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基于电子舌与SPME-GC-MS技术检测腐乳风味物质基于电子舌与SPME-GC-MS技术检测腐乳风味物质 樊 艳，李浩丽，郝怡宁 （南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室，江苏 南京 210023） 摘 要：目的：为了解腐乳的滋味和风味特征，对自制霉腐乳和市购腐乳进行研究分析。方法：采用电子舌、全自动氨基酸分析仪和固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）结合气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用技术对其物质构成进行定性定量分析。结果：电子舌分析发现自制霉腐乳M1和市购2 种腐乳口感较为接近，后期发酵的自制霉腐乳M2苦味和酸味值偏高；氨基酸分析表明，谷氨酸是对4 个腐乳样本滋味贡献最大的氨基酸，M2中苦味氨基酸含量最大；SPME-GC-MS分析共检测出73 种挥发性组分，自制霉腐乳中萜烯类和芳香族化合物的相对含量较高，市购腐乳中乙醇相对含量较高。结论：本研究结果为霉腐乳的研发和生产提供基础性数据，3 种研究方法互为辅助，结合使用会使结果更全面、可靠。 关键词： 腐乳；电子舌；氨基酸分析；固相微萃取；气相色谱-质谱联用 腐乳是一种微生物发酵大豆制品[1]，按其色泽可以分为红腐乳、白腐乳、青腐乳和各种花色腐乳，其中红腐乳因其色泽鲜艳、口感醇厚和气味愉悦，深受消费者喜爱。腐乳的滋味和香气是衡量其质量的重要指标之一，对腐乳的风味物质展开研究，不仅能够指导其加工工艺的优化，还有助于提高产品质量，进而提升其被消费的接受度。 临床实习效果评价[6]，包括临床实践技能、专业理论两个项目，每项100分，分数高，则实习效果优异。综合能力自我评价[7]，包括学习能力、发现问题、解决问题能力、学习兴趣、交流表达能力、理解能力、临床实践技术能力、学习自觉性、知识掌握能力及课程参与度，每项100分。教学满意度评价[8]，包括教学态度、知识拓展、操作能力等方面评价，总分100分，分为满意（≥90分）、一般（60～89分）、不满意（≤59分），总满意度=（满意+一般）/总数×100%。 滋味物质大多是水溶性、非挥发性的化合物[2]，电子舌是近年发展起来的一种用于分析滋味物质的新型检测手段[3-4]，目前使用电子舌研究腐乳滋味的报道较少。挥发性组分研究的前处理方法主要有液液萃取、同时蒸馏萃取[5-6]、顶空吸附等[7]。固相微萃取（solid-phase microextractio，SPME）是一种无溶剂样品前处理技术，操作简单、用时短[8]，被广泛应用于风味物质的研究，但鲜见应用于腐乳挥发性组分研究的报道。SPME和气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）联用在挥发性物质的分析和未知化合物的鉴定方面有非常理想的效果[9]。 本研究以自制霉腐乳和市购腐乳为研究对象，采用电子舌结合氨基酸自动分析仪比较腐乳样本的整体滋味和主要呈味物质的异同；采用SPME提取挥发性组分，同时对萃取头进行比较选择，利用GC-MS结合保留指数（retention index，RI），对样本中的挥发性组分进行定性和定量以及风味物质的分析和比较，为霉腐乳的研发和生产提供基础性数据。 1 材料与方法1.1 材料与试剂4 种腐乳样本：2 种为毛豆腐制得的霉豆腐乳，编号为M1（腐乳毛霉菌种），M2（菌种同M1）；2 种为市购红方腐乳，编号分别为C1（氨基氮质量分数为1.120%）、C2（氨基氮质量分数为0.921%）。 2016年2月2日至2017年3月30日，潘某利用该账户频繁买卖天成控股股票，每日交易股量从100股到上百万股不等，日均持有240万股左右。 10%三氯乙酸（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；500 mg/L正构烷烃（C7～C40）混合标准品 美国o2si公司；正己烷（色谱纯） 德国CNW公司；H型氨基酸混合标准品、茚三酮试剂以应液 日本和光纯药工业株式会社；氨基酸分析用缓冲液 日本三菱化学株式会社；去离子水（色谱级）由美国Millipore纯水机制备。 1.2 仪器与设备PHS-3C酸度计 上海雷磁仪器厂；GL-6250A磁力搅拌器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；Avanti J-26XP离心机 美国贝克曼公司；ASTREE电子舌（包含ASH、CTS、ANS、NMS、SCS、PKS和CPS 7 个味觉传感器和1 个Ag/AgCl参比电极） 法国Alpha M.O.S公司；7890A-5975C GC-MS联用仪 美国Agilent公司；MPS XT多功能样品处理平台 德国Gerstel公司；L-8900型氨基酸分析仪 日本株式会社日立制作所；SPME萃取头类型见表1，购自美国Supelco公司。 表1 SPME萃取头类型
Table 1 SPME fibers used in this study  序号 颜色 纤维涂层和厚度 纤维芯/组件类型 适用范围[10]1 灰色 50/30 μm DVB/CAR/PDMS 金属合金/金属合金 挥发性和半挥发性C3～C20化合物2 蓝色 65 μm PDMS/DVB 熔融石英/稳定氧化硅 挥发性组分、胺类、硝基芳香类化合物3 粉色 65 μm PDMS/DVB 稳定挠曲/稳定氧化硅4 红色 100 μm PDMS 熔融石英/稳定氧化硅 小分子挥发性非极性组分
1.3 方法1.3.1 霉腐乳样品的制作 2 000 g老豆腐，切成4 cm×4 cm×1.5 cm小方块，上锅蒸5min后放置凉透。称取15 g毛霉菌菌粉，加入500 mL水，搅拌均匀，把切好的豆腐块以1 cm均匀间隔摆放在蒸锅上，喷洒配制好的菌液，锅底加水，盖好盖子，温度15～25 ℃，相对湿度不低于50%，1 d开始长毛，发酵3 d后的毛豆腐用于制作霉豆腐乳。称取1 000 g毛豆腐，晾干，蘸取40 g的52°白酒，包裹50 g盐、15 g辣椒粉和1.6 g花椒粉[11]，入瓶，于阴凉处避光密封储存一周即可食用，存储后期M1样品添加食用油封面，M2未用油封面。 1.3.2 腐乳滋味的电子舌检测 琼和亚瑟将自己的利益和感受至于其他一切之上，使得汤米和戴安娜都未能得到足够的爱，这直接影响了他们的性格和人生经历。尼古拉斯认为一个幸福的家庭需要全体成员的共同努力才能实现。不幸福的家庭让人痛苦，形成性格上的缺陷。相反，和谐融洽的家庭关系可以让人得到精神上的满足，帮助抚平心灵的创伤。在与雷分手后，戴安娜带着汤米与凯尔一家生活在一起，在那里，他们感受到家人的温暖，而家的温情也逐渐修复了两颗受伤的心。 4 个腐乳样本，每个样本3 组平行，每组平行样称5 g（精确到0.01 g），加50 mL水搅拌并超声20 min，10 000 r/min离心20 min，过滤，滤液倒入电子舌样品杯中，和洗液（超纯水）间隔放在样品盘上，采集频率为120 s/次，每个样重复检测6 次，取后3 次稳定的检测数据进行分析（传感器响应值会有一定程度波动[12]）。 1.3.3 游离氨基酸的检测 样本冷冻干燥后，研磨成粉，称取0.2 g（精确到0.001 g）于试管中，加入5 mL 10%三氯乙酸溶液，沉淀样本中多肽和蛋白质，摇匀后存于4 ℃环境中，每隔10 min摇匀1 次，2 h后取出，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液稀释2 倍后，上全自动氨基酸分析仪测试。 1.3.4 腐乳气味的SPME-GC-MS检测 SPME条件[13]：精确称取3 g样品于20 mL顶空瓶中，MPS保温箱温度60 ℃，平衡时间10 min，萃取时间30 min，解吸时间300 s，萃取头老化温度260 ℃，老化时间30 min。 GC条件[13-14]：DB-5 MS色谱柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；载气为氦气（纯度≥99.999%）；流速1.0 mL/min；进样口温度250 ℃；不分流进样；升温程序：柱温35 ℃，保持5 min，以3 ℃/min升温到80 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升温到200 ℃，保持20 min。 6) 2号加氢预警诊断模型。该模型可实现反应系统预警，高压分离器到低压分离器流程预警，分馏系统预警，机组预警，调节阀预警。 国民经济由各产业(或行业)组成，因此各产业(或行业)的规模和增长速度决定了社会总产出的总体规模和增长速度。假设经济体中包含n个产业(或行业)，则社会总产出增长速度可表示为： MS条件：电子电离源；传输线温度280 ℃；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电子能量70 eV；采集模式为全扫描（Scan）；质量扫描范围30～450 u。 RI测定：取正构烷烃混合标准品，稀释100 倍，按GC-MS条件进行分析，进样量1 μL，分流比10∶1，溶剂延迟时间5 min，样品中各挥发性组分的RI根据式（1）[15]计算： 
式中：tx为待测组分的保留时间/min；tn为碳原子数为n的正烷烃（tn＜tx）保留时间/min；tn+1为碳原子为n+1的正烷烃（tx＜tn+1）保留时间/min。 定性和定量：匹配度不小于90，按烷烃标准品数据信息计算RI[16-17]，并与其他文献测定的RI进行对比确认，对样品的挥发性组分进行定性；采用峰面积归一化法进行定量，计算得到各组分的相对含量。选择挥发性组分的总峰面积和峰数量为考察指标，比较不同萃取头对样品挥发性组分萃取效果的影响。 Shimadzu LC-20AB高效液相色谱仪，数据分析软件LCsolution（日本岛津科技有限公司）；Alltech6000蒸发光散射检测器（美国奥泰科技有限公司）；DIONEX ICS-5000+离子色谱仪，Thermo 电导检测器（美国Thermo Fisher Scientific公司）；梅特勒-托利多电子天平XS205（瑞士梅特勒-托利多公司）；pH计 （瑞士梅特勒-托利多公司）；Millipore纯化水仪（美国Millipore公司）。 1.3.5 PCA和TAV分析 判别指数（discrimination index，DI）为进行主成分分析（principal component analysis，PCA）时样品区分程度的表征值，当DI在80%～100%时说明区分有效[18]。采用滋味活性值（taste active value，TAV）评价组分对滋味的贡献度，TAV以映了各呈味化合物对样品滋味的贡献程度，在评价单个组分对整体风味的贡献时，TAV是最经典、客观的方法[19]，其值按式（2）计算[20]。当TAV＜1时，该组分对整体滋味贡献不明显，当TAV≥1时，该组分具有滋味活性，可能对样本整体滋味具有显著性贡献，且值越高，贡献越大[21]。 沿淮低洼地又称湖洼地，是指沿淮河干流的湖泊、河洼地、采煤沉陷区、行蓄洪区及各圩堤保护的圩区及耕地。沿淮低洼地按水文条件可分为三类：永久积水区（河流湖泊等水体）、季节性积水区（水洼与滩地）、低平原（地下水水位较高的低地），前两种称为湿地；按地貌景观类型划分，则有低平原、坡谷地、碟形积水洼地、湖泊、河流等类型，后三种称为湿地；按土地利用方式，沿淮低洼地还可分成湖泊、洼地、圩区三大类，面积分别为湖泊16万 hm2， 洼地 31万 hm2， 圩区16万hm2，湖泊是最重要的湿地类型。 
1.4 数据处理采用Excel 2007和Origin pro 2018C软件制表和绘图，采用Origin pro 2018C软件进行PCA和聚类分析，采用MSD ChemStation软件处理SPME-GC-MS数据，未知挥发性组分与NIST08.L标准谱库进行匹配。 Hcy属于蛋氨酸循环的中间产物，且临床上已有不少研究报道证实，血浆Hcy水平的升高可促进动脉粥样硬化，同时促进动脉以及静脉血栓形成，从而导致心脑血管疾病的发生［5-8］。 2 结果与分析2.1 电子舌检测及传感器响应值的分析如图1所示，自制的霉腐乳（M1）和市购2 种腐乳（C1、C2）口感较为接近，发酵后期的霉腐乳（M2）的苦、酸味值都远高于其他3 种腐乳，原因为在贮存后期未添加食用油封面，离开汁液的腐乳暴露在空气中逐渐褐变造成的。 综合以上分析，该模型通过验证，可以根据广东省碳交易和地区生产总值来解释广东省碳排放，也验证了之前的模型假设：碳排放数量与碳交易年度总成交金额成反比，与地区生产总值成正比。  图1 腐乳电子舌传感器响应雷达图
Fig. 1 Radar diagram of electronic tongue sensor responses to fermented bean curd
 图2 基于电子舌的腐乳PCA
Fig. 2 Principal components analysis score plot of fermented bean curd based on electronic tongue sensor responses
由图2可知，PC1和PC2对总体方差的累计贡献率达到了99.97%，满足大于85%的界限[22]，说明PC1和PC2几乎包含了样本的所有信息，可以以映出腐乳的整体滋味信息，其中PC1的方差贡献率远高于PC2，说明腐乳滋味在PC1上差距比PC2大[23]。DI值为98%，表明4 个腐乳样本差异明显，能够用电子舌较好地区分，后期发酵霉腐乳（M2）和另外3 种腐乳相距很远，与图1结果相似。 2.2 腐乳中的游离氨基酸组成腐乳中的游离氨基酸主要是在其发酵过程中由蛋白质分解产生的[24]，不同的氨基酸组成和含量赋予腐乳丰富的味觉层次，使其具有鲜美、醇和、浓郁、柔润的滋味特征[25]。按游离氨基酸的呈味特征[26-27]，将17 种游离氨基酸分为鲜、甜、苦味3 组。如表2所示，4 种腐乳样本中含有丰富的游离氨基酸，在检测的17 种氨基酸中，除了Cys在C1和C2中未检测到，其余氨基酸在4 个样本中均有被检出。有研究[28]表明，Glu（鲜味）、Asp（鲜味）、Ala（甜味）、Met（苦味）和Lys（苦味）是发酵豆制品中主要的游离氨基酸。M1中游离氨基酸总量最大，鲜味氨基酸含量最大，对滋味贡献大的氨基酸依次为Glu、Val、Ala、His、Lys、Pro、Phe、Ile、Asp和Leu；M2中苦味氨基酸含量最大，该结论与电子舌分析结果一致，但苦味氨基酸含量过高会带来不良风味，影响腐乳整体口感，对滋味贡献大的氨基酸依次为Glu、Lys、Val、Ala、Ile、Phe、Tyr、Met、Asp、Leu、Gly、His和Arg；C1中游离氨基酸总量最小，可能是腐乳配方中的某些环境因素降低了蛋白酶系的活力，导致蛋白质分解成短肽和氨基酸的能力下降，鲜味氨基酸含量最大，对滋味贡献大的氨基酸只有Glu；C2中苦味氨基酸含量最大，对滋味贡献大的氨基酸依次为Glu、Val、Ala、Tyr、Lys、Phe、Met、His、Asp、Ile、Leu、Ser、Pro和Gly，与M2相似，但TAV相对较小。4 种腐乳中对滋味贡献最大的氨基酸均为Glu，Yamaguchi等[29]研究Glu是类似味精的鲜味物质，与其钠盐提供鲜味，因此4 种腐乳独特的滋味和鲜味氨基酸组分有一定关系。 2.3 SPME-GC-MS挥发性成分的分析2.3.1 萃取头对萃取效果的影响 不同萃取头涂层的极性不同导致其吸附的组分种类和极性不同[32-33]。由图3可知，不同萃取头对腐乳的萃取效果存在显著差异，其50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头得到的组分的总峰面积和峰数量都是最大的，因此，采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头用于腐乳挥发性组分的测定分析。  图3 萃取头类型对腐乳挥发性组分萃取效果的影响
Fig. 3 Effect of extraction fibers on the extraction efficiency of volatile compounds from fermented bean curd
2.3.2 腐乳挥发性组分的分析 经GC-MS检测，发现4 种腐乳挥发性组分复杂，本研究所采用的分析条件能较好地分离这些组分。按NIST08.L标准库检索，结合RI对腐乳中的挥发性组分进行的鉴定，结果见表3。4 种腐乳共鉴定出73 种挥发性组分，其中M1共鉴定出38 种，萜烯类占53.06%、芳香族占20.68%、醇类占9.00%、酯类占4.99%、烷烃类占4.11%、含氮化合物占2.53%、烯烃类占1.92%、酮类占1.60%、萘类占0.46%；M2鉴定出31 种，芳香族占55.72%、萜烯类占24.07%、烷烃类占7.51%、醚类占4.95%、醇类占3.89%、酯类占1.96%、烯烃类占1.05%、萘类占0.84%；C1共鉴定出27 种，醇类占59.19%、芳香族占25.17%、酯类占13.79%、萜烯类占1.40%、萘类占0.41%、烷烃类占0.04%；C2共鉴定出14 种，醇类占59.45%、酯类占40.40%、芳香族占0.12%、烷烃类占0.02%。M1中萜烯类和芳香族化合物的相对含量较高，M2中芳香族和萜烯类化合物的相对含量较高；C1中醇类和芳香族化合物的相对含量较高，C2中醇类和酯类化合物的相对含量较高。 表2 腐乳中游离氨基酸组成和含量及其对应的TAV
Table 2 Contents of free amino acids in fermented bean curd and their TAVs  注：/.阈值未知或未检出。 贡献氨基酸阈值[30-31]/（mg/100 mL）滋味（mg/100 g）TAV氨基酸含量/（mg/100 g）TAV氨基酸含量/（mg/100 g）TAV氨基酸含量/（mg/100 g）TAV M1 M2 C1 C2氨基酸含量/鲜味天冬氨酸Asp 100 135.55±1.25 1.36 246.15±0.12 2.46 19.75±1.53 0.20 262.88±1.20 2.63谷氨酸Glu 30 3 492.53±1.83 116.42 1 334.89±1.90 44.5 633.22±0.76 21.11 1 154.97±1.23 38.50总计 3 628.08 1 581.04 652.97 1 417.85甜味苏氨酸Thr 260 107.40±0.35 0.41 206.35±2.36 0.79 10.58±0.94 0.04 165.32±1.09 0.64丝氨酸Ser 150 75.73±1.15 0.50 85.90±1.25 0.57 3.90±1.18 0.03 172.41±2.19 1.15甘氨酸Gly 130 67.92±0.23 0.52 168.66±1.67 1.3 11.18±2.36 0.09 133.09±2.57 1.02丙氨酸Ala 60 194.86±5.44 3.25 291.04±2.01 4.85 37.67±3.01 0.63 308.35±3.62 5.14脯氨酸Pro 300 686.10±1.23 2.29 264.63±1.56 0.88 41.52±1.69 0.14 329.95±2.34 1.10总计 1 132.01 1 016.58 104.85 1 109.12苯丙氨酸Phe 90 149.90±2.04 1.67 311.98±1.93 3.47 14.38±2.16 0.16 303.35±2.16 3.37半胱氨酸Cys / 4.21±0.29 / 19.11±0.32 / / / / /缬氨酸Val 40 132.59±3.99 3.31 264.72±1.86 6.62 14.55±2.34 0.36 221.88±2.37 5.55蛋氨酸Met 30 29.50±1.44 0.98 84.60±2.31 2.82 1.16±1.96 0.04 83.85±1.95 2.80异亮氨酸Ile 90 122.93±2.90 1.37 317.80±1.02 3.53 12.93±1.36 0.14 205.13±2.98 2.28亮氨酸Leu 190 192.84±2.15 1.01 433.84±0.25 2.28 35.66±0.58 0.19 390.46±1.42 2.06酪氨酸Tyr 91 87.42±1.56 0.96 266.06±2.10 2.92 10.08±4.05 0.11 420.24±1.83 4.62赖氨酸Lys 50 150.81±0.86 3.02 363.16±1.83 7.26 12.56±4.06 0.25 191.74±0.20 3.83组氨酸His 20 62.83±2.35 3.14 24.78±2.00 1.24 0.21 0.01 52.24±2.15 2.61精氨酸Arg 50 14.54±2.54 0.29 50.30±2.21 1.01 0.15 0.00 9.49±1.85 0.19总计 947.57 2 136.35 101.68 1 878.38游离氨基酸总量 5 707.66 4 733.97 859.50 4 405.35苦味
表3 4 种腐乳挥发性组分的分析结果
Table 3 Analysis of volatile compounds in four fermented bean curds  序号 保留时间/min化合物名称 CAS号 匹配度 RI 定性 相对含量/%中文 英文 实测 检索[34] M1 M2 C1 C2 1 2.444 乙醇 ethanol 64-17-5 90 — — MS— —58.7059.45 2 14.221 甲氧基苯基-肟 oxime-, methoxy-phenyl- 1000222-86-6 91 929.20 — MS 2.28 — — —3 17.186 苯酚 phenol 108-95-2 90983.23— MS2.35— — —4 18.744 邻二氯苯 benzene, 1,2-dichloro- 95-50-1 95 1 010.48 1 003 MS, RI1.48 — — —5 19.372 4-异丙基甲苯 benzene, 1-methyl-4-(1-methylethyl)- 99-87-6 95 1 020.71 1 027 MS, RI 3.97 3.16 — —6 19.752 桉叶油醇 eucalyptol 470-82-6 92 1 027.03 1 033 MS, RI — 3.89 — —7 20.657 (Z)-3,7-二甲基-1,3,6-十八烷三烯 1,3,6-octatriene, 3,7-dimethyl-, (Z)- 3338-55-4 91 1 041.89 1 034 MS, RI 1.92 — — —8 21.047 丁苯 benzene, butyl- 104-51-8 911 048.291 054MS, RI1.07— — —9 21.242 1-甲基-4-(1-甲基乙基)-1,4-环己二烯1,4-cyclohexadiene, 1-methyl-4-(1-methylethyl)- 99-85-4 921 051.491 056MS, RI6.772.35— —10 24.286 3-蒈烯 3-carene 13466-78-9 95 1 101.02 1 009 MS, RI 43.45 11.61 — —11 25.243 苯乙醇 phenylethyl alcohol 60-12-8 93 1 115.66 1 116 MS, RI7.95 — 0.45 —12 27.021 邻苯二甲醚 benzene, 1,2-dimethoxy- 91-16-7 96 1 157.84 1 149 MS, RI — 3.00 — —13 27.313 4-甲氧基苯乙烯 benzene, 1-ethenyl-4-methoxy- 637-69-4 96 1 163.82 1 160 MS, RI — 2.28 — —14 27.868 间苯二甲醚 benzene, 1,3-dimethoxy- 151-10-0 95 1 175.18 1 181.9 MS, RI — 1.95 — —15 28.725 水杨酸甲酯 methyl salicylate 119-36-8 93 1 192.73 1 197 MS, RI 2.48 — — —16 28.968 草蒿脑/4-甲氧基苯丙烯 estragole 140-67-0 98 1 197.71 1 203 MS, RI — 3.32 — —17 29.095 正十二烷 dodecane 112-40-3 96 1 200.63 — MS 2.57— — —18 30.468 3-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-酮2-cyclohexen-1-one, 3-methyl-6-(1-methylethyl)- 89-81-6 951 257.951 254MS, RI1.60— —19 30.920 3-苯丙酸甲酯 benzenepropanoic acid, methyl ester 103-25-3 93 1 276.83 1 279.1 MS, RI 0.66 — — —20 31.122 茴香脑/1-甲氧基-4-[(Z)-1-丙烯基]苯 benzene, 1-methoxy-4-(1-propenyl)- 104-46-1 98 1 288.23 1 286 MS, RI 11.81 44.91 22.15 0.12 21 31.315 4-异丙基苯甲醇 benzenemethanol, 4-(1-methylethyl)- 536-60-7 95 1 293.32 1 293 MS, RI 1.05 — — —22 31.393 1-甲基-4-(1-甲基亚乙基)环己烯cyclohexene, 1-methyl-4-(1-methylethylidene)- 586-62-9 951 296.581 084MS, RI0.62— —23 31.626 1,2,3-三甲氧基苯 1,2,3-trimethoxybenzene 634-36-6 98 1 308.57 1 317 MS, RI — 2.05 — —24 32.366 以-2,3-二溴-2-丁烯-1,4-二醇 2-butene-1,4-diol, 2,3-dibromo-, (E)- 21285-46-1 90 1 337.20 — MS — — 0.04 —25 32.376 3-苯丙酸乙酯 benzenepropanoic acid, ethyl ester 2021-28-5 91 1 337.62 1 347 MS, RI — — — 0.03 26 32.474 2-甲氧基-3-(2-丙烯基)苯酚 phenol, 2-methoxy-3-(2-propenyl)- 1941-12-4 98 1 341.71 1 362 MS, RI — — 2.98 —27 32.590 α-戊基-γ-丁内酯 2(3H)-furanone, dihydro-5-pentyl- 104-61-0 90 1 363.28 1 360 MS, RI 1.33 — — —28 32.780 8-异丙基-1,3-二甲基三环[4.4.0.02,7]癸-3-烯8-isopropyl-1,3-dimethyltricyclo[4.4.0.02,7]dec-3-ene14912-44-8 981 374.061 373MS, RI0.40— —29 32.892 (-)-α-蒎烯 copaene 3856-25-5 99 1 380.42 1 378 MS, RI — 2.13 0.25 —30 33.033 3-甲基吲哚 1H-indole, 3-methyl- 83-34-1 93 1 388.42 1 396 MS, RI 0.19 — — —31 33.116 β-榄香烯 beta-elemene 515-13-9 95 1 393.13 1 389 MS, RI 0.27 — — —32 33.121 1-十四烯 1-tetradecene 1120-36-1 94 1 393.42 1 389 MS, RI — 0.39 — —33 33.150 癸酸乙酯 decanoic acid, ethyl ester 110-38-3 96 1 395.06 1 403 MS, RI 0.15 — 0.67 0.05 34 33.248 正十四烷 tetradecane 629-59-4 96 1 400.75 — MS 0.52 1.62 — —35 33.384 (4Z)-4,11,11-三甲基-8-亚甲基双环[7.2.0]十一-4-烯bicyclo[7.2.0]undec-4-ene,4,11,11-trimethyl-8-methylene- 13877-93-5 951 409.99— MS—0.06— —36 33.491 长叶烯 longifolene 475-20-7 98 1 417.271 412 MS, RI— 0.89 — —37 33.632 β-石竹烯 caryophyllene 87-44-5 99 1 426.85 1 417 MS, RI 0.96 2.46 0.89 —38 33.793 2,6-二甲基-6-(4-甲基-3-戊烯基)双环[3.1.1]庚-2-烯bicyclo[3.1.1]hept-2-ene,2,6-dimethyl-6-(4-methyl-3-pentenyl)-17699-05-7 931 437.801 433MS, RI0.28— 0.09—39 33.978 (E)-2-甲氧基-4-(1-丙烯基苯酚)phenol, 2-methoxy-4-(1-propenyl)-, (E)- 5932-68-3 921 450.371 451MS, RI— —0.05—40 34.119(4αS-顺式)-2,4α,5,6,7,8,9α-八氢-3,5,5-三甲基-9-亚甲基-1-苯并环庚烯1H-benzocycloheptene,2,4a,5,6,7,8,9,9a-octahydro-3,5,5-trimethyl-9-methylene-, (4aS-cis)-3853-83-6 991 459.961 451MS, RI0.391.21— —41 34.416 顺-9,以-12-十四烷二烯乙酸酯9,12-tetradecadien-1-ol, acetate, (Z,E)- 31654-77-0 95 1 480.15 MS — 1.87 — —
续表3  注：—.未检出；相对含量小于0.01%未列入表中；所有数据都是在扣除空白和总离子流图中柱流失的峰基础上进行的分析。 序号 保留时间/min化合物名称 CAS号 匹配度 RI 定性 相对含量/%中文 英文 实测 检索[34] M1 M2 C1 C2 42 34.436 1,2,3,4,4a,5,6,8a-十八氢-7-甲基-4-亚甲基-1-(1-甲基乙基)-萘naphthalene, 1,2,3,4,4a,5,6,8aoctahydro-7-methyl-4-methylene-1-(1-methylethyl)-, (1.alpha.,4a.alpha.,8a.alpha.)-30021-74-0 961 481.511 474MS, RI0.22— 0.04—43 34.533顺式-(-)-2,4a,5,6,9a-六氢-3,5,5,9-四甲基(1H)苯并环庚烯cis-(-)-2,4a,5,6,9a-hexahydro-3,5,5,9-tetramethyl(1H)benzocycloheptene1000104-20-1 991 488.101 484MS, RI0.771.95— —44 34.679 (+)-γ-古尔君烯 (+)-γ-gurjunene 22567-17-5 94 1 498.03 1 469 MS, RI — — 0.03 —45 34.713 正十五烷 pentadecane 629-62-9 97 1 500.38 — MS 0.43 1.73 0.02 —46 34.767 α-木乌龙烯 α-muurolene 10208-80-7 98 1 504.54 1 497 MS, RI 0.19 0.48 0.11 —47 34.825 (R)-β-雪松烯 (R)-β-himachalene 1461-03-6 96 1 509.00 1 505 MS, RI 0.31 0.65 — —48 34.869 (S)-β-没药烯 (S)-β-bisabolene 495-61-4 98 1 512.38 1 511 MS, RI — 0.26 0.04 —49 35.034 (1S-顺式)-1-甲基乙基-4,7-二甲基-1,2,3,5,6,8a-六氢萘naphthalene, 1,2,3,5,6,8a-hexahydro-4,7-dimethyl-1-(1-methylethyl)-,(1S-cis)-483-76-1 97 1 525.08 1 525 MS, RI 0.27 0.39 0.19 —50 35.093(1S-顺式)-1,2,3,4-四氢-1,6-二甲基-4-(1-甲基乙基)-萘naphthalene, 1,2,3,4-tetrahydro-1,6-dimethyl-4-(1-methylethyl)-, (1S-cis)- 483-77-2 94 1 529.62 1 522 MS, RI 0.19 0.45 0.15 —51 35.219 二氢猕猴桃内酯 2(4H)-benzofuranone,5,6,7,7a-tetrahydro-4,4,7a-trimethyl-15356-74-8 931 539.311 538MS, RI0.15— —52 35.244 1,2,3,4,4a,7-六氢-1,6-二甲基-4-(1-甲基乙基)-萘naphthalene, 1,2,3,4,4a,7-hexahydro-1,6-dimethyl-4-(1-methylethyl)- 16728-99-7 951 541.23— MS— —0.02—53 35.278 4-氯-N-甲基苯磺酰胺 4-chlorobenzenesulfonamide,N-methyl- 6333-79-5 901 543.85— MS0.05— — —54 35.555 2-甲基十五烷 pentadecane, 2-methyl- 1560-93-6 94 1 565.15 1 561 MS, RI — 1.34 — —55 35.648 9-甲基壬烷 nonadecane, 9-methyl- 13287-24-6 93 1 572.31 — MS — 0.57 — —56 35.770 氯乙酸十六烷基酯 acetic acid, chloro-, hexadecyl ester 52132-58-8 90 1 581.69 — MS — 0.09 — —57 35.925 月桂酸乙酯 dodecanoic acid, ethyl ester 106-33-2 95 1 593.62 1 597 MS, RI — — 0.39 0.13 58 36.018 正十六烷 hexadecane 544-76-3 96 1 600.84 — MS 0.26 1.35 — —59 36.880 1,13-十四烷二烯 1,13-tetradecadiene 21964-49-8 93 1 673.15 — MS — 0.50 — —60 37.133 十七烯 1-heptadecene 6765-39-5 96 1 694.381 690 MS, RI— 0.15 — —61 37.215 正十七烷 heptadecane 629-78-7 96 1 701.20 — MS 0.14 0.90 0.01 —62 38.428 十四酸乙酯 tetradecanoic acid, ethyl ester 124-06-1 98 1 792.33 1 793 MS, RI — — 0.70 0.51 63 40.078 十五酸乙酯 pentadecanoic acid, ethyl ester 41114-00-5 98 1 992.17 1 793 MS, RI — — — 0.04 64 40.726 棕榈酸甲酯 hexadecanoic acid, methyl ester 112-39-0 96 — — MS 0.08 — — —65 41.768 9-十六碳烯酸乙酯 ethyl 9-hexadecenoate 54546-22-4 93 — — MS — — 0.05 —66 41.772 以式-11-六癸酸乙酯 E-11-hexadecenoic acid, ethyl ester 1000245-71-9 93 — — MS — — — 0.10 67 42.367 棕榈酸乙酯 hexadecanoic acid, ethyl ester 628-97-7 98 — — MS 0.14 — 8.75 21.34 68 48.068 亚油酸甲酯 9,12-octadecadienoic acid (Z,Z)-,methyl ester 112-63-0 95— — MS— —1.498.82 69 48.379 9-十八酸乙酯 9-octadecenoic acid, ethyl ester 6512-99-8 93 — — MS — — 1.51 7.80 70 48.637 油酸乙酯 ethyl oleate 111-62-6 95 — — MS — — 0.080.54 71 49.704 17-甲基十八酸甲酯 methyl 17-methyl-octadecanoate 1000336-21-8 94 — — MS — — 0.09 —72 49.718 硬脂酸乙酯 octadecanoic acid, ethyl ester 111-61-5 95 — — MS — — — 0.83 73 51.106 乙基-9-顺式,11-以式十八碳二酸酯 ethyl 9-cis,11-trans-octadecadienoate 1000336-69-8 99 — — MS — — — 0.21
腐乳发酵过程中，氨基酸和汤料中的乙醇发生一系列复杂的生化以应产生酯类、醇类和醛类等挥发性风味物质[35-36]。小分子质量的酯类物质具有独特的气味，如水杨酸甲酯（M1相对含量2.48%）、癸酸乙酯（M1相对含量0.15%、C1相对含量0.67%、C2相对含量0.05%）、3-苯丙酸乙酯（C2相对含量0.03%）有水果味及其他诱人的风味；大分子质量的酯类虽然气味阈值高，香味弱，但含量高也可以产生特有的风味，如棕榈酸乙酯（C1相对含量8.75%、C2相对含量21.34%）有微弱果爵和奶油香味，9-十八酸乙酯（C2含7.80%）有淡淡的花味[37]。M1中萜烯类和芳香族化合物的相对含量较高，有可能是加入香辛料的原因，其中3-蒈烯的相对含量为43.45%，3-蒈烯多用于食用香精的配方[38]，M2中的3-蒈烯的相对含量也超过了10%，M1和M2中萜烯类化合物相对含量均高于C1和C2的萜烯类化合物含量，一定程度上说明M1和M2在生产中使用的香辛料用量大于C1和C2的香辛料用量。具有茴香特殊香气[39]的茴香脑在M1、M2和C1中均被检测到，相对含量分别为11.81%、44.91%和22.15%。具有玫瑰香气的苯乙醇在M1中的相对含量为7.95%。C1和C2中乙醇的相对含量都超过了50%，酒香明显，应该是蛋白质等物质在发酵过程中分解产生的醇类物质增加[39-40]，这与王伦兴等[41]的研究结果一致。刘娜等[42]采用顶空SPME-GC-MS-嗅闻法测定红腐乳挥发性风味物质，结果表明乙醇和酯类化合物是其主要贡献成分。穆旻等[5]对红腐乳中挥发性成分的提取和分析鉴定出的76 种挥发性成分中酯类有30 种、醇类10 种，与本实验测得的C1和C2的结果一致，2 种样品中醇类和酯类占比不同，可能与2 种红腐乳的生产工艺条件差异相关。M1和M2中烷烯类物质可能是脂肪分解产生的[6]，但由于其风味阈值较高，故对腐乳的总体风味贡献不大。 2.3.3 PCA结果 运用Origin pro 2018C软件对4 种腐乳样本挥发性成分的相对含量进行PCA，由结果可知，PC1贡献率为48.65%，PC2贡献率为42.75%，PC3贡献率为6.56%，PC4贡献率为2.04%，累计贡献率为100%。如图4所示，4 种腐乳中M1和M2分布在第2象限，与其相关性较高的挥发性组分是G10（3-蒈烯）和G9（1-甲基-4-(1-甲基乙基)-1,4-环己二烯）；C1和C2分布在第1象限，与其相关性较高的挥发性组分为G67（棕榈酸乙酯）、G1（乙醇）和G20（茴香脑）。  图4 4 种腐乳的主成分双标图
Fig. 4 PCA score plots and loading plots of four fermented bean curds
2.3.4 聚类分析结果  图5 4 种腐乳的聚类分析树状图
Fig. 5 Clustering dendrograms of four fermented bean curds
由图5可知，当4 种腐乳在类间间距为40时，腐乳样本分为2 类，第1类为M1和M2，第2类为C1和C2；当类间间距为30时，腐乳样本分为3 类，第1类为M1，第2类为M2，第3类为C1和C2。聚类分析结果和GC-MS检测结果一致。 3 结 论本实验采用电子舌和SPME-GC-MS结合化学计量学方法对4 种不同品牌腐乳的滋味和挥发性组分进行研究，比较自制霉腐乳和市售腐乳在滋味和风味上的异同。结果表明，电子舌传感器响应雷达图和PCA图能看出4 个腐乳样本差异明显，能够用电子舌较好地区分，自制霉腐乳（M1、M2）的滋味特征有别于其他2 种；氨基酸分析结果表明4 种腐乳样本中Glu的TAV最大，自制霉腐乳M1中鲜味氨基酸含量最大，M2中苦味氨基酸含量最大，此结果和电子舌分析结果一致；SPME-GC-MS共鉴定出73 种挥发性组分，其中酯类、醇类、萜烯类和芳香族类化合物相对含量较高，是构成腐乳香气的主要成分，自制霉腐乳中萜烯类和芳香族化合物的相对含量较高。利用PCA法得到的双标图中可知自制霉腐乳M1和M2分布在同一象限，与其相关性较高的挥发性组分为3-蒈烯和1-甲基-4-(1-甲基乙基)-1,4-环己二烯；利用聚类分析能看出不同腐乳之间的亲疏远近，其中自制霉腐乳M1和M2的挥发性成分最为接近。本研究结果为霉腐乳的研发和生产提供基础性数据，3 种研究方法互为辅助，结合使用会使结果更全面、可靠。 参考文献： [1] HAN B Z, ROMBOUTS F M, NOUT M J. A Chinese fermented soybean food[J]. International Journal of Food Microbiology, 2001,65: 1-10. DOI:10.1016/S0168-1605(00)00523-7. [2] 李露芳. 电子舌技术在酱油滋味评价中的应用研究[D]. 广州: 华南理工大学, 2019. [3] 宋泽, 徐晓东, 许锐, 等. 不同部位牛肉炖煮风味特征分析[J]. 食品科学,2019, 40(4): 206-214. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180104-050. [4] WEI Z B, WANG J, LIAO W Y. 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Analysis of Characteristic Flavor Compounds of Fermented Bean Curd Using Electronic Tongue and Solid-Phase Microextraction Combined with Gas Chromatography-Mass Spectrometry FAN Yan, LI Haoli, HAO Yining
(Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing, Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety, College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023, China) Abstract: Purpose: To understand the taste and flavor characteristics of laboratory-made (M1 and M2) and commercial(C1 and C2) fermented bean curds. Methods: An electronic tongue, an automatic amino acid analyzer and solid-phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry (SPME-GC-MS) were used to analyze quantitatively and qualitatively the flavor and chemical composition of fermented bean curd. Results: Electronic tongue analysis showed that the taste of M1 was similar to that of C1 and C2, while the bitterness and sourness of M2 were higher. Amino acid analysis showed that glutamic acid contributed most to the taste of the four fermented bean curds, and the content of bitter amino acids in M2 was the highest among these. Meanwhile, a total of 73 volatile compounds were detected by SPME-GCMS, and the relative contents of terpenes and aromatic compounds in M1 and M2 were higher, while the relative contents of ethanol in C1 and C2 were higher. Conclusions: The results from this study provide a theoretical basis for research on fermented bean curd and its production, and combined use of the above three methods can provide complementary and reliable information. Keywords: fermented bean curd; electronic tongue; amino acid analysis; solid-phase microextraction; gas chromatographymass spectrometry
收稿日期：2019-06-03 DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190603-017 中图分类号：TS214.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2020）10-0222-08 引文格式： 樊艳, 李浩丽, 郝怡宁. 基于电子舌与SPME-GC-MS技术检测腐乳风味物质[J]. 食品科学, 2020, 41(10): 222-229.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190603-017. http://www.spkx.net.cnFAN Yan, LI Haoli, HAO Yining. Analysis of characteristic flavor compounds of fermented bean curd using electronic tongue and solid-phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry[J]. Food Science, 2020,41(10): 222-229. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190603-017. http://www.spkx.net.cn
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发表于 2021-2-10 10:52:07
