运动通过调节皮层-纹状体通路功能连接可塑性改善PD模型...

奥鹏网院作业

运动通过调节皮层-纹状体通路功能连接可塑性改善PD模型大鼠行为
时凯旋1,2，刘晓莉1*，乔德才1

（1.北京师范大学 体育与运动学院，北京 100875；2.中国地质大学 体育部，北京 100083）

摘 要：目的：帕金森病（Parikinson's disease，PD）是起始于黑质-纹状体通路多巴胺（dopamine，DA）损耗的一种神经退行性疾病，运动皮层-纹状体通路功能连接强度改变被认为是导致PD运动障碍产生的重要病理基础。通过计算神经信号振荡同步性量化分析皮层-纹状体之间功能连接强度，并从代谢型谷氨酸受体（mGluR2/3）介导的谷氨酸（glutamte，Glu）兴奋性传导角度来阐释运动干预PD的神经调控机制。方法：清洁级SD大鼠随机分为3组：假手术组（Control）、PD组（PD）和PD运动组（PD+Ex），于右侧内侧前脑束（medial forebrain bundle，MFB）注射6-羟基多巴（6-hydroxydopamine hydrobromide，6-OHDA）建立单侧PD大鼠模型。采用阿朴吗啡（apomorphine，APO）旋转行为实验，并结合黑质和纹状体酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）表达水平评价PD大鼠模型的可靠性。PD+Ex组大鼠进行为期4周的跑台运动干预（11 m/min，30 min/天，5天/周），在第0、1、2、3、4周末检测各组大鼠自主活动行为；利用在体多通道电生理技术，观察各组大鼠运动皮层和纹状体局部场电（local field potentials，LFPs）活动；采用微透析-高效液相色谱联用技术检测纹状体胞外Glu浓度，结合生化技术检测纹状体mGluR2/3蛋白表达。结果：自主行为测试结果显示，PD+Ex组较PD组快速和慢速移动时间占比均显著增加（P＜0.05），静止状态时间占比显著降低（P＜0.05），且大鼠自主活动行为改善效果具有时间依赖性。电生理结果表明，PD+Ex组运动皮层-纹状体β振荡的相干系数和相位同步指数较PD组显著下降（P＜0.05），且变化也具有时间依赖性。蛋白检测结果显示，PD+Ex组纹状体mGluR2/3表达较PD组显著上调（P＜0.01）；递质检测结果显示，PD+Ex组纹状体胞外Glu浓度较PD组显著降低（P＜0.01）。结论：PD模型大鼠自主活动行为降低伴随运动皮层-纹状体通路功能连接异常。运动干预通过调节运动皮层-纹状体通路功能连接有效改善PD模型大鼠自主活动行为。运动皮层-纹状体通路功能连接的运动依赖可塑性增强可能是改善PD大鼠自主活动行为的神经调控机制之一，mGluR2/3受体介导的Glu兴奋性传递参与了这一过程。

关键词：运动；帕金森病；功能性连接可塑性；皮层-纹状体通路；同步振荡；谷氨酸

帕金森病（Parikinson’s disease，PD）是一种典型的神经退行性疾病，运动不能、肌僵直、姿势/步态异常及震颤麻痹是主要临床症状（Lang et al.，1988）。PD发病机制尚不明确，多巴胺（dopamine，DA）缺失后皮层-纹状体谷氨酸（glutamate，Glu）能过度传导，引起皮层-基底神经节环路内参与运动调控的多个核团β振荡增高及同步性增强，从而影响运动调控神经信息的正常编码，被认为是PD运动障碍发生发展的重要病理基础（Bell et al.，2015；Sanabria et al.，2017）。临床研究证实，丘脑底核深部脑刺激术和左旋多巴药物治疗均可降低皮层-基底神经节环路β振荡的同步性，为同步振荡与行为功能的关联性提供了直接证据（Accolla et al.，2016；Gulberti et al.，2015）。

目前，临床仍缺乏有效治愈PD的方法，药物或手术疗法仅能延缓或减轻PD病症（Raza et al.，2019）。近年发现，运动疗法可显著改善PD患者运动表现和自主生活能力，提高药物和手术治疗的有效性，因而逐渐被临床认可与运用（Ridgel et al.，2009）。围绕皮层-纹状体通路在PD运动防治中的重要作用的研究，已经证实运动的神经保护作用可降低PD大鼠纹状体胞外Glu浓度（Shi et al.，2019），抑制PD小鼠皮层-纹状体Glu突触传递效能的异常增高（赵刚等，2019）；减轻了PD大鼠皮层-纹状体Glu兴奋性毒作用导致的纹状体中等多棘神经元（medium spiny neurons，MSNs）结构与功能的异常（Wei et al.，2017），为PD皮层-纹状体通路功能的运动依赖可塑性发生奠定了良好的基础。第Ⅱ组代谢型谷氨酸受体（ionot ropic glutamate receptors，mGluR2/3）主要分布于皮层-纹状体Glu突触前膜，是调节突触前Glu释放及突触传递效能的重要细胞分子（Conn et al.，2005），推测PD大鼠皮层-纹状体通路功能连接可塑性可能与运动干预上调mGluR2/3表达、抑制皮层-纹状体Glu释放有关，但目前尚未见到相关实验证据。为此，拟采用在体多通道电生理记录技术，观察运动皮层-纹状体通路β振荡同步性变化，并采用生化技术检测纹状体胞外Glu浓度及mGluR2/3表达，从Glu介导的皮层-纹状体通路功能连接可塑性的角度进一步阐释运动改善PD模型大鼠行为功能的神经调控机制。

1 材料和方法
1.1 实验设计与流程
大鼠在第2周开始进行适应性跑台训练，剔除不能进行跑台运动的大鼠，在第2周末进行6-羟基多巴（6-hydroxydopamine hydrobromide，6-OHDA）注射及电极或探针植入手术。在术后第1周周末进行阿朴吗啡（apomorphine，APO）诱导的旋转行为测试，剔除不成模大鼠。在第0周末进行行为学测试与电信号记录，第1周运动组大鼠进行跑台运动干预；行为学测试和电信号的记录于第1、2、3、4周的固定时间完成，所有实验结束后48 h进行生化检测（图1）。

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图1 实验设计流程
Figure 1.Protocol of the Experimental Trials

注：Biochemical assays包括免疫印迹（western blot，WB）和高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）。

1.2 实验动物及分组
选用雄性Sprague-Dawley 8周龄大鼠（体重230～250 g）为实验对象。动物实验过程按实验动物使用的3R原则给予人道主义关怀。大鼠实行分笼饲养，自由饮食，动物房室内温度控制在20℃～25℃，相对湿度为45%～50%。适应性饲养1周后随机分为假手术安静组（Control）和PD模型组，待模型鉴定成功后再分为PD安静组（PD）和PD运动组（PD+Ex）。每组根据实验技术不同又分为2个亚组，即电生理实验组（Control：n=8；PD：n=7；PD+Ex：n=9）、微透析-高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）与蛋白检测组（Control：n=10；PD：n=11；PD+Ex：n=14）。

1.3 PD模型制备与电极、探针植入手术
单侧损伤PD大鼠模型制备。采用10%水合氯醛（3.5 ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠。参考Paxinos等（1997）大鼠脑立体定位图谱，标记右侧内前脑侧束（medial forebrain bundle，MFB；AP：-4.3 mm，R：1.5 mm，DV：7.6～7.8 mm）为染毒注射位点。采用微量注射泵将6-OHDA以1 μL/min速度注射4 μL，留针5 min后再缓慢退针。假手术组大鼠在相同注射位点给予等量赋形剂含0.02%抗坏血酸的生理盐水。

电极植入手术。16通道梯度阵列电极（Stablohm 675，间距 200 μm，直径 35 μm）包括 8短和 8长记录电极及1根参比电极。6-OHDA或赋形剂注射完成后，选取运动皮层（AP：1.8～3.0 mm，R：2.3～3.3 mm）、纹状体（AP：0～1.4 mm，R：2.3～3.3 mm）为开颅区；于手术显微镜（WPI，USA）下剥离硬脑膜，电极固定于微推进器（Kofe，USA）后缓慢将8通道短电极植入运动皮层（DV：2.0～2.5 mm），其他8通道长电极植入纹状体（DV：4.0～5.5 mm）；记录页面观察到至少3/16通道神经元放电幅值的信噪比＞3：1时停止。信号稳定后采用生物硅胶（WPI，USA）封口充当颅骨，牙科水泥固定电极并覆盖颅骨表面。术后碘伏消毒并腹腔注射青霉素减少感染。

探针植入手术。开颅手术与上述方法相同，6-OHDA药物注射后采用右侧纹状体（AP：0.3 mm，R：3.5 mm，DV：3.5 mm）为探针埋藏位点，缓慢将微透析探针和套管尖端下至该位置，螺丝固定后采用牙科水泥覆盖，术后护理与上述方法一致。

1.4 PD大鼠模型评价
1.4.1 APO诱导的旋转行为试验

大鼠6-OHDA染毒术后第7天于颈部皮下注射APO（0.5 mg/kg），稳定5 min后开始记录旋转行为，记录时间为30 min；以向右侧（损伤侧）旋转圈数与向左侧（健侧）旋转圈数的差值＞100转/30 min作为PD大鼠模型制备成功的标准（Jia et al.，2019）。

1.4.2 酪氨酸羟化酶的免疫组化检测

免疫组化。所有实验结束后48 h，采用10%水合氯醛（4.5 ml/kg）麻醉大鼠、灌流取脑，在多聚甲醛（4%）中浸泡固定24 h，用蔗糖（30%）脱水、包埋后进行切片（片厚30 μm）。经免疫组化ABC法染色后，每只大鼠选用黑质（AP：-4.2～-6.6 mm）和纹状体（AP：2～-1 mm）连续相邻切片，均取片6张，使用相同的配置及光强度对每一张切片进行拍照。用Image-pro Plus 6.0软件对黑质酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）阳性细胞计数和纹状体TH阳性纤维阳性细胞计数定量，选取右侧脑相同区域位置0.04 mm2矩形框，每只大鼠选取3个相同层面的切片。数据标准化操作方法：相同的矩形框，选取皮质白质部位的光密度值为W，纹状体或黑质部位的光密度值为S，得到标准化系数C=（S-W）/（S+W），损伤侧与未损侧进行标准化计算后，将损伤侧/未损伤侧比值作为最后评价指标。

1.5 mGluR2/3蛋白的免疫印迹检测
免疫印迹（western bolt，WB）。大鼠麻醉后取脑，于冰上迅速剥离右侧纹状体，加入适量裂解液提取各组脑组织总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度后加入5倍SDS缓冲液，沸水煮5 min，冷却后于-80℃冰箱保存待测。取30 μg蛋白样本，进行SDS-PAGE电泳分离后转移蛋白至PVDF膜上。将PVDF膜置入保鲜膜中，加入封闭液，室温条件下缓慢摇动90 min。将膜置于用TBST溶解的5%脱脂奶粉中封闭，加入一抗4℃孵育过夜。PBS洗膜，加入二抗放置在摇床上，室温下孵育90 min后洗膜。室温反应1 h加入ECL化学发光液于膜上，X射线曝光显影，以β-actin为内参照，采用图像分析软件分析图片，以每个条带的积分光密度（integral optical density，IOD）值与其相对应的β-actin IOD值之比表示蛋白的相对表达水平。

1.6 运动干预方案
PD+Ex组大鼠跑台运动干预在第1周介入，采用Tajiri等（2010）提出的匀速跑台运动干预方案（11 m/min，30 min/天，5天/周，共4周）。运动干预时间在每天同一时间进行，环境保持一致。

1.7 自主活动行为测试
采用自主活动监测装置（Panlab，Spanish）记录大鼠自主活动行为（图2）。实验开始前先将大鼠置于清洁测试箱中适应5 min，正式测试时间为30 min。每次测试完毕取出大鼠，用75%酒精和纸巾清洁箱体内部，确保不影响下次测试。采用SMART 3.0软件对总运动距离（distance in zone）、快速移动（fast moving）、慢速移动（slow moving）、安静状态（resting）时间占比等指标进行统计计算。

1.8 纹状体细胞外液采集及HPLC检测
样品采集。直径2 mm的微透析探针（CMA，Solan，Sweden）缓慢插入套管，并用封口膜固定。将恒流泵的人工脑脊液（145 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，1.2 mmol/L CaCl2，1.0 mmol/L MgCl2，2.0 mmol/L NaH2PO4，5.4 mmol/L glucose，pH：7.4）流速调至 2 μL/min，待灌流平衡后，打开冷冻收集器收集纹状体透析液，每次采样15 min，样品放于-80℃冰箱待检测。

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图2 大鼠自主活动能力监测设备
Figure 2.The Rat's Locomotor Behavior Test

Glu浓度检测。采用HPLC-荧光法检测纹状体胞外Glu浓度。流动相A：0.1 mol/L的KH2PO4溶液，调节pH至6.60；流动相B：纯甲醇（40%恒流洗脱），流速设为1.0 mL/min，样品测试前进行OPA柱前衍生。

1.9 运动皮层-纹状体神经电信号采集与分析
1.9.1 神经电信号采集

Cerebus-128多通道电生理信号记录系统（Cyberkinetics）设置采样频率为1 kHz，低通250 Hz滤波得到局部场电（local field potentials，LFPs）信号，每次采样时间为30 min；并通过Neuromotive系统（Cyberkinetics，USA）同步追踪大鼠行为。

1.9.2 LFPs数据分析

相干分析（coherence value）。采集的局部场电位LFPs信号采用希尔伯特（Hilbert）变化提取瞬时相位（王策群等，2014；Siapas et al.，2005；Sigurdsson et al.，2010），具体方法为如下。

1）给定连续的时间信号S(t)=A(t)ejφs(t)，其中A（t）为信号的瞬时振幅，φs（t）为信号的瞬时相位；

2）S（t）的希尔伯特变换为pagenumber_ebook=53,pagenumber_book=51（t），用如下公式计算：

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式中，p、v为柯西主值；

3）根据解析信号方法求解瞬时相位：

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互相关分析时将脑电信号划分为n个时间段，每个数据段先进行窗平滑处理，再对得到的窗函数进行傅里叶变换。相干函数由归一化互谱函数得到，选取两个通道之间振幅、频率和相位角的一致程度，即皮层和纹状体两个脑区神经电活动的相干性情况，以此评价LFPs的同步关系。具体计算方法如下。

Xn(k)和Yn(k)分别代表皮层和纹状体第n次实验中的两个通道，X和Y LFPs功率谱GXX(k)和GYY(k)及互谱GXY(k)的计算公式如下：

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其中，k与频率分量fk的对应关系为：fk=kfs/M，式中，fs为采样率，M为每小段时间段内采样点数。

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CXY(k)为相干系数，取值范围为0～1。当相干系数趋于0时，表明两通道LFPs在fk频率相干度较低，即二者相互独立；相干系数趋于1时，说明两导LFPs在fk频率段节奏趋于一致。

相位同步指数（coherence phase index）。相位同步指数适用于评价窄带频域的相位同步化程度，此算法可以排除信号幅度的影响，只从相位上考察两个信号之间的同步性（Kondabolu et al.，2016；Pittman-Polletta et al.，2018；Rohenkohl et al.，2018），算法如下。

1）对两导信号x1(t)和x2(t)进行Hilbert变换，求取瞬时相位φ1(t)和φ2(t)；

2）求取φ1(t)和φ2(t)的相位差，并取一段进行平均，求其相位同步值PLV：

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式中，|∙|表示复数的模；N为取样点的总数。相位同步指数PLV取值范围在0～1之间，PLV是0时，两LFPs之间无任何相位同步；当PLV是1时，两LFPs之间有稳定的相位差，即两LFPs间的相位同步。

1.9.3 电生理组织切片定位

所有试验结束后，各组大鼠用4%多聚甲醛灌流、取脑，包埋后切片（50 μm），进行尼氏染色和组织定位（图3）。剔除运动能力差、造模或手术失败的大鼠后，共24只大鼠进入最后电生理数据分析。

1.10 数理统计
采用Sigmaplot 13.0做图，SPSS 21.0进行统计结果分析，数据统计结果用平均值±标准差（M±SD）表示。各组间数据差异性用单因素方差分析（One way ANOVA），各组行为学数据随时间变化的差异性用重复测量方差（Repeated ANOVA）分析，各组电生理数据的功率谱密度（power spectral density，PSD）值采用可重复双因素方差（two-factor with replication）分析，组间、组内百分比分析用卡方检验，相干系数与相关系数组间、组内比较用U检验。所有数据以P＜0.05视为具有统计学意义。

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图3 运动皮层和纹状体电极位点组织切片定位
Figure 3.The Location of Electrode Tract in the Motor Cortex and Striatum

注：M1为运动皮层，Str、CPU为纹状体。

2 结果
2.1 PD模型可靠性评价
染毒后第7天进行APO诱导旋转行为测试，结果显示，Control组大鼠未出现异常旋转行为，PD模型组大鼠共41只净旋转次数＞100转/30 min（152.37±15.41/30 min），符合模型判定标准。

第4周行为测试结束后进行免疫组化取材及染色，结果显示，Control组大鼠两侧黑质TH阳性细胞均匀、对称分布，PD模型组大鼠损伤侧黑质TH阳性细胞数量（图4A）和纹状体TH阳性纤维数量（图4B）显著减少，双侧呈现不对称性。Control组大鼠黑质与纹状体TH阳性表达均无显著性改变（P＞0.05），与Control组相比，PD组黑质DA能神经元丢失达90%以上（0.97±0.05 vs.0.06±0.02，P＜0.01），纹状体TH阳性纤维含量丢失达到85%以上（0.23±0.02 vs.1.07±0.08，P＜0.01）；PD+Ex组黑质与纹状体TH阳性表达较PD组无显著性改变（P＞0.05）；上述结果进一步证实PD大鼠模型成功（图4C、D）。

2.2 自主活动能力测试结果
自主活动能力测试结果显示，3组大鼠自主活动能力存在明显差异（图5A），与Control组相比，PD组大鼠总运动距离显著减少（P＜0.01），且在中心区域停留较少；与PD组大鼠相比，PD+Ex组大鼠总运动距离显著增加（P＜0.05），但仍少于Control组（P＜0.05，图5B）。对3组大鼠各周行为测试结果进行比较，与第0周相比，Control组大鼠各周总运动距离无显著变化（P＞0.05）；PD组大鼠总运动距离有逐渐下降趋势，仅第4周出现显著减少（P＜0.05）；PD+Ex组第1周总运动距离出现增加趋势，第3周显著增加（P＜0.05），第4周极显著增加（P＜0.01，图5C）。

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图4 黑质和纹状体TH免疫组化结果
Figure 4.TH Immunostaining Results in the Striatum and SNc

注：**P ＜ 0.01，与Control组比较。

大鼠各种状态时间占比的统计结果表明，与Control组相比，PD组快速移动和慢速移动时间占比均显著减少（P＜0.01，P＜0.05），而安静状态时间明显增加（P＜0.01）；与PD组相比，PD+Ex组快速移动和慢速移动时间占比均明显提升（P＜0.05），而安静状态时间占比显著降低（P＜0.05），但快速移动时间仍低于 Control组（P＜0.05，图5D）。

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图5 自主活动行为测试结果
Figure 5.Locomotor Behavior Results

注：*P＜0.05，与Control组或基线水平比较；**P ＜0.01；#P＜ 0.05，与PD组比较。

2.3 运动皮层和纹状体LFPs功率频谱分析
与Control组比较，PD组大鼠运动皮层低频振荡和中频振荡的能量明显增高；与PD组比较，PD+Ex组运动皮层中高频段（约8～35 Hz）能量带减弱，但仍强于Control组（图6）。

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图6 各组大鼠运动皮层LFPs的功率频谱图
Figure 6.Power Spectral Density of LFPs in Motor Cortex

注：50 Hz因做了陷波处理，故能量较低。

与Control组相比，PD组大鼠纹状体内（8～35 Hz）振荡能量带明显增强，PD+Ex组较PD组有一定减弱，但仍强于Control组（图7）。

2.4 运动皮层-纹状体β振荡同步性分析
采用matlab软件进行PSD数据处理与分析后发现，PD大鼠运动皮层和纹状体内10～30 Hz的β频段功率谱密度PSD出现异常增高（图8C），运动干预后PD大鼠运动皮层和纹状体β频段PSD值降低（图8D）。

采用相干分析与相关分析后发现，与Control组相比，PD组和PD+Ex组运动皮层-纹状体β振荡的相干系数显著增加（P＜0.01，P＜0.05）；PD+Ex组较PD组显著降低（P＜0.05，图9A）；相位同步指数与相干系数结果相一致（图9B）。组内数据统计结果发现，Control组相干系数第1、2、3、4周与第0周比均无显著差异（P＞0.05），PD+Ex组第1、2周相干指数与第0周比无显著差异（P＞0.05），第3周较第0周显著下降（P＜0.05），第4周极显著降低（P＜0.01），PD组第4周较第0周相干系数显著增高（P＜0.05，9C）；相位同步指数各组大鼠随时间变化的趋势与相干系数相同（图9D）。

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图7 各组大鼠纹状体LFPs功率频谱图
Figure 7.Power Spectral Density of LFPs in Striatum

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图8 大鼠运动皮层--纹状体LFPs及PSD结果
Figure 8.Power Spectral Density and LFPs in Motor Cortex and Striatum

2.5 纹状体Glu浓度检测结果和mGluR2/3蛋白表达
3组大鼠HPLC结果显示，与Control组相比，PD组和PD+Ex组纹状体胞外Glu浓度均显著升高（P＜0.01，P＜0.05），但PD+Ex组较PD组显著降低（P＜0.01，图10A）。WB分析结果显示，PD组和PD+Ex组mGluR2/3蛋白水平均较Control组显著下调（PD：P＜0.01，PD+Ex：P＜0.05，图10B），PD+Ex组mGluR2/3蛋白水平显著高于PD组（P＜0.01）。

3 讨论
皮层和基底神经节是哺乳类动物运动行为调控的重要中枢。纹状体作为皮层向基底神经节信息输入脑区，主要负责神经信息的整合与编码，并通过直接与间接通路调节运动发起与停止、动作的协调性与精确性。皮层-基底神经节环路内多频段同步振荡活动能够量化空间上分离的神经元在时间上的功能性连接强度，被认为是哺乳类动物运动和技能学习过程中大脑神经网络信息加工的重要机制，也是脑功能连接状态的主要生理表现形式之一（Schroll et al.，2016；Wichmann et al.，2010）。

3.1 PD模型大鼠运动皮层-纹状体通路功能性连接异常
PD病理状态下，纹状体神经元电活动改变在麻醉与清醒PD动物模型的研究中均已被证实（Chen et al.，2018；Delaville et al.，2014；Lozovaya et al.，2018）。Oswal等（2013）、Brittain等（2014）、De等（2019）、Delaville等（2014）研究发现，PD动物运动皮层神经元出现异常β振荡，且经基底神经节各核团逐级放大，同时伴随振荡的同步性增强，这可能是导致动作迟缓和自主活动减少的病理基础。长期使用左旋多巴药物治疗引起PD动物丘脑底核神经元β振荡增强也与异动症发病有关（Alonsofrech et al.，2006；Picconi et al.，2018）。Sanabria等（2017）、Brown等（2005）认为，运动皮层-基底神经节环路多个核团出现β振荡同步性增强是PD患者及动物脑功能连接异常的表现形式之一。本研究也发现，PD模型大鼠运动皮层-纹状体β振荡异常增高，且之间的相干系数和相位同步指数显著增加，振荡的同步性增强，表明运动皮层-纹状体通路功能连接增强，与上述研究结果一致。

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图9 运动皮层--纹状体β振荡的同步性分析
Figure 9.Results of Synchronization in Corticostriatal β Oscillation

注：*P＜ 0.05，与Control组或基线水平比较；**P＜ 0.01。

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图10 纹状体胞外Glu浓度和mGluR2/3表达水平
Figure 10.Extracellular Glutamate Levels and mGluR2/3 Expression in Striatum

注：*P＜0.05，与 Control组比较；**P＜0.01；##P＜0.01，与PD组比较。

脑片膜片钳实验证实，DA损耗后，皮层-纹状体Glu能突触的兴奋性突触后场电位（field excitatory postsynaptic potentials，fEPSPs）显著升高，表明该通路突触传递增强（Edouard et al.，2016）。皮层神经元Spike-LFPs耦合增加，Glu释放增多，纹状体MSNs突触前、后膜Glu受体活性改变，可能均是导致PD状态皮层-纹状体通路突触传递增强的原因（Damodaran et al.，2014；Warre et al.，2011）；皮层-纹状体兴奋性Glu能突触的同步活动叠加是通路功能连接可塑性的基础。由此推测，皮层-纹状体运动调控通路的驱动异常与PD大鼠行为障碍和自主活动减少有关。

3.2 运动调节PD模型大鼠运动皮层-纹状体通路功能连接可塑性
规律运动可促进脑的神经可塑性已经成为共识。Li等（2012）、Steib等（2019）研究证实，太极拳、跑步机等多种运动形式均能改善PD患者的行为功能障碍；本研究及前期的研究均证明，跑台运动可明显改善PD大鼠的自主活动行为、步态、平衡和协调能力（时凯旋等，2017）。采用在体电生理学技术观察发现，跑台运动降低了PD模型大鼠运动皮层-纹状体通路β振荡的同步性，重塑了该通路功能连接可塑性；且发现运动皮层-纹状体通路功能连接可塑性改变与PD模型大鼠自主活动行为改善均存在类似的时间依赖关系；基于此，运动皮层-纹状体通路功能连接的运动依赖可塑性增强可能是改善PD大鼠自主活动行为的神经调控机制的假说。

研究发现，早期运动干预介导的神经保护作用可降低PD模型大鼠皮层-纹状体通路Glu的兴奋性毒作用，纠正由于纹状体内DA和Glu失衡导致运动调节通路的功能紊乱（Shi et al.，2017，2019）；利用脑片膜片钳和免疫印迹技术研究发现，跑台运动可降低PD动物皮层-纹状体Glu突触传递（赵刚等，2019）；Glu兴奋性驱动减弱使MSNs适当去同步化，使皮层-纹状体通路对信息整合处理的功能得到改善。Lee等（2018）、Elena等（2018）通过损毁苍白球或电刺激丘脑底核的方法，降低运动皮层-纹状体通路β振荡的同步性也达到改善PD行为功能的效果。因此，运动皮层-纹状体通路功能连接的运动依赖可塑性增强可能是改善PD大鼠自主活动行为的神经调控机制之一。

3.3 Glu兴奋性传导参与皮层-纹状体通路运动依赖可塑性的调节
Glu作为中枢神经系统的兴奋性神经递质，参与运动皮层-纹状体突触可塑性的调节。Glu由突触前释放，激活突触后膜上的离子型Glu受体（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA），触发Ca2+等阳离子内流介导的突触后神经元去极化，产生动作电位或局部场电位。PD病理状态下，由于缺乏DA调节的内在K+电流，会增加皮层-纹状体突触Glu兴奋性突触后电位（excitatory postsynaptic potentials，EPSP）传入，趋使纹状体较多MSNs兴奋，导致皮层-纹状体通路β振荡的同步性增强（Lozovaya et al.，2018）。mGluR2/3位于运动皮层-纹状体突触前膜，作为突触前异源性受体调控Glu释放，同时还作为自身受体抑制电压门控钙通道（voltage gated calcium channel，VGCC）活化，降低Glu突触兴奋性传导（图11），已被认为是调控皮层-纹状体Glu突触信息传递和功能可塑性的重要细胞靶分子。

6-OHD染毒大鼠纹状体mGluR2/3表达下调，引起胞外Glu浓度增高；给予mGluR2/3激动剂抑制Glu释放，可抑制皮层-纹状体Glu突触的过度传导，减轻Glu的兴奋性毒作用（Conn et al.，2005）。此外，PD模型大鼠纹状体mGluR2/3表达下调引起Glu兴奋性毒作用增强与纹状体MSNs树突棘脱落密切相关（Garcia et al.，2010；Murray et al.，2002）。有研究提出，激活mGluR2/3促进MSNs树突棘结构可塑性，可能是抑制PD皮层-基底神经节通路功能连接强度的潜在细胞分子机制（Lovinger et al.，1995；Picconi，2002）。本研究发现，4周跑台运动上调mGluR2/3表达并降低纹状体胞外Glu浓度，表明mGluR2/3介导的Glu兴奋性传递参与了PD大鼠运动皮层-纹状体通路功能连接强度的调节，提示mGluR2/3可能是调控运动皮层-纹状体通路运动依赖可塑性的重要细胞分子靶点。后续将拟选用D2-Cre或D1-Cre转基因小鼠，通过纹状体注入兴奋性光敏感蛋白或抑制性光敏感蛋白病毒，利用全细胞膜片钳结合光遗传技术精准激活皮层-纹状体突触前膜上的mGluR2/3，实现对D1-MSNs和D2-MSNs兴奋性的调控，并从胞内Ca2+信号转导通路及VGCC活性水平揭示mGluR2/3调控PD小鼠皮层-纹状体通路运动依赖可塑性的细胞分子机制，进一步验证本研究提出的假设。

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图11 mGluR2/3对皮层--纹状体突触传导的调节
Figure 11.The Regulation of mGluR2/3 in Corticostriatal Synaptic Transmission

4 结论
PD模型大鼠自主活动行为降低伴随运动皮层-纹状体通路功能连接异常。运动干预通过调节运动皮层-纹状体通路功能连接有效改善PD模型大鼠自主活动行为。运动皮层-纹状体通路功能连接的运动依赖可塑性增强可能是改善PD大鼠自主活动行为的神经调控机制之一，mGluR2/3受体介导的Glu兴奋性传递参与了这一过程。

参考文献：

陈巍，时凯旋，刘晓莉，等，2015.运动干预通过纹状体MSNs结构可塑性改善PD模型大鼠行为功能［J］.中国运动医学杂志，34（3）：228-234.

时凯旋，刘晓莉，乔德才，等，2017.跑台运动对PD模型大鼠运动皮层异常β振荡的调节作用［J］.西安体育学院学报，34（5）：83-91.

王策群，陈强，张栌，等，2014.多通道在体记录技术：神经元放电与节律性场电位间的相位分析方法［J］.生理学报，66（6）：746-755.

赵刚，张丹昱，刘晓莉，等，2019.多巴胺D2型受体可能参与运动对帕金森病小鼠皮层-纹状体突触传递及自主活动的调节［J/OL］.生理学报，71（4）：547-554.

ACCOLLA E A，HERROJO R M，HORN A，et al.，2016.Brain networks modulated by subthalamic nucleus deep brain stimulation［J］.Brain，139（Pt 9）：2503-2515.

ALONSOFRECH F，ZAMARBIDE I，ALEGRE M，et al.，2006.Slow oscillatory activity and levodopa-induced dyskinesias in Parkinson’s disease［J］.Digest World Core Med J，129（7）：1748-1757.

BELL P T，GILATM，O’CALLAGHANC，etal.，2015.Dopaminergic basis for impairments in functional connectivity across subdivisions of the striatum in Parkinson’s disease［J］.Hum Brain Mapp，36（4）：1278-1291.

BRITTAIN J S，BROWN P，2014.Oscillations and the basal ganglia：Motor control and beyond［J］.Neuroimage，85（2）：637-647.

BROWN P，WILLIAMS D，2005.Basal ganglia local field potential activity：Character and functional significance in the human［J］.Clin Neurophysiol，116（11）：2510-2519.

CHEN H，LEI H，XU Q，2018.Neuronal activity pattern defects in the striatum in awake mouse model of Parkinson’s disease［J］.Behav Brain Res，341：135-145.

CONNP J，BATTAGLIA G，MARINOMJ，etal.，2005.Metabotropic glutamate receptors in the basal ganglia motor circuit［J］.Nat Rev Neurosci，6（10）：787-798.

DAMODARANS，EVANS R C，BLACKWELL K T，2014.Synchronized firing of fast-spiking interneurons is critical to maintain balanced firing between direct and indirect pathway neurons of the striatum［J］.J Neurophysiol，111（4）：836-848.

DE HEMPTINNE C，WANG D D，MIOCINOVIC S，et al.，2019.Pallidalthermolesion unleashes gamma oscillations in the motor cortex in Parkinson’s disease［J］.Mov Disord，34（6）：903-911.

DELAVILLE C，CRUZ A V，MCCOY A J，et al.，2014.Oscillatory activity in basal ganglia and motor cortex in an awake behaving rodent model of Parkinson’s disease［J］.Basal Ganglia，3（4）：221-227.

EDOUARD P，MICHEL F J，SAVE LAURÈNE，et al.，2016.Abnormal development of glutamatergic synapses afferent to dopaminergic neurons of the pink1（-/-）mouse model of Parkinson’s disease［J］.Front Cell Neurosci，10：168.

ELENA K，NATALIA D，ALEKSANDR D，et al.，2018.Deep brain stimulation of the subthalamic nucleus in patients with Parkinson disease with prior pallidotomy or thalamotomy［J］.Brain Sci，8（4）：66.

GARCIA B G，NEELY M D，DEUTCH A Y，2010.Cortical regulation of striatal medium spiny neuron dendritic remodeling in parkinsonism：Modulation of glutamate release reverses dopamine depletion-induced dendritic spine loss［J］.Cereb Cortex，20（10）：2423-2432.

GULBERTI A，MOLL C K E，HAMEL W，et al.，2015.Predictive timing functions of cortical beta oscillations are impaired in Parkinson’s disease and influenced by L-DOPA and deep brain stimulation of the subthalamic nucleus［J］.NeuroImage Clin，9：436-449.

JIA J，SUN Z L，LI B，et al.，2009.Electro-acupuncture stimulation improves motor disorders in Parkinsonian rats［J］.Behav Brain Res，205（1）：214-218.

KONDABOLU K，ROBERTS E A，BUCKLIN M，et al.，2016.Striatal cholinergic interneurons generate beta and gamma oscillations in the corticostriatal circuit and produce motor deficits［J］.Proc Natl Acad Sci USA，113（22）：E3159-3168.

LANG A E，LOZANO A M，1988.Parkinson’s Disease［J］.Lancet，386（9996）：896-912.

LEE P S，CRAMMOND D J，RICHARDSON R M，2018.Deep brain stimulation of the subthalamic nucleus and globus pallidus for Parkinson’s disease.［J］.Progress Neurol Surg，33：207-221.

LI F，HARMER P，FITZGERALD K，et al.，2012.Tai chi and postural stability in patients with Parkinson’s disease［J］.N Engl J Med，366（6）：511-519.

LOVINGER D M，MCCOOL B A，1995.Metabotropic glutamate receptor-mediated presynaptic depression at corticostriatal synapses involves mGLuR2 or 3［J］.J Neurophysiol，73（3）：1076-1083.

LOZOVAYA N，EFTEKHARI S，CLOAREC R，et al.，2018.GABAergic inhibition in dual-transmission cholinergic and GABAergic striatal interneurons is abolished in Parkinson disease［J］.Nat Commun，9：1422.

MURRAY T K，MESSENGER M J，WARD M A，et al.，2002.Evaluation of the mGluR2/3 agonist LY379268 in rodent models of Parkinson’s disease［J］.Pharmacol Biochem Behav，73（2）：455-466.

OSWAL A，BROWN P，LITVAK V，2013.Synchronized neural oscillations and the pathophysiology of Parkinson’s disease［J］.Curr Opin Neurol，26（6）：662-670.

PAXINOS G，WATSON C，1997.The Rat Brain in Stererotaxic Coordinates［M］.3th ed.San Diego：Academic Press.

PICCONI B，2002.Striatal metabotropic glutamate receptor function following experimental parkinsonism and chronic levodopa treatment［J］.Brain，125（12）：2635-2645.

PICCONI B，HERNÁNDEZ L F，OBESO J A，et al.，2018.Motor complications in Parkinson’s disease： Striatal molecular and electrophysiological mechanisms of dyskinesias［J］.Movement Disord，33（6）：867-876.

PITTMAN-POLLETTA B R，QUACH A，MOHAMMED A I，et al.，2018.Striatal cholinergic receptor activation causes a rapid，selective and state-dependent rise in cortico-striatal β activity［J］.Eur J Neurosci，48（8）：2857-2868.

RAZA C，ANJUM R，SHAKEEL N U A，2019.Parkinson’s disease：Mechanisms，translational models and management strategies［J］.Life Sci，226：77-90.

RIDGEL A L，VITEK J L，ALBERTS J L，2009.Forced，not voluntary，exercise improves motor function in Parkinson’s disease patients［J］.Neurorehabil Neural Rep，23（6）：600-608.

ROHENKOHL G，BOSMANC A，FRIESP，2018.Gamma synchronization between V1 and V4 improves behavioral performance［J］.Neuron，100（4）：953-963.

SANABRIA D E，JOHNSON L A，NEBECK S D，et al.，2017.Parkinsonism and vigilance：Alteration in neural oscillatory activity and phase-amplitude coupling in the basal ganglia and motor cortex［J］.J Neurophysiol，118（5）：2654-2669.

SCHROLL H，HAMKER F H，2016.Basal ganglia dysfunctions in movement disorders：What can be learned from computational simulations［J］.Movement Disord，31（11）：1591-1601.

SHI K，LIU X，HOU L，et al.，2019.Effects of exercise on mGluR-mediated glutamatergic transmission in the striatum of hemiparkinsonianrats［J］.Neurosci Lett，705：143-150.

SHI K，LIU X，QIAO D，et al.，2017.Effects of treadmill exercise on spontaneous firing activities of striatal neurons in a rat model of Parkinson’s disease［J］.Motor Control，21（1）：58-71.

SIAPAS A G，2005.Prefrontal phase locking to hippocampal theta oscillations［J］.Neuron，46（1）：141-151.

SIGURDSSON T，STARK K L，KARAYIORGOU M，et al.，2010.Impaired hippocampal-prefrontal synchrony in a genetic mouse model of schizophrenia［J］.Nature，464（7289）：763-767.

STEIB S，KLAMROTH S，GAßNER H，et al.，2019.Exploring gait adaptations to perturbed and conventional treadmill training in Parkinson’s disease：Time-course，sustainability，and transfer［J］.Hum Movement Sci，64：123-132.

TAJIRI N，YASUHARA T，SHINGO T，et al.，2010.Exercise exerts neuroprotective effects on Parkinson’s disease model of rats［J］.Brain Res，1310：200-207.

WARRE R，THIELE S，TALWAR S，et al.，2011.Altered function of glutamatergic cortico-striatalsynapses causes outputpathway abnormalities in a chronic model of parkinsonism［J］.Neurobiol Dis，41（3）：591-604.

WEI C，DECAI Q，XIAOLI L，et al.，2017.Treadmill exercise improves motor dysfunction and hyperactivity of the corticostriatal glutamatergic pathway in rats with 6-OHDA-induced Parkinson’s disease［J］.Neural Plast，2017：2583910.

WICHMANN T，DELONG M R，1999.Neurobiology：Oscillations in the basal ganglia［J］.Nature，400（6745）：621-622.

Treadmill Exercise Improves Motor Performance by Regulating the Plasticity of Corticostriatal Functional Connection in Hemiparkinsonian Rats

SHI Kaixuan1，2，LIU Xiaoli1*，QIAO Decai1
1.College of P.E and Sports,Beijing Normal University,Beijing 100875,China;2.Department of Physical Education,China University of Geosciences,Beijing 100083,China

Abstract:Objective：Parkinson’s disease(PD)is a progressive neurodegenerative disorder that is characterized by the loss of dopamine(DA)due to the degeneration of substantia nigra pars compacta dopaminergic neurons.Functional connection changes of cortical-striatum pathway is considered to be the fundamental pathological feature of motor dysfunction in PD patients.In order to explain the possible mechanism of motor improving the behavioral function of PD model rats.This study aimed to quantify the strength of functional connectivity between the motor cortex and striatum by measuring oscillation synchronization,and to investigate the mechanism underlying behavioral improvement by exercise intervention in the view of metabotropic glutamate receptors 2/3(mGluR2/3)-mediated plasticity.Methods：Thirty adult male SD rats were randomly divided into three groups：shamoperation group(Control),PD group(PD)and PD with exercise group(PD+Ex).6-hydroxydopamine(6-OHDA)was injected into medial forebrain bundle(MFB)in the right brain of SD rat to establish the parkinsonian rat model,and apomorphine(APO)-induced rotational test combined with TH-immunoreactivity in the striatum and substantia nigra pars compacta were performed to evaluate the reliability of PD model.Exercise intervention was applied to the PD+Ex group for 4 weeks(11 m/min,30 min/d,5 d/w).Locomotor behavior test were carried out at the end of 0/1/2/3/4 week;the local field potentials(LFPs)in the motorcortex and striatum of freely moving parkinsonian were recorded by using vivo multichannel recording technology;the extracellular glutamate levels and mGluR2/3 protein levels were measured by using microdialysis inserted-high performance liquid chromatography(HPLC)and biochemical tests,respectively.Results：Compared with the PD group,the PD+Ex group spent significantly more time performing fast and slow movements(P＜0.05),and significantly less time in resting(P＜0.05),and these improvements in locomotor behavior showed time-dependent.Electrophysiological results indicated that the coherence value and phase index between motor cortical and striatal β oscillation were both significantly decreased in PD+Ex group compared with PD group(P＜0.05),and this decrease is time-dependent as well.In addition,the PD+Ex rats expressed a significant decrease in extracellular glutamate levels(P＜0.01)while mGluR2/3 protein was up-regulated(P＜0.01)in striatum compared with Control group.Conclusions：Low locomotor level accompanied with exaggerated synchronized beta oscillation were observed in hemiparkinsonian rats.Exercise-enhanced neuroplasticity targeting corticostriatal pathway provide a possible mechanism for revealing neural substrates underlying exercise-based neurorehabilitation,and mGluR-mediated glutamatergic transmission may serve as an attractive target in this process.

Keywords:exercise;Parkinson's disease;functional connectivity;corticostraital pathway;synchronized oscillation;glutamate