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功能基因分析辅助筛选产双乙酰和乙偶姻乳酸菌功能基因分析辅助筛选产双乙酰和乙偶姻乳酸菌 杨 铭1，郝晓娜1，罗天淇1，姜云芸1，杨贞耐1，朱 宏2,*，张 健1,* （1.北京工商大学 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京 100048；2.石家庄君乐宝乳业有限公司，河北 石家庄 050221） 摘 要：研究8 株分离自内蒙古奶豆腐和西藏灵菇的乳酸菌产双乙酰和乙偶姻特性，通过全基因组注释分析，确定各菌株与双乙酰、乙偶姻等风味物质相关的6 个基因。发酵乳双乙酰含量检测显示，嗜热链球菌GST-6、鼠李糖乳杆菌5-1和副干酪乳杆菌N1115的双乙酰产量较高（P＜0.05），分别为0.72、0.53 μg/mL和0.47 μg/mL；加入柠檬酸后产量为6.23、5.28 μg/mL和4.47 μg/mL。与基因的关联统计分析结果显示，草酰乙酸脱羧酶基因与双乙酰产量高度相关，Pearson相关系数为0.898（P＜0.01），乳酸脱氢酶基因和乙酰乳酸合成酶基因与产量相关性不显著（P＞0.05）。乙偶姻产量与6 个功能基因的关系不显著（P＞0.05）。气相色谱-质谱法检测各菌株发酵乳的挥发性化合物组成，共检测到24 种挥发性风味化合物，主成分分析显示有机酸、乙偶姻和双乙酰可能是形成菌株特征性风味的主要原因，2-庚酮和2-壬酮对各样品的挥发性风味也有较大贡献。 关键词： 乳酸菌；双乙酰；乙偶姻；功能基因注释；挥发性风味物质 发酵乳因其具有特殊的质地、风味和缓解乳糖不耐症等益生功能深受消费者欢迎，其中风味是消费者评价发酵乳的重要指标。发酵乳中的风味物质主要来源于乳酸菌在发酵过程中产生的乳酸和各种香气化合物，这些化合物有的存在于牛乳本身中，也有的在发酵过程中产生[1]，其中双乙酰是对发酵乳风味起决定性作用的化合物[2-3]。双乙酰是在乳酸菌发酵和乳中柠檬酸代谢过程中产生的双酮化合物[4]，可赋予乳制品特殊的奶油风味，乳酸乳球菌亚种中柠檬酸盐对双乙酰和乙偶姻途径的作用已有相关研究报道[5-6]。乙偶姻与双乙酰密切相关，也是存在于乳制品中具有奶油风味的物质，通常乙偶姻的浓度可高于双乙酰10～50 倍，但因双乙酰的阈值较低，所以人们通常认为双乙酰对乳制品风味的影响更大[7]。Milesi等[8]将高产双乙酰和乙偶姻的干酪乳杆菌添加到发酵乳中可闻到浓郁的黄油味。 基因组注释分析是一种快速、高通量功能性菌株筛选方法，被越来越广泛地应用于乳酸菌的优良菌种选育和生理代谢机制的研究[9]。赵洁等[10]利用分子生物学的方法筛选出优良产酸特性的菌株。Lo等[11]对13 种鼠李糖乳杆菌进行基因组分析和柠檬酸代谢关键酶基因重组，使菌株风味物质产量大幅提高。传统发酵乳制品风味多样，其中蕴藏着大量的高产风味物质的乳酸菌。利用基因注释分析技术筛选高产风味物质乳酸菌对优良菌株的发掘具有重要意义。 本研究以从内蒙古奶豆腐和西藏灵菇中分离出的8 株乳酸菌为研究对象，在前期明确其发酵乳加工和风味改良特性基础上[12-13]，通过全基因组测序，分析这些菌株代谢双乙酰、乙偶姻等重要风味物质的基因通路。采用气相色谱-质谱和化学分析方法定量检测不同菌株发酵乳的风味物质含量，分析风味物质功能基因与关键风味物质双乙酰和乙偶姻产量间的关系，以期为筛选高产双乙酰菌株和改良发酵乳的风味品质提供技术参考。 1 材料与方法1.1 材料与试剂西藏灵菇：嗜热链球菌（GST-6，本实验室分离）、保加利亚乳杆菌（YNF-5，吉林省农业科学院）、鼠李糖乳杆菌（5-1，本实验室分离）、保加利亚乳杆菌（KW14-3，本实验室分离）、植物乳杆菌（YW11，本实验室分离）。 奶豆腐：副干酪乳杆菌（N1115，君乐宝）、植物乳杆菌（K25，吉林省农业科学院）、乳酸乳球菌（XZ3303，内蒙古农业大学）。 然而，比赛并没有让观众满意。面对职业排名402名的墨西哥菜鸟，他仅凭点数获胜。“重心比较飘，打拳没有力量，打了就跑。”邹市明的经纪公司老板李胜赛后收到很多批评。 MRS培养基、M17培养基、柠檬酸 北京奥博星生物技术有限责任公司；脱脂乳粉 新西兰恒天然集团有限公司；三氯乙酸、邻苯二胺、浓盐酸、氯仿、异戊醇（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。 1.2 仪器与设备CR21G III立式高速冷冻离心机、U3900紫外分光光度计 日本Hitachi公司；MLS-3750高压蒸汽灭菌器日本三洋公司；THZ-D电热恒温培养箱 上海一恒仪器科技有限公司；固相微萃取手动进样手柄、DVB-CARPDMS纤维头（2 cm，50/30 μm） 美国Supelco公司；气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司。 1.3 方法1.3.1 发酵乳的制备 各菌株经活化后（球菌使用M17培养基，其他使用MRS培养基），按5%（体积分数）接种量接种于10 mL 10%（质量分数）的脱脂乳培养基中，37 ℃恒温发酵过夜后，以5%接种量转接到50 mL脱脂乳培养基中，于37 ℃扩大培养，发酵至pH 4.5。 含柠檬酸脱脂乳培养基的制备：将柠檬酸晶体溶于去离子水，配制成10%溶液，经0.22 μm微孔滤膜除菌后，缓慢添加至灭菌脱脂乳培养基中，调柠檬酸终质量分数为0.5%。 1.3.2 双乙酰标准曲线的测定 参考康欢等[14]的方法。配制质量浓度分别为0.0、3.0、6.0、9.0、12.0、15.0、18.0、21.0、24.0 μg/mL的双乙酰标准溶液各20 mL，处理后使用紫外分光光度计测定335 nm波长处吸光度，绘制标准曲线。 就物质利用水平而言，投入的油漆量仅有11.3 t被有效利用涂覆工件上，相当于投入的物质总量仅有0.4%被有效利用，从而造成严重的资源浪费；大部分废物难以得到回收和利用，代谢“废物”流失入水体、大气或土壤环境中，直接影响区域环境质量。究其根本原因，风电齿轮箱涂装生产线表面处理水耗高、对挥发性高的清洗剂及油性漆的过分依赖，是导致废物排放量大、末端处理处置难的症结所在；同时，大量“废物”不可循环利用而是直接进行废物集中处理，“废物”只是从水体或大气中转移进入土壤，这部分“资源”浪费严重。 1.3.3 双乙酰含量检测 采用维氏硬度计（FUTURE-TECH/LC-200RB）测量断裂行星齿轮轴的表面硬度、基体硬度，检测前先用标准试块进行校准；对断裂轴的断口进行金相取样，经镶嵌、打磨、抛光、腐蚀后，采用光学显微镜（ZEISS/HAL100）进行显微金相组织检测，结果如表2所示，表面硬度、基体硬度、氮化层深、氮化物和脆性级别等均符合技术要求，但表面疏松达到4级，不符合技术要求，这直接导致零件表面强度下降，在使用过程易产生裂纹，降低零件的疲劳寿命。 采用邻苯二胺法[15]，取发酵乳样品20 mL，加入等体积的16%（质量分数）三氯乙酸溶液，混匀后于4 ℃、3 500×g离心10 min除蛋白，3M滤纸过滤上清液，使用紫外分光光度计在335 nm波长处测定上清液吸光度，利用标准曲线计算双乙酰含量。 1.3.4 菌株基因组与功能基因的测定 1．语料库能够提供典型、有代表性并且经过权威校勘的敦煌文献纯文本语料，从而为中古汉语的语言学研究提供真实鲜活的语言实例。 ①底泥的弱碱性能够中和一部分岩土的酸性，并且不会产酸，避免了可能的产酸风险；底泥中含有大量的钙，这可以在一定程度上降低重金属对植物的毒害作用。 1.3.5 乙偶姻及发酵乳风味物质测定 参考王琪等[16]方法并稍加改动，采用固相微萃取与气相色谱-质谱联用技术检测乙偶姻及发酵乳中的风味物质。 取6 g发酵乳样品于20 mL萃取小瓶中，同时加入0.05 mL 1,2-二氯苯作为内标物，将老化后的萃取头插入密封的萃取小瓶中，于50 ℃顶空吸附30 min。 色谱条件：程序升温：起始温度30 ℃，保持5 min；以10 ℃/min速率升温至230 ℃，保持5 min。进样口温度240 ℃，载气为氦气。 质谱条件：采用电子电离源，发射能量70 eV，离子源温度250 ℃，发射电流100 μA。根据各风味物质保留时间计算物质保留指数，对标准库和相关文献对比，确定风味化合物种类，计算各风味化合物质量浓度。 1.4 数据统计与处理采用SPSS 13.0软件进行数据统计处理。应用SigmaPlot 12.5软件对发酵乳中的风味物质进行统计分析，主成分分析采用XLSTATE 12.0软件。 根据《中华人民共和国农业技术推广法》，农业科研人员并非作为农业技术推广的主体。但作为农业技术的研发源头，部分学者已经看到农业科研人员在农业技术推广中的重要作用。他们认为，作为农业科技成果产生源头的农业高校、科研院所的科研人员已成为我国农业技术推广战线的重要力量,并在农业和农村经济社会发展中发挥着越来越重要的作用[8]。而根据科研工作的开展，越来越多的农业科研人员参与到农业技术推广工作中。 综上,于骨折处行球囊扩张有利于保障椎体后凸成形术治疗骨质疏松性椎体压缩骨折患者临床有效性、安全性,值得今后推广。 2 结果与分析2.1 不同菌株发酵乳双乙酰产量分析 图1 发酵乳的双乙酰产量
Fig. 1 Diacetyl contents of fermented milk samples
如图1所示，在未添加柠檬酸的发酵乳样品中，各组双乙酰产量有显著差异（P＜0.05），其中GST-6菌株所产双乙酰质量浓度最高，为0.72 μg/mL。其次菌株5-1、N1115双乙酰产量分别为0.53、0.47 μg/mL。添加柠檬酸后，各组发酵乳中双乙酰质量浓度明显升高，GST-6菌株发酵发酵乳中双乙酰质量浓度升高效果最为明显，为6.23 μg/mL，可达未添加柠檬酸样品的8.65 倍，这与丹彤等[17]在嗜热链球菌发酵含柠檬酸酸奶产双乙酰研究中的结论相符。菌株5-1、N1115双乙酰质量浓度也升高至5.28、4.47 μg/mL，分别为未添加柠檬酸样品的9.96 倍和9.51 倍。说明柠檬酸是促进GST-6、5-1和N1115菌株产双乙酰的重要因素。袁星星等[18]研究也发现乳酸菌可以以柠檬酸为碳源进行生长，产生具有奶油风味的双乙酰，改善发酵乳等产品的风味。并且当某些乳酸菌的生长速率不再提高时，仍可以利用柠檬酸代谢产生双乙酰等风味物质[19]。 2.2 菌株产双乙酰和乙偶姻相关基因的注释与分析 图2 乳酸菌中双乙酰和乙偶姻合成途径
Fig. 2 Synthesis pathways of diacetyl and acetoin in lactic acid bacteria
表1 合成双乙酰关键基因的注释
Table 1 Annotations of key genes related to synthesis of diacetyl  注：√.在基因组中检索到该基因序列；—.在基因组中未检索到该基因序列。 菌株 基因组登录号码 ALS ALDB LDH DR PFL OAD GST-6 SRR7850709 √—√—√√YNF-5SDJX01000001:SDJX01000113— √√— —5-1SDJW01000001:SDJW01000076√—√—√√KW14-3 SRR8476696 —√√— —K25 GCA_003020005.1 √√√—√—YW11CP035027-CP035032 √√√—√—XZ3303SDJU01000001:SDJU01000075√√√—√—N1115 GCA_000582665.1 √√√—√√
为分析菌株风味相关基因与双乙酰和乙偶姻等关键风味物质间的关系，研究首先对8 株菌的基因组进行基因注释分析，并参考Chen Chen等[20]和Cheng Hefa[21]绘制了乳酸菌双乙酰和乙偶姻合成的主要途径（图2）。如图2和表1所示，乳酸菌合成双乙酰的主要途径有两条，一是由葡萄糖经过糖酵解途径生成丙酮酸，再由丙酮酸代谢产生双乙酰，另一途径是由柠檬酸裂解酶形成草酰乙酸盐，再经草酰乙酸脱羧酶的作用生成丙酮酸，从而促进双乙酰的合成。两种代谢途径中都以丙酮酸为中间代谢产物，后续以应再以丙酮酸为起点最后可形成不同香气活性物质[22]。当未向发酵乳中添加柠檬酸时，产双乙酰的两种途径共同作用，但产生量较少；向发酵乳中添加柠檬酸后，柠檬酸产生双乙酰的途径被大大加快，双乙酰的产量也随之显著升高。增加双乙酰的积累量，要求菌株中必需物质为OAD和ALS，这两种物质可以促进柠檬酸代谢转化为双乙酰。而LDH促进丙酮酸分解为乳酸，PFL促进丙酮酸转化为醋酸，ALDB会使α-乙酰乳酸转化为乙偶姻，这3 种基因通路会减少双乙酰的产量。DR会将已经形成的双乙酰分解成乙偶姻，不利于双乙酰的积累。Ricciardi等[23]研究也发现乳酸菌可通过呼吸作用改变丙酮酸转化途径，使OAD、ALS基因和ALDB基因表达上调，LDH基因和PFL基因表达下调，有利于双乙酰等挥发性成分的形成。 因此，教学活动设计围绕学生的知识盲点展开，将有助于学生进行自主探索，形成自我构建，自然能够达到事半功倍的效果。 2.3 菌株双乙酰、乙偶姻产量与相关功能基因的关联分析为研究菌株基因组中风味相关功能基因的有无及其数量对风味物质产量的影响，采用关联分析方法分析功能基因与风味产量间的关系。本研究选用拟合分析，参考Acosta-Pech等[24]和Covarrubias-Pazaran[25]根据不同来源样品进行基因组分析的统计模型。依据菌株的功能基因信息建立菌株功能基因图谱，并转换为数量矩阵，以菌株含有的基因数量赋值，不含有的基因赋值为0，将各基因、双乙酰和乙偶姻含量进行正态分布检验，结果如图3所示，可知各基因和双乙酰含量符合正态分布，故在关联分析时选用Pearson相关分析。其中ALDB基因和DR基因在8 种菌株中没有差异，不参与分析。 
 图3 双乙酰、乙偶姻产量与相关功能基因的正态分布分析
Fig. 3 Normal probability plot of diacetyl and acetoin production and levels of related functional genes
表2 双乙酰、乙偶姻产量与相关功能基因的关联分析
Table 2 Correlation analysis between diacetyls and acetoin production and related functional genes  注：*.差异显著（P＜0.05）；**.差异极显著（P＜0.01）。 基因双乙酰（未添加柠檬酸发酵）双乙酰（添加柠檬酸发酵） 乙偶姻R P R P ALS 0.346 0.502 0.573 0.234 0.656 0.109 LDH -0.131 0.840 -0.265 0.612 0.320 0.484 OAD 0.898* 0.015 0.916** 0.010 0.462 0.296 R P
R绝对值代表该基因与双乙酰或乙偶姻产量的相关程度。R为正时表现为正相关，R为负时表现为负相关；R＞0.5，具有相关性，R＞0.8，强相关。如表2所示，双乙酰和乙偶姻均与PFL基因的关联不大，起到主要作用的为OAD基因。在未添加柠檬酸发酵乳的双乙酰关联分析中，ALS基因相关系数值仅为0.346，且P＞0.05，表明统计上的关联度不高，OAD基因的相关系数为0.898，说明该基因对双乙酰的贡献较大（P=0.015）。并且LDH基因与ALS基因、OAD基因为负相关，表明LDH基因可能会减少双乙酰产量。菌株添加柠檬酸发酵的双乙酰关联分析中，ALS基因的相关系数有所上升，并且OAD基因相关系数增大为0.916，表明其对双乙酰产量的贡献显著增强（P=0.010）。这可能与柠檬酸刺激了柠檬酸代谢产双乙酰的通路，使经过此条通路产生的双乙酰量显著升高有关[17]。乙偶姻产量与各功能基因的相关程度略差，且显著性分析P＞0.05，表明乙偶姻的合成可能较为复杂，现有数据和功能基因信息上无法有效预测。 2.4 发酵乳气相色谱-质谱检测结果表3 气相色谱-质谱检测藏灵菇发酵乳风味物质分析
Table 3 Contents of volatile flavor components in yoghurt determined by GC-MS  序号 物质名称保留时间/min质量浓度/（μg/mL）GST-6 YNF-5 5-1 KW14-3 K25 YW11 XZ3303 N1115酮类1 2-庚酮 6.25 1 182.00 0.86 1.91 1.81 2.30 0.81 0.65 1.58 0.39 2 2-壬酮 11.561 386.00 0.64 1.83 1.36 1.17 0.77 0.33 0.87 0.19 3 2-十一烷酮 16.711 595.00 0.00 0.22 0.00 0.28 0.25 0.08 0.17 0.00 4 2,3-丁二酮 3.85 962.00 0.72 0.13 0.53 0.25 0.14 0.24 0.24 0.47 5 乙偶姻 10.91 1 246.40 2.22 0.00 0.78 0.00 8.59 0.58 0.00 1.09 6 二氢-2-甲基-3(2H)-呋喃酮 3.30 1 260.00 0.00 0.00 2.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 7 二氢-4,4-二甲基-2(3H)-呋喃酮 30.902 116.57 0.00 0.00 0.07 0.07 0.05 0.00 0.04 0.01保留指数醛类8 壬醛 18.31 1 385.00 0.08 0.00 0.00 0.00 0.56 0.00 0.00 0.00 9 糠醛 15.46 1 411.35 0.06 0.17 0.57 0.14 0.18 0.02 0.00 0.00 10 苯甲醛 14.661 495.00 0.11 0.12 0.15 0.26 0.18 0.05 0.03 0.05酸类11 乙酸 12.791 446.00 2.61 1.81 2.69 5.10 4.89 0.66 2.89 0.73 12 丁酸 17.48 1 620.00 0.72 0.92 1.08 1.77 2.18 0.09 0.78 0.81 13 戊酸 20.461 614.28 0.00 0.00 0.00 0.40 0.00 0.00 0.00 0.00 14 己酸 20.081 835.00 2.08 2.78 4.46 5.32 5.81 0.38 3.07 2.37 15 辛酸 26.512 055.00 0.49 0.52 1.08 1.15 1.15 0.20 0.70 0.60 16 正癸酸 37.502 300.00 0.00 0.00 0.00 0.13 0.12 0.03 0.07 0.05醇类17 乙醇 1.21 946.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.35 1.71 0.00 18 2-呋喃甲醇 20.60 1 620.37 0.00 0.00 1.31 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00酯类19 丁酸乙酯 5.01 1 025.61 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.32 20 4-甲基-戊酸乙酯 9.93 1 207.13 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.03其他21 甲苯 8.37 1 028.00 0.54 1.13 1.35 0.97 0.00 0.55 0.88 0.00 22 二氢-2-甲基-3(2H)-噻吩 17.091 475.91 0.19 0.00 0.19 0.00 0.43 0.00 0.00 0.04 23 二甲砜 30.54 1 273.00 0.04 0.00 0.00 0.05 0.00 0.01 0.04 0.01 24 D-柠檬烯 9.03 1 179.26 0.00 0.00 0.00 0.00 0.58 0.00 0.00 0.00
为进一步明确菌株对发酵乳风味的整体影响，采用气相色谱-质谱法检测各菌株发酵乳的挥发性化合物组成，如表3所示。共检测到24 种挥发性风味化合物，酮类7 种，醛类3 种，酸类8 种，酯类2 种，其他挥发性物质4 种。不同菌株发酵乳的挥发性风味物质含量差异较大，植物乳杆菌K25菌株发酵乳挥发性风味物质种类最多，有16 种；而保加利亚乳杆菌YNF-5菌株发酵乳中挥发性风味物质种类最少，有11 种。 本实验共检出7 种酮类化合物，其中5-1、K25、N1115检测出6 种酮类化合物。酮类化合物可通过不饱和脂肪酸氧化、氨基酸降解和热降解途径产生[26]。此类物质阈值较低，对发酵乳的风味贡献较大。2-庚酮产生于亚油酸氧化过程，可赋予发酵乳强烈的果香[27]。乙偶姻（3-羟基-2-丁酮）是由α-乙酰乳酸脱羧形成的，也可由双乙酰分解产生，因此与发酵乳中双乙酰的含量有重要关系。在YNF-5、KW14-3发酵乳中未检测到乙偶姻，可能是因为这两种菌株中不含产双乙酰的关键基因OAD和ALS。K25发酵乳中的乙偶姻质量浓度较高，为8.59 μg/mL。2-壬酮可赋予发酵乳甜香、果香及奶油气味；2-十一烷酮有蜡香、脂肪香，并伴有奶油、乳酪的味道[28]。 醛类化合物是构成发酵乳典型香气的重要组分，其阈值一般较低，是各种氧化风味的来源[29]。本次检出的主要为壬醛、糠醛和苯甲醛。壬醛具有蜡香和脂肪香[28]。苯甲醛在8 种样品中均被检出，据报道苯甲醛有类似水果和坚果一样香气，可使发酵乳更加清香柔和[30]。这3 种醛类物质在刘东等[31]对天祝牧区传统发酵白牦牛发酵乳风味特性的分析也有检出。 本文考虑到主客观赋权法存在的缺点与不足，立足于主客观结合赋权方法的现状，采用层次分析法与熵权法相结合的赋权方法，确定了汾河流域节水灌溉水平综合评价体系中各个指标的综合权重，将专家的经验知识和各个数据信息充分结合，既体现了专家的个人意向，实现了专家个人偏好的合理表达，又能反映指标的客观特性，具有较强的实用性和可操作性。可为相关评价体系指标权重的确定提供参考。 酸类化合物是发酵乳中的重要风味化合物，乳酸也是发酵乳中的主要滋味的来源。本实验共检出6 种酸类化合物，其中乙酸、丁酸、己酸和辛酸在8 种样品中均有检出。丁酸、己酸、辛酸为牛乳本身具有的风味脂肪酸物质，乙酸可表现为醋酸味，丁酸可赋予发酵乳奶酪的香气[32]，己酸有脂肪气味，辛酸有水果的微酸香气。戊酸仅在KW14-3发酵乳中检出，可在一定程度上提高发酵乳的奶油香气。癸酸有增加发酵奶香的作用。但酸类化合物对发酵乳更主要的作用体现在滋味上，可使发酵乳具有清香爽滑的口感[33]。 醇类物质的阈值普遍较高，对发酵乳风味的作用不大。但醇类物质可在一定情况下转化为酸类物质，所以醇类物质也是发酵乳中一种重要的化合物。在8 种样品共检出乙醇和2-呋喃甲醇两种醇类物质。乙醇仅在YW11和XZ3303发酵乳中存在，它主要由藏灵菇中的酵母菌无氧代谢产生。2-呋喃甲醇仅在5-1发酵乳中检出，这种醇类主要由乳中的脂肪酶降解脂肪酸产生，具有甜香[34]。 酯类化合物主要来源于牛乳中的脂肪酸水解和微生物的代谢过程。本实验中共检出两种酯类物质，都仅在N1115发酵乳中检出。酯类物质可使发酵乳含有水果香气[35]。在适当质量浓度下，酯类物质可调和发酵乳的气味及口感，影响发酵乳的整体风味。 本实验还检测出了甲苯、二氢-2-甲基-3(2H)-噻吩、二甲砜和D-柠檬烯，它们在不同的样品中被检测到，这可能与乳酸菌种间的差异有关。各种风味化合物通过协同作用等可构成发酵乳的整体风味。  图4 发酵乳挥发性风味物质的主成分分析
Fig. 4 PCA of volatile components in yogurts fermented by the 8 LAB strains
为明确不同挥发性风味物质对菌株整体风味构成的贡献，采用主成分分析法研究发酵乳中的挥发性风味物质对样品整体风味构成的贡献，结果如图4所示。主成分1、2的累计贡献率为86.24%，其中酮类的主成分贡献率为14.25%，醛类对风味的贡献率为4.57%，酸类对风味的贡献率为71.27%，酯类为3.83%，其他为6.08%。根据各风味物质在样品射线上投影的长短可知，对各菌株发酵乳挥发性风味贡献度较大的主要为酸类，包括乙酸、丁酸、己酸和辛酸等。另外，2-庚酮和2-壬酮对各样品的风味也有较大贡献，而乙偶姻和双乙酰将样品从主成分1轴中间分为上下两组，水平中线上方为样品鼠李糖乳杆菌5-1、副干酪乳杆菌N1115、嗜热链球菌GST-6和植物乳杆菌K25，除菌株K25外，其他3 株菌的双乙酰和乙偶姻产量均较高。植物乳杆菌K25为何有如此高乙偶姻产量还有待进一步研究。水平中线下方为植物乳杆菌YW11、保加利亚乳杆菌KW14-3和YNF-5、乳酸菌乳球菌XZ3303，这些菌株的双乙酰和乙偶姻产量较低。挥发性风味物质中的有机酸、乙偶姻和双乙酰可能是形成菌株特征性风味的主要原因。 以EPSON Stylus Pro7910c为喷墨打印设备，对4种喷墨打印纸打印GATF标准色块，用QEA图像分析仪测试青色油墨网点的平均直径。 3 结 论检测8 株乳酸菌在发酵乳中双乙酰、乙偶姻等风味物质的产量，筛选出嗜热链球菌GST-6、鼠李糖乳杆菌5-1和副干酪乳杆菌N1115三株高产双乙酰菌株（P＜0.05）。全基因组注释与关联分析显示，8 株乳酸菌的双乙酰产量与PFL基因的关联不大，起到主要作用的为OAD基因。乙偶姻产量与功能基因的关联度较差。气相色谱-质谱法共检测到24 种挥发性风味化合物，有机酸、乙偶姻和双乙酰可能是区分菌株发酵乳特征性风味的主要物质。2-庚酮和2-壬酮对各样品的挥发性风味也有较大贡献。 参考文献： [1] DAN T, WANG D, JIN R L, et al. 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Analysis of Functional Genes Related to Production of Diacetal and Acetoin by Lactic Acid Bacteria YANG Ming1, HAO Xiaona1, LUO Tianqi1, JIANG Yunyun1, YANG Zhennai1, ZHU Hong2,*, ZHANG Jian1,*
(1. Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, Beijing Technology and Business University,Beijing 100048, China; 2. Shijiazhuang Junlebao Dairy Co. Ltd., Shijiazhuang 050221, China) Abstract: The diacetyl and acetoin production characteristics of eight lactic acid bacteria (LAB) strains isolated from Tibetan kefir and Inner Mongolia dairy tofu were studied. For this purpose, the six key genes related to the production of the fl avor compounds including diacetyl and acetoin in the 8 strains were determined using genome-wide annotation analysis.The amounts of diacetyl produced by Streptococcus thermophilus GST-6, Lactobacillus rhamnosus 5-1, and L. paracasei N1115 in fermented milk were 0.72, 0.53 and 0.47 μg/mL, respectively, significantly higher than those produced by fi ve other strains (P ＜ 0.05), and were increased up to 6.23, 5.28 and 4.47 μg/mL, respectively, when citric acid was added to the milk. Correlation analysis showed that the oxaloacetate decarboxylase (OAD) gene was strongly correlated with the yield of diacetyl with Pearson correlation coefficient of 0.898 (P ＜ 0.01), while the lactate dehydrogenase (LDH) and acetyl lactate synthase (ALS) genes were not significantly correlated with the yield of diacetyl (P > 0.05). The relationship between the yield of acetoin and each of the key genes was not significant (P > 0.05). Using gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS), a total of 24 volatile compounds were detected in all the fermented milk samples. Principal component analysis showed that organic acids, acetoin and diacetyl were the characteristic flavor compounds of the strains. Heptanone and 2-nonanone were also important volatile fl avor compounds. Keywords: lactic acid bacteria; diacetyl; acetoin; functional gene annotation; volatile compounds
收稿日期：2019-04-18 基金项目：北京市自然科学基金面上项目（6192004）；“十三五”国家重点研发计划重点专项（2018YFC1604302-02）；2019年研究生科研能力提升计划项目（19008001616） DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190418-231 中图分类号：TS252.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2020）10-0117-07 引文格式： 杨铭, 郝晓娜, 罗天淇, 等. 功能基因分析辅助筛选产双乙酰和乙偶姻乳酸菌[J]. 食品科学, 2020, 41(10): 117-123.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190418-231. http://www.spkx.net.cnYANG Ming, HAO Xiaona, LUO Tianqi, et al. Analysis of functional genes related to production of diacetal and acetoin by lactic acid bacteria[J]. Food Science, 2020, 41(10): 117-123. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190418-231. http://www.spkx.net.cn
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发表于 2021-2-10 10:45:25
