黑麦多酚提取物对猪肉丸冷藏期间氧化稳定性和品质的影响

奥鹏网院作业

黑麦多酚提取物对猪肉丸冷藏期间氧化稳定性和品质的影响
郝教敏1，杨文平2，靳明凯1，赵芳芳1，王 凯1，杨珍平3,*，高志强3
（1.山西农业大学食品科学与工程学院，山西 太谷 030801;2.华北理工大学生命科学学院，河北 唐山 063000;3.山西农业大学农学院，山西 太谷 030801）
摘要：为研究黑麦多酚提取物（rye polyphenol extract，RPE）对猪肉丸冷藏过程中脂肪和蛋白质氧化的抑制作用以及猪肉丸品质的影响。以混合0.04%、0.08%、0.12%（以猪肉质量计，下同）RPE的猪肉为原料制成肉丸，冰箱（4 ℃）冷藏12 d，以不添加抗氧化剂的产品作对照。结果表明：添加RPE的猪肉丸具有较高的抗氧化能力;添加RPE（0.08%和0.12%）可显著降低硫代巴比妥酸反应产物值（P＜0.05），蛋白质氧化被明显抑制，表现为羰基含量显著降低和巯基含量显著提高（P＜0.05）。与对照组相比，添加0.12% RPE显著提高了猪肉丸的L*值和a*值，并明显改善咀嚼性和回复性，提高肉丸在冷藏后期的感官品质。0.12% RPE与0.02%二丁基羟基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）对抑制猪肉丸的脂质和蛋白质氧化和对猪肉丸品质的影响无显著差异。结论：RPE作为一种天然抗氧化剂，具有良好的抗氧化性能和替代合成抗氧化剂（0.02% BHT）的潜力，可在改善或不降低品质的前提下延长产品的货架期，在生产功能改良的健康肉制品方面具有很大的应用潜力。
关键词：黑麦多酚提取物;抗氧化能力;健康肉制品
食品质量与安全是目前人们普遍关注的问题。肉制品中脂肪和蛋白质易发生氧化，严重降低了产品的品质和营养价值，通常表现为使产品变色、风味恶化、营养物质破坏和可能形成有毒化合物[1-2]。因此，为控制氧化损害，在肉制品加工中，合成抗氧化剂如丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）、没食子酸丙酯等被广泛使用[3-4]。但是长期使用合成抗氧化剂对人体有较大潜在的毒副作用，因此，天然抗氧化剂的开发应用已成研究热点。天然抗氧化剂主要为多酚类化合物，广泛存在于天然植物中，如常见的茶多酚、迷迭香提取物和一些水果多酚[4-8]。其酚羟基中的邻位酚羟基极易被氧化，且对活性氧等自由基有较强的捕捉能力，所以具有较强的抗氧化性，其替代合成抗氧化剂是必然的趋势[3-8]。
黑麦不但营养价值很高，而且富含膳食纤维、多酚类化合物和β-葡聚糖等活性物质[9-10]。目前已有不少关于黑麦中多酚类活性物质的报道，但主要集中于多酚的提取及其体外抗氧化性能的评估，将黑麦多酚与肉制品联系起来的研究鲜见报道。研究表明，黑麦富含阿魏酸、植物甾醇类和木酚素等多酚类物质，具有较强的清除自由基、抗菌、抗氧化活性，可以保护机体免受过氧化物造成的氧化损伤，防止机体细胞衰老[11-13]。本研究以混合了黑麦多酚提取物的猪肉丸为研究对象，以目前生产中常用的合成抗氧化剂BHT为对照，通过测定猪肉丸中硫代巴比妥酸反应产物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值、蛋白质羰基含量、蛋白巯基含量和品质变化，评价黑麦多酚对抑制猪肉丸经4 ℃冷藏12 d后的脂质和蛋白质氧化的效果，为黑麦多酚的开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑麦（Secale cereal L.）引自加拿大的‘黑引1号’品种，由山西农业大学农学院提供。
新鲜猪肉购自山西省太谷双汇冷鲜肉店。
无水乙醇、没食子酸、无水碳酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三氯甲烷、乙二胺四乙酸钠、BHT、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、氯仿、过硫酸钾、2,4-二硝基苯肼（dinitrophenylhydrazine，DNPH）、2-硫代巴比妥酸 国药集团化学试剂有限公司;福林-酚、2,2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)（2,2-diazobis(3-ethylbenzothiazole-6-sulfonic acid)，ABTS）、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）、5,5-二巯基-2-硝基苯甲酸（5,5-dimercapto-2-nitrobenzoic acid，DTNB） 上海Solarbio生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
HC-3018R高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司;Ratavapor R-3旋转蒸发仪 瑞士BUCHI公司;PL3000真空冷冻干燥机 北京水方仪涛贸易有限公司;WFJ2100可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司;TCP2型全自动测色色差计 北京鑫奥依克光电技术有限公司;TMS-Pro质构仪 美国FTC公司。
1.3 方法
1.3.1 黑麦多酚提取物的制备
将黑麦全粒谷物粉碎，除壳外的所有部位全部收集，得黑麦全粉，混合均匀。称取一定量样品，按料液比1∶11.8溶于体积分数50%乙醇溶液中，封口，置于54 ℃恒温水浴锅，浸提48 min，过滤，得黑麦多酚粗提液。经高速冷冻离心的上清液，以1 mL/min的流速通过AB-8型吸附树脂，用体积分数70%的乙醇溶液以1 mL/min的速率洗脱。收集的洗脱液经旋转蒸发浓缩，再经冷冻干燥成粉得到黑麦多酚提取物（rye polyphenol extract，RPE）（参考文献[14]检测得到其总酚含量为54.6 mg/g，以每克干提取物的没食子酸质量计），保存备用。
1.3.2 猪肉丸的制作
原料准备：猪瘦肉10 kg、猪背膘3 kg、食盐150 g、白砂糖100 g、白胡椒粉37 g、三聚磷酸钠30 g、亚硝酸钠0.8 g、淀粉500 g、味精100 g。将猪瘦肉和背膘经4 mm孔板的绞肉机绞碎，加入配料和2.7 kg水，充分搅拌均匀，制成直径为3 cm的肉丸，80 ℃煮制20 min，放入聚丙烯托盘中用聚氯乙烯薄膜包裹，置于4 ℃冰箱冷藏。
1.3.3 实验设计
对于4 个实验组，在基础配方中按猪肉质量分别添加0.04% RPE、0.08% RPE、0.12% RPE和0.02% BHT，以基础配方（不添加抗氧化剂）作为对照。指标测定从冷藏当天（0 d）开始，每隔3 d测定一次，每次测定重复3 次。
1.3.4 指标测定
1.3.4.1 抗氧化能力测定
按照文献[15]测定抗氧化能力，并进行少量修改。将38.41 mg ABTS与5 mL 0.1 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）混合制备ABTS溶液，将5 mL PBS与6.615 mg过硫酸钾混合制备过硫酸钾溶液，再将上述两种溶液混合反应16 h共制得10 mL ABTS原液（含7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L过硫酸钾）。用PBS稀释所得的ABTS原液，获得734 nm波长处吸光度为0.70±0.04的工作液。将2 g肉糜与10 mL 0.1 mol/L PBS混合，匀浆2 min，4 ℃下3 000 r/min离心5 min。取10 mL匀浆，加入90 mL稀释的ABTS工作液，室温静置6 min，734 nm波长处测定吸光度。结果由Trolox的标准曲线计算得到，抗氧化能力以每克样品的Trolox当量表示，单位为mg/g。
1.3.4.2 TBARS值的测定
参照GB 5009.181—2016《食品安全国家标准 食品中丙二醛的测定》[16]中的方法测定TBARS值。
1.3.4.3 蛋白质氧化程度的测定
羰基含量的测定采用DNPH法，参照Lampila等[17]的方法并略加修改。将2 g肉样在10 mL 0.1 mol/L PBS（pH 7.4）中均质，并取两份2 mL的该溶液，分别与2 mL质量分数20% TCA混合，11 000×g离心3 min。第一份沉淀物用于蛋白质量浓度的测定，第二份沉淀物加入浓度为10 mmol/L的DNPH 2 mL，4 ℃静置1 h，然后11 000×g离心3 min，弃上清液，沉淀风干后，再添加3 mL 6 mol/L盐酸胍，50 ℃保温45 min，在370 nm波长处测吸光度。羰基含量（以蛋白质量计）由公式（1）计算得到。

式中：2.2×104为摩尔吸光系数/（L/（mol·cm））;106为mmol/mg到nmol/mg的单位转换系数;ρ表示用盐酸胍作空白在280 nm波长处测得的蛋白质量浓度/（mg/mL）。
巯基含量的测定采用DTNB法，具体参考Eymard等[18]的方法。巯基含量由公式（2）计算得到，结果以每毫克蛋白质中所含的游离硫醇物质的量表示，单位为nmol/mg。

式中：1.36×104表示摩尔吸光系数/（L/（mol·cm））;106为mmol/mg到nmol/mg的单位转换系数;ρ表示采用考马斯亮蓝法[19]在595 nm波长处所测得的肉样蛋白质量浓度/（mg/mL）。
1.3.4.4 色泽的测定
将不同冷藏期的猪肉丸样品绞碎，碎肉填充于比色皿内，压实、抹平，保证测定表面无气泡，用色差计测定样品的L*、a*、b*值。
1.3.4.5 质构特性的测定
将猪肉丸切成2 cm的正方体样品，采用质构仪在TPA模式下测定样品的硬度、弹性、回复性及咀嚼性，每个样品做3 次平行测定。质构仪参数：探头型号：P/50;测定前探头速率：5.00 mm/s;测定时探头速率：2.00 mm/s;测定后探头速率：5.00 mm/s;压缩比：50%;触发类型：自动;触发力：5.0 g;两次测定间隔时间：5.00 s。
1.3.4.6 感官评价
各处理组不同冷藏期的猪肉丸都在100 ℃水中煮制10 min，冷却后切成2 cm的正方体样品，然后由8 名专业人员对其感官特性进行评价。所有样本是随机编码的盲样本，并按照随机顺序提供给每个评价员。每个评价员被要求评价样品表面的颜色、多汁性和酸败味。1 分代表极度不喜欢，5 分代表既不喜欢也不讨厌，9 分代表极度喜欢。给评价小组成员提供矿泉水，以清洗样品之间的味觉，最后得分为所有成员所打的平均分。
1.4 数据统计与分析
实验均重复3 次，结果用平均值±标准差表示。数据统计分析采用Statistix 8.1软件进行方差分析，采用Tukey HSD多重比较法进行差异显著性分析（P＜0.05），采用SigmaPlot 14.0绘图软件作图。
2 结果与分析
2.1 猪肉丸冷藏过程中的抗氧化能力变化

图 1 猪肉丸冷藏过程中的抗氧化能力
Fig. 1 Antioxidant capacity of pork meatballs during refrigerated storage
如图1所示，添加RPE（0.04%、0.08%、0.12%）提高了猪肉丸的抗氧化能力，第0天0.12% RPE组抗氧化能力最高，与RPE（0.04%和0.08%）组和对照组有显著差异（P＜0.05），但与0.02% BHT组无显著差异（P＞0.05）。随冷藏时间延长，各组抗氧化能力均显著降低，但在所有时间点RPE（0.04%、0.08%、0.12%）组的抗氧化能力仍高于对照组，抗氧化能力由大到小依次为0.12% RPE组＞0.08% RPE组＞0.04% RPE组。第12天0.12% RPE组抗氧化能力最高，与0.04% RPE组和对照组有显著差异（P＜0.05），但与0.08% RPE组和0.02% BHT组无显著差异（P＞0.05）。冷藏期间（0～12 d）0.12% RPE组虽然抗氧化能力稍高于0.02% BHT组，但并无显著差异（P＞0.05），二者抗氧化能力相当。
2.2 猪肉丸冷藏过程中TBARS值变化

图 2 猪肉丸冷藏过程中的TBARS值
Fig. 2 TBARS value of pork meatballs during refrigerated storage
在食品科学研究及食品保鲜或加工生产中，TBARS值已被广泛用以检测贮藏过程中食品的脂质过氧化程度[20]。如图2所示，猪肉丸的脂质氧化从第0天就已发生，RPE也在第0天立即表现出对脂质氧化的抑制作用，且0.12% RPE作用显著（P＜0.05）。随冷藏时间延长，所有处理组的TBARS值呈上升趋势，12 d后对照组的TBARS值最高。与对照组相比，0.12% RPE在第0天、0.08% RPE在第3天即开始显著抑制肉丸中TBARS值的增加（P＜0.05），0.04% RPE抑制作用不明显（P＞0.05）。此外，添加0.12% RPE与0.02% BHT对猪肉丸冷藏12 d内的脂质氧化具有相同的保护作用。
2.3 猪肉丸冷藏过程中的蛋白质氧化程度变化情况
蛋白质氧化是影响肉制品品质的另一个重要因素。脂质氧化产物包括自由基、过氧化氢和次生化合物，易与硫醇、氨基酸等蛋白质成分发生氧化反应，导致蛋白质氧化并失去其功能[21]。蛋白质氧化主要表现为肽键断裂和氨基酸侧链修饰，从而产生羰基化合物及其衍生物，而半胱氨酸残基中的巯基（—SH）也极易在氧自由基攻击下形成二硫键（—S—S—）[22-23]。羰基化合物的形成是氧化蛋白中最显著的变化，其含量已被作为蛋白质氧化的可靠指标广泛应用于食品和生物系统中[24-25]。游离硫醇基是半胱氨酸残基的巯基，其含量也是判断组织中蛋白质氧化程度的重要参数[26]。
2.3.1 猪肉丸羰基含量的变化
如图3所示，第0天即存在蛋白质氧化，且添加0.12% RPE的肉丸羰基含量显著低于对照组（P＜0.05）。与对照组相比，添加0.12% RPE从开始就显著抑制了猪肉丸的蛋白氧化（P＜0.05），且冷藏12 d内抑制作用均显著（P＜0.05），说明经0.12% RPE处理的猪肉丸蛋白氧化得到了有效抑制。随冷藏时间延长，猪肉丸的羰基含量一直呈增加趋势。添加0.08% RPE从第3天开始显著减缓了羰基含量的增加（P＜0.05），而添加0.04% RPE从第9天开始也显著减缓了羰基含量的增加（P＜0.05）。除第6、9天外，添加0.12% RPE组与0.02% BHT组的羰基含量均无显著差异（P＞0.05），说明二者对保护猪肉丸蛋白质氧化的作用基本相当。

图 3 猪肉丸冷藏过程中的羰基含量
Fig. 3 Protein carbonyl content of pork meatballs during refrigerated storage
2.3.2 猪肉丸中巯基含量的变化

图 4 猪肉丸冷藏过程中的巯基含量
Fig. 4 Sulfydryl contents of pork balls during refrigerated storage
如图4所示，各处理组的巯基含量一直呈下降趋势，对照组巯基含量降低速度最快。第0天，RPE（0.04%、0.08%、0.12%）组与对照组巯基含量无显著差异（P＞0.05）。0.12% RPE处理从第3天开始，0.04%、0.08% RPE处理从第9天开始显著抑制巯基水平的降低（P＜0.05），说明RPE处理可以很好地保护巯基，降低蛋白质氧化程度。冷藏9 d后，RPE（0.04%、0.08%、0.12%）组之间及与0.02% BHT组之间的巯基水平均无显著差异（P＞0.05）。
2.4 猪肉丸在冷藏过程中的色泽变化
颜色是消费者判断肉制品质量的直观依据。表1结果表明，与对照组相比，添加RPE（0.08%和0.12%）显著提高了猪肉丸第0天的L*值（亮度）和a*值（红度）（P＜0.05），但b*值（黄度）降低不显著（P＞0.05）。冷藏12 d内，添加RPE（0.04%、0.08%、0.12%）均不同程度抑制了猪肉丸L*、a*值的降低和b*值的增加，但只有添加0.12% RPE起到了显著稳定肉色的作用（P＜0.05），且与0.02% BHT作用相当（P＞0.05）。
表 1 猪肉丸冷藏过程中的色泽
Table 1 Color values of pork meatballs during refrigerated storage

注：对于同一指标，同行肩标大写字母不同表示差异显著（P＜0.05），同列肩标小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。
肉类的颜色与肌肉组织中的肌红蛋白直接相关，氧合肌红蛋白的存在是肉类呈鲜红色的主要原因，当氧合肌红蛋白中血红素所含的二价铁被氧化为三价铁时，肉就会发生褐变。因此，二价铁肌红蛋白的保持程度直接决定肉类颜色的稳定性。颜色变化是由氧化反应引起的，添加具有抗氧化活性的物质即可抑制颜色的变化[27]。脂肪氧化会促进肌红蛋白的氧化，因而多酚提取物还能通过抑制脂肪氧化达到稳定肉色的目的[5]。
2.5 猪肉丸冷藏过程中的质构特性
如表2所示，所有处理组硬度随冷藏时间延长均呈先升高后降低的趋势，12 d冷藏期内，添加RPE（0.04%和0.08%）的猪肉丸硬度与对照组相比没有显著差异，而添加0.12% RPE的肉丸硬度9 d后才显著高于对照组（P＜0.05），说明RPE对猪肉丸的硬度影响不大。添加RPE（0.04%、0.08%、0.12%）对猪肉丸的弹性没有显著影响（P＞0.05）。除第3天外，添加0.12% RPE的猪肉丸回复性均显著高于对照组（P＜0.05），而添加RPE（0.04%和0.08%）对肉丸回复性没有显著影响（P＞0.05）。与对照组相比，添加RPE（0.04%、0.08%、0.12%）的猪肉丸咀嚼性从第6天开始均显著提高（P＜0.05），添加0.12% RPE的猪肉丸咀嚼性在第0天即显著提高（P＜0.05）。
肉制品的质构特性与其本身所含的蛋白质、脂肪和水分有着密切联系。水分和脂肪的存在有利于维持肉制品质构的稳定，而蛋白质构成的框架能够锁住水分和脂肪，蛋白质氧化导致羰基含量增加、蛋白质交联，脂肪氧化破坏肌纤维膜的完整性，两者均会造成肉制品水分和脂肪流失，从而影响肉制品的质构特性[28-29]。研究表明，植物提取物可以通过抑制肉类脂肪和蛋白质氧化来改善肉制品的质构特性[30]。
表 2 猪肉丸冷藏过程中的质构特性
Table 2 Texture characteristics of pork meatballs during refrigerated storage

2.6 猪肉丸感官评价结果
表 3 猪肉丸冷藏过程中的感官评分
Table 3 Sensory scores of pork meatballs during refrigerated storage

如表3所示，第0天所有处理组的表面颜色、多汁性和酸败味评分均无显著差异（P＞0.05）。与对照组相比，第9天，添加RPE（0.08%和0.12%）的猪肉丸颜色和酸败味评分显著提高（P＜0.05），添加0.12% RPE的猪肉丸多汁性评分显著提高（P＜0.05）。冷藏12 d内，添加0.12% RPE与0.02% BHT的猪肉丸的所有感官品质（表面颜色、多汁性和酸败味）评分均无显著差异（P＞0.05）。
3 结 论
本实验将添加RPE（0.04%、0.08%、0.12%）的猪肉为原料制成肉丸，放入冰箱（4 ℃）冷藏12 d，以目前常用的合成抗氧化剂BHT作阳性对照，以不添加抗氧化剂的产品作空白对照，研究了RPE对猪肉丸冷藏过程中脂质和蛋白质氧化的抑制作用。结果表明，添加RPE的猪肉丸具有较高的抗氧化能力;添加RPE（0.08%和0.12%）可显著降低TBARS值，显著降低羰基含量和提高巯基含量;0.12% RPE和0.02% BHT在抑制猪肉丸脂质和蛋白质氧化方面作用相当。
此外，探讨了RPE对猪肉丸在冷藏过程中品质变化的影响。与对照组相比，添加0.12% RPE显著提高了猪肉丸的L*值和a*值，降低了b*值;经RPE（0.04%、0.08%、0.12%）处理的猪肉丸咀嚼性明显改善，而对硬度和弹性影响不大，添加0.12% RPE明显改善了猪肉丸的回复性和冷藏后期的感官品质;冷藏12 d内，0.12% RPE与0.02% BHT对猪肉丸品质的影响无显著差异。研究结果表明，RPE作为一种天然抗氧化剂，具有良好的抗氧化性能和替代合成抗氧化剂（0.02% BHT）的潜力，可在改善或不降低品质的前提下延长产品的货架期，在生产功能改良的健康肉制品方面具有很大的应用潜力。
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Effect of Rye Polyphenol Extract on Oxidative Stability and Quality of Pork Meatballs during Refrigerated Storage
HAO Jiaomin1, YANG Wenping2, JIN Mingkai1, ZHAO Fangfang1, WANG Kai1, YANG Zhenping3,*, GAO Zhiqiang3
(1. College of Food Science and Engineering, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China;2. College of Life Sciences, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China;3. College of Agriculture, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China)
Abstract: The inhibitory effect of rye polyphenol extract (RPE) on the oxidation of fat and protein in pork meatballs during refrigerated storage was studied along with its effect on the storage quality of pork meatballs. Meatballs were made from ground pork mixed with different levels of RPE (0.04%, 0.08% and 0.12%, m/m) and refrigerated at 4 ℃ for 12 days.The results showed that the pork meatballs with RPE had higher antioxidant capacity than did the control without any antioxidant. Addition of RPE at 0.08% and 0.12% significantly reduced the level of thiobarbituric acid reactive substances(TBARS) value (P < 0.05), and inhibited the oxidation of proteins, as evidenced by significantly reduced carbonyl content and increased sulfhydryl level (P < 0.05). The effect of 0.12% RPE was comparable to that of 0.02% butylated hydroxytoluene (BHT) in inhibiting lipid and protein oxidation and maintaining the storage quality of pork meatballs.Compared with the control group, addition of 0.12% RPE significantly increased the L* and a* values, and improved the chewiness and resilience, as well as the sensory quality during the later stage of storage. These findings showed that RPE, a potent natural antioxidant, is a potential alternative to synthetic antioxidants (0.02% BHT), which could improve the shelf life of the product while maintaining and even improving the quality, and it has great application potential in the production of healthy meat products with improved functions.
Keywords: rye polyphenol extract; antioxidant capacity; healthy meat products
收稿日期：2019-05-09
基金项目：山西省重点研发计划重点项目（201703D211001-02-02）;山西农谷建设科研专项（SXNGJSKYZX201701）
第一作者简介：郝教敏（1974—）（ORCID: 0000-0003-3795-6041），男，副教授，硕士，研究方向为天然植物功能因子提取及应用。E-mail: haojm.1@163.com
*通信作者简介：杨珍平（1973—）（ORCID: 0000-0001-6085-8752），女，教授，博士，研究方向为植物资源学及天然植物功能因子提取。E-mail: yangzp.2@163.com
DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190509-091
中图分类号：TS251.1
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2020）09-0175-07
引文格式：
郝教敏, 杨文平, 靳明凯, 等. 黑麦多酚提取物对猪肉丸冷藏期间氧化稳定性和品质的影响[J]. 食品科学, 2020, 41(9):175-181. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190509-091. http://www.spkx.net.cn
HAO Jiaomin, YANG Wenping, JIN Mingkai, et al. Effect of rye polyphenol extract on oxidative stability and quality of pork meatballs during refrigerated storage[J]. Food Science, 2020, 41(9): 175-181. (in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190509-091. http://www.spkx.net.cn