植物多酚氧化酶的生理功能、分离纯化及酶促褐变控制的...

奥鹏网院作业

植物多酚氧化酶的生理功能、分离纯化及酶促褐变控制的研究进展植物多酚氧化酶的生理功能、分离纯化及酶促褐变控制的研究进展

王馨雨1,2，杨绿竹1,2，王 婷3，王蓉蓉4，刘 洁1,2，单 杨1,2，张 群1,2，丁胜华1,2,*

（1.湖南大学研究生院隆平分院，湖南 长沙 410125;2.湖南省农业科学院农产品加工研究所，果蔬贮藏加工与质量安全湖南省重点实验室，湖南 长沙 410125;3.吐鲁番市林果业技术推广服务中心，新疆 吐鲁番 838000;4.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南 长沙 410128）

摘要：多酚氧化酶是一类能催化多酚类物质氧化的含铜质体的金属酶，在植物、动物、微生物中广泛存在。一方面对植物生理功能有重要作用;另一方面也引起植物，主要是果蔬品质的下降，造成严重经济损失。本文系统总结了多酚氧化酶的生理功能、分离纯化、酶学性质、酶促褐变控制方法等研究进展，以期为多酚氧化酶的基础研究与应用研究提供参考依据。

关键词：多酚氧化酶;生理功能;分离纯化;酶促褐变控制

日本科学家Yoshida最早提出漆树液汁变硬可能与某种活性物质有关，随后Keilin等从蘑菇中提取纯化得到该物质，并将其命名为多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）[1]。国际生物化学和分子生物学联合命名委员会提出PPO有以下分类：1）单酚酶（EC 1.14.18.1）即酪氨酸酶;2）二酚酶（EC 1.10.3），包括儿茶酚氧化酶（EC 1.10.3.1）和漆酶（EC 1.10.3.2）[2]，PPO是一类核基因编码酶，受多个基因控制，主要存在质体类囊体腔中，在植物中主要指儿茶酚氧化酶[2]。PPO对植物抵御外界胁迫、光合作用、生物合成等起重要作用，但在果蔬中PPO常引起负面效应，使颜色、味道、营养等受到破坏，因此对PPO的抑制作用一直是研究热点。Klabunde等[3]报道了甘薯PPO晶体结构，并揭示了其活性中心，这促进了分子水平上构效关系及性质的研究，为褐变控制提供了理论基础和研究思路。目前对PPO的抑制以化学处理和漂烫热处理为主，其他热处理及非热处理也正逐步发展，后者能够更好地保留果蔬营养，但存在灭酶不完全、成本高等缺点，因此还未能广泛应用。在遗传学方面，也有学者通过基因沉默或基因敲除手段抑制PPO表达，从而控制褐变，但因其基因家族和表达的复杂性，对其研究相对困难，离实际应用还有一定距离。本文就近年来PPO的生理功能、分离纯化、酶学性质及褐变控制进行综述，在此基础上，对酶促褐变的控制研究前景进行展望。

1 PPO的生理功能1.1 对抵御外界胁迫的影响

自然界植物受到外界胁迫时，其首先通过天然屏障（包括细胞壁、角质层、蜡质层、木质素等）发挥作用[4]。酚类物质是形成木质素的前提，可促进细胞壁和组织木质化，而PPO是参与酚类聚合的酶，影响细胞壁中木质素的合成[5]。病原菌侵染能诱导植物体内酚类物质的积累，酚类物质与PPO反应形成的醌再与其他物质交联形成的物质可作为物理屏障保护植物组织[2,6]。Thipyapong等[7]从基因层面研究发现转基因番茄PPO在正义表达中比反义表达表现出对昆虫更强的抗性。酚类物质的积累还被认为与植物抵御非生物胁迫有关，在冷胁迫、水分胁迫、热胁迫条件下均观察到该现象[8-10]，这些酚类物质与抑制PPO活性、增加抗氧化酶和活性氧清除剂酶活性相关[11]。

1.2 对光合作用的影响

目前普遍认为PPO是一种质体酶，存在于正常细胞的光合组织（叶绿体类囊体）和非光合组织质体（如马铃薯块茎细胞的造粉体）中[12]。PPO参与光合作用的猜想可分为两种，间接影响和直接影响。间接影响的相关证据为PPO蛋白与光系统II存在关联;PPO活性与叶绿体产生高水平O2相关;酚类物质对光合作用磷酸化有抑制作用，这暗示PPO可以通过氧化植物体内的底物来阻止这种抑制[12]。直接影响的相关证据为PPO可为光合作用起到氧缓冲作用,以促进活性氧的清除。但是该猜想的局限性在于目前缺乏酚类物质存在于叶绿体的证据,同时,与光合作用的速率相比,这种催化调节的速率相对缓慢[13]。

1.3 对生物合成的影响

Nakayama等[14]在金鱼草中发现一种酶，它能催化查耳酮生成金鱼草素，通过纯化该酶并测序得到cDNA，预测的蛋白质序列与其他植物PPO具有高度同源性。另外，体外实验表明来自脉孢菌的酪氨酸酶也可将查耳酮转化为金鱼草素[15]。由此推测，PPO可能参与了金鱼草素的生物合成。但是，金鱼草素合成酶N端无特异性的导肽，使其无法进入质体，并且这种酶的作用底物存在于液泡中的糖蛋白，不存在于质体中，这对PPO存在于质体的亚细胞定位问题提出了质疑[12]。

1.4 其他生理功能

在甜菜植物中PPO被认为参与甜菜碱的合成，但目前酪氨酸转化为L-二羟基苯丙氨酸（L-dihydroxyphenylalanine，L-DOPA）的证据还不完善[15]。Araji等[16]发现在PPO沉默的核桃植株中，酪氨酸的主要代谢物酪胺含量大量增加，而酪氨酸和3-羟基酪氨酸（酪氨酸酶的良好底物）含量显著降低，并且酪胺的积累使叶片细胞发生自发性坏死，由此认为PPO介导核桃酪氨酸代谢。未成熟番茄及香蕉果实和幼叶中PPO的活性均分别显著高于成熟果实和叶片，因此猜想它可能与植物生长发育有关[17]。

2 PPO对果蔬褐变的影响

虽然PPO对植物生理功能具有重要作用，但PPO引起的褐变反应使受损果蔬造成巨大的经济损失。图1为Gerdemann等[18]提出的酶促褐变反应机理，PPO的活性部位由两个铜原子组成，其在氧分子存在的条件下可催化单酚酶羟基化和将邻二酚氧化为邻醌;随后醌类化合物被氧化成醌衍生物，形成的邻醌与其他醌、氨基酸、蛋白质非酶聚合形成褐色化合物[18-19]。虽然这种褐变反应在红茶、咖啡、可可豆的着色方面必不可少，但在多数果蔬中是不被期望的[20-21]。从营养角度来说，一方面，酶促褐变形成的醌类是一种不稳定的化合物，醌的逆向歧化可形成半醌自由基，与氧气结合会形成一系列活性氧簇，这些活性氧簇会对DNA、蛋白质、氨基酸或脂类造成损害[13];另一方面，果蔬中的许多酚类物质，如绿原酸（苹果、甘薯、生菜）、儿茶酚（西兰花、茶叶、梨、葡萄、蓝莓）、酪氨酸（蘑菇、核桃、马铃薯），对人体健康有重要作用，如可抗癌、抗炎、诱导雌激素活性;酶促褐变反应会消耗底物酚类物质，这对果蔬的营养价值造成一定损失[18]。因此，对PPO引起的褐变反应控制一直是研究的热点。

     

图 1 单酚酶与二酚酶氧化反应机理[18]
Fig. 1 Oxidation mechanism between monophenolase and diphenolase[18]

3 PPO的提取与分离纯化

酶促褐变的控制通常需要对PPO的性质及结构进行研究，分离纯化是研究性质的第一步。在研究性质时常使用纯化倍数不高的粗酶液，而涉及其分子质量、结构等信息时，则需纯化至较高倍数。根据PPO来源的多样性及性质的差异性，应选择合适的方法，必要时可多种方法联用以达到最佳效果。

1.3.3 吸湿率 称重后的干燥粉尘，置于相对湿度控制在某一范围的保湿其中，若干时间后称重，粉尘的增重即为24h内从温度和相对湿度在范围的周围空气中吸收水分量，吸收的水分量与干燥粉尘本身质量之比率即为粉尘的吸湿率。

3.1 提取

酶的来源不同，提取酶的试剂也有差异。盐溶液用于提取在低浓度盐中溶解度大的酶，有机溶剂用于提取与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶。由于酚类物质会干扰酶的纯化，为减缓这种不良反应，研究者采用了以下手段：氮气环境、低温组织均质化、添加酚醛吸收聚合物。Alici等[22]在用磷酸盐提取琉璃苣PPO时添加聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）、Triton X-100作为苯酚清除剂。植物中PPO存在两种形式，游离态PPO（soluble PPO，sPPO）和结合态PPO（membrane-bound PPO，mPPO），mPPO在未激活前不表现出酶促活性。通常，在提取时需通过蛋白酶如胰蛋白酶[23]、蛋白酶K[24]或温和洗涤剂[22,25]（如Triton X-100、Triton X-114、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS））对酶激活。Liu Fang等[25]在提取富士苹果mPPO时，添加抗坏血酸以及蛋白质抑制剂苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）和乙二胺四乙酸（edetic acid，EDTA）以防止酶的降解。Yoruk等[26]研究中提到在提取mPPO时添加其激活剂SDS，可使马铃薯叶中PPO活性提高4 倍，使蚕豆中PPO活性最大提高119 倍。

3.1.1 盐溶液提取法

[2]庄国土：《16一18世纪白银流入中国数量估算》，《中国钱币》1995年第3期；庄国土：《茶叶、白银和鸦片:1750一1840年中西贸易结构》，《中国经济史研究》1995年第3期；杜恂诚、李晋：《白银进出口与明清货币制度演变》，《中国经济史研究》2017年第3期；陈昆：《宝钞崩坏、白银需求与海外白银流入———对明代白银货币化的考察》，《南京审计学院学报》2011年第2期；王裕巽：《明代白银国内开采与国外流入数额试考》，《中国钱币》1998年第3期；刘军：《明清时期白银流入量分析》，《东北财经大学学报》2009年第6期。

大多数蛋白类酶都溶于水，且在低浓度盐存在条件下，酶的溶解度随盐浓度升高而增加，这种现象称为“盐溶”效应。提取效果的关键在于缓冲液的选择。研究者在提取西米[27]、马鲁拉果[28]、龙葵果实[29]等植物的PPO时，常采用磷酸盐缓冲液作为提取剂。提取PPO时为了给蛋白质提供一个温和环境，通常提取液的pH值在6.5～7.3之间（表1）。低浓度盐缓冲液提取酶较为温和，得率较高，但低浓度盐缓冲液所需体积大，一般需经过进一步浓缩、提纯才能进一步进行研究应用。

表 1 盐溶液提取PPO的方法
Table 1 PPO extraction methods with salt solutions

     

来源 酶的类型 提取液 辅助剂 参考文献富士苹果 结合态 0.05 mol/L pH 6.8磷酸钠 抗坏血酸、PMSF、EDTA [25]柿子 结合态 0.1 mol/L pH 7.3磷酸盐 PMSF、Triton X-100 [30]杏 结合态 0.1 mol/L pH 6.8 磷酸钠 抗坏血酸钠、PVPP [31]龙葵果实 游离态 0.05 mol/L pH 6.5 磷酸钠 Triton X-114、PVP [29]琉璃苣 游离态 0.1 mol/L pH 7.0 磷酸盐 抗坏血酸、PVP、TX-100 [22]

3.1.2 有机溶剂提取法

有机溶剂如丙酮、乙醇也常用于沉淀蛋白质[32]。主要是有机溶剂的存在使溶液介电常数降低，溶质分子间静电引力增大，互相吸引而凝集。相比盐析法，有机溶剂法析出的蛋白质沉淀更易过滤和离心，但易使蛋白质结构发生构象变化使酶变性失活;因此，有机溶剂提取通常在-20 ℃低温下进行[33-34]。Tao Yiming等[35]在用磷酸盐缓冲液提取PPO后，用丙酮进一步纯化得到2.5 倍纯度、69.4%回收率的PPO。粗酶液与冷却的丙酮混合得到的酶提取物称为丙酮粉，Gong Zhiqing等[33]先将板栗PPO制成丙酮粉，用磷酸盐缓冲液溶解，再用硫酸铵对其进一步纯化，得到4.19 倍纯度的PPO。

致谢 本文研究工作受南京航空航天大学研究生创新基地(实验室)开放基金(kfjj20170122)资助.

3.2 纯化

在多数研究中，PPO纯化涉及的步骤为硫酸铵或有机溶剂沉淀后，经过滤、离心、透析处理，再采用几种色谱纯化技术，如离子交换色谱、体积排阻色谱、疏水相互作用色谱等[36-37]。尽管用这种工艺纯化酶能得到较好纯化效果，但它仍具有许多缺点，例如成本高、耗时长等。温度诱导相分离、双水相萃取、三相分离技术等液-液萃取的技术也应用于酶的纯化[23,38-39]。

3.2.1 硫酸铵沉淀

所有蛋白质表面都有亲水基团和疏水基团，在含水提取物中，加入过量的盐会增加表面张力，最终增强蛋白质疏水相互作用使其沉淀，这种现象称为“盐析”效应。多数研究人员已采用质量分数30%～85%的饱和硫酸铵用于沉淀PPO（表2）。盐析会使蛋白质构象变化，却不会使其变性失活，通常在4 ℃下进行。但是，经盐析得到的酶沉淀含大量盐成分，Derardja[31]和Liu Nana[37]等用Tris-HCl作缓冲液低温透析除去沉淀中的盐成分，也有许多学者通过超滤、层析等手段进行后续纯化处理。为提高酶提取效率，在用沉淀法提取酶时，需将提取液pH值调节至提取酶的等电点附近。

表 2 硫酸铵对不同来源PPO纯化的影响
Table 2 Effect of ammonium sulphate on the purification of PPO from different sources

     

来源 饱和硫酸铵质量分数/%纯化步骤纯化倍数回收率/%参考文献富士苹果 60～80 2 16.48 5.28 [25]蛇果 40～80 2 3.30 31.33 [38]杏85 1 1.00 100.00 [31]榅桲 30～75 3 16.30 45.30 [40]香蕉 15～35 3 5.00 50.00 [41]柿子 50～75 2 4.50 90.00 [30]板栗仁 30～80 1 4.19 40.31 [33]欧芹 50 1 2.40 53.00 [36]

3.2.2 双水相萃取

表 3 双水相萃取不同来源PPO纯化的影响
Table 3 Effect of aqueous two phase system on the purification of PPO from different sources

     

注：纯化倍数是与最初未经纯化的粗酶液进行比较。下同。

来源 聚合物 盐 pH 纯化步骤纯化倍数回收率/%参考文献榅桲 5% PEG-8000 14%磷酸盐 7.0 2 4.2 56.35 [40]香蕉 5% PEG-8000 14%磷酸钾 7.0 2 3.10 54.00 [41]金莓 5% PEG-8000 14%磷酸盐 5.5 2 4.65 74.29 [39]灯笼果 5% PEG-8000 14%磷酸盐 5.5 2 169.40 13.90 [46]马铃薯 5% PEG-8000 28.5%磷酸盐 7.0 1 15.70 97.0 [44]

通常，双水相萃取体系是由两种互不相溶的聚合物/聚合物或聚合物/盐的水溶液组成，利用溶质在两个互不相溶的水相中的溶解度不同而达到分离目的。如表3所示，聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）是双水相萃取中使用最多的成分之一，多数研究者使用分子质量1 500～8 000 Da的PEG和磷酸盐/硫酸盐组合。聚合物的分配行为取决于聚合物的相对疏水性[42]。体系的pH值影响蛋白质的可电离基团并改变蛋白质表面电荷，随着pH值增加，高于其等电点的蛋白质/酶更多地分配到顶部相，低于等电点的酶则分布至底部相[43]。榅桲[40]、马铃薯[44]PPO提取物位于顶部相，而菠萝[39]PPO提取则富集于底部盐相。Vaidya等[44]探究了不同参数对马铃薯PPO纯化的影响，得到最佳体系为pH 7.0、质量分数5%PEG-8000、28.5%磷酸盐。Niphadkar等[45]则用双水相萃取法对废弃马铃薯中PPO进行纯化，得到的纯化酶是粗酶活力的4.5 倍。双水相萃取法是植物中PPO的有效初级纯化步骤，其优势在于可大批量纯化PPO，但聚合物产生的污染、难以回收是双水相萃取中的一大难题。

3.2.3 温度诱导相分离

温度诱导相分离利用浊点萃取原理，以表面活性剂胶束水溶液的溶解性和浊点现象为基础，改变温度参数引发相分离，将疏水性物质与亲水性物质分离。低温时，处于临界胶束浓度的表面活性剂在水溶液中完全溶解，当温度升至浊点温度时，溶液变得混浊，此后通过离心可以将溶液分成两个透明相，分别由接近临界胶束浓度的表面活性剂的无胶束溶液与该表面活性剂的浓溶液组成[47]。Trition X-114是最常见的非离子表面活性剂，温度诱导相分离法纯化PPO的示例见表4。Onsa等[27]使用离子表面活性剂如SDS和脱氧胆酸钠，以及非离子表面活性剂如Trition X-100、Trition X-114和Tween-80从西米中提取PPO，观察到非离子表面活性剂较离子型表面活性剂提取效率高2～5 倍，尤其是具有较低疏水指数的Trition X-114更有效。选择诱导温度通常为4 ℃和35～37 ℃，诱导时间多为10～15 min。温度诱导相分离得到的PPO纯化倍数相对较低，通常作为纯化的第一步，后续常与硫酸铵及色谱法联用。

二是全力打造城市安全食品产业，促进垦区现代农业的高质量发展。面向粤港澳大湾区，全力打造城市安全食品产业，继续发展糖业、畜牧、粮油、乳业、果蔬等城市安全食品产业，优化提升糖粮油、肉菜果等食品板块生产结构，延伸产业链条，拓展营销渠道，在优化农产品生产和供应结构，补齐产业链、价值链短板方面发力。总之，就是要把农垦的好产品卖出去，并且卖出好价钱。

表 4 温度诱导相分离对不同来源PPO纯化的影响
Table 4 Effect of temperature induced phase separation on the purification of PPO from different sources

     

来源 表面活性剂 诱导温度和时间 纯化步骤纯化倍数回收率/%参考文献富士苹果 1.5% Trition X-100 4 ℃、15 min;35℃、15 min 1 1.33 46.98 [25]蛇果 8% Trition X-114 4 ℃、30 min;35 ℃、15 min 1 1.20 76.79 [39]柿子 4%～6% Trition X-114 4 ℃、10 min;37 ℃、15 min;37℃、15min 1 4.10 69.80 [30]马鲁拉果实 4% Trition X-114 35 ℃、10 min;室温10 min 1 3.00 1530 [28]榅桲 4%～6% Trition X-114 4 ℃、10 min;37 ℃、15 min;37 ℃、15 min 1 3.70 76.26 [40]香蕉 6% Trition X-114 4 ℃、15 min;37 ℃、15 min 1 1.60 93.00 [37]西米 8% Trition X-114 4 ℃、30 min;35 ℃、15 min 1 4.10 69.80 [23]卷心莴苣 8% Trition X-114 4 ℃、15 min;35 ℃、15 min 1 5.71 70.40 [48]

3.2.4 三相分离

三相分离是一种简单、经济且相对较新的生物分离纯化技术，已有研究者用其分离纯化蛋白质尤其是酶、酶抑制剂、脂肪、多糖等[49]。根据谭显东等[50]的划分，三相分离萃取有5 类，酶的提取属于第一类，包括有机相/水相萃取体系和形成的第三相。通常在粗提取物中加入硫酸铵作为盐，叔丁醇为有机相，水与叔丁醇能完全混溶，但加入大量的硫酸铵时，溶液会分离为上层叔丁醇相、下层水相，中间层是新形成的酶的共聚物[51]。这其中可能是盐析、共溶剂沉淀、渗透、亲液效应等协同作用的结果[52]。表5总结了三相分离法提取不同来源PPO的情况。纯化的PPO并非都在中间沉淀相中纯度最高，受pH值和分子质量等影响，有时蛋白质更倾向于保留在底层水相，这在马铃薯PPO的纯化[52]中有所体现。此外，三相分离法用于纯化过氧化物酶中也出现这种蛋白质在底层水相的现象[53]。Niphadkar等[52]利用超声波辅助三相分离法提取马铃薯皮中的PPO时发现，超声辅助提高了酶纯度和回收率，同时将分离时间从40 min缩短到5 min。三相分离技术应用于PPO分离纯化的研究目前不多，但该技术在其他酶如木瓜蛋白酶、番茄转化酶的研究上已取得较好成效[54-55]。三相分离的纯化效果与传统的沉淀法和色谱法相比，有处理量大、简单、快速、经济的优势，但其缺点是纯化倍数较低，因此比较适合大规模纯化的第一步骤。此外，三相分离与双水相分离技术相比避免了聚合物的回收和水污染等问题，更加绿色环保。

表 5 三相分离对不同来源PPO纯化的影响
Table 5 Effects of three-phase separation on the purification of PPO from different sources

     

来源 V（溶剂）∶V（粗提物） 有机相 盐 pH 温度/℃ 提取时间/min纯化步骤纯化倍数回收率/%参考文献琉璃苣 1∶1 叔丁醇 15%硫酸铵 6.5 25 60 1 3.59 69.75 [22]马铃薯皮 1∶1 叔丁醇 40%硫酸铵 7.0 30 40 1 6.30 70.00 [52]

3.2.5 色谱法

色谱法是最常用且纯化效果最好的技术之一，目前常用的色谱方法有凝胶过滤色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱、快速蛋白质液相色谱等。从表6来看，纯化不同来源PPO时选择的色谱类型、色谱柱不同，选择时主要根据酶和杂质的类型、电荷、分子质量等多方面考虑。色谱分离法一般在初步提取纯化后使用[25,28,56-58]。进色谱柱前需对粗酶液进行多次透析过夜处理，磷酸盐是最常用的试剂[56,59]，Tris-HCl缓冲液也常被用到[31,60]。为了获取更高纯化倍数，研究者通常多次使用色谱法进行纯化，如海枣PPO经两次色谱纯化后，纯化倍数从4.4提高至79.9，茄子PPO经3 次纯化后，纯化倍数高达259[57-58]。还有的研究者在凝胶色谱之前对粗酶进行超滤处理，使用特定的分子膜截留酶分子，以获取更高的纯化倍数[28]。对于吸附酶的洗脱，常采用pH值为6.0～8.0磷酸盐缓冲液、氯化钠溶液、Tris-HCl缓冲液。洗脱方式主要有线性洗脱与梯度洗脱。凝胶过滤色谱法根据分子质量的大小分离不同组分，也可用于估计酶的分子质量，Marrufo-Hernández等[60]利用Superdex 200 10/300 GL柱分离金冠苹果PPO得到58 kDa的单体。在科研工作中，色谱法因其绿色温和高效等优势得到广泛使用，但这种方式要求性能设备高且操作周期较长。

表 6 色谱分离条件对不同来源PPO纯化的影响
Table 6 Effect of chromatographic separation conditions on PPO purification from different sources

     

来源 树脂 色谱类型 洗脱液 纯化步骤纯化倍数蛋白质回收率/%参考文献富士苹果 DEAE Sepharose Fast Flow 阴离子交换 0.05 mol/L磷酸钠（pH 6.8） 3 54.41 0.054 [25]蛇果HiTrap Phenyl Sepharose 快速蛋白液相 0.1 mol/L磷酸钾（pH 6.8） 3 10.50 36.72 [38]Superdex 200 HR 10/30 凝胶过滤 0.05 mol/L磷酸钾（pH 6.8）+0.15 mol/L NaCl 4 14.10 12.35刺果番荔枝XK 16/20 快速蛋白液相 0.05 mol/L 磷酸盐（pH 7.0）+0.15 mol/L KCl 2 102.00 18 [56]Mono Q HR 10/10 阳离子交换 20 mmol/L Tris-HCl+1 mol/L KCl 3 160.00 3蜜桃Phenyl-Sepharose CL-4B 疏水相互作用 50 mmol/L磷酸盐（pH 6.8） 2 2.83 87 [34]DEAE Sepharose Fast Flow 阴离子交换 Tris-HCl缓冲液（pH 6.5） 3 6.58 56 Sephaoryl HR S-200 分子排阻凝胶 50 mmol/L磷酸盐（pH 6.8） 5 12.40 20杏Q-Sepharose FF 阴离子交换 0～1 mol/L NaCl（梯度洗脱） 2 6.30 58.6 [31]Mono S HR 5/50 GL 阳离子交换 同上 3 23.20 51海枣Q-Sepharose Big Beat 阴离子交换 0.5 mol/L磷酸钠（pH 7.0）+0～0.5 mol/L NaCl（梯度洗脱） 2 4.40 9 [57]C18 zorbax 凝胶过滤高效液相 同上 3 79.90 20马鲁拉果实DEAE-Toyopearl 阴离子交换 10～200 mmol/L磷酸盐（pH 7.0）（梯度洗脱） 2 16.00 118 [28]Sephadex G 100 凝胶过滤 100 mmol/L磷酸盐（pH 7.0） 3 58.00 75板栗 DEAE-52 阴离子交换 0.05 mol/L磷酸钠（pH 7.0）+0.15～1.5 mmol/L NaCl（梯度洗脱） 2 4.60 2.03 [33]茄子DEAE Cl-6B Sepharose 阴离子交换 0.2 mmol/L磷酸盐（pH 8.0）+0～0.5 mol/L NaCl（梯度洗脱） 2 8.94 13 [58]phenyl Sepharose 疏水相互作用 18%～0%硫酸铵（降梯度洗脱） 3 44.00 2.7 Superdex™ 200 GE healthcare 凝胶过滤 150 mmol/L NaCl 4 259.00 0.02

4 PPO的酶学性质4.1 理化性质

根据蛋白质的性质，测定酶的分子质量一般使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）或非变性凝胶电泳（native polyacrylamide gel electrophoresis，Native-PAGE）法，前者使酶分子变性，后者保留了酶的生物活性，但清晰度不如前者。因此在PPO分子质量的测定中大多用SDS-PAGE法，少部分使用Native-PAGE法[38,48]。如表7所示，根据来源的不同，PPO的分子质量范围为31～144 kDa。有的研究人员在测定植物PPO分子质量时获得了不止一条带，如Batista等[29]用SDS-PAGE法测定龙葵果实PPO分子质量，得到约70 kDa的单带，再用Trition X-100处理PPO，以改善蛋白的电泳迁移率，得到分子质量分别为47 kDa和68 kDa的两条带，这表明相同来源的PPO可能存在不同的亚型，即同工酶。此外，Mishra等[58]用SDS-PAGE和Native-PAGE法测定茄子PPO分子质量，SDS-PAGE法显示其分子质量为65 kDa，Native-PAGE显示约为112 kDa，同时经Superdex凝胶过滤色谱中测得PPO分子质量也为112 kDa，由此推测具有活性的茄子PPO可能是一种同型二聚体。同样的PPO二聚体现象在刺果番荔枝[56]、菠萝蜜[35]中也被发现。果蔬成熟期不同，PPO的分子质量也有差异，Cheema等[61]研究不同成熟期芒果PPO的分子质量发现，处于R1阶段未成熟的芒果PPO表现出144 kDa的分子质量，处于R2～R4中间阶段均表现出53 kDa的条带，R5～R6的过熟期PPO分子质量又升至112 kDa。

pH值对PPO的影响在于改变酶表面的电荷影响其溶解度以及破坏其结构。温度则通过影响动力学性质及氧溶解度改变酶的活性。PPO最适pH值和温度都是对特定的底物而言，由表7可知，PPO的最适pH值为3.6～8.0，最适温度为5～45 ℃不等。针对单一底物和酶来源，最适pH值可能不止一个。在沙漠松露中，催化邻苯二酚氧化时存在两个最适pH值，分别为3.6、7.0，说明同工酶的存在[62]。不同来源的PPO催化同一底物氧化时的最适pH值、温度也不同。整体看来，PPO适合在弱酸性、30 ℃左右保持活性。据报道，大多数植物、动物和真菌都具有儿茶酚氧化酶、酪氨酸酶和甲酚酶活性，在少数果蔬中缺乏单酚酶活性，如茄子[58]、蛇果[38]、杏[33]。无核葡萄PPO能催化邻苯二酚和L-DOPA氧化，但不能催化单酚酪氨酸、二酚愈创木酚和咖啡酸、三酚焦没食子酸和没食子酸氧化[63]。PPO活性似乎与底物结构有关，Mishra等[58]研究了11 种底物与PPO活性的关系，发现相对于羟基，邻苯二酚环结构及较小的官能团（4-甲基）是决定其活性的主要因素。米氏方程中Km常用于衡量底物对酶的亲和性，Km越小，与酶的亲和性越高，琉璃苣PPO与咖啡酸、灯笼果PPO与绿原酸、茄子PPO与4-甲基邻苯二酚、沙漠松露PPO与酪氨酸的亲和力最高（表7）[22,46,58,62]，Km分别为0.51、0.56、0.34 mmol/L和0.14 mmol/L。但亲和力高的催化效率不一定高，如金冠苹果中PPO与4-甲基邻苯二酚的亲和性是与邻苯二酚亲和性的4.0～5.8 倍，但从催化效率Kcat/Km或Vmax/Km来看，邻苯二酚是前者催化效率的2.6 倍[60]。与酶亲和力高的底物更易结合，从而发生一定程度的褐变，而与酶反应使酶催化效率高的底物，能在最短的时间达到最大的褐变度。

表 7 不同来源果蔬中PPO的酶学性质
Table 7 Enzymatic properties of free and bound PPOs in fruits and vegetables

     

注：—.文献未报道，ND.未检出。

来源 PPO类型分子质量/kDa高特异性底物Km/（mmol/L）Vmax/Km/（（U·L）/（mmol·mL））Kcat/Km/（L/（mmol·s））pH温度/℃抑制剂参考文献琉璃苣 游离态 80.6邻苯二酚 2.24—9.8×103 7.5 10偏亚硫酸钠、叠氮化钠、L-半胱氨酸、抗坏血酸 [22]4-甲基邻苯二酚 4.55 2.4×104 5.0 5咖啡酸 0.51 1.22×105 5.5 20连苯三酚 2.36 11.5 7.5 30欧芹 游离态 46 邻苯二酚 31 64.52 — 7.0 40 L-半胱氨酸、柠檬酸 [36]4-甲基邻苯二酚 37.4 38.17 8.0 35蛇果 结合态 38 儿茶酚 5.46 0.98 — 6.5 30 L-半胱氨酸、抗坏血酸、谷胱甘肽、EDTA [38]海枣 游离态 90邻苯二酚 35 80—5.0 40焦亚硫酸钠、抗坏血酸、苯甲酸、钠氟、水杨酸 [57]4-甲基邻苯二酚 48.5 28 4.0 35连苯三酚 60.2 18 5.5 30灯笼果 游离态 31邻苯二酚 203.8 0.06—5.5 40抗坏血酸、L-半胱氨酸、槲皮素、亚硫酸钠 [46]4-甲基邻苯二酚 3.88 9.92 5.5 25绿原酸 0.56 94.91 5.0 20芒果 游离态 53、112、144邻苯二酚 10.59 0.03—5.4～5.6— 抗坏血酸钠、谷胱甘肽、曲酸 [61]3-甲基儿茶酚 3.69 0.07 5.4～5.6连苯三酚 0.83 0.59 5.7杏 结合态 63邻苯二酚 5.3—40 4.5 45 4-己基间苯二酚、偏亚硫酸钠、抗坏血酸、L-半胱氨酸 [31]绿原酸 2.7 500—4-甲基邻苯二酚 2.0 340连苯三酚 11.5 50茄子 游离态 56邻苯二酚 0.54—2.9×105— 半胱氨酸盐酸盐、亚硫酸氢钾、抗坏血酸、曲酸、二羟基苯酸 [58]4-甲基儿茶酚 0.34 3.3×106叔丁基儿茶酚 0.44 8.6×105二氢咖啡酸 0.48 4.7×105金冠苹果 游离态 58邻苯二酚 7.5 15 402—6 35偏亚硫酸氢钠、抗坏血酸、托酚酮 [60]4-甲基邻苯二酚 1.3 5 941—连苯三酚 1.1 —绿原酸 4.6柿子 结合态 — 4-叔丁基邻苯二酚 0.68 — — — 托酚酮、焦亚硫酸钠、肉桂酸、L-半胱氨酸 [30]榅桲 结合态 — 4-叔丁基邻苯二酚 1.2 — — 5.5 — L-半胱氨酸、抗坏血酸、偏亚硫酸氢盐 [40]龙葵果实 游离态 47、68邻苯二酚 6.47 0.53—6.0～6.5 28 L-半胱氨酸、偏亚硫酸氢钠、抗坏血酸、硫脲和柠檬酸 [29]4-甲基邻苯二酚 0.15 20.07 —连苯三酚 20.11 0.19沙漠松露 结合态 —酪氨酸 0.14——5～6 35～45—[62]邻苯二酚 2.5 3.6、7.0 30邻苯二酚 8.2 7.0 8酚酮、曲酸、抗坏血酸L-半胱氨酸、谷胱甘肽 [35]菠萝蜜 游离态 65 4-甲基邻苯二酚 18.2 — — 6.5 8酪氨酸/连苯三酚/没食子酸 ND ND — —

植物中的mPPO和sPPO分别位于叶绿体类囊体膜、和内腔中。其中mPPO可以与类囊体膜发生弱结合或强结合，不参与酚类化合物的合成[25,38]。sPPO可能是mPPO活化或在成熟或衰老中自发释放的[38]。研究者对sPPO的关注相对更多，如在海枣果[57]、茄子[58]、金冠苹果[60]、芒果[61]等中，但在一些非热处理下，如超声、高静水压、脉冲电场等能增强酶的活性[25]，这引起了学者们对mPPO的关注。沙漠松露PPO在未经SDS活化时，没有表现出PPO的活性，经SDS处理后，才能够测出催化酪氨酸和邻苯二酚的活性[62]。

正规形理论是寻找具有一定光滑性的坐标变换，以简化给定的非线性系统[1].简化之后的系统与原系统属于同一个等价类，拓扑结构或定性结构不会发生改变，并且形式简单易于研究.该理论是研究系统在不动点附近性态的有效工具，也是动力系统理论中的重要方法之一.

4.2 结构性质

PPO通常以无活性的前体形式存在。前体由N端导肽、中间高度保守的Cu原子结合区和C端疏水区3 个部分组成。N端导肽可引导PPO蛋白质前体进入类囊体膜，保守性低。C端疏水区也有导肽，能引导成熟的酶蛋白进入类囊体中。Cu原子结合区是该酶的主要功能区，其他部分则对酶的构象、高级结构的形成和维持起作用，中间高度保守的Cu原子结合区富含His残基，每个Cu与3 个His残基相连，形成特有的三维活性部位[15]。对蛋白质结构性质的研究，主要是进行氨基酸序列模拟分析。获取氨基酸序列的途径主要有两种，一种是对纯化的酶进行质谱分析获得小分子肽段，再经数据库比对整合所有氨基酸序列;另一种是通过基因克隆手段获取氨基酸序列。

目前，我国书刊市场呈现期刊业进入内容为王的时代、童书发展速度惊人、按需印刷成为图书印刷的重要组成部分、畅销书时代即将来临的四大特点。针对这一发展态势，郭健坦言：“利丰雅高未来仍将坚持占领期刊的制高点，努力扩大图书、喷绘市场空间，以期成为一个集期刊、图书、文宣、喷绘于一体的、新的一站式印刷服务商。”

不同来源的植物PPO氨基酸序列相似但不完全相同，如菠菜、梨、桃、蚕豆、胡萝卜、马铃薯、番茄、葡萄、苹果的PPO氨基酸序列相似性达45%～95%[63]。不同植物PPO氨基酸序列不同，其高度保守的活性中心氨基酸特征也存在差异，Liu Fang等[25]对富士苹果mPPO结构预测分析，发现其含有6 个α-螺旋、2 个β-短链、10 个无规卷曲，2 个Cu结合位点连接3 个His残基，分别为CuA连接His191、His212、His221，CuB连接His344、His348、His378。而Klabunde等[3]提出的甘薯中CuA和CuB分别与His88、His118、His109和His244、His274、His240相连。经分子对接发现PPO在富士苹果中的活性中心主要由疏水氨基酸（His191、His221、Phe217、Try224、Phe374）形成的疏水口组成，在葡萄中则由His87、Phe113、Asn240、His243、Lys244、Gly257、Phe259、Ala262、Phe268组成[64]，这些氨基酸残基可能在酶的催化位点起重要作用。彭益强等[65]研究了乙酰丙酮、溴乙酸等具有相对专一性的氨基酸基团修饰剂，发现富士苹果中PPO蛋白质中酶活性中心的必需基团有组氨酸的咪唑基、精氨酸的胍基与色氨酸残基。PPO的三维结构模型研究一般基于数据库中已建立的晶体结构作为模板同源模建，齐晓娟[66]以甘薯PPO为模板，同源建模得到藕的PPO三维结构，再用计算机进行PPO靶酶结构筛选，根据构象筛选抑制剂，再对其进行结构修饰开发了21 种新型抑制剂。

5 酶促褐变的控制

PPO在植物生理功能中地位显著，但会使果蔬发生褐变，从而导致巨大的经济损失。因此，必须抑制果蔬的酶促褐变以保持其色泽和营养。基于前文提到的褐变机制，褐变的控制主要可从4 个方面入手（图2）：氧气浓度的控制、酶活性的抑制、酚含量的控制、褐变反应过程的控制。目前对抑制褐变的研究很多，过去主要集中在化学处理、热处理方面，近来高压、超声、脉冲电场等控制技术已成为新的研究热点。

经过以上多元路径的开发，拓展性课程结构已初步具备，配合教学进度实施，根据课堂实施情况，逐步根据生成适当调整，以保证课程资源更贴近学生的生活和学习实际，微课程设计流程如图1.

     

图 2 酶促褐变的控制机理及方法
Fig. 2 Mechanisms and methods for enzymatic browning control

5.1 化学方法

根据抑制机理，化学抑制剂可分为还原剂、螯合剂、酸剂、酶抑制剂、酶处理剂和络合剂[67]。常用的还原剂有抗坏血酸及其盐和硫化物。抗坏血酸是一种维生素，较硫化物安全性更高，其抑制机制在于将醌还原成酚阻止醌的二次聚合反应，并且能降低环境pH值，抑制酶活性。在大多数研究中，抗坏血酸表现出良好的抑制作用，在刺果番荔枝[56]、芒果[68]中，0.1 mmol/L的抗坏血酸能使PPO完全失活;在菠萝蜜[35]、蛇果[38]中抑制50%的酶活力，抗坏血酸浓度分别需达到0.3、1.5 mmol/L。但也有研究发现抗坏血酸能与色素、内源性酶和铜等金属等中间体发生不可逆氧化，在苹果汁中0.18 mmol/L的浓度只能维持4 h[67]。在含硫化合物中，L-半胱氨酸作为一种生物体内常见的氨基酸，在控制蛇果[38]、黄金梨[69]、生姜[70]等果蔬褐变中效果显著。其主要抑制机制是与醌类结合形成无色化合物抑制黑色素的形成。但是它的缺陷在于有一种难闻的气味，限制了其使用。偏亚硫酸钠、亚硫酸钠、亚硫酸氢钾等硫化剂因其强还原性表现出非常强的PPO活性抑制效果，但出于安全考虑其正逐渐被其他健康的抑制剂替代，如曲酸、谷胱甘肽、托酚酮、槲皮素等。

作为基层食品药品监管部门的负责人，面对食品药品基层监管点多、线长、面广、人员不足等共性问题，他积极创新基层工作亮点，依托社会综治网格化管理优势，将食品药品监管纳入综治网格化信息平台，在全省率先试行食品药品安全网格化监管工作，不仅最大程度延伸基层监管触角，还有效引导各界共同参与食品安全社会共治、大大提升群众食品药品的安全感和满意度。

4)反冲质子经过质子准直器的限束后，选择能进入二极偏转磁场的反冲质子；接着，在二极磁场力的作用下进行动量分析，确定经过二极磁场后出射质子的空间位置和飞行方向。

曲酸主要通过发酵产生，它对几种曲霉菌、蘑菇、某些植物（茄子、金冠苹果、刺果番荔枝、芒果等）和甲壳类动物的PPO活性具有抑制作用，并能有效地抑制色素的形成和氧的吸收，它被认为是过渡金属离子的螯合剂、自由基清除剂，还能将褐变色素化学还原为无色化合物，从而使黑色素变白[67]。托酚酮在结构上类似于邻二酚基质，可作为有效的铜离子螯合剂，在酶促反应中起竞争性抑制剂的作用，在刺果番荔枝[56]、芒果[68]中，0.1 mmol/L酚酮就能使酶完全失活，在金冠苹果[60]中，0.1 mmol/L酚酮也能使酶失去90%活力。还原性谷胱甘肽与半胱氨酸类似，通过将邻醌还原成无色二酚来抑制反应，或者通过与邻醌不可逆地相互作用来防止聚合并形成稳定的无色产物，在蛇果[38]、菠萝蜜[35]中分别以0.15、0.45 mmol/L浓度达到半抑制酶活性效果。

4-己间基苯二酚（4-hexylresorcinol，4-HR）是一种公认安全的间苯二酚衍生物，已成功用于杏[31]、梨[71]、苹果汁[72]褐变的控制。在杏中，与其他10 种抑制剂相比，0.1 mmol/L 4-HR最有效，仅保留了34%的PPO活力[31]。动力学研究表明，4-HR通过不可逆抑制梨褐变[71]，但也有研究表明4-HR抑制PPO活性是由于抑制剂在还原复合物结合位点的竞争性结合[73]，这可能与底物有关。酸化剂，如柠檬酸、苹果酸或磷酸，可通过降低食品中的pH值或螯合铜来抑制PPO活性，但pH值过低产生的味道可能使消费者难以适应。β-CD是一种具有疏水内腔的低聚物，可将酚类物质捕获形成包合物，避免其与PPO直接接触，以控制褐变。Tao Yiming等[35]用β-CD抑制菠萝蜜PPO活性，在β-CD浓度为1 mmol/L时基本无效，在4、10 mmol/L下，PPO活力分别下降16.5%和21.3%，但β-CD与4-HR、抗坏血酸结合具有很好的协同作用[74]。除了专用抑制剂之外，蜂蜜、原花青素、美拉德反应产物、鳕鱼肽、果蔬（洋葱、辣椒、菠萝）提取物等也用于褐变抑制研究，它们主要是通过内在抗氧化物如黄酮、酚类物质等抗氧化性起作用[70,75]。金属盐抑制效果不明显，用于褐变抑制的应用较少。菠萝蜜中添加0.1～1.0 mmol/L的K+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Mn2+，PPO均表现活性增加[35]，Palma-Orozco等[68]用0.1～10 mmol/L的Mg2+、Mn2+、Zn2+处理芒果PPO，PPO活性随浓度升高而增强。这些金属离子可能与底物和/或PPO结合，从而有利于底物与酶的活性位点结合，增强酶催化作用，导致活性增强[68]。相似的激活和微弱的抑制效果在刺果番荔枝[56]、杏[31]、芒果[68]中也有体现。但螯合剂EDTA与金属铜活性位点结合抑制效果显著，得到了广泛应用。

5.2 物理方法

5.2.1 热处理

·差异化原则。品牌定位能与同类服务不同，才拥有自己的特色。虽然图书馆少有同行竞争，但是与阅读推广类似的市场化服务还是存在的，比如“薄荷阅读”的阅读打卡服务是一项有吸引力的阅读推广服务，而图书馆的阅读推广只有具有其它服务不同的特色时才能更好地吸引读者。

热处理是最广泛使用的稳定食品的方法，它同时具有杀灭微生物和灭活酶的能力。漂烫是果蔬加工中最常用的热处理方式。通常，PPO热失活主要受温度和时间的影响，温度70～90 ℃能破坏PPO催化活性，但失活所需时间取决于原料[53,58]。经热动力学研究，PPO的失活主要遵循一级动力学，在海枣[57]、梨[76]、菠萝[77]、沙漠松露[62]等均有体现。高温热烫导致酶变性失活，也会破坏热敏营养物质，不适合应用于软性水果。另外，它会导致维生素、碳水化合物和其他水溶性成分的损失，引起质构、色泽的变化，且会消耗大量水和能源，须处理废物，增大了经济成本。新型的热处理方式如微波、欧姆加热、红外等技术的非液体环境减少了水溶性物质及营养物的流失，正逐渐替代漂烫热技术。经轻度微波处理（90 W、165 s），马梅PPO活性增加，在高功率微波（590～937 W、30 s以上）时能完全失活[78]，板栗仁在微波处理（640 W、60 s）下完全失活[79]，鳄梨在功率密度11 W/g下处理80 s，PPO活性降低了80%[80]。经电子显微镜观察，马梅在微波后经漂烫处理，其细胞结构的破坏更小[78]。Benlloch-Tinoco等[81]模拟猕猴桃PPO失活与微波功率和时间的相关性，发现PPO活性与功率呈正线性和负二阶相关，与时间呈正线性和正二阶相关。欧姆加热通过食品本身的介电性质，在食品物料内部将电能转化为热能，引起食品温度升高，达到直接均匀加热杀菌和灭酶效果，该技术多用于液体食品如甘蔗汁[82]、椰子汁[83]、西瓜汁[84]中，其温度通常控制在70～90 ℃。由于样品中介电离子的运动，欧姆加热可能发生电化学变化，从而引起pH值的浮动[84]。

5.2.2 超高压处理

一般认为压强超过100 MPa为超高压，超高压技术应用于PPO的抑制，主要有高静水压（high hydrostatic pressure，HPP）和动态高压微射流（dynamic highpressure microfluidization，DHPM）。如HPP对PPO的灭活效果不仅与压力、时间等工艺条件有关，还与酶源有关（表8）。Fernandez等[85]利用响应面研究HPP处理对果蔬混合汁的最佳控制效果，在627.5 MPa、20 ℃条件下处理6.4 min，PPO活力降低了10%，抗氧化活性提高了75%，微生物数量减少，颜色得到改善。Liu Wei等研究了DHPM对梨[86]和蘑菇[87]PPO活性的影响，发现对梨和蘑菇进行多次处理后，PPO活性均显著上升，未出现降低，这可能与DHPM技术的短时（低于5 s）和低压（60～200 MPa）处理条件有关[86]。在相同的条件下，不同来源果蔬的抗性不同。经高压（600 MPa）处理5 min后，草莓PPO活力降至原来的63%，而梨和苹果PPO活力则分别升高了26%、94%[88]。相似情况也在荔枝[89]、芒果[90]中有发现。用DHPM技术对富士苹果PPO粗酶液处理，发现压力为34～172 MPa时，PPO活性均下降[91]。相对低的温度（20～34 ℃）和中低等压强（100～400 MPa）条件下，PPO被激活可能的原因是压力改变了酶的二、三级结构，构象改变激活了潜在PPO活性，增加了底物相互作用或蛋白质C端延伸的裂解导致更活跃的活性中心位点的产生[92]。HPP对果蔬中褐变控制作用显著，并能保护活性物质（黄酮类、酚类、抗坏血酸、类胡萝卜素等）免受热处理损害，但不同酶的耐压性不同，有必要严格控制压力、时间、温度等工艺变量，避免PPO的活化。

表 8 高静水压处理对不同来源PPO活性的影响
Table 8 Effect of high hydrostatic pressure processing on PPO activity from different sources

     

来源 压强/MPa 温度/℃ 时间/min 相对酶活力/% 参考文献蘑菇 600 20 1～9 90～96 [93]哈密瓜汁 400 45 10 87.6 [94]荔枝泥 100～600 25 30 52～116 [89]芒果泥 550 59 8～16 28.4～34.0 [90]李子 600 25 1/60 92～95 [95]果蔬混合物 627.5 20 6.4 10 [85]草莓600 34 5～60 19～63[88]梨100～126苹果 90～194草莓 400～600 20 3 70～89 [96]胡萝卜 100～500 20 20 6.9～15.1 [97]菠菜 21.0～31.1

5.2.3 高密度二氧化碳处理

高密度二氧化碳（dense phase carbon dioxide，DPCD）技术又称为超临界CO2（supercritical carbon dioxide，SCCD）和高压联合CO2（high pressure carbon dioxide，HPCD）技术。食品与高于超临界压力（7.38 MPa）和温度（31.1 ℃）的CO2接触，可通过降低细胞pH值、诱导酶构象变化、诱导细胞内碳酸钙和镁的沉淀及破坏细胞等作用使PPO和微生物失活[98]。DPCD处理时典型的CO2压力在4～30 MPa，很少超过50 MPa，温度则在20～50 ℃[99]。表9显示了不同条件下PPO活性的差异。相同温度（35 ℃）下，与压力（30～60 MPa）相比，时间（0～30 min）对草莓汁PPO活性影响更大[98]。在相对较低压力下（18 MPa、45 ℃）测得苹果汁20% PPO残留[99]。此外，在更温和条件下（10 MPa、35 ℃、15 min）还发现PPO活性的增加[100]。Xu Zenghui等[101]在22 MPa、60 ℃下则观察到苹果汁PPO完全失活。在不同温度（35～45 ℃）和压力（10～20 MPa）下对金冠苹果浊汁进行酶失活动力学研究，发现一级动力学模型可较好地描述失活曲线，但Weibull模型拟合效果更好[102]。DPCD与HPP有许多相似性，与HPP处理（400 MPa、25 ℃、10 min）相比，DPCD（30 MPa、65 ℃、15 min）处理的灭酶率更高，分别为12.4%、50.2%[94]。与热处理相比，木瓜汁分别经热（65 ℃）和DPCD（20 MPa、65 ℃）处理20 min，酶活力保留率分别为34.18%、7.40%[103]。DPCD处理后PPO的稳定性较好，草莓汁PPO经处理失去83%的活性后，在6 ℃环境贮藏12 周未出现酶活性上升现象[98]。除了表型分析外，PPO经DPCD处理灭活后，其结构的变化能更深层地解释酶失活的机理。Li Renjie等[100]研究了具有高PPO活性的类甜蛋白（thaumatinlike protein，TLP）在DPCD处理下结构的变化，发现PPO的失活是由TLP的聚集和催化中心的坍塌造成。

Based on Eqs. (1) and (3), the particle sedimentation rate can be expressed as:

表 9 高密度二氧化碳处理对不同来源PPO活性的影响
Table 9 Effect of dense phase carbon dioxide processing on PPO activity from different sources

     

来源 压强/MPa温度/℃ 时间/min相对酶活力/% 参考文献苹果汁 6～18 20～45 30 18～69 [99]苹果汁 10～30 35～55 15 20～165 [100]哈密瓜汁 30 65 15 49.8 [94]草莓汁 30～60 35 30 0 [98]木瓜汁 20 25～65 20 7.40～78.26 [103]西瓜汁 10～30 50 5～60 4.2～45.0 [104]蘑菇 6～18 20～45 15 0～15 [105]

5.2.4 脉冲电场处理

脉冲电场（pulsed electric field，PEF）是一种新兴的非热性食品保鲜技术，在两个电极的腔室中放入液态或半液态的食品，在微秒内施加高强度（15～80 kV/cm2）的高压脉冲，能有效灭活微生物和酶[106]。表10显示了不同PEF处理条件下，果蔬中PPO的活性变化。Salinas-Roca等[107]研究了恒定电场强度（35 kV/cm2）、脉冲频率（200 Hz）、脉冲宽度（4 μs）下，不同时间（50～2 000 μs）对芒果汁微生物和酶活性的影响，不超过1 800 μs处理，PPO活性与初始状态比较不仅无显著下降，还存在活性升高及营养丢失现象，经1 800 μs处理，酶活力最低下降至初始时的70%，霉菌和酵母菌数量显著减少。Zhong Kui等[108]报道了缓冲溶液中PPO的残留活性与电场强度呈良好的正线性关系，回归系数为0.933。在相对低的场强下，PEF对酶的活性影响很小，甚至可能激活潜在酶，也能诱导果蔬应激反应促进次生代谢产物的产生，如类胡萝卜素（南瓜）[109]、花青素（李子）[110]、己醛（番茄）[111]。温度的升高对PEF灭酶有一定的辅助作用，随着脉冲时间的延长，温度升高。在用PEF处理（电场强度3 kV/cm2、脉冲频率200 Hz）蓝莓时，其中心温度随时间的延长逐渐升高，在前2 min PPO活力随温度升高而增强，最高相对酶活力达220%，随后酶活力逐渐下降，在5 min时，中心温度达88 ℃时PPO完全失活[112]。经50 ℃预热，再经PEF处理，苹果汁PPO的相对活力降低至29%，与常规巴氏杀菌（72 ℃、26 s）相比，PEF的灭酶效果好于巴氏杀菌（52%）[113]。不同酶源PPO对PEF处理有不同的抗性，在相同条件下（25 kV/cm2、25～28 ℃、66 μs），树莓PPO的抗性大于蓝莓PPO，树莓、蓝莓PPO相对活力分别为98%和80%[114]。PEF技术应用于PPO的灭活时，高强度瞬时条件破坏酶结构，导致酶失活率高，低强度瞬时条件能更大程度激活酶的活性以及增加次生代谢产物含量，在低强度、长时条件下，灭活酶的效果更倾向于高温效应，适当与中低温技术结合能起到协同灭酶作用。因此，应根据不同果蔬原料以及工艺目标选择适当的技术参数来抑制酶活性。

表 10 脉冲电场处理对不同来源PPO活性的影响
Table 10 Effect of pulsed electric field processing on PPO activity from different sources

     

注：-.文献未报道。下同。

来源 脉冲频率/Hz脉冲宽度/μs 时间/μs 电场强度/（kV/cm2） 温度/℃ 相对酶活力/%参考文献苹果汁 15 - 100 40 50 29 [113]草莓 229 3.23～4.23 2 000 35 ＜40 2.5 [115]苹果汁 721 2.8 169 24.8 53.8 17.7 [116]葡萄汁 630 4 5 000 35 ＜40 0 [117]梨 200 2 1 200 35 40 0.05 [118]李子 0.1 - 4×106 0.4 - 112 [110]蓝莓 200 1 3×108 3 48～88 0～220 [112]芒果汁 200 4 1 800 35 ＜40 70 [107]南瓜 0.1 - 20 2 - ≈100 [109]

5.2.5 超声处理

周转材料租赁主要在于对施工项目的主体结构起到辅助成型的作用，租赁公司的租赁材料主要覆盖了建筑施工项目多次周转的施工材料，包括主体施工中的模板脚手架的各项材料，这类材料在主体施工的过程中存在用量大、损耗大的问题，由于其用量大及损耗大的施工问题，对于承租单位(施工单位)来说工程造价中所占的比例也大，稍微管理不当对于租赁单位及承租单位都会出现不可预估的经济损失。

超声是一种高强度-低频率（10～1 000 W/cm2、20～200 kHz）的非热技术，应用在食品领域能最大限度地减少感官、营养和抗氧化能力的损失。表11总结了超声处理对不同来源PPO影响的部分研究。在一级失活动力学条件下，随着超声强度的增加和处理时间的延长，杨梅汁PPO活性显著降低;在90、181 W/cm2功率密度下超声10 min，PPO活力分别降低了53.23%和12.84%;在271、362 W/cm2处理下，PPO活力仅残留4.22%和0.08%[119]。相似的PPO失活动力学模型在蘑菇、梨、草莓、苹果中[120-121]也有体现。低功率下超声处理能促进酶的激活，菠萝汁经超声150～300 W/cm2处理，酶活性随功率密度的增加而增加，处理时间在4～5 min时表现最大残余活性[122]。虽然高超声功率（968 W/cm2、10 min）降低了PPO活性，提高了酚类物质含量及抗氧化活性，但草莓汁的花青素含量减少了19.91%，桑葚汁中花青素最低损失率也达到5.6%[123-124]。超声处理引起的酶失活可归因于不同的机制，包括超声引起的空化作用导致压力和温度局部增加，以及强剪切应力导致蛋白质的二级和三级结构的改变[125]。温度随着超声频率的增加及处理时间的延长而升高，在超声（24 kHz、460 W/cm2、210 μm）处理15 min条件下，草莓酱的中心温度从20 ℃增至33 ℃，在未经控温的超声处理苹果汁时温度随时间延长呈线性增加，在7 min内温度从7 ℃升高至78 ℃[126-127]。一定程度上，温度的升高对超声灭酶处理有辅助作用，在不控制温度情况下，超声联合热处理与常规巴氏杀菌相比，有更好的杀菌和灭酶效果。然而，有研究者比较了热（65 ℃）、高压（600 MPa、48 ℃）、超声（24 kHz、1.3 W/g、33 ℃）处理对草莓酱灭酶耗能情况，在灭酶效果相近（剩余11%～18%活力）时，所需能量分别为240、291、1 233 kJ/kg，说明在同等效应下超声反应器的设计还需克服耗能高的问题[126]。PPO的抗性不仅受加工条件的影响，还与酶源有关。Sulaiman等[126]研究超声波和热处理对不同果泥酶促褐变的控制效果，结果表明梨PPO的抗性强于苹果和草莓。超声单独应用于抑制酶活性的效果不太显著，因此它主要联合热处理使用，在黄花菜中利用低频（40 kHz）和低密度（低于1 W/cm2）超声结合热（高于60 ℃）作为预处理以使酶活性丧失，可提高颜色质量并减少干燥黄花菜的营养损失[128]。

表 11 超声处理对不同来源PPO活性的影响
Table 11 Effect of ultrasound processing on PPO activity from different sources

     

来源 超声频率/kHz功率密度/（W/cm2）时间/min温度/℃相对酶活力/%参考文献草莓酱 24 460 15 20～33 11.3 [126]草莓汁 20 968 10 25 55.1 [123]桑葚汁 22 — 10 6 55 [124]杨梅汁 20 362 8 — 0.08 [119]菠萝汁 19 376 10 54 80.81 [122]梨24 460 10 32 58 [121]苹果 59 [121]草莓 25 [121]蘑菇 25 — 15 60 1 [120]黄花菜 40 0.4 ＜1 70 15 [128]

5.2.6 紫外辐射处理

（2）改造后阀7不开启而小泵无汽蚀情况，水冷塔液位调节阀保持在50（±3）%开度即可保证水冷塔液位稳定在1300（±100）mm，水冷塔内水气比稳定，氮气与水换热效果更好。

紫外光根据波长可分为UV-A（315～400 nm）、UV-B（280～315 nm）、UV-C（100～280 nm）3 种类型。有研究表明在波长250～280 nm之间紫外线会改变细胞遗传物质，使微生物无法繁殖，因此UV-C辐射常用于食品领域的杀菌处理[129]。近年来，研究发现紫外辐射对酶促褐变也有一定影响，Lante等[130]提出这可能与氨基酸残基（Trp、Tyr、His、Phe、Met、Cys）吸收光而引起的直接光氧化、蛋白质变性和高分子质量聚集体的形成有关。表12总结了部分研究近况。Al-Qurashi等[131]研究了不同功率密度（0.9～4.9 W/m2）对葡萄品质的影响，发现与对照组相比，微生物数量减少，但PPO活性显著增加。另一研究用UV-C对苹果PPO酶液进行处理，经13.8 W/m2辐照33 min后，酶活力下降至原来的10%以下;但将UV-C直接应用于苹果汁时，在更高的辐照强度21.9 W/m2处理100 min下，相对酶活力仍大于20%，且果汁颜色发生明显褐变，这可能与果汁的低UV-C透光率和酚类物质的直接光氧化有关[132]。Sampedro等[133]研究了pH值对蘑菇中PPO活性的影响，发现将低温与紫外联合（60 ℃、58.2 mJ/cm2）处理5 min，任何pH值处理下均能使PPO完全灭活，且在酸性条件下失活更容易。一些研究表明UV-C辐照对食物可能造成不良影响，如颜色变化、抗氧化能力降低、形成潜在致癌物呋喃[134]。因此，一些研究者也探究了其他紫外波长处理对PPO的影响，经UV-A（波长390 nm、辐照强度2.43×10-3 W/m2）处理鲜切苹果60 min后，与对照组相比其色差减少的百分比%RΔE（用于衡量抗褐变的能力）为60%，褐变控制效果显著[134]。不同来源的PPO抗性不同，在相同条件下（（25±1）℃、辐照功率400 W），苹果汁PPO在100 min后完全失活，白葡萄汁PPO在140 min后仍保留20%活力，粉葡萄汁PPO仅失活50%[135]。总体来说，紫外辐射较其他物理灭酶技术效果弱，但联合低温技术能大大提高其效率，此外紫外辐射能同时灭菌与灭酶，未来应该具有较大发展前景。

表 12 紫外辐射处理对不同来源PPO活性的影响
Table 12 Effect of UV radiation on PPO activity from different sources

     

来源 波长/nm 功率/W 辐照强度/（W/m2）光源距离/cm 时间/min 温度/℃ 相对酶活力/%参考文献苹果汁 254～405 0.2～10.0 mW — 1 40 24 56.35～70.43 [136]苹果片 254 15 13.5 — 5 4 100 [132]橙汁 254 — 22 — 1～10 25～65 1～57 [137]桃汁 250～740 460 — 23.9 60 45 0 [138]模拟椰子汁 250～740 400 — 23.4 30 25 2 [139]葡萄 254 16 0.9～4.9 20 1～5 — 190～196 [131]蘑菇 254 — 0.975 7.5 1～5 60 0 [132]

6 结 语

PPO引起的褐变反应对果蔬工业造成了巨大损失，受到广泛关注，研究者从化学、物理、生物角度对其进行了探究，但仍存在很多未解决的问题。

首先，多种现象表明PPO与植物抵御外界胁迫、光合作用、生物合成等相关，但其中关联机制并未解开。另外，PPO基因家族较复杂，物种间编码基因也存在差异。因此，从基因敲除或基因沉默上对PPO进行控制变得困难，研究也较少。目前有学者对马铃薯PPO基因进行反义表达及人工microRNA手段调控[140-141]，可从基因层面调控马铃薯褐变问题，但是对这种马铃薯的等效性评价还有待考证。未来在该领域的研究可能会逐渐从粮食作物（马铃薯）延伸至日常果蔬作物，并且采用基因敲除、基因沉默或基因编辑的手段研究PPO，可厘清PPO基因参与调控褐变和生理功能的关系。

其次，随着蛋白质分离技术不断完善，对PPO的分离纯化研究也越来越多，不同来源的PPO被分离出来，酶学性质也被广泛研究。基于酶学性质，许多控制手段被提出，如酸化剂、螯合剂、竞争性抑制剂、热水漂烫、蒸汽漂烫等。但这些方法的弊端，如营养损失、不安全等问题也显现。新的、更温和的方法逐步发展，如脉冲电场、超声处理、超高压处理、紫外辐射处理等，通常这些非热物理方法同时具有杀菌和灭酶的效果，但不同酶源的抗性不同，物理作用引起酶结构变化还可能引起潜在酶激活，因此非热物理手段常作为一种辅助灭酶技术使用。今后，实现非热物理手段灭酶还需克服酶激活、高成本及高能耗问题。

最后，1998年Klabunde等[3]对儿茶酚氧化酶结构模型及活性中心的提出促进了分子水平上构效关系模型的研究。随后Gerdemann等[18]在前人的研究基础上提出了酶促褐变反应机理，为褐变控制研究明确了方向，可从氧气浓度、酶活性、褐变反应过程、底物4 个方面进行控制。目前广泛研究的主要是对前3 个方面，包括隔氧、控氧、抑制醌的聚合及调节醌的还原、破坏酶适应环境等。实际上，从氧气浓度和褐变反应过程控制褐变具有一定延时性，从酶结构性质方面对控制褐变会更直接有效。但由于PPO分离纯化及结晶难度大，且其在细胞中广泛存在并以不同形式存在等原因，其高级结构至今仍未解开。目前对结构的研究主要从核酸序列、蛋白质序列出发，用软件模拟其空间结构、活性中心、底物结合区等，再根据PPO结构信息，用计算机模拟设计筛选新型抑制剂。但是，这些研究均建立于模拟结构基础上，PPO的真实结构还未被解开。近年，冷冻电子显微镜技术已应用于生物大分子结构解析研究，目前在生物医学方面研究较多，在未来若能成功应用于PPO结构的解析将有助于为褐变控制研究开拓新方向。

参考文献：

[1] KEILIN D, MANN T. Laccase, a blue copper-protein oxidase from the latex of rhus succedanea[J]. Nature, 1939, 143: 23-24.DOI:10.1038/143023b0.

[2] TARANTO F, PASQUALONE A, MANGINI G, et al. Polyphenol oxidases in crops: biochemical, physiological and genetic aspects[J].International Journal of Molecular Sciences, 2017, 18(2): 377.DOI:10.3390/ijms18020377.

[3] KLABUNDE T, EICKEN C, SACCHETTINI J C, et al. Crystal structure of a plant catechol oxidase containing a dicopper center[J].Nature Structural & Molecular Biology, 1998, 5(12): 1084-1090.

[4] 代丽, 宫长荣, 史霖, 等. 植物多酚氧化酶研究综述[J]. 中国农学通报, 2007, 23(6): 312-316.

[5] REN G H, WANG B J, ZHU X D, et al. Cloning, expression, and characterization of miR058 and its target PPO during the development of grapevine berry stone[J]. Gene, 2014, 548(2): 166-173.DOI:10.1016/j.gene.2014.07.021.

[6] IRAWATI A F C, MUTAQIN K H, SUHARTONO M T, et al. The effect of application endophytic fungus Trichoderma spp. and Fusarium spp. to control bacterial wilt in chilli pepper[J]. Walailak Journal of Science and Technology, 2018, 17(2): 6.

[7] THIPYAPONG P, MAHANIL S, BHONWONG A, et al. Increasing resistance of tomato to lepidopteran insects by overexpression of polyphenol oxidase[J]. Acta Horticulturae, 2006, 724: 29-38.DOI:10.17660/ActaHortic.2006.724.2.

[8] AHMADIPOUR S, ARJI I, EBADI A, et al. Physiological and biochemical responses of some olive cultivars (Olea europaea L.) to water stress[J]. Cellular and Molecular Biology, 2018, 64(15): 20-29.DOI:10.14715/cmb/2017.64.15.4.

[9] ADAK N, GUBBUK H, TETIK N. Yield, quality and biochemical properties of various strawberry cultivars under water stress[J].Journal of the Science of Food and Agriculture, 2018, 98(1): 304-311.DOI:10.1002/jsfa.8471.

[10] ORTEGA-GARCÍA F, PERAGÓN J. The response of phenylalanine ammonia-lyase, polyphenol oxidase and phenols to cold stress in the olive tree (Olea europaea L. cv. Picual)[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2009, 89(9): 1565-1573. DOI:10.1002/jsfa.3625.

[11] PANDEY S, FARTYAL D, AGARWAL A, et al. Abiotic stress tolerance in plants: myriad roles of ascorbate peroxidase[J]. Frontiers in Plant Science, 2017, 8: 581. DOI:10.3389/fpls.2017.00581.

[12] 王曼玲, 胡中立, 周明全, 等. 植物多酚氧化酶的研究进展[J]. 植物学通报, 2005, 22(2): 215-222.

[13] BOECKX T, WINTERS A L, WEBB K J, et al. Polyphenol oxidase in leaves: is there any significance to the chloroplastic localization?[J].Journal of Experimental Botany, 2015, 66(12): 3571-3579.DOI:10.1093/jxb/erv141.

[14] NAKAYAMA T, YONEKURA-SAKAKIBARA K, SATO T, et al.Aureusidin synthase: a polyphenol oxidase homolog responsible for flower coloration[J]. Science, 2000, 290: 1163-1166. DOI:10.1126/science.290.5494.1163.

[15] SULLIVAN M L. Beyond brown: polyphenol oxidases as enzymes of plant specialized metabolism[J]. Frontiers in Plant Science, 2015, 5:783. DOI:10.3389/fpls.2014.00783.

[16] ARAJI S, GRAMMER T A, GERTZEN R, et al. Novel roles for the polyphenol oxidase enzyme in secondary metabolism and the regulation of cell death in walnut[J]. Plant Physiology, 2014, 164(3):1191-1203. DOI:10.1104/pp.113.228593.

[17] MAYER A M. Polyphenol oxidases in plants and fungi: going places?a review[J]. Phytochemistry, 2006, 67(21): 2318-2331. DOI:10.1016/j.phytochem.2006.08.006.

[18] GERDEMANN C, EICKEN C, KREBS B. The crystal structure of catechol oxidase: new insight into the function of type-3 copper proteins[J]. Accounts of Chemical Research, 2002, 35(3): 183-191.DOI:10.1021/ar990019a.

[19] SELVARAJAN E, VEENA R, MANOJ KUMAR N. Polyphenol oxidase, beyond enzyme browning[J]. Microbial Bioprospecting for Sustainable Development, 2018, 2018: 203-222. DOI:10.1007/978-981-13-0053-0_10.

[20] NARAI-KANAYAMA A, UEKUSA Y, KIUCHI F, et al. Efficient synthesis of theaflavin 3-gallate by a tyrosinase-catalyzed reaction with (-)-epicatechin and (-)-epigallocatechin gallate in a 1-octanol/buffer biphasic system[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2018, 66(51): 13464-13472. DOI:10.1021/acs.jafc.8b05971.

[21] MAZZAFERA P, ROBINSON S P. Characterization of polyphenol oxidase in coffee[J]. Phytochemistry, 2000, 55(4): 285-296.DOI:10.1016/S0031-9422(00)00332-0.

[22] ALICI E H, ARABACI G. Purification of polyphenol oxidase from borage (Trachystemon orientalis L.) by using three-phase partitioning and investigation of kinetic properties[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2016, 93: 1051-1056. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2016.09.070.

[23] SELLÉS-MARCHART S, CASADO-VELA J, BRU-MARTÍNEZ R.Effect of detergents, trypsin and unsaturated fatty acids on latent loquat fruit polyphenol oxidase: basis for the enzyme’s activity regulation[J].Archives of Biochemistry and Biophysics, 2007, 464(2): 295-305.DOI:10.1016/j.abb.2007.04.023.

[24] PRETZLER M, BIJELIC A, ROMPEL A. Heterologous expression and characterization of functional mushroom tyrosinase (Ab PPO4)[J].Scientific Reports, 2017, 7(1): 1810. DOI:10.1038/s41598-017-01813-1.

[25] LIU Fang, ZHAO Jinhong, WEN Xin, et al. Purification and structural analysis of membrane-bound polyphenol oxidase from Fuji apple[J]. Food Chemistry, 2015, 183: 72-77. DOI:10.1016/j.foodchem.2015.03.027.

[26] YORUK R, MARSHALL M R. Physicochemical properties and function of plant polyphenol oxidase: a review[J]. Journal of Food Biochemistry, 2003, 27(5): 361-422. DOI:10.1111/j.1745-4514.2003.tb00289.x.

[27] ONSA G H, BIN SAARI N, SELAMAT J, et al. Latent polyphenol oxidases from sago log (Metroxylon sagu): partial purification,activation, and some properties[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2000, 48(10): 5041-5045. DOI:10.1021/jf9909454.

[28] MDLULI K M. Partial purification and characterisation of polyphenol oxidase and peroxidase from marula fruit (Sclerocarya birrea subsp.Caffra)[J]. Food Chemistry, 2005, 92(2): 311-323. DOI:10.1016/j.foodchem.2004.07.026.

[29] BATISTA K A, BATISTA G L A, ALVES G L, et al. Extraction, partial purification and characterization of polyphenol oxidase from Solanum lycocarpum fruits[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic,2014, 102: 211-217. DOI:10.1016/j.molcatb.2014.02.017.

[30] NÚÑEZ-DELICADO E, SOJO M M, GARCÍA-CARMONA F, et al.Partial purification of latent persimmon fruit polyphenol oxidase[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51(7): 2058-2063.DOI:10.1021/jf0208583.

[31] DERARDJA A E, PRETZLER M, KAMPATSIKAS I, et al.Purification and characterization of latent polyphenol oxidase from apricot (Prunus armeniaca L.)[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2017, 65(37): 8203-8212. DOI:10.1021/acs.jafc.7b03210.

[32] CHENG S, ZHANG Y F, ZENG Z Q, et al. Screening, separating,and completely recovering polyphenol oxidases and other biochemicals from sweet potato wastewater in starch production[J].Applied Microbiology and Biotechnology, 2015, 99(4): 1745-1753.DOI:10.1007/s00253-014-6034-7.

[33] GONG Zhiqing, LI Dajing, LIU Chunquan, et al. Partial purification and characterization of polyphenol oxidase and peroxidase from chestnut kernel[J]. LWT-Food Science and Technology, 2015, 60(2):1095-1099. DOI:10.1016/j.lwt.2014.10.012.

[34] LIU L, CAO S Q, YANG H, et al. Pectin plays an important role on the kinetics properties of polyphenol oxidase from honeydew peach[J]. Food Chemistry, 2015, 168: 14-20. DOI:10.1016/j.foodchem.2014.07.064.

[35] TAO Yiming, YAO Leyi, QIN Qiuyan, et al. Purification and characterization of polyphenol oxidase from jackfruit (Artocarpus heterophyllus) bulbs[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2013, 61(51): 12662-12669. DOI:10.1021/jf403828e.

[36] LIN H B, NG A W R, WONG C W. Partial purification and characterization of polyphenol oxidase from Chinese parsley(Coriandrum sativum)[J]. Food Science and Biotechnology, 2016,25(S1): 984-996. DOI:10.1007/s10068-016-0103-x.

[37] LIU Nana, LIU Wei, WANG Daijie, et al. Purification and partial characterization of polyphenol oxidase from the flower buds of Lonicera japonica Thunb.[J]. Food Chemistry, 2013, 138(1): 478-483.DOI:10.1016/j.foodchem.2012.10.103.

[38] ZAINI N A M, OSMAN A, HAMID A A, et al. Purification and characterization of membrane-bound polyphenoloxidase (mPPO) from snake fruit [Salacca zalacca (Gaertn.) Voss][J]. Food Chemistry, 2013,136(2): 407-414. DOI:10.1016/j.foodchem.2012.08.034.

[39] BRAVO K E, MUNOZ K, CALDERON J, et al. Development of an extraction method of golden berry (Physalis peruviana L.) polyphenol oxidase and isolation by aqueous two-phase system[J]. Vitae-Revista De La Facultad De Quimica Farmaceutica, 2011, 18(2): 124-185.

[40] ORENES-PIÑERO E, GARCÍA-CARMONA F, SÁNCHEZ-FERRER A. Latent polyphenol oxidase from quince fruit pulp (Cydonia oblonga): purification, activation and some properties[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2006, 86(13): 2172-2178.DOI:10.1002/jsfa.2593.

[41] SOJO M M, NUÑEZ-DELICADO E, GARCÍA-CARMONA F, et al.Partial purification of a banana polyphenol oxidase using Triton X-114 and PEG 8000 for removal of polyphenols[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1998, 46(12): 4924-4930. DOI:10.1021/jf980473d.

[42] ANDREWS B A, ASENJO J A. Theoretical and experimental evaluation of hydrophobicity of proteins to predict their partitioning behavior in aqueous two phase systems: a review[J]. Separation Science and Technology, 2010, 45(15): 2165-2170. DOI:10.1080/0149 6395.2010.507436.

[43] BABU B R, RASTOGI N K, RAGHAVARAO K S M S. Liquidliquid extraction of bromelain and polyphenol oxidase using aqueous two-phase system[J]. Chemical Engineering and Processing: Process Intensification, 2008, 47(1): 83-89. DOI:10.1016/j.cep.2007.08.006.

[44] VAIDYA B K, SUTHAR H K, KASTURE S, et al. Purification of potato polyphenol oxidase (PPO) by partitioning in aqueous two-phase system[J]. Biochemical Engineering Journal, 2006, 28(2): 161-166.DOI:10.1016/j.bej.2005.10.006.

[45] NIPHADKAR S S, VETAL M D, RATHOD V K. Purification and characterization of polyphenol oxidase from waste potato peel by aqueous two-phase extraction[J]. Preparative Biochemistry and Biotechnology, 2015, 45(7): 632-649. DOI:10.1080/10826068.2014.940970.

[46] BRAVO K, OSORIO E. Characterization of polyphenol oxidase from cape gooseberry (Physalis peruviana L.) fruit[J]. Food Chemistry,2016, 197: 185-190. DOI:10.1016/j.foodchem.2015.10.126.

[47] RAGHAVARAO K, RANGANATHAN T V, SRINIVAS N D, et al.Aqueous two phase extraction-an environmentally benign technique[J].Clean Technologies and Environmental Policy, 2003, 5(2): 136-141.DOI:10.1007/s10098-003-0193-z.

[48] CHAZARRA S, CABANES J, ESCRIBANO J, et al. Partial purification and characterization of latent polyphenol oxidase in iceberg lettuce (Lactuca sativa L.)[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1996, 44: 984-988. DOI:10.1021/jf9501352.

[49] NADAR S S, PAWAR R G, RATHOD V K. Recent advances in enzyme extraction strategies: a comprehensive review[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2017, 101: 931-957.DOI:10.1016/j.ijbiomac.2017.03.055.

[50] 谭显东, 常志东, 梁向峰, 等. 液-液-液三相萃取研究进展及其在生化分离中的应用[J]. 化工进展, 2003, 22(3): 244-249. DOI:10.16085/j.issn.1000-6613.2003.03.007.

[51] VETAL M D, RATHOD V K. Three phase partitioning a novel technique for purification of peroxidase from orange peels (Citrus sinenses)[J]. Food and Bioproducts Processing, 2015, 94: 284-289.DOI:10.1016/j.fbp.2014.03.007.

[52] NIPHADKAR S S, RATHOD V K. Ultrasound-assisted three-phase partitioning of polyphenol oxidase from potato peel[J]. Biotechnology Progress, 2015, 31(5): 1340-1347. DOI:10.1002/btpr.2139.

[53] PANADARE D C, RATHOD V K. Extraction of peroxidase from bitter gourd (Momordica charantia) by three phase partitioning with dimethyl carbonate (DMC) as organic phase[J]. Process Biochemistry,2017, 61: 195-201. DOI:10.1016/j.procbio.2017.06.028.

[54] CHAIWUT P, PINTATHONG P, RAWDKUEN S. Extraction and three-phase partitioning behavior of proteases from papaya peels[J].Process Biochemistry, 2010, 45(7): 1172-1175. DOI:10.1016/j.procbio.2010.03.019.

[55] ÖZER B, AKARDERE E, ÇELEM E B, et al. Three-phase partitioning as a rapid and efficient method for purification of invertase from tomato[J]. Biochemical Engineering Journal, 2010, 50(3): 110-115.DOI:10.1016/j.bej.2010.04.002.

[56] PALMA-OROZCO G, MARRUFO-HERNÁNDEZ N A, TOBÍAS I, et al.Purification and biochemical characterization of polyphenol oxidase from soursop (Annona muricata L.) and its inactivation by microwave and ultrasound treatments[J]. Journal of Food Biochemistry, 2019,43(3): e12770. DOI:10.1111/jfbc.12770.

[57] BENACEUR F, GOUZI H, MEDDAH B, et al. Purification and characterization of catechol oxidase from Tadela (Phoenix dactylifera L.) date fruit[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2019, 125: 1248-1256. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2018.09.101.

[58] MISHRA B B, GAUTAM S, SHARMA A. Purification and characterisation of polyphenol oxidase (PPO) from eggplant(Solanum melongena)[J]. Food Chemistry, 2012, 134(4): 1855-1861.DOI:10.1016/j.foodchem.2012.03.098.

[59] VISHWASRAO C, ANANTHANARAYAN L. Partial purification and characterization of the quality deteriorating enzymes from Indian pink guava (Psidium guajava L.), var. Lalit[J]. Journal of Food Science and Technology, 2018, 55(8): 3281-3291. DOI:10.1007/s13197-018-3263-2.

[60] MARRUFO-HERNÁNDEZ N A, PALMA-OROZCO G, BELTRÁN H I, et al. Purification, partial biochemical characterization and inactivation of polyphenol oxidase from Mexican Golden Delicious apple (Malus domestica)[J]. Journal of Food Biochemistry, 2017,41(3): e12356. DOI:10.1111/jfbc.12356.

[61] CHEEMA S, SOMMERHALTER M. Characterization of polyphenol oxidase activity in Ataulfo mango[J]. Food Chemistry, 2015, 171: 382-387. DOI:10.1016/j.foodchem.2014.09.011.

[62] GOUZI H, DEPAGNE C, BENMANSOUR A, et al. First extraction of polyphenol oxidase from edible desert truffle (Terfezia leonis Tul.)and its thermal behavior[J]. European Food Research and Technology,2013, 237(5): 721-729. DOI:10.1007/S00217-013-2040-8.

[63] KIM J Y, SEO Y S, KIM J E, et al. Two polyphenol oxidases are differentially expressed during vegetative and reproductive development and in response to wounding in the Fuji apple[J]. Plant Science, 2001,161(6): 1145-1152. DOI:10.1016/S0168-9452(01)00522-2.

[64] NOKTHAI P, LEE V S, SHANK L. Molecular modeling of peroxidase and polyphenol oxidase: substrate specificity and active site comparison[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2010,11(9): 3266-3276. DOI:10.3390/ijms11093266.

[65] 彭益强, 邓峰, 刘宇, 等. 富士苹果中多酚氧化酶活性的中心必需基团与抑制动力学[J]. 华侨大学学报(自然科学版), 2012, 33(1): 51-54.

[66] 齐晓娟. 基于多酚氧化酶靶酶结构的新型抑制剂先导化合物的合理设计与筛选[D]. 武汉: 华中农业大学, 2016: 42-50.

[67] QUEIROZ C, MENDES LOPES M L, FIALHO E, et al.Polyphenol oxidase: characteristics and mechanisms of browning control[J]. Food Reviews International, 2008, 24(4): 361-375.DOI:10.1080/87559120802089332.

[68] PALMA-OROZCO G, MARRUFO-HERNÁNDEZ N A, SAMPEDRO J G, et al. Purification and partial biochemical characterization of polyphenol oxidase from mango (Mangifera indica cv. Manila)[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014, 62(40): 9832-9840.DOI:10.1021/jf5029784.

[69] ZHOU X R, XIAO Y J, MENG X L, et al. Full inhibition of Whangkeumbae pear polyphenol oxidase enzymatic browning reaction by l-cysteine[J]. Food Chemistry, 2018, 266: 1-8. DOI:10.1016/j.foodchem.2018.05.086.

[70] LIM W Y, WONG C W. Inhibitory effect of chemical and natural anti-browning agents on polyphenol oxidase from ginger (Zingiber officinale Roscoe)[J]. Journal of Food Science and Technology, 2018,55(8): 3001-3007. DOI:10.1007/s13197-018-3218-7.

[71] ARIAS E, ORIA R, LÓPEZ-BUESA P. Spectroscopic and kinetic studies of pear polyphenoloxidase inactivation by 4-hexylresorcinol[J].Journal of Food Biochemistry, 2011, 35(6): 1710-1714. DOI:10.1111/j.1745-4514.2010.00509.x.

[72] DE LA ROSA L A, ALVAREZ-PARRILLA E, MOYERSMONTOYA E, et al. Mechanism for the inhibition of apple juice enzymatic browning by Palo Fierro (desert ironweed) honey extract and other natural compounds[J]. LWT-Food Science and Technology,2011, 44(1): 269-276. DOI:10.1016/j.lwt.2010.05.030.

[73] GUERRERO-BELTRÁN J A, SWANSON B G, BARBOSACÁNOVAS G V. Inhibition of polyphenoloxidase in mango puree with 4-hexylresorcinol, cysteine and ascorbic acid[J]. LWT-Food Science and Technology, 2005, 38(6): 625-630. DOI:10.1016/j.lwt.2004.08.002.

[74] ALVAREZ-PARRILLA E, DE LA ROSA L A, RODRIGO-GARCIA J,et al. Dual effect of β-cyclodextrin (β-CD) on the inhibition of apple polyphenol oxidase by 4-hexylresorcinol (HR) and methyl jasmonate(MJ)[J]. Food Chemistry, 2007, 101(4): 1346-1356. DOI:10.1016/j.foodchem.2006.03.040.

[75] LIU X, LU Y Z, YANG Q, et al. Cod peptides inhibit browning in fresh-cut potato slices: a potential anti-browning agent of random peptides for regulating food properties[J]. Postharvest Biology and Technology, 2018, 146: 36-42. DOI:10.1016/j.postharvbio.2018.08.001.

[76] ZHOU L, LIU W, STOCKMANN R, et al. Effect of citric acid and high pressure thermal processing on enzyme activity and related quality attributes of pear puree[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2018, 45: 196-207. DOI:10.1016/j.ifset.2017.10.012.

[77] DHAKAL S, BALASUBRAMANIAM V M, AYVAZ H, et al. Kinetic modeling of ascorbic acid degradation of pineapple juice subjected to combined pressure-thermal treatment[J]. Journal of Food Engineering,2018, 224: 62-70. DOI:10.1016/j.jfoodeng.2017.12.016.

[78] PALMA-OROZCO G, SAMPEDRO J G, ORTIZ-MORENO A, et al.In situ inactivation of polyphenol oxidase in mamey fruit (Pouteria sapota) by microwave treatment[J]. Journal of Food Science, 2012,77(4): 359-365. DOI:10.1111/j.1750-3841.2012.02632.x.

[79] WANG C N, YI X X, QI J H, et al. Study on destroying enzyme in chestnuts (Castanea Mollissima Blume) by microwave heating[J].Advanced Materials Research, 2014, 852: 262-265. DOI:10.4028/www.scientific.net/AMR.852.262.

[80] ZHOU L Y, TEY C Y, BINGOL G, et al. Effect of microwave treatment on enzyme inactivation and quality change of defatted avocado puree during storage[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2016, 37: 61-67. DOI:10.1016/j.ifset.2016.08.002.

[81] BENLLOCH-TINOCO M, IGUAL M, RODRIGO D, et al.Comparison of microwaves and conventional thermal treatment on enzymes activity and antioxidant capacity of kiwifruit puree[J].Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2013, 19: 166-172. DOI:10.1016/j.ifset.2013.05.007.

[82] SAXENA J, AHMAD MAKROO H, SRIVASTAVA B. Effect of ohmic heating on polyphenol oxidase (PPO) inactivation and color change in sugarcane juice[J]. Journal of Food Process Engineering,2017, 40(3): e12485. DOI:10.1111/jfpe.12485.

[83] DELFIYA D S A, THANGAVEL K. Effect of ohmic heating on polyphenol oxidase activity, electrical and physicochemical properties of fresh tender coconut water[J]. International Journal of Food Engineering, 2016, 12(7): 691-700. DOI:10.1515/ijfe-2015-0329.

[84] MAKROO H A, SAXENA J, RASTOGI N K, et al. Ohmic heating assisted polyphenol oxidase inactivation of watermelon juice: effects of the treatment on pH, lycopene, total phenolic content, and color of the juice[J]. Journal of Food Processing and Preservation, 2017, 41(6):e13271. DOI:10.1111/jfpp.13271.

[85] FERNANDEZ M V, DENOYA G I, AGÜERO M V, et al. Optimization of high pressure processing parameters to preserve quality attributes of a mixed fruit and vegetable smoothie[J]. Innovative Food Science& Emerging Technologies, 2018, 47: 170-179. DOI:10.1016/j.ifset.2018.02.011.

[86] LIU Wei, LIU Jianhua, XIE Mingyong, et al. Characterization and high-pressure microfluidization-induced activation of polyphenoloxidase from Chinese pear (Pyrus pyrifolia Nakai)[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(12): 5376-5380.DOI:10.1021/jf9006642.

[87] LIU Wei, LIU Jianhua, LIU Chengmei, et al. Activation and conformational changes of mushroom polyphenoloxidase by high pressure microfluidization treatment[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2009, 10(2): 142-147. DOI:10.1016/j.ifset.2008.11.009.

[88] SULAIMAN A, SOO M J, YOON M M L, et al. Modeling the polyphenoloxidase inactivation kinetics in pear, apple and strawberry purees after high pressure processing[J]. Journal of Food Engineering,2015, 147: 89-94. DOI:10.1016/j.jfoodeng.2014.09.030.

[89] CHAIKHAM P, RATTANASENA P, PHUNCHAISRI C, et al. Quality changes of litchi (Litchi chinensis Sonn.) in syrup due to thermal and high pressure processes[J]. LWT-Food Science and Technology, 2017,75: 751-760. DOI:10.1016/j.lwt.2016.10.037.

[90] MORALES-DE LA PEÑA M, SALINAS-ROCA B, ESCOBEDOAVELLANEDA Z, et al. Effect of high hydrostatic pressure and temperature on enzymatic activity and quality attributes in mango puree varieties (cv. Tommy Atkins and Manila)[J]. Food and Bioprocess Technology, 2018, 11(6): 1211-1221. DOI:10.1007/s11947-018-2090-9.

[91] 王倩. 动态高压微射流技术对富士苹果褐变酶和辣根过氧化物酶的影响[D]. 南昌: 南昌大学, 2011: 22-24.

[92] TEREFE N S, BUCKOW R, VERSTEEG C. Quality-related enzymes in fruit and vegetable products: effects of novel food processing technologies, part 1: high-pressure processing[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2014, 54(1): 24-63. DOI:10.1080/10408398.2011.566946.

[93] YI J J, YI J Y, DONG P, et al. Effect of high-hydrostatic-pressure on molecular microstructure of mushroom (Agaricusbisporus)polyphenoloxidase[J]. LWT-Food Science and Technology, 2015,60(2): 890-898. DOI:10.1016/j.lwt.2014.10.027.

[94] PEI L Y, HOU S H, WANG L L, et al. Effects of high hydrostatic pressure, dense phase carbon dioxide, and thermal processing on the quality of Hami melon juice[J]. Journal of Food Process Engineering,2018, 41(6): e12828. DOI:10.1111/jfpe.12828.

[95] GARCÍA-PARRA J, GONZÁLEZ-CEBRINO F, DELGADOADÁMEZ J, et al. Effect of high-hydrostatic pressure and moderateintensity pulsed electric field on plum[J]. Food Science and Technology International, 2018, 24(2): 145-160. DOI:10.1177/1082013217735965.

[96] AABY K, GRIMSBO I H, HOVDA M B, et al. Effect of high pressure and thermal processing on shelf life and quality of strawberry purée and juice[J]. Food Chemistry, 2018, 260: 115-123. DOI:10.1016/j.foodchem.2018.03.100.

[97] JUNG L S, LEE S H, KIM S, et al. Effect of high hydrostatic pressure on the quality-related properties of carrot and spinach[J]. Food Science and Biotechnology, 2013, 22(1): 189-195. DOI:10.1007/s10068-013-0066-0.

[98] MARSZAŁEK K, SKĄPSKA S, WOŹNIAK Ł, et al. Application of supercritical carbon dioxide for the preservation of strawberry juice:microbial and physicochemical quality, enzymatic activity and the degradation kinetics of anthocyanins during storage[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2015, 32: 101-109.DOI:10.1016/j.ifset.2015.10.005.

[99] MANZOCCO L, PLAZZOTTA S, SPILIMBERGO S, et al. Impact of high-pressure carbon dioxide on polyphenoloxidase activity and stability of fresh apple juice[J]. LWT-Food Science and Technology,2017, 85: 363-371. DOI:10.1016/j.lwt.2016.11.052.

[100] LI Renjie, WANG Yongtao, HU Wanfeng, et al. Changes in the activity,dissociation, aggregation, and the secondary and tertiary structures of a thaumatin-like protein with a high polyphenol oxidase activity induced by high pressure CO2[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2014, 23: 68-78. DOI:10.1016/j.ifset.2014.02.013.

[101] XU Zenghui, ZHANG Liyun, WANG Yongtao, et al. Effects of high pressure CO2 treatments on microflora, enzymes and some quality attributes of apple juice[J]. Journal of Food Engineering, 2011, 104(4):577-584. DOI:10.1016/j.jfoodeng.2011.01.020.

[102] ILLERA A E, SANZ M T, BELTRÁN S, et al. Evaluation of HPCD batch treatments on enzyme inactivation kinetics and selected quality characteristics of cloudy juice from Golden delicious apples[J].Journal of Food Engineering, 2018, 221: 141-150. DOI:10.1016/j.jfoodeng.2017.10.017.

[103] IQBAL A, MURTAZA A, MUHAMMAD Z, et al. Inactivation,aggregation and conformational changes of polyphenol oxidase from quince (Cydonia oblonga Miller) juice subjected to thermal and highpressure carbon dioxide treatment[J]. Molecules, 2018, 23(7): 1743.DOI:10.3390/molecules23071743.

[104] LIU Y, HU X S, ZHAO X Y, et al. Combined effect of high pressure carbon dioxide and mild heat treatment on overall quality parameters of watermelon juice[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2012, 13: 112-119. DOI:10.1016/j.ifset.2011.11.001.

[105] MANZOCCO L, IGNAT A, VALOPPI F, et al. Inactivation of mushroom polyphenoloxidase in model systems exposed to highpressure carbon dioxide[J]. The Journal of Supercritical Fluids, 2016,107: 669-675. DOI:10.1016/j.supflu.2015.07.029.

[106] WANG Q J, LI Y F, SUN D W, et al. Enhancing food processing by pulsed and high voltage electric fields: principles and applications[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2018, 58(13): 2285-2298. DOI:10.1080/10408398.2018.1434609.

[107] SALINAS-ROCA B, ELEZ-MARTÍNEZ P, WELTI-CHANES J,et al. Quality changes in mango juice treated by high-intensity pulsed electric fields throughout the storage[J]. Food and Bioprocess Technology, 2017, 10(11): 1970-1983. DOI:10.1007/s11947-017-1969-1.

[108] ZHONG Kui, WU Jihong, WANG Zhengfu, et al. Inactivation kinetics and secondary structural change of PEF-treated POD and PPO[J]. Food Chemistry, 2007, 100(1): 115-123. DOI:10.1016/j.foodchem.2005.09.035.

[109] GARCÍA-PARRA J, GONZÁLEZ-CEBRINO F, DELGADOADÁMEZ J, et al. Application of innovative technologies, moderateintensity pulsed electric fields and high-pressure thermal treatment,to preserve and/or improve the bioactive compounds content of pumpkin[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies,2018, 45: 53-61. DOI:10.1016/j.ifset.2017.09.022.

[110] GARCÍA-PARRA J, GONZÁLEZ-CEBRINO F, DELGADOADÁMEZ J, et al. Effect of high-hydrostatic pressure and moderateintensity pulsed electric field on plum[J]. Food Science and Technology International, 2018, 24(2): 145-160. DOI:10.1177/1082013217735965.

[111] VALLVERDU-QUERALT A, BENDINI A, BARBIERI S, et al.Volatile profile and sensory evaluation of tomato juices treated with pulsed electric fields[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2013, 61(8): 1977-1984. DOI:10.1021/jf3051126.

[112] YU Y S, JIN T Z, FAN X T, et al. Biochemical degradation and physical migration of polyphenolic compounds in osmotic dehydrated blueberries with pulsed electric field and thermal pretreatments[J].Food Chemistry, 2018, 239: 1219-1225. DOI:10.1016/j.foodchem.2017.07.071.

[113] RIENER J, NOCI F, CRONIN D A, et al. Combined effect of temperature and pulsed electric fields on apple juice peroxidase and polyphenoloxidase inactivation[J]. Food Chemistry, 2008, 109(2): 402-407. DOI:10.1016/j.foodchem.2007.12.059.

[114] MEDINA-MEZA I G, BOIOLI P, BARBOSA-CÁNOVAS G V.Assessment of the effects of ultrasonics and pulsed electric fields on nutritional and rheological properties of raspberry and blueberry purees[J]. Food and Bioprocess Technology, 2016, 9(3): 520-531.DOI:10.1007/s11947-015-1642-5.

[115] AGUILÓ-AGUAYO I, SOLIVA-FORTUNY R, MARTÍN-BELLOSO O.High-intensity pulsed electric fields processing parameters affecting polyphenoloxidase activity of strawberry juice[J]. Journal of Food Science, 2010, 75(7): 641-646. DOI:10.1111/j.1750-3841.2010.01735.x.

[116] SULAIMAN A, FARID M, SILVA F V M. Quality stability and sensory attributes of apple juice processed by thermosonication, pulsed electric field and thermal processing[J]. Food Science and Technology International, 2017, 23(3): 265-276. DOI:10.1177/1082013216685484.

[117] MARSELLÉS-FONTANET Á R, MARTÍN-BELLOSO O.Optimization and validation of PEF processing conditions to inactivate oxidative enzymes of grape juice[J]. Journal of Food Engineering,2007, 83(3): 452-462. DOI:10.1016/j.jfoodeng.2007.04.001.

[118] ZHAO W, YANG R J, HUA X, et al. Inactivation of polyphenoloxidase of pear by pulsed electric fields[J]. International Journal of Food Engineering, 2010, 6(3): 4. DOI:10.2202/1556-3758.1853.

[119] CAO X M, CAI C F, WANG Y L, et al. The inactivation kinetics of polyphenol oxidase and peroxidase in bayberry juice during thermal and ultrasound treatments[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2018, 45: 169-178. DOI:10.1016/j.ifset.2017.09.018.

[120] CHENG X F, ZHANG M, ADHIKARI B. The inactivation kinetics of polyphenol oxidase in mushroom (Agaricus bisporus) during thermal and thermosonic treatments[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2013,20(2): 674-679. DOI:10.1016/j.ultsonch.2012.09.012.

[121] SULAIMAN A, SOO M J, FARID M, et al. Thermosonication for polyphenoloxidase inactivation in fruits: modeling the ultrasound and thermal kinetics in pear, apple and strawberry purees at different temperatures[J]. Journal of Food Engineering, 2015, 165: 133-140.DOI:10.1016/j.jfoodeng.2015.06.020.

[122] COSTA M G M, FONTELES T V, DE JESUS A L T, et al. Highintensity ultrasound processing of pineapple juice[J]. Food and Bioprocess Technology, 2013, 6(4): 997-1006. DOI:10.1007/s11947-011-0746-9.

[123] CHEN L Y, BI X F, CAO X M, et al. Effects of high-power ultrasound on microflora, enzymes and some quality attributes of a strawberry drink[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2018, 98(14):5378-5385. DOI:10.1002/jsfa.9079.

[124] ENGMANN F N, MA Y K, TCHABO W, et al. Ultrasonication treatment effect on anthocyanins, color, microorganisms and enzyme inactivation of mulberry (Moraceae nigra) juice[J]. Journal of Food Processing and Preservation, 2015, 39(6): 854-862. DOI:10.1111/jfpp.12296.

[125] TEREFE N S, BUCKOW R, VERSTEEG C. Quality-related enzymes in plant-based products: effects of novel food-processing technologies part 3: ultrasonic processing[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2015, 55(2): 147-158. DOI:10.1080/10408398.2011.586134.

[126] SULAIMAN A, FARID M, SILVA F V M. Strawberry puree processed by thermal, high pressure, or power ultrasound: process energy requirements and quality modeling during storage[J]. Food Science and Technology International, 2017, 23(4): 293-309.DOI:10.1177/1082013216685485.

[127] BOT F, CALLIGARIS S, CORTELLA G, et al. Study on high pressure homogenization and high power ultrasound effectiveness in inhibiting polyphenoloxidase activity in apple juice[J]. Journal of Food Engineering, 2018, 221: 70-76. DOI:10.1016/j.jfoodeng.2017.10.009.

[128] ZHANG Z Y, NIU L Y, LI D J, et al. Low intensity ultrasound as a pretreatment to drying of daylilies: impact on enzyme inactivation,color changes and nutrition quality parameters[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2017, 36: 50-58. DOI:10.1016/j.ultsonch.2016.11.007.

[129] RIGANAKOS K A, KARABAGIAS I K, GERTZOU I, et al.Comparison of UV-C and thermal treatments for the preservation of carrot juice[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies,2017, 42: 165-172. DOI:10.1016/j.ifset.2017.06.015.

[130] LANTE A, TINELLO F, LOMOLINO G. Effect of UV light on microbial proteases: from enzyme inactivation to antioxidant mitigation[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies,2013, 17: 130-134. DOI:10.1016/j.ifset.2012.11.002.

[131] AL-QURASHI A D, AWAD M A. Quality, antioxidant capacity,antioxidant compounds and enzyme activities of ‘El-Bayadi’ table grapes as affected by postharvest UV-C radiation[J]. Philippine Agricultural Scientist, 2016, 99(1): 34-41.

[132] MANZOCCO L, QUARTA B, DRI A. Polyphenoloxidase inactivation by light exposure in model systems and apple derivatives[J].Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2009, 10(4): 506-511. DOI:10.1016/j.ifset.2009.02.004.

[133] SAMPEDRO F, PHILLIPS J, FAN X. Use of response surface methodology to study the combined effects of UV-C and thermal processing on vegetable oxidative enzymes[J]. LWT-Food Science and Technology, 2014, 55(1): 189-196. DOI:10.1016/j.lwt.2013.07.010.

[134] LANTE A, TINELLO F, NICOLETTO M. UV-A light treatment for controlling enzymatic browning of fresh-cut fruits[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2016, 34: 141-147. DOI:10.1016/j.ifset.2015.12.029.

[135] FALGUERA V, GARVÍN A, GARZA S, et al. Effect of UV-Vis photochemical processing on pear juices from six different varieties[J].Food and Bioprocess Technology, 2014, 7(1): 84-92. DOI:10.1007/s11947-013-1069-9.

[136] AKGÜN M P, ÜNLÜTÜRK S. Effects of ultraviolet light emitting diodes (LEDs) on microbial and enzyme inactivation of apple juice[J].International Journal of Food Microbiology, 2017, 260: 65-74.DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2017.08.007.

[137] SAMPEDRO F, FAN X T. Inactivation kinetics and photoreactivation of vegetable oxidative enzymes after combined UV-C and thermal processing[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies,2014, 23: 107-113. DOI:10.1016/j.ifset.2014.02.007.

[138] AGUILAR K, GARVÍN A, IBARZ A. Effect of UV-Vis processing on enzymatic activity and the physicochemical properties of peach juices from different varieties[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2018, 48: 83-89. DOI:10.1016/j.ifset.2018.05.00.

[139] DONSINGHA S, ASSATARAKUL K. Kinetics model of microbial degradation by UV radiation and shelf life of coconut water[J]. Food Control, 2018, 92: 162-168. DOI:10.1016/j.foodcont.2018.04.030.

[140] BACHEM C W B, SPECKMANN G J, VAN DER LINDE P C G,et al. Antisense expression of polyphenol oxidase genes inhibits enzymatic browning in potato tubers[J]. Biotechnology, 1994, 12(11):1101-1105.

[141] CHI M, BHAGWAT B, LANE W D, et al. Reduced polyphenol oxidase gene expression and enzymatic browning in potato (Solanum tuberosum L.) with artificial microRNAs[J]. BMC Plant Biology,2014, 14(1): 62. DOI:10.1186/1471-2229-14-62.

Recent Progress toward Understanding the Physiological Function, Purification, and Enzymatic Browning Control of Plant Polyphenol Oxidases

WANG Xinyu1,2, YANG Lüzhu1,2, WANG Ting3, WANG Rongrong4, LIU Jie1,2, SHAN Yang1,2, ZHANG Qun1,2, DING Shenghua1,2,*
(1. Longping Branch, Graduate School of Hunan University, Changsha 410125, China;2. Hunan Provincial Key Laboratory for Fruits and Vegetables Storage Processing and Quality Safety, Agricultural Product Processing Institute, Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410125, China;3. Turpan Technology Extention Center of Forestry and Fruit Industry, Turpan 838000, China;4. College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

Abstract: Polyphenol oxidases (PPOs) are a group of metalloenzymes containing copper plastid that can catalyze the oxidation of polyphenols, which widely exist in plants, animals, and microorganisms. On the one hand, they play an important role in the physiological functions of plants; on the other hand, they also cause a decline in fruit and vegetable quality, thereby resulting in a large number of economic losses. In this paper, the physiological function, extraction and purification, and enzymatic properties of PPOs, as well as the different methods for inhibiting PPO acticity for enzymatic browning control are summarized, which will provide a references for basic research and application of PPO.

Keywords: polyphenol oxidases; physiological function; purification; enzymatic browning control

DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190411-145

中图分类号：TS255.1

文献标志码：A

文章编号：1002-6630（2020）09-0222-16

引文格式：

王馨雨, 杨绿竹, 王婷, 等. 植物多酚氧化酶的生理功能、分离纯化及酶促褐变控制的研究进展[J]. 食品科学, 2020,41(9): 222-237. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190411-145. http://www.spkx.net.cn

WANG Xinyu, YANG Lüzhu, WANG Ting, et al. Recent progress toward understanding the physiological function,purification, and enzymatic browning control of plant polyphenol oxidases[J]. Food Science, 2020, 41(9): 222-237. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190411-145. http://www.spkx.net.cn

收稿日期：2019-04-11

基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（31501543）;湖南省自然科学基金项目（2016JJ6077）;

湖南省农业科技创新项目（2019JG01）;湖南省长沙市杰出创新青年培养计划项目（KQ1905025）

第一作者简介：王馨雨（1996—）（ORCID: 0000-0003-1109-0382），女，硕士研究生，研究方向为果蔬加工及贮藏。E-mail: wxy25994@163.com

*通信作者简介：丁胜华（1985—）（ORCID: 0000-0003-2383-0843），男，副研究员，博士，研究方向为果蔬加工及贮藏。E-mail: shhding@hotmail.com