玉米质膜内在蛋白ZmPIP2;6响应渗透、盐和干旱胁迫的功能鉴...

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玉米质膜内在蛋白ZmPIP2;6响应渗透、盐和干旱胁迫的功能鉴定
周练，熊雨涵，洪祥德，周京，刘朝显，王久光，王国强，蔡一林

（西南大学农学与生物科技学院玉米研究所，重庆 400715）

摘要：【目的】质膜内在蛋白（plasma membrane intrinsic proteins，PIPs）广泛存在于植物细胞的膜系统上，在植物体内水分运输和水分平衡的过程中至关重要。对ZmPIP2;6在植物水分胁迫耐性中的功能进行探究，为玉米培育抗旱耐盐新品种提供优秀基因资源。【方法】分析并比对ZmPIP2;6与其他物种中报道参与水分胁迫的PIPs的氨基酸序列，构建ZmPIP2;6-GFP载体并通过PEG介导转化玉米原生质体，对ZmPIP2;6进行亚细胞定位。采集玉米的不同组织样品，包括根、茎、叶、未成熟雄穗、未成熟雌穗、胚和胚乳；对玉米进行PEG或NaCl处理，在处理的不同时间点采集玉米的根和叶样品。提取总RNA并通过qRT-PCR调查ZmPIP2;6在玉米不同组织以及在水分胁迫下的表达模式。构建ZmPIP2;6超表达载体，发展并鉴定ZmPIP2;6超表达拟南芥材料，观察转基因植株对渗透、盐及干旱胁迫的耐性生理表型，并测量其根长、叶片水分散失率等性状。检测在干旱或盐胁迫条件下，拟南芥胁迫信号通路上的相关基因在ZmPIP2;6超表达植株中的表达。【结果】氨基酸序列分析比对结果显示ZmPIP2;6具有PIP蛋白的典型结构与并且其他物种的PIP蛋白具有很高的同源性。转化玉米原生质体试验结果显示ZmPIP2;6蛋白定位在细胞质膜。qRT-PCR结果显示ZmPIP2;6在玉米未成熟雄穗中表达量最高，并且在玉米受到渗透和盐胁迫后根和叶中的ZmPIP2;6表达受到显著诱导。在MS固体培养基上进行渗透胁迫处理和盐胁迫处理以及进一步的土培试验中进行干旱胁迫处理，ZmPIP2;6超表达拟南芥植株相对野生型都显示出更强的胁迫耐性。在干旱或盐胁迫条件下，拟南芥胁迫信号通路上的相关基因在ZmPIP2;6超表达植株中的表达受到不同程度的影响。【结论】玉米内在质膜蛋白基因ZmPIP2;6在渗透或盐胁迫下表达上调，在拟南芥中超表达ZmPIP2;6会增强植株对渗透、盐和干旱胁迫的耐性，并且在盐或干旱胁迫条件下会影响拟南芥中胁迫相关基因的表达。ZmPIP2;6可能参与植物水分胁迫响应过程。

关键词：玉米；质膜内在蛋白；渗透胁迫；干旱胁迫；盐胁迫

0 引言
【研究意义】近几十年来，尽管世界玉米产量达到稳定增长，但是由于全球气候变暖导致地球上极端天气的加剧及水分的不平衡，干旱和盐胁迫影响玉米产量的威胁也在逐渐增加[1-2]。因此，在有限的土地和水资源条件下，提高作物水分胁迫耐性和培育与推广应用抗逆作物新品种是解决这一问题的重要途径。广泛存在于植物细胞膜系统中的水通道蛋白是水分跨细胞运输的主要通道，其中质膜内在蛋白（plasma membrane intrinsic proteins，PIPs）在植物细胞质膜上起着重要功能，主导植物根部和叶片组织的水分运输，在维持植物体内水势平衡的过程中至关重要[3-7]。受到渗透、盐或干旱胁迫等非生物胁迫时植株体内水分转运的调控非常重要，因此，研究ZmPIPs在植物水分胁迫应答过程中的功能更是关键。【前人研究进展】广泛存在于植物细胞膜系统中的水通道蛋白作为主要内在蛋白（major intrinsic protein，MIP）家族成员，是水分跨细胞运输的主要通道，在植物水分运输和水分平衡中起着非常重要的作用[3-7]。MIP是一类具有高度保守结构的疏水蛋白，包括6个跨膜结构域，构成A、B、C、D、E共5个环，其N端与C端都位于胞内。其中B、E 2个环上具有高度保守的NPA（天冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸）基序，这是水通道蛋白与底物结合所必须的结构[8]。在高等植物中，水通道蛋白主要分为5个亚家族：质膜内在蛋白（PIPs）、液泡膜内在蛋白（tonoplast intrinsic proteins，TIPs）、NOD26相似内在蛋白（nodulin26-like intrinsic proteins，NIPs）、小分子碱性内在蛋白（small basic intrinsic proteins，SIPs）和未鉴定的膜内在蛋白（X intrinsic proteins，XIPs）[9]。其中，PIPs在植物细胞质膜上起着重要功能，植物根部和叶片的水分运输主要由PIPs完成[6,10]。根据序列相似度，PIPs可以分为PIP1和PIP2 2个亚类，其中PIP2的C端序列长于PIP1。有报道指出PIP1与PIP2蛋白能够互作并影响其水通道活性[11-17]，如玉米中ZmPIP1;2能与多个ZmPIP2s蛋白互作并显著提高ZmPIP2s的水通道活性[11]。植物基因组中含有大量的水通道蛋白基因，例如玉米有31个水通道蛋白基因[8]、拟南芥有35个[18]、水稻有33个[19]和大豆有66个[20]等。植物水通道蛋白的高度多样性暗示着其在植物生理生化进程中具有多种功能。除了水分运输以外，水通道蛋白还参与植物多种生理进程例如固氮[21]、光合作用[22-24]、营养吸收[25-27]以及各种环境胁迫[28]。生物胁迫例如非生物胁迫例如渗透、干旱、盐和冷胁迫都会影响植物水分平衡和水通道蛋白基因的表达[29]。例如不同浓度的盐处理玉米不同时间后，ZmPIPs呈不同水平的表达调节[30]；PEG处理玉米，ZmPIPs的转录水平在水分胁迫及复水时期在玉米根的不同区段中显示出差异性调节[31]。研究表明，在植物中超表达某些内源或外源水通道蛋白基因，能显著提高转基因植物对各种非生物胁迫的耐性[24,32-36]。例如在拟南芥中超表达HvPIP2;5能增强植物对盐和渗透胁迫的耐性[36]；在大豆中超表达GmPIP1;6能提高大豆的耐盐能力，增加光合效率，并通过增加籽粒大小提高产量[24]；在香蕉中超表达MusaPIP1;2，能够提高香蕉对干旱、盐和冷胁迫等多种非生物胁迫的耐性[35]等。通过上述研究报道，说明发掘水通道蛋白基因应用于抗逆转基因作物育种具有可行性。【本研究切入点】玉米ZmPIP已被鉴定，但是关于其功能，特别是参与非生物胁迫耐性的ZmPIP功能的研究鲜见报道。前期用PEG或NaCl处理玉米后，发现根和叶中的ZmPIP1;1和ZmPIP2;6表达会出现不同程度变化，其中ZmPIP1;1已经报道在增强植物对干旱和盐胁迫的耐性过程中起关键作用[37]，因此，研究ZmPIP2;6是否也在参与植物响应水分胁迫过程中具有重要功能，对于下一步探索玉米水分平衡过程中ZmPIPs蛋白间的网络调控机制具有重要意义。【拟解决的关键问题】本研究通过分析ZmPIP2;6的蛋白序列并确定其在玉米原生质体中的亚细胞定位，调查ZmPIP2;6在玉米的不同组织中以及在渗透和盐胁迫下的表达模式，发展ZmPIP2;6超表达转基因拟南芥材料并对转基因植株对不同非生物胁迫的耐性进行鉴定，增进对ZmPIP2;6参与植物对水分胁迫应答过程的了解，也可以为玉米培育抗旱耐盐新品种提供优秀的基因资源。

1 材料与方法
1.1 植物材料、生长条件及胁迫处理
使用的玉米（Zea Mays L.）材料是B73，根、茎、叶、未成熟雄穗（3—4 cm）、未成熟雌穗（3—4 cm）、胚和胚乳分别取自授粉后18 d。植物温室培养条件是12 h光照/12 h黑暗，光照强度为1 000 μmol·m-2·s-1，白天/夜晚的温度分别是30℃/22℃，生长室湿度控制在约30%。玉米在土壤里播种，发芽5 d后，将长势一致的幼苗移至营养液里水培。改良后1/2 Hoagland营养液[38]成分如下：6.0 mmol·L-1 KNO3、4.0 mmol·L-1 Ca(NO3)2、1.0 mmol·L-1 KH2PO4、0.05 mmol·L-1 KCl、1.0 mmol·L-1 MgSO4、0.02 mmol·L-1 Fe-EDTA(Na)、25 μmol·L-1 H3BO3、0.2 μmol·L-1 MnSO4、0.2 μmol·L-1 ZnSO4、0.05 μmol·L-1 (NH4)2MoO4和0.05 μmol·L-1 CuSO4。进行胁迫处理时，向营养液中添加10%的PEG6000进行渗透处理或100 mmol·L-1的NaCl进行盐处理。

拟南芥（Arabidopsis thaliana）材料使用的是Col-0型。拟南芥种子通过表面消毒播种在MS培养基平板上，4℃春化3 d。拟南芥生长箱的培养条件控制在16 h光照/8 h黑暗，白天/夜晚的温度分别是24℃/21℃，生长室湿度控制在约30%。

MS培养基平板试验：拟南芥种子通过表面消毒播种在MS培养基平板上，4℃春化3 d，正常培养5 d的幼苗移至含有150 mmol·L-1甘露醇或100 mmol·L-1 NaCl的MS培养基中，正常光照下培养7 d。

土壤培养试验：拟南芥种子通过表面消毒播种在MS培养基平板上，4℃春化3 d，正常培养5 d的幼苗移至营养土的小盆中于生长室中继续培养至2周大，不浇水14 d作干旱处理，对照正常3 d浇一次水。实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）试验：正常条件下土壤中生长2周的拟南芥，脱水作干旱处理2 h后取样，用含有100 mmol·L-1 NaCl的溶液浇灌拟南芥作盐处理6 h后取样。

1.2 基因注释及氨基酸比对分析
通过NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和MaizeGDB（https://maizegdb.org）等数据库网站，搜索下载相关PIP基因信息，包含目的基因的全长基因组序列，全长cDNA序列和氨基酸序列。目的基因ZmPIP2;6的基因序列号为：AF326495/GRMZM2G047368。将所有进行比对的氨基酸序列转换成FASTA格式合并导出，通过MegAlign软件进行Clustal V多序列比对分析，比对参数用默认值，生成比对报告文件。

1.3 亚细胞定位
以玉米叶片cDNA为模板，通过PCR扩增ZmPIP2;6的全长CDS序列（除去终止密码子）并测序验证，连接到西南大学玉米研究所改造载体pCAMBIA1302，构建ZmPIP2;6-GFP融合表达载体。将ZmPIP2;6-GFP融合表达载体和质膜定位标记载体PM107（AtPIP2A-mCherry融合表达载体）[39]分别通过PEG介导共转化玉米原生质体。玉米叶肉原生质体的分离提取以及PEG介导的瞬时转化是参照前人报道的方法上进行改进[40]。每个载体分别准备10 μg质粒DNA制备成0.2 mL的原生质体悬浮液，黑暗条件下23℃培养12—16 h，在激光共聚焦显微镜（LSM800，Carl Zeiss）下观察荧光。所用引物序列见电子附表1。

1.4 转化载体的构建及转基因材料的培育
以玉米叶片cDNA为模板，通过PCR扩增并测序验证ZmPIP2;6的全长cDNA序列，通过酶切位点BamHⅠ和XbaⅠ连接到西南大学玉米研究所改造的含有花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子的双元转化载体pCAMBIA3300。将载体转化到农杆菌菌株EHA101中，通过浸花序法进行拟南芥转化。T0、T1和T2代转基因种子通过含有草丁膦（Glufosinate，5 mg·L-1，Sigma）的MS培养基进行筛选，并通过PCR和qRT-PCR进行鉴定。

1.5 RNA的提取及qRT-PCR
玉米或拟南芥样品快速采集放置在液氮里并于-80℃保存。使用RNAprep pure Plant Kit（TIANGEN）试剂盒提取总RNA。使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit （Thermo Scientific）试剂盒将总RNA反转录合成cDNA。通过SYBR Green（TOYOBO, OSAKA）和定量仪CFX96 TouchTM Cycler（Bio-Rad）进行qRT-PCR分析。扩增程序为94℃10 s；58℃10 s；72℃10 s。每个样品2个技术学重复。设计ZmPIP2;6定量引物时，避开ZmPIPs蛋白序列中的保守基序序列。分别利用玉米内参基因ZmACTIN3、拟南芥内参基因AtACT2（正常条件下）和AtUBQ10（水分胁迫条件下，AtUBQ10在不同植株中的表达水平较一致）在各个cDNA样品中的表达量，样品间同一基因的相对表达量通过公式计算：2-ΔΔct。相应引物序列见电子附表1。

1.6 水分散失率测定
正常土培条件下生长2周的野生型和ZmPIP2;6超表达转基因拟南芥，摘下整个拟南芥植株的地上部分，放在稳定环境中实验台的滤纸上，5 h内每小时称取鲜重。水分散失率通过不同时间点的样品鲜重进行计算。

2 结果
2.1 ZmPIP2;6的氨基酸序列分析
玉米MIP家族含有个31水通道蛋白基因，其中包括13个ZmPIP。ZmPIP进一步又分为2个亚类：6个ZmPIP1和7个ZmPIP2。目的蛋白ZmPIP2;6的蛋白结构保守，具有PIP蛋白的典型结构，包括保守基序HINPAVTFG（黑色方框）和2个NPA基序（灰色阴影）（图1）。将ZmPIP2;6与其他物种已知参与水分胁迫响应的PIP蛋白（TaAQP8、TaAQP7、OSPIP1;1、NaAQP1、MusaPIP1;2、HvPIP2;5、HvPIP1;1和GmPIP1;6）氨基酸序列进行比对，结果显示，ZmPIP2;6与其他植物物种的PIP蛋白具有很高的同源性（图1）。

2.2 ZmPIP2;6的亚细胞定位
通过将ZmPIP2;6融合GFP蛋白（ZmPIP2;6-GFP）和质膜定位标记蛋白（PM107）在玉米原生质体中共表达，分析目的蛋白定位（图2）。结果显示，ZmPIP2;6的绿色荧光能与PM107的红色荧光完全重合，ZmPIP2;6定位在细胞质膜上。

2.3 ZmPIP2;6的表达分析
为了检测ZmPIP2;6在玉米不同组织中的表达情况，分别采集玉米的不同组织（根、茎、叶、未成熟雌穗、未成熟雄穗、胚和胚乳）。提取总RNA并进行qRT-PCR分析，可知，ZmPIP2;6在这几个组织中均有表达，其中，在雄穗中表达量最高，其次在根中表达量较高，而在胚乳中的表达量相对较低（图3-A）。

在人工气候室条件下营养液培养玉米幼苗，向营养液中添加10%的PEG6000进行渗透处理或100 mmol·L-1的NaCl进行盐处理，取样进行qRT-PCR分析，结果显示，渗透胁迫处理下，玉米根中ZmPIP2;6的表达在0.5、1和2 h显著上调，并在4 h后表达呈下降趋势；玉米叶中ZmPIP2;6的表达在0.5和1 h时受到显著抑制，但在2 h显著上调，之后呈下降趋势（图3-B）。盐处理下，玉米根和叶中ZmPIP2;6的表达分别在处理早期（根6 h、叶6 h和12 h）受到抑制，表达下调；在处理后期（根12 h和1 d、叶1 d）显著上调，之后再呈下降趋势（图3-C）。推测ZmPIP2;6在玉米受到渗透和盐胁迫后根和叶中表达受到显著诱导，说明ZmPIP2;6可能参与玉米水分胁迫响应过程。

2.4 ZmPIP2;6超表达转基因拟南芥获得及鉴定
为了进一步研究ZmPIP2;6在水分胁迫中的作用，把ZmPIP2;6的CDS序列连接到含有CaMV 35S启动子的双元表达载体中（图4-A）。通过农杆菌介导的浸花序法获得转基因拟南芥植株。对T1转基因拟南芥株系进行分子鉴定，利用PCR方法对转化载体上筛选标记基因Bar进行扩增。有4个ZmPIP2;6转基因株系均能扩增出目的片段，说明其均为独立的转基因阳性株系（图4-B）。对T2的转基因株系进行qRT-PCR分析，检测ZmPIP2;6在拟南芥中的超表达效果（图4-C），结果显示，T2转基因株系中，ZmPIP2;6超表达（ZmPIP2;6 Overexpression，ZmPIP2;6-OE）株系OE1—OE4中都能检测到ZmPIP2;6的表达并且不同株系的表达有差异。选择了超表达株系OE1、OE2和OE3用作后期试验。

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图1 PIPs氨基酸序列比对

Fig. 1 Comparison of the amino acid sequences of PIPs

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ZmPIP2;6-GFP载体与mCherry标记的质膜标记（mCherry-PM；CD3-1007）共定位。标尺为20 μm

ZmPIP2;6-GFP was colocalized with a mCherry-labeled plasma membrane marker (mCherry-PM; CD3-1007). Bars=20 μm

图2 ZmPIP2;6的亚细胞定位

Fig. 2 Subcellular localization of ZmPIP2;6 in maize protoplasts

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A：ZmPIP2;6在根、茎、成熟叶、未成熟雄穗、未成熟雌穗、胚和胚乳中的相对表达情况；B：ZmPIP2;6在含有10% PEG营养液处理后的三叶期玉米幼苗中的表达；C：ZmPIP2;6在含有100 mmol·L-1 NaCl的营养液处理后的三叶期玉米幼苗中的表达

A: Relative expression levels of ZmPIP2;6 in root, stem, mature leaf, immature tassel, immature ear, endosperm and embryo; B: Trifoliolate maize seedlings were treated with 10% PEG in nutrient solution; C: Trifoliolate maize seedlings were treated with 100 mmol·L-1 NaCl in nutrient solution

图3 ZmPIP2;6在正常和胁迫条件下的表达模式

Fig. 3 Expression pattern of ZmPIP2;6 under normal and stress conditions

2.5 ZmPIP2;6超表达转基因拟南芥的抗性鉴定
将ZmPIP2;6超表达转基因拟南芥（ZmPIP2;6- OE）和野生型（WT）植株播种到正常MS培养基上，在正常条件下生长5 d后转移到含有100 mmol·L-1 NaCl和150 mmol·L-1甘露醇的培养基上分别进行盐胁迫或渗透胁迫处理7 d（图5）。结果显示，正常条件下，ZmPIP2;6-OE和WT植株的生长没有差异；在盐胁迫或渗透胁迫处理下，ZmPIP2;6-OE和WT植株地上部分和根的生长都受到明显地抑制，其中地上部分受抑制程度没有差异，但是ZmPIP2;6-OE植株主根长度显著长于WT。相应的拟南芥主根长度测定结果与照片一致，说明超表达ZmPIP2;6增强拟南芥植株对盐胁迫和渗透胁迫的耐性。

进一步的土培干旱试验中，ZmPIP2;6-OE和WT植株在正常条件下生长2周，2种材料生长情况没有差异（图6-A）。进行4周的干旱处理后，ZmPIP2;6-OE和WT植株均出现萎焉情况，但ZmPIP2;6-OE植株的萎焉程度没有WT植株严重。再进行3 d的复水处理后，ZmPIP2;6-OE植株几乎完全恢复生长，存活下来；但WT植株不能恢复生长，完全死亡（图6-A）。对2种材料的地上部分进行水分散失率测定发现，WT植株每小时的水分散失率都显著高于ZmPIP2;6-OE植株，在测定5 h后，与起始鲜重相比，WT失去68%的水分，而ZmPIP2;6-OE植株平均失去约57%水分（图6-B）。结果说明，拟南芥中超表达ZmPIP2;6可能通过降低水分散失率从而提高植物对干旱胁迫的耐性。

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A：ZmPIP2;6超表达载体的T-DNA序列示意图；B：ZmPIP2;6超表达T1代转基因株系的PCR检测；1—5：独立的转基因株系，MK：DNA Marker，PC：质粒正对照，NC：野生型负对照；C：3个独立的ZmPIP2;6超表达T2代转基因株系的qRT-PCR分析

A: Schematic illustration of T-DNA sequence of ZmPIP2;6 overexpression vector; B: PCR detection of T1 generation of ZmPIP2;6 overexpression transgenic lines; 1-5: five independent transgenic lines; MK: DNA Marker, PC: positive control, NC: WT negative control; C: qRT-PCR analysis of three representative ZmPIP2;6 overexpression transgenic lines

图4 ZmPIP2;6超表达转基因株系的检测

Fig. 4 Generation of ZmPIP2;6 overexpression transgenic lines

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*P＜0.01。下同The same as below

图5 ZmPIP2;6超表达转基因拟南芥的盐和渗透胁迫耐性的鉴定

Fig. 5 Salt and osmotic stress tolerance of ZmPIP2;6 overexpression transgenic Arabidopsis

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A：野生型和ZmPIP2;6超表达转基因拟南芥植株在正常对照和干旱条件下生长14 d以及复水3 d后的表型。B：WT和ZmPIP2;6超表达转基因株系叶片水分散失率的检测

A. Phenotype of WT and ZmPIP2;6 overexpression transgenic Arabidopsis seedlings under normal and dehydration conditions for 14 days and re-watered for another 3 days. B. Determination of water loss from detached leaves of WT and ZmPIP2;6 overexpression transgenic lines

图6 ZmPIP2;6超表达转基因植株在干旱处理下的表型以及水分散失率

Fig. 6 Phenotypes of ZmPIP2;6 overexpression transgenic lines under drought treatment and water loss rate

2.6 胁迫响应基因的表达分析
为了检测ZmPIP2;6是否影响拟南芥胁迫响应通路，对RD29A、RD29B和NHX1等分别参与拟南芥特定胁迫信号通路的基因表达进行定量分析。正常条件下土壤中生长2周的拟南芥，分别在正常条件下脱水2 h作干旱处理，用含有100 mmol·L-1 NaCl的溶液浇灌作盐处理6 h后取样。分别取叶和根样并提取RNA，通过qRT-PCR检测拟南芥胁迫响应基因的表达（图7）。结果显示，在正常条件下，RD29A和RD29B的表达在WT和ZmPIP2;6-OE植株中并没有差异；在干旱和盐处理条件下，RD29A和RD29B的表达在WT和ZmPIP2;6-OE植株中都受到诱导，但在ZmPIP2;6- E植株中的表达显著低于WT。在正常和干旱处理条件下，NHX1的表达在WT和ZmPIP2;6-OE植株中并没有差异；在盐处理条件下，NHX1的表达在WT中都显著上调，在ZmPIP2;6-OE植株中NHX1的表达显著低于WT。在正常条件下，ZmPIP2;6-OE植株中SOS3的表达显著高于WT；在干旱条件下，SOS3的表达在WT和ZmPIP2;6-OE植株中并没有差异；在盐处理条件下，SOS3的表达在WT和ZmPIP2;6-OE植株中都受到诱导，并且在ZmPIP2;6-OE植株中的表达显著高于WT。这些结果说明，在干旱或盐胁迫条件下，在拟南芥中超表达ZmPIP2;6会影响植物胁迫响应基因的表达，ZmPIP2;6可能在植物水分胁迫响应通路中起着重要的调控作用。

3 讨论
玉米基因组中已经证实含有31个AQP基因[8]，其中包括13个PIP基因，本研究中，ZmPIP2;6与其他植物物种中参与水分胁迫的PIP蛋白具有很高的同源性（图1）。氨基酸序列显示ZmPIP2;6具有典型的PIP蛋白结构，包含6个跨膜结构域，保守的HINPAVTFG氨基酸序列和2个NPA基序（图1）。通过转化玉米原生质体显示，ZmPIP2;6蛋白定位在细胞质膜（图2）。ZmPIP2;6在玉米各个组织中均有表达，但在雄穗中表达量最高（图3-A），推测雄穗中的ZmPIP2;6高表达量可能与玉米生育期对水分的大量需求有关，这个结果也与前人的研究结果一致[37,41]。渗透或盐胁迫引起的水分胁迫会对AQP基因表达产生复杂的影响[29]。本研究中玉米植株对PEG引起的渗透胁迫响应非常迅速，根中ZmPIP2;6的表达在0.5 h受到显著诱导，叶中ZmPIP2;6的表达则是先下调，再在2 h显著上调（图3-B）。王卫锋等[31]报道在PEG处理及复水时期玉米根的不同区段中的ZmPIPs的转录水平显示出差异性调节，其中ZmPIP2;5表达在胁迫时显著下调，复水后4个ZmPIPs的表达都受到诱导，其差异可能是由于玉米根不同区段的结构和功能差异所引起的。在盐胁迫条件下AQP基因的表达可分为2个阶段。盐胁迫响应初期，植物通常会抑制PIP基因的表达，从而避免当土壤水势降低时水分从根部向外界环境中流失[42-43]。一段时间以后，植物会诱导PIP基因的表达从而恢复根部导水率[44-45]。本研究中在盐处理的2个阶段，盐胁迫初期（根6 h，叶6和12 h）ZmPIP2;6在玉米根和叶中的表达下降，盐胁迫后期（根12 h和1 d，叶1 、3和5 d）ZmPIP2;6在玉米根和叶中的表达升高（图3-C）。Zhu等[30]报道盐或ABA处理玉米后，根中部分ZmPIPs在短期内有短暂的表达上调。渗透或盐胁迫条件下，ZmPIP2;6的表达受到不同程度的诱导，推测ZmPIP2;6可能参与玉米对渗透和盐胁迫的响应过程。

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图7 拟南芥胁迫响应基因的表达分析

Fig. 7 Expression analysis of Arabidopsis stress responsive genes

近几年的研究已经证实了植物中某些PIP基因在植物对干旱或盐等非生物胁迫的耐性中的重要作用[24,32-35,46]。超表达特定的PIP基因可能会对干旱或盐胁迫耐性起正面作用或负面作用[47]，一些报道称，超表达某些PIP基因能增强植物对于干旱或盐胁迫的耐性。例如，在酵母和拟南芥中超表达HvPIP2;5都显示其在渗透和盐胁迫耐性上的重要作用[36]等。而另一些研究则显示，超表达一些PIP基因使植物对于干旱或盐胁迫更加敏感[48-49]。例如，在水稻中超表达大麦HvPIP2;1使转基因水稻对盐胁迫的耐性降低[49]；烟草中超表达拟南芥AtPIP1;2也降低了转基因植物对干旱胁迫的耐性[48]。PIP蛋白在植物中具有高度的多样性及序列同源性，但是在不同植物中PIP基因在胁迫拮抗中表现出不同表达模式，可能说明PIP在不同植物中的功能多样化。本研究中，通过构建ZmPIP2;6的超表达载体并发展超表达转基因拟南芥材料（图4）。MS培养基中渗透或盐胁迫处理下的ZmPIP2;6-OE植株根长显著长于WT，说明其根的生长受到的抑制相对WT更少（图5），ZmPIP2;6-OE对渗透和盐胁迫的耐性增强。进一步土培试验中ZmPIP2;6-OE同样显示出相对WT更强的干旱胁迫耐性（图6）。这些结果都说明，拟南芥中超表达ZmPIP2;6会对渗透、盐或干旱胁迫耐性起正面作用，既能提高植株在较温和的缺水胁迫条件下（7 d的100 mmol·L-1 NaCl和150 mmol·L-1甘露醇处理）的耐性，也能增强植株在长期严重缺水条件下（2周的干旱处理）的耐性，并且在后者条件下显示出更强的耐性表型。推测ZmPIP2;6在植物受到长期干旱胁迫过程中起着重要的水分平衡功能。本研究中使用的3个独立的拟南芥转基因超表达株系，其中，OE2株系ZmPIP2;6的表达量显著高于另外2个株系但耐性表型却相似。推测超表达拟南芥耐性的增强不仅需要ZmPIP2;6蛋白在植物水分调控过程中行驶重要功能，可能还需要ZmPIP2;6蛋白与其他PIP蛋白或其他调控形式的协同作用。

RD29A和RD29B是ABA诱导表达基因[50]，在干旱和盐处理条件下，RD29A和RD29B的表达在WT和ZmPIP2;6-OE中都受到诱导，但在ZmPIP2;6-OE中的表达显著低于WT（图7）。SOS1是植物细胞质膜上的Na+/H+逆向转运体[51]，SOS3在盐胁迫中具有钙离子感应体的功能，盐胁迫能引起瞬时的钙离子浓度增加，并能被SOS3感应[52]。SOS3能够通过与SOS2互作形成SOS2/SOS3激酶复合体磷酸化并激活SOS1[53-54]。NHX1是将Na离子转运到植物液泡中的Na+/H+转运体[55]，其活性也受SOS通路调控[56]。前期报道称在拟南芥中超表达AtNHX1、SOS1或SOS3都能增加植物的耐盐性[55,57-58]。本研究中在正常条件下，ZmPIP2;6-OE中SOS3的表达显著高于WT；在盐处理条件下，SOS3的表达在WT和ZmPIP2;6-OE中都受到诱导，并且在ZmPIP2;6-OE中的表达显著高于WT；SOS1和SOS2的表达在WT和ZmPIP2;6-OE中没有显著差异（结果未显示）。盐处理使得NHX1的表达在WT中显著上调，但在ZmPIP2;6-OE中NHX1的表达却没有受到诱导（图7）。在其他一些研究中也曾报道，在植物中超表达特定的水通道蛋白基因后，在水分胁迫条件下，转基因植物的胁迫响应基因的转录水平会发生不同程度变化[24,59]。本研究结果显示，在干旱或盐胁迫条件下，拟南芥中超表达ZmPIP2;6可能会影响植物胁迫响应基因的调控。

4 结论
玉米内在质膜蛋白基因ZmPIP2;6的表达在渗透或盐胁迫下受到诱导，在拟南芥中超表达ZmPIP2;6会增强植株对渗透胁迫、干旱胁迫和盐胁迫的耐性，并且在干旱或盐胁迫条件下会影响拟南芥中胁迫相关基因的表达。推测ZmPIP2;6可能参与植物对水分胁迫的应答过程。

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Functional Characterization of a Maize Plasma Membrane Intrinsic Protein ZmPIP2;6 Responses to Osmotic, Salt and Drought Stress

ZHOU Lian, XIONG Yuhan, HONG Xiangde, ZHOU Jing, LIU Chaoxian, WANG Jiuguang, WANG Guoqiang, CAI Yilin

(Maize Research Institute, College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715)

Abstract: 【Objective】Plasma membrane Intrinsic Proteins (PIPs) exist widely in the membrane system of plant cells, which are essential to water transport and water balance in plant. The aim of this study is to explore the function of ZmPIP2;6 in plant water stress tolerance, and provide potential gene resources for new varieties of stress tolerance maize breeding. 【Method】Amino acid sequences of ZmPIP2;6 was analyzed and compared with other PIPs that involved in water stress tolerance. To verify the subcellular localization of ZmPIP2;6,ZmPIP2;6-GFP infusion vector was constructed and assessed using maize protoplasts isolated from leaves of maize seedlings. Tissues fromroot, stem, mature leaf, immature tassel, immature ear, endosperm and embryo of maize were isolated. Samples from root and leaf of maize were collected at different time after PEG or NaCl treatment. Total RNA were extracted, and expression pattern of ZmPIP2;6 in different tissues or under water stress condition was investigated by qRT-PCR. Transgenic Arabidopsis plants that overexpressed ZmPIP2;6 were generated and identified. The phenotype of ZmPIP2;6 overexpression transgenic Arabidopsis that tolerated to osmotic, salt or drought stress were monitored and primary root length and leaf water loss rate were measured. A number of stress responsive genes in ZmPIP2;6 overexpression Arabidopsis were detected under drought or salt condition.【Result】Analysis and comparison of the amino acid sequences showed that ZmPIP2;6shared the same conserved structural domains andhad a high degree of sequence similarity with other PIPs. The subcellular localization was assessed using maize protoplasts indicated ZmPIP2;6 was located on the plasma membrane. qRT-PCR result showed that ZmPIP2;6 was highly expressed in tassel. Treatment with PEG or NaCl resulted in induced expression of ZmPIP2;6 in root and leaf of maize. Overexpression of ZmPIP2;6 in transgenic Arabidopsis showed enhanced osmotic and salt stress tolerance in MS media plate and improved drought stress tolerance in soil condition compared to wild type. Expressions of related genes in the stress signaling pathway were changed in ZmPIP2;6 overexpression Arabidopsis under drought or salt condition. 【Conclusion】 Expression of ZmPIP2;6 was up-regulated under osmotic or salt stress condition. Overexpression of ZmPIP2;6 inArabidopsis enhanced osmotic, salt and drought stress tolerance. A number of stress responsive genes in ZmPIP2;6 overexpression Arabidopsis were affected under salt or drought stress condition. These results indicated that ZmPIP2;6 might be involved in plant water stress responsive pathway.

Key words: maize (Zea mays L.); plasma membrane intrinsic proteins; osmotic stress; drought stress; salt stress

收稿日期：2019-07-03；

接受日期：2019-08-02

基金项目：国家自然科学基金（31601312）

联系方式：周练，E-mail：zhoulianjojo@swu.edu.cn。熊雨涵，E-mail：xiongyh11@163.com。周练和熊雨涵为同等贡献作者。通信作者蔡一林，E-mail：caiyilin@163.com

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（责任编辑 李莉）