogaea transcript sequences. The Crop Journal, 2018, 2(6): 172-180.

[36] ZHAO C, QIU J, AGARWAL G, WANG J, REN X, XIA H, GUO B, MA C, WAN S, BERTIOLI D J, VARSHNEY R K, PANDEY M K, WANG X. Genome-wide discovery of microsatellite markers from diploid progenitor species, Arachis duranensis and A. ipaensis, and their application in cultivated peanut (A. hypogaea). Frontiers in Plant Science, 2017, 8: 1209.

[37] 王玉龙, 黄冰艳, 王思雨, 杜培, 齐飞艳, 房元瑾, 孙子淇, 郑峥, 董文召, 张新友. 四倍体野生种花生A.monticola 全基因组SSR 的开发与特征分析. 中国农业科学, 2019, 52(15): 2567-2580. WANG Y L, HUANG B Y, WANG S Y, DU P, QI F Y, FANG Y J, SUN Z Q, ZHENG Z, DONG W Z, ZHANG X Y. Development and characterization of whole genome SSR in tetraploid wild peanut (Arachis monticola). Scientia Agricultura Sinica, 2019, 52(15): 2567-2580. (in Chinese)

[38] HE G, WOULLARD F E, MARONG I, GUO B Z. Transferability of soybean SSR markers in peanut (Arachis hypogaea L.). Peanut Science, 2006, 33(1): 22-28.

[39] 张照华, 王志慧, 淮东欣, 谭家壮, 陈剑洪, 晏立英, 王晓军, 万丽云, 陈傲,康彦平, 姜慧芳, 雷永, 廖伯寿. 利用回交和标记辅助选择快速培育高油酸花生品种及其评价. 中国农业科学, 2018, 51(9): 1641-1652. ZHANG Z H, WANG Z H, HUAI D X, TAN J Z, CHEN J H, YAN L Y, WANG X J, WAN L Y, CHEN A, KANG Y P, JIANG H F, LEI Y, LIAO B S. Fast development of high oleate peanut cultivars by using marker-assisted backcrossing and their evaluation. Scientia Agricultura Sinica, 2018, 51(9): 1641-1652. (in Chinese)

[40] LÜ J, LIU N, GUO J, XU Z, LI X, LI Z, LUO H, REN X, HUANG L, ZHOU X, CHEN Y, CHEN W, LEI Y, TU J, JIANG H, LIAO B. Stable QTLs for plant height on chromosome A09 identified from two mapping populations in peanut (Arachis hypogaea L.). Frontiers in Plant Science, 2018, 9: 684.

[41] HUANG L, HE H, CHEN W, REN X, CHEN Y, ZHOU X, XIA Y, WANG X, JIANG X, LIAO B, JIANG H. Quantitative trait locus analysis of agronomic and quality-related traits in cultivated peanut (Arachis hypogaea L.). Theoretical and Applied Genetics, 2015, 128(6): 1103-1115.

[42] PANDEY M K, UPADHYAYA H D, RATHORE A, VADEZ V, SHESHSHAYEE M S, SRISWATHI M, GOVIL M, KUMAR A, GOWDA M V, SHARMA S, HAMIDOU F, KUMAR V A, KHERA P, BHAT R S, KHAN A W, SINGH S, LI H, MONYO E, NADAF H L, MUKRI G, JACKSON S A, GUO B, LIANG X, VARSHNEY R K. Genomewide association studies for 50 agronomic traits in peanut using the ‘reference set’ comprising 300 genotypes from 48 countries of the semi-arid tropics of the world. PLoS ONE, 2014, 9(8): e105228.

[43] ZHAO J, HUANG L, REN X, PANDEY M K, WU B, CHEN Y, ZHOU X, CHEN W, XIA Y, LI Z, LUO H, LEI Y, VARSHNEY R K, LIAO B, JIANG H. Genetic variation and association mapping of seed-related traits in cultivated peanut (Arachis hypogaea L.) using single-locus simple sequence repeat markers. Frontiers in Plant Science, 2017, 8: 2105.

[44] SHIRASAWA K, KOILKONDA P, AOKI K, HIRAKAWA H, TABATA S, WATANABE M, HASEGAWA M, KIYOSHIMA H, SUZUKI S, KUWATA C, NAITO Y, KUBOYAMA T, NAKAYA A, SASAMOTO S, WATANABE A, KATO M, KAWASHIMA K, KISHIDA Y, KOHARA M, KURABAYASHI A, TAKAHASHI C, TSURUOKA H, WADA T, ISOBE S. In silico polymorphism analysis for the development of simple sequence repeat and transposon markers and construction of linkage map in cultivated peanut. BMC Plant Biology, 2012, 12(1): 80.

[45] RAVI K, VADEZ V, ISOBE S, MIR R R, GUO Y, NIGAM S N, GOWDA M V, RADHAKRISHNAN T, BERTIOLI D J, KNAPP S J, VARSHNEY R K. Identification of several small main-effect QTLs and a large number of epistatic QTLs for drought tolerance related traits in groundnut (Arachis hypogaea L.). Theoretical and Applied Genetics, 2011, 122(6): 1119-1132.

[46] KHEDIKAR Y P, GOWDA M V, SARVAMANGALA C, PATGAR K V, UPADHYAYA H D, VARSHNEY R K. A QTL study on late leaf spot and rust revealed one major QTL for molecular breeding for rust resistance in groundnut (Arachis hypogaea L.). Theoretical and Applied Genetics, 2010, 121(5): 971-984.

[47] 洪彦彬, 温世杰, 钟旎, 李杏瑜, 朱方何, 梁炫强. SSR 标记与花生青枯病、锈病抗性的相关性研究. 广东农业科学, 2011(s1): 61-63. HONG Y B, WEN S J, ZHONG N, LI X Y, ZHU F H, LIANG X Q. Correlation analysis of SSR markers with bacterial wilt and rust resistance of peanut (Arachis hypogaea L.). Guangdong Agricultural Sciences, 2011(s1): 61-63. (in Chinese)

[48] 王韵, 徐正进, 陈温福, 赵明辉, 方萍. 辽宁水稻直立穗型基因位点SSR 标记变异分析. 沈阳农业大学学报, 2007, 38(3): 395-397. WANG Y, XU Z J, CHEN W F, ZHAO M H, FANG P. Characteristic of alleles at RM5833-11 locus associated with erect panicle gene of Liaoning rice accesions. Journal of Shengyang Agricultural University, 2007, 38(3): 395-397. (in Chinese)

[49] 王文辉, 邱丽娟, 常汝镇, 马凤鸣, 谢华, 林凡云. 中国大豆种质抗SCN 基因rhg1 位点SSR 标记等位变异特点分析. 大豆科学, 2003, 22(4): 246-250. WANG W H, QIU L J, CHANG R Z, MA F M, XIE H, LIN F Y. Characteristics of alleles at satt309 locus associated with rhg1 gene resistant to SCN for Chinese soybean germplasm. Soybean Science, 2003, 22(4): 246-250. (in Chinese)

[50] 杨留启, 杨文鹏, 牛素贞, 王明春. 玉米O2 和Wx 基因内及O16基因连锁SSR 位点的等位变异研究. 玉米科学, 2009, 17(3): 10-14. YANG L Q, YANG W P, NIU S Z, WANG M C. Allelic variations of SSR sites within opaque-2 and Wx gene and linkage opaque-16 gene in maize. Journal of Maize Sciences, 2009, 17(3): 10-14. (in Chinese)

[51] JOSH C, CHU Y, SCHEFFLER B, OZIAS-AKINS P. A developmental transcriptome map for allotetraploid Arachis hypogaea. Frontiers in Plant Science, 2016, 7: 1446.

[52] DENG P, WANG M, FENG K, CUI L, TONG W, SONG W, NIE X. Genome-wide characterization of microsatellites in Triticeae species: Abundance, distribution and evolution. Scientific Reports, 2016, 6: 32224.

[53] CHEN C, XIA R, CHEN H, HE Y. TBtools, a Toolkit for Biologists integrating various HTS-data handling tools with a user-friendly interface. BioRxiv, 2018: 289660.

[54] BERTIOLI D J, CANNON S B, FROENICKE L, HUANG G, FARMER A D, CANNON E K, LIU X, GAO D, CLEVENGER J, DASH S, REN L, MORETZSOHN M C, SHIRASAWA K, HUANG W, VIDIGAL B, ABERNATHY B, CHU Y, NIEDERHUTH C E, UMALE P, ARAÚJO A C, KOZIK A, KIM K D, BUROW M D, VARSHNEY R K, WANG X, ZHANG X, BARKLEY N, GUIMARÃES P M, ISOBE S, GUO B, LIAO B, STALKER H T, SCHMITZ R J, SCHEFFLER B E, LEAL-BERTIOLI S C, XUN X, JACKSON S A, MICHELMORE R, OZIAS-AKINS P. The genome sequences of Arachis duranensis and Arachis ipaensis, the diploid ancestors of cultivated peanut. Nature Genetics, 2016, 48(4): 438.

[55] 陈竟男, 马晓兰, 王振, 李仕金, 谢皓, 叶兴国, 林志珊. 基于簇毛麦No.1026 转录组的SSR 序列分析及其PCR 标记开发. 中国农业科学, 2019, 52(1): 1-10. CHEN J N, MA X L, WANG Z, LI S J, XIE H, YE X G, LIN Z S. SSR sequences and development of PCR markers based on transcriptome of Dasypyrum villosum No.1026. Scientia Agricultura Sinica, 2019, 52(1): 1-10. (in Chinese)

[56] 徐志军. 花生青枯病抗性相关的QTL 分析[D]. 北京: 中国农业科学院, 2016. XU Z J. Quantitative trait locus analysis of bacterial wilt resistance in peanut (Arachis hypogaea). Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2016. (in Chinese)

附录

[1] 彭春瑞, 涂田华, 邱才飞, 周国华. “超级稻-再生稻”模式在江西的应用效益及关键技术初步研究. 杂交水稻, 2006, 21(6): 56-58.

[2] 李贵勇, 刘玉文, 袁江华, 王耀伟, 王枝富, 夏琼梅, 邓安风, 龙瑞平, 杨从党. “头季稻-再生稻-马铃薯”高效种植模式关键技术研究和应用. 中国稻米, 2014, 20(3): 64-66.

[3] 蔡行明, 颜曰红, 朱德峰, 张玉屏. Ⅱ优航1 号再生稻高产栽培技术与效益分析. 中国农学通报, 2005, 21(9): 161-162.

[4] 黄成志, 黄文章, 严明建, 雷树凡, 吕直文, 胡景涛, 冉彦秀. 10 个三系杂交水稻组合的中稻加再生稻筛选试验初报. 湖南农业科学, 2014,17: 4-6.

[5] 吴芸紫, 段门俊, 刘章勇, 陈阜, 金涛. 播种期对3 个再生稻品种产量及产量构成因子的影响. 作物杂志, 2017, 35(2): 151-156.

[6] 刘松. 不同氮肥运筹对再生稻产量和稻米品质的影响[D]. 华中农业大学, 2016.

[7] 罗丽华, 肖应辉, 刘国华, 唐文帮, 陈立云. 不同类型水稻再生特性的比较研究. 南方农业学报, 2006, 37(2): 123-126.

[8] 陈梅香, 陈象. 不同留桩高度对超级稻中浙优1 号作再生稻栽培的影响. 福建农业科技, 2013, 44(11): 9-11.

[9] 许光明. 不同留桩高度对优质稻佳辐占再生稻产量的影响. 现代农业科技, 2011(1): 63-63.

[10] 徐中华, 吴小江, 李山. 不同密度及施肥时间对再生稻产量的影响试验初报. 南方农业, 2015, 9(3): 57-58.

[11] 段门俊, 吴芸紫, 田玉聪, 刘永武, 刘章勇, 陈阜, 金涛. 不同品种再生稻产量及品质比较研究. 作物杂志, 2018(2): 61-67.

[12] 郭祖寿. 不同施肥方法对头季稻及再生稻的影响简报. 福建农业科技, 1998(2): 20-20.

[13] 张羽, 刘习中, 钱伟宏. 不同收获方式和催芽肥施用时间对再生稻产量的影响. 中国稻米, 2015, 21(6): 83-84.

[14] 陈国银, 黎银忠, 李义才.不同施肥方式对再生稻产量的影响. 现代农业科技, 2013(3): 24-25.

[15] 林玉弘, 蒙善标, 韦目阔. 不同栽培密度对超级稻—再生稻产量的影响. 现代农业科技, 2012(9): 45-45. [16] 唐仁忠, 梁昌南, 贾翠仙, 韦凤舞, 柳有广. 不同栽培密度对头季稻及再生稻产量的影响. 广西农学报, 2014, 29(1): 3-6.

[17] 张黎光, 黎用朝. 插秧根数与留桩高度对中稻及其再生稻产量的影响. 湖南农业科学, 1994(2): 21-22.

[18] 黄其椿, 何大福, 黄世礽, 林明龙, 陈同聪, 何万福, 梁玉祥, 农振平. 超级稻中浙优1 号蓄留再生稻高产栽培技术研究. 安徽农业科学, 2011, 39(31): 19073-19074,19077.

[19] 胡春花, 孟卫东, 陈健晓, 符研, 符策强, 王效宁. 超级杂交稻Ⅱ优航2 号再生稻配套栽培技术研究. 杂交水稻, 2013, 28(4): 48-51.

[20] 钟顺清, 曾世清, 宋绍明, 张义团. 川东南再生稻稻作区水稻新品种品比试验. 园艺与种苗, 2012(1): 16-18, 21.

[21] 王光明, 胡声荣, 石孝均, 朱自均, 郑钦玉. 川东丘陵区头季稻密度和肥料对再生稻产量的影响. 西南大学学报(自然科学版), 1993, 15(5): 392-397.

[22] 吕泽林, 雷大存, 邓榆千, 赵小康. 促芽肥对再生稻产量及性状的影响研究. 农业科技通讯, 2013(3): 68-70.

[23] 傅长珠. 氮钾肥配合对早稻再生稻产量影响及施肥建议. 现代农业科技, 2008(20): 174-174.

[24] 刘爱中, 张胜文, 屠乃美. 稻桩贮藏同化产物的分配与再生稻腋芽再生率及产量构成的关系. 华北农学报, 2008, 23(3): 190-193.

[25] 王少明, 吕泽林, 周远清,曹嘉荣. 德香4103 再生稻单产3.75t/hm2 以上高产栽培技术. 耕作与栽培, 2016(2):55-57.

[26] 李贵勇, 刘玉文, 袁江华, 夏琼梅, 龙瑞平, 杨从党. 低纬高原区再生稻高产栽培技术研究. 云南农业大学学报(自然科学版), 2015, 30(4): 560-565.

[27] 徐富贤, 范青华, 陈应平, 陈昌荣, 陈定素, 曾静成, 陈祖君, 张林, 刘茂, 周兴兵, 郭晓艺, 熊洪, 朱永川. 冬水田杂交中稻栽秧密度与方式互作对头季稻及再生稻生长的影响. 西南农业学报, 2010, 23(3):629-635.

[28] 余贵龙, 刘祥臣, 丰大清, 张强, 赵海英, 张万平, 李伟, 陈昌. 不同留茬高度对豫南再生稻生育期及产量的影响. 中国稻米, 2018, 24(5): 112-115.

[29] 舒玲, 柏平, 董祖国. 富顺县中稻-再生稻新品种比较试验. 安徽农学通报, 2014, 20(5): 24-25.

[30] 涂军明, 王欢, 曹志刚, 胡海珍, 梅新华. 高产水稻品种作再生稻种植比较试验初报. 湖北农业科学, 2013, 52(23): 5683-5685.

[31] 黄俊明. 贵州省再生稻试验研究总结. 贵州农业科学, 1993(5): 55-59.

[32] 周奥, 何可佳, 李晓刚. 湖南地区再生稻品种筛选及高产栽培技术研究. 中国农学通报, 2016, 32(15): 1-5.

[33] 闵军, 黎用朝, 张黎光,黄海明. 湖南再生稻品种筛选研究. 中国稻米, 2002, 8(1): 10-11.

[34] 黄新杰, 屠乃美, 周娟, 易镇邪, 李艳芳, 万定海. 激素处理对再生稻剑叶光合产物分配及产量的影响. 华北农学报, 2012, 27(5): 114-118.

[35] 谢磊, 许晖, 曹纯海, 刘署艳, 江庆生, 史方春, 张天晓, 李守华. 江汉平原再生稻机械化生产的产量构成因素分析和品种适应性研究. 湖北农业科学, 2016, 55(10): 2462-2465.

[36] 兰兴庆. 两优2186 再生生育特性及其栽培技术. 杂交水稻, 2003, 18(1): 34-36.

[37] 蒋廷杰, 易镇邪, 屠乃美. 留桩高度对培矮64S/E32 再生特性的影响. 湖南农业大学学报(自科科学版), 2005, 31(4): 359-363.

[38] 黄志刚, 屠乃美, 江巨鳌, 秦鹏, 黄泽春. 留桩高度对培两优210 再生稻产量和源库性状的影响. 生态学报, 2009, 29(8): 4572-4579.

[39] 刘爱中, 邹冬生, 屠乃美, 刘飞. 留桩高度对再生稻生长发育及产量的影响. 安徽农业科学, 2007, 35(17): 5120-5121, 5172.

[40] 易镇邪, 周文新, 屠乃美. 留桩高度对再生稻源库性状与物质运转的影响. 中国水稻科学, 2009, 23(5): 509-516.

[41] 李树祥, 张万林, 王洋. 精确定量施肥对再生稻生长发育及产量的效应分析. 南方农业, 2013, 7(7): 4-5. [42] 严兴康, 庞爱军, 唐艳军, 朱贵祥, 伍国银, 唐少东, 胡继银. 隆两优华占高产高效再生稻栽培技术研究. 湖南农业科学, 2017(5): 17-20, 24.

[43] 任怀富. 泸县杂交中稻-再生稻品种大区对比试验初探. 基层农技推广, 2016, 4(11): 30-32.

[44] 刘桅, 梁小兵. 耐淹再生稻-泰香稻再生栽培技术初探. 江西农业科技, 2000(6): 1-3.

[45] 黄林煌. 内优航148 不同种植密度对再生稻产量的影响. 福建农业科技, 2016, 47(5): 19-21.

[46] 吉中贵, 邓相秋, 何花强, 张建奎, 孙海艳. 抛栽密度与促芽肥用量和化学促芽剂对中稻-再生稻的影响研究. 中国农学通报, 2009, 25(22): 109-113.

[47] 张桂莲, 屠乃美, 张顺堂. 喷施赤霉素和细胞分裂素对再生稻腋芽萌发和产量的影响. 耕作与栽培, 2004(5): 26-26.

[48] 廖义利. 浦城县机收再生稻品比试验. 福建农业科技, 2016, 47(2): 7-9.

[49] 蔡克桐, 沈其文, 黄志谋, 施仕胜, 耿协议. 丘陵红黄壤区施用399 对“一种两收”再生稻根系和产量的影响. 安徽农业科学, 2015, 43(26): 51-52.

[50] 罗玉水. 施氮量与栽培密度对Ⅱ优航1 号作再生稻产量的影响. 中国农学通报, 2007, 23(7): 203-206.

[51] 刘代银, 刘基敏, 牟锦毅. 受淹杂交中稻蓄留再生稻的关键技术探讨. 中国稻米, 2009(1): 30-33.

[52] 杨东, 陈鸿飞, 卓传营, 林文雄. 头季不同施氮方式对再生稻生理生化的影响. 中国生态农业学报, 2009, 17(4): 643-646.

[53] 周文新, 易镇邪, 屠乃美, 李合松. 头季稻齐穗期剑叶光合产物分配与再生稻产量的相关性. 核农学报, 2008, 22(6): 860-864.

[54] 乐开富. 头季稻栽培因素对Ⅱ优1259 再生稻产量的影响. 中国稻米, 2011, 17(5): 60-62. [55] 郭丽清. 头季稻增施穗肥对再生稻的效应. 福建农业科技, 1998(3): 3-5.

[56] 刘丹, 黄修荣, 王记安, 高长清, 罗珍美, 程建平. 孝感市再生稻品种的筛选试验. 湖北农业科学, 2016, 55(11): 2739-2742.

[57] 刘怀珍, 黄庆, 陆秀明, 李康活, 李惠芬, 张彬. 一季中晚稻-再生稻高产栽培技术研究. 广东农业科学, 2012, 39(20): 1-3.

[58] 涂军明, 曹志刚, 程建平, 彭少兵, 黄见良, 方锡文, 钱太平. 一种两收适宜品种筛选试验. 湖北农业科学, 2014, 53(23): 5666-5668.

[59] 黄文武, 覃柳末, 凌强清, 潘廷由, 梁忠明, 罗芳媚. 右江河谷地区再生稻品种筛选试验. 南方农业学报, 2012, 43(7): 936-941.

[60] 刘圣全, 汪剑鸣, 陈伦华, 杨爱卿. 杂交稻再生稻经济性状试验研究. 杂交水稻, 1997, 12(2): 18-20.

[61] 张继新, 钱太平, 张晓勇, 李江苏, 王长兵. 杂交水稻不同留桩高度对再生稻产量的影响. 安徽农业科学, 2014, 42(8): 2221-2222, 2224.

[62] 张瑞祥, 李土明, 张红林, 刘海平, 刘跃青, 李建新. 杂交水稻再生稻组合的筛选研究. 杂交水稻, 2001, 16(4): 36-38.

[63] 吴德成, 陈国梁, 姜在田, 叶兰, 揭经伦, 傅仲礼, 朱秀皋. 杂交再生稻不同密度对产量的影响及其成因分析. 作物研究, 1994, 8(4): 17-18.

[64] 刘唐兴, 黄国龙, 刘东辉, 李益锋. 杂交早稻“一季加再生”的高产品种(组合)筛选试验. 安徽农业科学, 2013, 41(23): 9551-9552, 9555.

[65] 任天举, 肖长明, 李贤勇, 鲁远源, 李经勇, 彭海涛, 李世永, 刘义文. 杂交中稻、再生稻两季增产的施肥技术研究. 西南农业学报, 2001, 14(1): 55-60.

[66] 钱太平, 方锡文, 张继新, 邹春华, 陈建军, 徐志进, 肖齐圣. 杂交中稻-再生稻品种筛选试验. 湖北农业科学, 2012, 51(19): 4193-4195.

[67] 周兴兵, 张林, 郭晓艺, 熊洪, 徐富贤, 朱永川, 刘茂. 杂交中稻不同割苗时期及留桩高度对再生特性及产量的影响. 中国稻米, 2013, 19(1): 54-55.

[68] 周兴兵, 熊洪, 蒋鹏, 张林, 朱永川, 刘茂, 郭晓艺, 徐富贤. 杂交中稻对洪涝的响应时机及洪水再生稻的高产调控技术研究. 中国稻米, 2015, 21(5): 29-32

[69] 周智华, 陈全美, 李小玲, 谢娟秀, 周智理. 杂交组合头季稻-再生稻栽培品比试验初报. 现代农业科技, 2008(12): 200-201.

[70] 廖海林, 熊顺贵, 郑景生,吴隆灿, 黄信恩, 姜照伟. 再生稻‘佳辐占’再生季施肥试验初报. 福建农业学报, 2014, 29(7): 646-650.

[71] 钱太平, 梅少华, 张键, 喻均吉, 翟中兵, 方锡文, 陈建军, 张从德, 魏坦雄. 再生稻不同留桩高度和收割方式的产量及其构成因素分析. 湖北农业科学, 2015, 54(1): 14-17.

[72] 蔡亚港, 黄育民, 李义珍. 再生稻产量形成过程稻桩的形态生理学效应. 福建农业学报, 1998, 13(4): 7-11.

[73] 罗赣丰, 郭飞舟, 周志宏, 孙火喜. 再生稻高产栽培技术研究. 江西农业学报, 2007, 19(6): 19-20.

[74] 王光明, 刘保国, 张修清, 任昌福, 黄友钦. 再生稻高产栽培综合农艺措施研究. 西南农业大学学报(自然科学版), 1993, 15(5): 386-391.

[75] 林文, 李义珍, 姜照伟, 郑景生. 再生稻根系形态和机能的品种间差异及与产量的关联性. 福建农业学报, 2001, 16(1): 1-4.

[76] 杨树华. 再生稻旱育抛栽技术组合选优研究. 福建农业科技, 1998(6): 7-8.

[77] 李贵勇, 宁波, 刘玉文, 胡慧, 王安东, 李加华, 夏琼梅, 邓安凤, 杨从党. 再生稻精确定量栽培技术研究. 西南农业学报, 2012, 25(6): 1977-1981.

[78] 姚厚军. 再生稻可行性及潜伏芽生长规律的研究. 安徽农业科学, 1988(2): 40-45.

[79] 万碧珠. 再生稻两季高产品种筛选试验. 福建稻麦科技, 2009, 27(4): 45-47.

[80] 蒋春林. 再生稻品种比较试验. 现代农业科技, 2012(10): 88-89.

[81] 廖思樟. 再生稻施肥问题研究初报. 中国农学通报, 1987(4): 12-14.

[82] 刘正忠. 再生稻头季机收关键技术分析. 农业科技通讯, 2013(4): 118-120.

[83] 刘见平, 李彦宁, 熊继东, 罗赫荣. 再生稻优良品种(组合)筛选研究. 湖南农业科学, 2002(6): 11-13, 15.

[84] 易镇邪, 周文新, 秦鹏, 屠乃美. 再生稻与同期抽穗主季稻源库流特性差异研究. 作物学报, 2009, 35(1): 140-148.

[85] 刘爱中, 邹冬生, 屠乃美, 周文新, 易镇邪, 梁养贤. 再生稻与同期抽穗主季稻源库特性比较. 湖北农业科学, 2007, 46(4): 526-529.

[86] 习敏, 吴文革, 汪靖桂, 汪宏伟, 陈刚, 许有尊. 再生稻种植产量差形成的研究. 华北农学报, 2017, 32(1): 104-110.

[87] 王苏影, 吴志青, 徐慧芳, 熊清云, 黄海燕, 喻凤琴, 刘宗发. 直播-再生稻的品种筛选初探. 作物研究, 2015, 29(5): 472-474.

[88] 戴立智, 吴天长, 俞开启. 中稻-再生稻新组合试验初报. 福建农业科技, 2012(2): 3-6.

[89] 李木英, 石庆华, 王忠明, 潘晓华, 谭学明. 种植密度对Ⅱ优明86 中稻蓄留再生稻群体发育和产量的影响. 江西农业大学学报, 2009, 31(4): 625-632.

[90] 丛云飞, 何清中, 曾卓华, 方立魁. 重庆再生稻品种筛选及品质研究. 南方农业, 2016, 10(19): 7-9.

[91] 彭成林, 陈天春, 袁家富, 曾祥明, 赵书军, 徐大兵. 准两优608 在湖北作再生稻的营养特性与施肥效应. 湖北农业科学, 2016, 55(13): 3301-3304.

[92] 李伟. 不同定植方式对水稻低位再生特性和产量品质的影响[D]. 湖南农业大学, 2004.

[93] 周文新. 不同类型再生稻生育特性及源库关系比较研究[D]. 湖南农业大学, 2006.

[94] 李阳. 不同品种中稻蓄留再生稻产量形成的差异与再生芽化学调控初探[D]. 华中农业大学, 2014.

[95] 朱校奇. 超级杂交稻再生特性及其生理基础研究[D]. 中南大学, 2008.

[96] 袁高华. 促芽肥和留桩高度对水稻再生芽生长及产量形成的影响[D]. 华中农业大学, 2017.

[97] 王清峰. 非结构性物质对水稻产量及再生性的影响[D]. 海南大学, 2014.

[98] 黄水明. 机收低桩再生稻栽培技术研究[D]. 福建农林大学, 2010.

[99] 陈小花. 粳稻和籼稻品种的再生特性比较研究[D]. 华中农业大学, 2013.

[100] 徐秀娟. 水稻一种两收机械化栽培技术研究[D]. 安徽农业大学, 2016.

[101] 唐浩. 水稻再生特性及其头季稻体内营养物质含量的关系研究[D]. 湖南农业大学, 2002.

[102] 刘利民. 刈割处理对优质稻农艺性状、产量及稻米品质的影响[D]. 华中农业大学, 2016.

[103] 梁冠. 豫南稻区再生稻栽培技术初探[D]. 河南农业大学, 2016.

[104] 王直华. 杂交中稻半期旱作对再生稻生长发育的影响[D]. 华中农业大学, 2009.

[105] 杨东. 再生稻不同施N 方式的增产效应研究[D]. 福建农林大学, 2007.

[106] 郑景生. 再生稻高产栽培特性与相关性状的基因定位研究[D]. 福建农林大学, 2004.

[107] 周红英. 再生稻轻简化高产栽培技术及其生理机制研究[D]. 华中农业大学, 2012.

[108] 马晓春. 中稻蓄留再生稻品种筛选与头季收获方式对再生季产量的影响[D]. 华中农业大学, 2015.

[109] 何文杰. 主季再生季丰产稳产优质品种筛选及钾肥对再生季稻米品质的影响[D]. 华中农业大学, 2017.

[110] 周宗汉, 高红兵, 彭晓满, 万健民, 李小平. 再生稻配方施肥试验. 湖北农业科学, 1993(3): 14-16.

[111] 陈梅香, 丁信良, 张守良. 再生杂交稻新组合筛选试验. 福建农业科技, 1999(s1):12-13.

[112] CHEN Q, HE A B, WANG W Q, PENG S B, HUANG J L, GUI K H. Comparisons of regeneration rate and yields performance between inbred and hybrid rice cultivars in a direct seeding rice-ratoon rice system in central China. Field Crops Research, 2018(223): 164-170.

[113] DONG H L, CHEN Q, WANG W Q, PENG S B, HUANG J L, GUI K H. The growth and yield of a wet-seeded rice-ratoon rice system in central China. Field Crops Research, 2017(208): 55-59.

[114] 柳开楼. 赣东北再生稻轻型化种植模式播期优化及其对源库关系的影响. 南京农业大学, 2011.

[115] 张现伟, 李经勇, 唐永群, 姚雄. 不同栽培处理下杂交水稻渝香203 的再生性分析. 西南农业学报, 2012, 25(1): 59-62.

[116] 杨坚, 陈恺林, 赵正洪, 刘洋, 周学其, 张玉烛. 不同种植方式对再生稻产量和品质的影响. 湖南农业大学学报(自然科学版), 2017, 43(3): 234-237.

[117] 夏桂龙, 欧阳建平, 柳开楼, 李亚贞, 周利军, 余跑兰,胡惠文. 促芽肥用量和留茬方式对赣东北地区再生稻产量和再生能力的影响. 中国稻米, 2016, 22(2): 27-30.

[118] 李景润, 邱明朝. 杂交中稻-再生稻生产试验示范初报. 农村经济与科技, 2016, 27(3): 25-27.

[119] 徐小兵, 陈凌, 钱太平, 郭建新. 再生稻头季机械收割和人工收割对比试验. 中国种业, 2016(11): 52-53.

Discovery of Microsatellite Markers from RNA-seq Data in Cultivated Peanut (Arachis hypogaea)

XU ZhiJun1, ZHAO Sheng2, XU Lei1, HU XiaoWen1, AN DongSheng1, LIU Yang1
(1 Zhanjiang Experiment Station, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Guangdong Engineering Technology Research Center for Dryland Water-saving Agriculture, Zhanjiang 524013, Guangdong; 2 Shenzhen Agricultural Genome Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Shenzhen 518120, Guangdong)

Abstract: 【Objective】 This study aimed to identify SSRs in peanut RNA-seq data，clarify their distribution and structural characteristics，and develop gene-associated SSR markers. The study may lay the foundation for the excavation of important functional genes of peanut, the study of isometric variation and molecular markers assisted breeding. 【Method】From 22 different cultivated peanut tissue types and ontogenies that represent its full development, the reported RNA-Seq data, were used to analyze the distribution and characteristics of SSR using MISA software. Gene-associated SSR primers were designed by Primer 3.0 and its quality were detected by e-PCR 2.3.9. 38 pairs of primers were randomly synthesized for polymorphism testing. 【Result】A total of 19 143 SSRs were identified from 52 280 transcripts, distributed in 14 084 transcripts, with a frequency of 26.94%. The dominant SSR repeat unit types were mononucleotide and trinucleotide in mononucleotide to pentanucleotide, accounting for 39.24% and 38.40% of the total SSR locus. Dominant motif types of each repeat unit were A/T, AG/CT, AAG/CTT, AAAG/CTTT, AACAC/GTGTT, accounting for 97.62%, 72.01%, 30.96%, 24.59%, and 16.67% in the corresponding repeat units, respectively. The repetition of repeat units was 5-47 times, and the length distribution range of single SSR site was 10-47bp, mainly concentrated at 10-14 bp. The length range of compound SSR locus was 21-249 bp, mainly concentrated at 31-40 bp. Among all the SSR，13 477 SSR could be used to develop SSR markers, of which 5 020 transcript sequences were annotated to specific genes, containing 5 859 SSR markers locus. These SSRs were unevenly distributed on the 20 chromosomes of A and B genomes, and chromosomes B03 had the most SSR locus of 484. Using electronic PCR, 4 468, 4 929 and 10 188 effective loci were amplified in the genome of A. duranensis, A. ipaensis, A. hypogaea, with 3 968 (67.74%), 4 232 (72.25%) and 5 174 (88.33%) effective markers, respectively. In the genome of A. hypogaea, SSR primers amplified mainly with 2 loci, while 1 477 pairs of SSR primers were single-locus markers. And the physical map of amplified SSR loci was drawn according to the loci position in cultivated peanut genome. Among the randomly synthesized primers, 35 pairs (92.1%) of SSR primers amplified stable and clear bands in two peanut varieties, among which 11 pairs (28.9%) of SSR primers amplified different band. 【Conclusion】 In this study, 13 477 potential primer design SSRs were identified, 5 859 gene-associated SSR markers were developed and detected，with high amplification efficiency in cultivated peanut genome，and the physical map of gene-associated SSR were constructed.

Key words: peanut; RNA-seq data; SSR loci; gene-associated SSR markers; physical map

收稿日期：2019-07-28；

接受日期：2019-10-21

基金项目：中国热带农业科学院科技创新团队专项资金（1630102017002）

联系方式：徐志军，E-mail：zhijunxu1990@163.com。

通信作者刘洋，E-mail：lyfull@163.com

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

pagenumber_ebook=32,pagenumber_book=695
（责任编辑 李莉）