|
鲜切莲藕腐败的荧光检测方法鲜切莲藕腐败的荧光检测方法 刘永乐，唐 倩，俞 健，刘小芳，陈善辉，李 彦，王发祥 （长沙理工大学化学与食品工程学院，湖南省水生资源食品加工工程技术研究中心，湖南 长沙 410114） 摘 要：针对传统微生物卫生指标法检测果蔬产品腐败的局限性，研究利用腐败指示菌的荧光检测表征鲜切莲藕样品腐败的方法。鲜切莲藕样品于4 ℃冷藏，每间隔3 d取出检测其微生物菌落总数和指示菌自发荧光检出的相关性，分析指示菌荧光强度与微生物数量的关系并优化荧光检测条件。结果显示：鲜切莲藕冷藏第6天菌落总数为6.4×104 CFU/g，达到腐败标准，而自冷藏第6天开始，莲藕悬液培养后均能检测到荧光，表明荧光检出时间与样品腐败时间点一致；激光共聚焦荧光检测显示样品悬液的荧光强度随其冷藏时间的延长而增强，随其稀释度的增加而降低，表明荧光强度与微生物数量间呈正相关；最终确定该荧光检测方法的最优条件为样品悬液稀释10 倍、接种量5 μL，对随机10 个样品进行检测验证，准确率达90%，操作简单、便捷可行。 关键词：鲜切莲藕；腐败；荧光；菌落总数；检测 莲藕营养成分丰富、口感微甜而脆，同时又可消食止泻、开胃清热、滋补养性，是优良的水生蔬菜和副食佳品，深受广大消费者喜爱[1-2]。我国是莲藕产销大国，近年来产销量均持续增长，2017 1 122.2万 t，居世界前茅。目前我国莲藕消费仍以鲜食为主，加工比例仅约5%，深加工领域发展空间较大。鲜切莲藕是将新鲜莲藕进行清洗、整修、去皮、切分、保鲜、包装等加工流程后得到的即食或即用莲藕制品，因其具有清洁、卫生、新鲜和方便等特点而十分畅销[3-5]，已成为我国莲藕加工的主要方式。然而，莲藕水分含量高，加之加工过程中的去皮、切分等工序使其细胞受损，导致其生理生化反应加剧、容易发生微生物侵染，极易腐败变质[5-6]，严重影响到其质量与安全。因此，研究准确评价鲜切莲藕产品是否腐败变质的方法具有重要的现实意义。 食品变质腐败泛指在微生物为主的各种因素作用下，食品降低或失去食用价值的一切变化，是一个复杂的生物化学反应过程[7-8]。因此，目前尚无统一的评价标准和检验方法，主要借助微生物菌落总数、致病菌等传统的卫生指标进行检验[9-10]。然而，传统的微生物学检验方法具有操作复杂、专业性较强、检验周期较长、特异性较弱等缺点[11-14]，不能满足鲜切果蔬产品便捷检测的需求，急需建立一种方便快捷的检测方法。荧光检测具有灵敏度高、选择性强等优点，目前已广泛应用于现代食品安全检测领域[15-17]，但利用荧光指示菌表征果蔬产品微生物腐败的研究报道较少。 对患儿治疗前,护理人员要详细地向患儿家长介绍支气管肺炎的有关知识,正确地应用盐酸氨溴索联合布地奈德治疗的方式。同时,要事先给患儿家长打预防针,让其做好准备,患儿在治疗期间可能会产生的不良反应。再次,对于患儿家长的疑惑,护理人员要及时解答,保证相互间的信任性。最后,以患者年龄为基础,给予患者合适的雾化吸入。 关于莲藕制品贮藏过程中的微生物污染和腐败分析，目前的研究主要集中在其优势腐败菌的分离鉴定[6,18-19]、产品货架期预测模型[20-21]等方面，而针对其腐败变质快速检测或评价方法的研究较少。在前期研究中，课题组基于聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技术对鲜切莲藕冷藏过程中微生物菌相结构变化进行分析，明确了两种能自发产生荧光的特异腐败菌Pseudomonas fluorescens和P. asturiensis可作为潜在的腐败指示菌用于鲜切莲藕产品质量安全的评价和快速检测研究[22]。本研究在此基础上，根据该指示菌自发荧光的特性，建立一种基于荧光显影检测鲜切莲藕产品微生物腐败的方法，并进行检测条件的优化、验证和相关性分析，以期为相关产品的质量安全评价和便捷检测新技术开发提供一定的参考依据。 1 材料与方法1.1 材料与试剂新鲜莲藕：成熟度适中，藕节完整，无机械伤的带泥莲藕，购自本地农贸批发市场；大肠杆菌（Escherichia coli BL21），由本实验室保藏。 金氏B（KB）培养基[23]、营养琼脂培养基 广东环凯微生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。 1.2 仪器与设备C2 Plus激光扫描共聚焦显微镜 日本尼康公司；Champ Ge15000增强型全自动凝胶成像仪 北京赛智创业科技有限公司；THZ-98AB恒温振荡器 上海一恒科学仪器有限公司。 1.3 方法1.3.1 鲜切莲藕样品及其悬液制备 新鲜莲藕按文献[20]方法切片后置于4 ℃冰箱中冷藏，分别于第0、3、6、9、12天从冰箱取出，在无菌条件下称取25 g，剪碎（大小约5 mm×5 mm），加入225 mL无菌生理盐水中，于恒温振荡器以25 ℃、120 r/min振荡15 min制成样品悬液，用于后续指标分析。 1.3.2 微生物菌落总数测定 按照GB 4789.2—2010《食品微生物学检验 菌落总数测定》方法进行。 打响民生水利品牌，出自2011年广东省水利工作会议上汪洋书记的讲话。它揭示了广东过去一个时期水利改革发展的显著特点，也指明了广东未来一个时期水利改革发展的总体方向。 1.3.3 指示菌自发荧光实验 称取适量KB培养基，按使用说明加入蒸馏水和适量甘油，加热溶解、灭菌后倾注平板。待固体平板冷却后，用接种环分别点接种对照组（大肠杆菌培养液）和3 个平行实验组（系列莲藕悬液样品），于28 ℃培养箱中培养2 d，分别于可见光和紫外光下观察结果。 1.3.4 激光共聚焦显微镜测定样品悬液荧光强度 分别取冷藏0、3、6、9、12 d的莲藕样品悬液及冷藏第6天的莲藕悬液稀释10、100、1 000、10 000 倍，用微量移液枪移取2 μL置于载玻片上，盖上盖玻片以激光共聚焦显微镜检测其荧光强度，其中荧光激发波长为405 nm，电压为105 V，激发器输出功率为14%；标本在不同视野进行拍摄，将图片分为强、中、弱3 个等级，选取中等强度的视野代表该样品的荧光强度[24]，以4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的荧光值表示，计算平均值。 1.3.5 荧光指示菌的便捷检测方法建立 取不同冷藏时间点的莲藕样品悬液，用接种环划线接种至KB培养基斜面试管，置于28 ℃培养箱中培养2 d，利用凝胶成像系统的紫外模式观察荧光并拍照，根据检测到的荧光情况与样品菌落总数的对应关系验证利用荧光指示菌检测样品腐败的可行性。每一样品接种3 支斜面，同时接种1 支大肠杆菌斜面作为阴性对照。 1.3.6 荧光检测条件的优化 取不同冷藏时间点的莲藕样品悬液，分别稀释0、2.5、5、10、20 倍，用微量移液枪移取10 μL至KB培养基斜面，置于28 ℃培养箱中培养2 d后拍照，以样品图像的积分光密度（integrated optical density，IOD）平均值表示荧光强度，根据IOD值变化规律筛选合适悬液稀释比例；悬液按最佳比例稀释后，分别接种5、10、15、20、25 μL，按同样的条件分析计算其IOD值，筛选最佳接种量。 1.3.7 荧光检测方法的验证 按1.3.1节方法制备鲜切莲藕样品（30 袋），分别在冷藏第0、5、6、7天随机取样制备悬液，按1.3.5节的最优条件进行荧光检测，根据荧光信号是否检出判定样品是否腐败；同时按传统的菌落总数指标法检测样品是否腐败，验证荧光检测方法的可靠性。 1.4 数据处理每组实验进行3～6 个平行，以 ±s表示，以Microsoft Excel软件计算并绘制结果图；激光共聚焦显微镜测定的DAPI值采用Leica LSCM软件计算，KB培养基法获得的照片采用Gel-Pro Analyzer软件分析计算IOD值。 2 结果与分析2.1 鲜切莲藕冷藏过程中菌落总数的变化 图 1 鲜切莲藕冷藏过程中菌落总数变化
Fig. 1 Changes in total colony count of lotus root samples during cold storage
如图1所示，冷藏过程中菌落总数一直呈增长趋势，新鲜（第0天）样品为2.1×103 CFU/g，冷藏前3 d增加缓慢；此后菌落总数增长加快，第6天时达6.4×104 CFU/g。根据浙江大学食品科学与发酵工程研究所2005年起草的《蔬菜（净菜）质量安全要求》，要求其菌落总数不得超过5×104 CFU/g，因此可以认为样品在冷藏第6天时已开始腐败变质；冷藏第9天后，样品菌落总数开始急剧增加，至第12天时已达到4.3×105 CFU/g，表明已严重腐败。 2.2 自发荧光指示菌的确认 图 2 莲藕样品悬液接种KB培养基的荧光检测显影结果
Fig. 2 Fluorescence detection of the bacterial colonies in KB plate from different lotus root samples
在前期研究中，课题组通过PCR-DGGE技术研究了冷藏期间莲藕的优势腐败菌类型和菌相结构变化，发现假单胞菌属细菌在腐败关键期开始大量增殖，逐渐成为优势腐败菌，可以作为评价鲜切莲藕产品是否腐败的重要指示菌；尤其是优势腐败菌P. asturiensis的检出时间与腐败时间一致[22]，且可产生水溶性黄绿色荧光色素[25-26]，可以通过荧光显影技术检测[15]。 如图2所示，第0、3天样品悬液接种后没有在KB平板上长出明显菌落，可能与悬液中微生物数量较少有关；第6天后的样品才开始长出菌落，且在可见光下呈黄绿色，但对照菌液接种后一直为灰白色菌落。将平板置于紫外光下，在接种第6～12天样品处可观察到明显的荧光，对照菌则不会产生荧光，说明荧光的产生与莲藕样品的腐败菌有关。此外，样品检测出荧光的时间与DGGE图谱[22]中P. asturiensis出现的时间一致，也与通过菌落总数指标判定莲藕样品腐败变质的时间一致。因此，理论上通过检测荧光表征样品腐败变质可行。 “花山崖壁画”中有的八字下蹲，膝盖朝向相反的两侧，双手平着举起；有的是侧着身体成半蹲形式，双手前推。他们整齐有序的排列成一排，像是整齐的踏步，慢慢起舞。 2.3 荧光强度与微生物数量的关系 图 3 不同冷藏时间（A）和稀释度（B）莲藕样品悬液的激光共聚焦检测图像
Fig. 3 Laser confocal fluorescence detection of suspension cultures of lotus roots with different cold storage times (A) and dilution factors (B)
表 1 不同冷藏时间和稀释度莲藕样品悬液的DAPI值
Table 1 Fluorescence intensities of suspension cultures of lotus root samples with different cold storage times and dilution factors  冷藏时间/d 稀释倍数 DAPI值0 0 19.52±2.92 3 0 25.76±10.12 6 106.75±11.51 6 10 82.71±2.80 6 100 69.55±8.90 6 1 000 51.51±8.31 6 10 000 19.30±1.63 9 0 125.30±10.24 0 12 0 159.99±21.78
激光扫描共聚焦显微镜可以定量检测生物体自发荧光强度[27-28]。如图3所示，随着莲藕冷藏时间的延长，样品悬液的荧光强度逐渐增强，尤其是第6天后荧光强度急剧上升，至第12天时达到最强（图3A、表1），说明样品悬液中荧光指示菌产生的荧光强度与其冷藏过程中菌落总数（图1）的变化趋势基本一致。由于莲藕样品在冷藏第6天开始腐败，将冷藏6 d的莲藕样品悬液稀释后进行激光共聚焦荧光检测。样品原液的荧光强度最强，随着稀释度的增加，荧光强度逐渐减弱（图3B、表1），说明荧光强度与指示菌数量间具有一定的正相关关系，可以根据指示菌的荧光强度表征样品的微生物污染程度，从而直观地分析其腐败情况[29]。 教师设情境置2：假如在等待“120”过程中，你发现晕倒的女生又被刮伤出血了，该怎么办？阅读教材76页第二段。如何根据出血状况，判断出血类型？请阅读教材86页。 1.1一般资料2015年1月至2017年1月我院对82例脑胶质瘤患者进行了研究分析,将患者分成了对照组和观察组,均有41例患者,对照组有23例男性和18例女性患者,最小患者19岁,最大患者53岁,平均39.4岁;病程方面,病程时间在6个月~2年,平均病程为6个月;为患者使用开放式手术治疗。观察组共有22例男性和19例女性患者,最小患者21岁,最大患者56岁,平均42.1岁;病程方面,病程时间在6个月~2年,平均病程为7个月;采用微创式手术方法治疗脑胶质瘤。 2.4 荧光检测方法的建立激光共聚焦荧光检测可以较好地根据指示菌的荧光强度表征样品的微生物腐败程度，但受限于激光扫描共聚焦显微镜的购置和检测成本，目前采用该方法检测鲜切莲藕样品微生物腐败仍不现实。因此，需要发展一种相对经济又便捷的荧光指示菌检测方法。图4为不同冷藏时间的莲藕样品悬液接种KB斜面后利用凝胶成像系统照相获得的照片。各组阴性对照的斜面试管（第4支）均无荧光产生，样品试管从冷藏第6天开始检测到荧光，这一时间点与图1的结论（开始腐败的时间点为第6天）吻合。因此，可以用样品荧光指示菌的检出表征样品的微生物腐败，该方法较激光共聚焦检测更实惠，同时较传统卫生指标检测法更简单快捷。然而，可能由于划线接种量的不确定性，样品的荧光强度与其微生物菌落总数的线性对应关系还不理想，尚需对其荧光检测条件进一步优化。  图 4 不同莲藕样品悬液接种KB斜面后的荧光检测结果
Fig. 4 Fluorescence detection of suspension cultures of different lotus root samples inoculated on KB slopes
2.5 荧光检测条件的优化2.5.1 稀释度的选择 青海特色优势企业面临着科研经费不足，技术人员匮乏的窘境。企业缺乏具有 “工匠精神”的生产员工和具有“创新精神”的技术员工，且涉外人才稀缺，这使得大多数企业在面临不合理的国际贸易规则时，不能拿出有效的应对策略，保护企业的合法权益。  图 5 不同稀释度莲藕悬液接种KB斜面后的荧光检测结果
Fig. 5 Fluorescence detection of suspension cultures of lotus root samples with different dilution factors inoculated on KB slopes
如图5所示，对照和第0天样品斜面试管均无荧光产生，而冷藏6 d以后样品的各稀释度斜面均检测到荧光，且强度基本随冷藏时间的延长逐渐增强，再次印证了利用指示菌荧光检测表征样品微生物腐败的可行性；然而，原液和稀释2.5、5 倍的第3天样品各有1 支试管检测到微弱荧光，说明不合适的样品悬液稀释度可能会影响检测结果的准确性，因此，后续选取稀释10 倍作为最佳稀释度。 2.5.2 接种量的确定 在不同莲藕样品均稀释度悬液均稀释10 倍的基础上，进行不同接种量实验，斜面培养后的荧光检测结果如图6所示。接种量为5、10 μL的样品均第6天开始出现荧光，且随着接种量的增加，荧光强度逐渐增强；而接种量大于15 μL后，冷藏第3天样品试管也能检测到荧光，说明接种量太大造成假阳性结果。分析计算接种5 μL和10 μL实验组样品图像的IOD值，发现当接种量为5 μL时其与冷藏时间的相关性更好（图7）。因此，最终确定样品悬液稀释10 倍、接种量5 μL为荧光指示菌便捷检测方法的最优条件。 选择我院2017年6月至2018年2月间收治的隐匿性肋骨骨折患者98例,将其按照统计学方法平均分为两组,分别为实验组和对照组,每组患者49例。实验组患者男性31例,女性18例,年龄在27~81岁,平均年龄为(48.3±5.6)岁,其中交通意外伤害21例,摔伤12例,重物击砸伤8例,直接暴力伤害7例。对照组患者男性32例,女性17例,年龄在28~80岁,平均年龄为(47.9±5.4)岁,其中交通意外伤害22例,摔伤11例,重物击砸伤9例,直接暴力伤害6例。两组患者的一般情况比较,P>0.05,其差异不具有统计学意义,具有可比性。  图 6 不同接种量莲藕悬液于KB斜面培养后的荧光检测结果
Fig. 6 Fluorescence detection of suspension cultures of lotus root samples at different inoculum amounts inoculated on KB slopes
 图 7 最佳检测条件下的样品IOD值与冷藏时间的关系
Fig. 7 Relationship between cold storage time of lotus root samples and fluorescence intensity under optimal conditions
2.6 检测方法的验证随机选取10 个不同冻藏时间的鲜切莲藕样本，分别以本研究的荧光检测方法和传统的微生物菌落总数分析法进行样品微生物腐败检测对比，结果如表2所示。除冷藏第5天的样品检测到微弱荧光外（导致这一结果的原因可能与样品腐败菌的个体差异和稀释或接种操作有关[30]），其余样品均与传统方法检测的结果一致，准确率高达90%，说明本研究建立的利用荧光指示菌检测鲜切莲藕腐败的方法可行。 随着我国一带一路、西电东送、沿海核电等建设，抽水蓄能电站凭借可优化电源结构、改善电网质量、确保电网安全等特点，目前仅华南地区就已兴建或将建清远、深圳、梅州、阳江和海南琼中等多座抽水蓄能电站。抽水蓄能电站的水道系统不同于一般水工隧洞，一是水道系统长，空间布置复杂，局部相互影响；二是最大内水压力可达7 MPa～8 MPa；三是运行期内水外渗而检修期外水内渗，工作性态复杂，若发生失稳或渗透破坏，其后果是灾难性的。因此，须保证水道系统的稳定性和防渗性能[1]。 表 2 荧光检测法与传统方法的检测结果比对
Table 2 Comparison of the results of fluorescence detection and traditional detection methods  样品 冷藏时间/d一致1 7 23.99±1.07 腐败 2.02±0.45 腐败 是2 7 17.78±3.32 腐败 2.14±0.20 腐败 是3 7 22.91±3.08 腐败 2.40±0.27 腐败 是4 6 5.74±1.76 腐败 1.68±0.12 腐败 是5 6 8.31±0.85 腐败 1.49±0.08 腐败 是6 6 7.59±0.57 腐败 1.73±0.65 腐败 是7 5 1.20±0.09 未腐败 0.00±0.00 未腐败 是8 5 1.21±0.14 未腐败 0.00±0.00 未腐败 是9 5 1.96±0.18 未腐败 0.68±0.26 腐败 否10 0 0.21±0.07 未腐败 0.00±0.00 未腐败 是菌落总数/（104 CFU/g）传统方法结果判读IOD值（×107）本方法结果判断是/否
3 结 论本研究基于前期PCR-DGGE技术明确了鲜切莲藕冷藏过程中优势腐败菌P. asturiensis的检出时间与腐败时间点的一致性，应用其自发荧光的特点建立了一种基于荧光显影表征鲜切莲藕产品微生物腐败情况便捷检测方法。通过荧光指示菌的确认、荧光强度与微生物数量的相关性分析、荧光检测方法建立及其检测条件的优化，最终对实际样品腐败检测的验证结果与传统菌落总数检验方法基本一致。与传统微生物卫生指标检验方法相比，该荧光检测方法操作简便、结果直观，而且检出准确率高，是一种便捷可行的莲藕腐败检测方法。 目前的导航卫星系统包括GPS、北斗、伽利略和格罗纳兹四个体系，同一地点一般情况下可见卫星数在20颗以上[8]。通过读取导航卫星星历数据，可以得到当前经纬度下，大地坐标系中，导航卫星的方位角和俯仰角(方位角以正东方向为0°，顺时针为负，俯仰角是与水平面的夹角)。某地点某时刻下的导航卫星分布情况如图2所示。 参考文献： [1] XING Y G, LI X H, XU Q L, et al. Effects of chitosan-based coating and modied atmosphere packaging (MAP) on browning and shelflife of fresh-cut lotus root (Nelumbo nucifera Gaerth)[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2010, 11(6): 684-689.DOI:10.1016/j.ifset.2010.07.006. [2] 孙世旭, 李莉, 韩祥稳, 等. 纳米抗菌包装材料对延缓白莲藕风味品质劣变的影响[J]. 食品科学, 2019, 40(7): 212-218. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181130-352. [3] RAMOS B, MILLER F A, BRAND O T R S, et al. Fresh fruits and vegetables: an overview on applied methodologies to improve its quality and safety[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2013, 20: 1-15. DOI:10.1016/j.ifset.2013.07.002. [4] 黄杨敏, 孙晔, 耿思翌, 等. 魔芋葡甘聚糖复合涂膜对鲜切莲藕保鲜效果的影响[J]. 食品科学, 2016, 37(8): 266-271. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608048. [5] 何萌, 王丹, 马越, 等. 不同清洗处理对鲜切莲藕贮藏期褐变的影响[J].食品科学, 2014, 35(18): 214-218. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201418041. [6] 李新楠, 齐小保, 严守雷, 等. 5 种鲜切藕片胀袋微生物的分离与鉴定[J]. 食品科学, 2014, 35(23): 151-154. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201423030. [7] 朱军莉, 冯立芳, 王彦波, 等. 基于细菌群体感应的生鲜食品腐败机制[J]. 中国食品学报, 2017, 17(3): 225-234. DOI:10.16429/j.1009-7848.2017.03.028. [8] FRANCIS G A, GALLONE A, NYCHAS G J, et al. Factors affecting quality and safety of fresh-cut produce[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2012, 52(7): 595-610. DOI:10.1080/10408398.2010.503685. [9] 冯可, 胡文忠, 姜爱丽, 等. 鲜切果蔬中4 种病原微生物多重PCR检测技术[J]. 食品科学, 2018, 39(6): 276-283. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201806043. [10] 成黎. 新鲜蔬菜中的微生物污染危害、检测和控制方法研究进展[J]. 食品科学, 2015, 36(23): 347-352. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201523062. [11] HAMEED S, XIE L J, YING Y B. Conventional and emerging detection techniques for pathogenic bacteria in food science: a review[J]. Trends in Food Science & Technology, 2018, 81: 61-73.DOI:10.1016/j.tifs.2018.05.020. [12] KLEINA D, BREUCHA R, MARK S, et al. Detection of spoilage associated bacteria using Raman-microspectroscopy combined with multivariate statistical analysis[J]. Talanta, 2019, 196: 325-328.DOI:10.1016/j.talanta.2018.12.094. [13] 岑璐伽, 唐善虎, 郝小倩, 等. DGGE技术及其在食品微生物研究中应用[J]. 粮食与油脂, 2012, 25(1): 9-12. DOI:10.3969/j.issn.1008-9578.2012.01.004. [14] 周冰谷, 花振新, 杨荣, 等. 近红外光谱技术在食品微生物检测中的应用[J]. 食品安全质量检测学报, 2019(16): 5393-5398. [15] KAROUI R, BLECKER C. Fluorescence spectroscopy measurement for quality assessment of food systems: a review[J]. Food and Bioprocess Technology, 2011, 4: 364-386. DOI:10.1007/s11947-010-0370-0. [16] 刘欢, 刘文, 杨斯, 等. 表面荧光法无损检测牛肉的新鲜度[J].中国食品学报, 2019, 19(7): 234-240. DOI:10.16429/j.1009-7848.2019.07.031. [17] 黄林, 赵杰文, 陈全胜, 等. 冷却猪肉优势腐败菌原位荧光染色检测方法研究[J]. 中国食品学报, 2014, 14(3): 145-150. [18] 刘小芳, 王发祥, 俞健, 等. 鲜切莲藕冷藏过程中优势腐败菌的分离与鉴定[J]. 食品与机械, 2016, 32(4): 148-150; 186. [19] 高晗, 孙俊良, 高愿军, 等. 气调包装对鲜切莲藕保鲜效果研究[J]. 食品科学, 2008, 29(10): 612-614. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2008.10.147. [20] 樊振江, 郝亚勤, 张素君, 等. 鲜切莲藕微生物模型的建立及货架寿命预测[J]. 中国农学通报, 2007, 23(1): 326-330. DOI:10.3969/j.issn.1000-6850.2007.01.078. [21] 刘春菊, 钱旻, 宋江峰, 等. 速冻莲藕片贮藏过程中品质变化动力学模型[J]. 农业工程学报, 2017, 33(6): 301-308. DOI:10.11975/j.issn.1002-6819.2017.06.039. [22] 王发祥, 刘永乐, 俞健, 等. PCR-DGGE分析鲜切莲藕冷藏过程中的菌相变化[J]. 中国食品学报, 2017, 17(8): 255-260. DOI:10.16429/j.1009-7848.2017.08.034. [23] KING E O, WARD M K, RANEY D E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin[J]. Journal of Laboratory and Clinical Medicine, 1954, 44(2): 301-307. DOI:10.1371/journal.pone.0057409. [24] MUSETTI R, BUXA S V. DAPI and confocal laser-scanning microscopy for in vivo imaging of phytoplasmas[M]//Phytoplasmas:methods and protocols. US: Springer, 2009: 301-306. [25] GONZALEZ A J, CLEENWERCK I, PAUL D V, et al. Pseudomonas asturiensis sp. nov., isolated from soybean and weeds[J]. Systematic and Applied Microbiology, 2013, 36: 320-324. DOI:10.1016/j.syapm.2013.04.004. [26] BRENNER D J, KRIEG N R, STALEY J T. Bergey’s manual of systematic bacteriology[M]. Berlin: Springer, 2005: 323-378. [27] 冯倩倩, 王文娟, 李海冬, 等. 利用激光扫描共聚焦显微镜研究叶绿体自发荧光[J]. 清华大学学报(自然科学版), 2017, 57(6): 651-654;660. DOI:10.16511/j.cnki.qhdxxb.2017.26.034. [28] D’INCECCO P, ONG L, GRAS S. A fluorescence in situ staining method for investigating spores and vegetative cells of Clostridia by confocal laser scanning microscopy and structured illuminated microscopy[J]. Micron, 2018, 110: 1-9. DOI:10.1016/j.micron.2018.04.005. [29] POGHOSSIAN A, GEISSLER H, SCHÖNING M J. Rapid methods and sensors for milk quality monitoring and spoilage detection[J].Biosensors and Bioelectronics, 2019, 140: 111-272. DOI:10.1016/j.bios.2019.04.040. [30] 黄炯, 张读朴, 徐亚萍, 等. 产气荚膜梭菌和腐败梭菌在厌氧菌基础培养基中的生长特性[J]. 动物医学进展, 2005, 26(4): 94-98.DOI:10.16511/j.cnki.qhdxxb.2017.26.034.
Fluorescence Detection of the Spoilage of Fresh-Cut Lotus Roots LIU Yongle, TANG Qian, YU Jian, LIU Xiaofang, CHEN Shanhui, LI Yan, WANG Faxiang
(Hunan Provincial Engineering Research Center for Food Processing of Aquatic Biotic Resources,School of Chemistry and Food Engineering, Changsha University of Science and Technology, Changsha 410114, China) Abstract: In order to overcome the disadvantages of the traditional microbial hygiene indicator tests, a fluorescence method based on spoilage indicator bacteria for determining the spoilage of fresh-cut lotus root products was developed. The samples were refrigerated at 4 ℃. Total colony count (TCC) and the fluorescence of the indicator bacteria were measured at 3 d intervals, and their correlation was analyzed. The optimum conditions for fluorescence detection were also studied.The results showed that the TCC of the samples stored for 6 d was 6.4 × 104 CFU/g, indicating spoilage. The fluorescence of the suspension culture of lotus roots was detected starting from the sixth day, suggesting that the time point of fluorescence detection and spoilage were consistent. The fluorescence intensity detected with confocal laser scanning microscope showed an increase with storage time but a decrease with the dilution of the suspension, indicating a positive correlation between the fluorescence intensity and the number of microorganisms. Finally, the optimal conditions for this fluorescence method were determined as follows: 10-fold dilution of the suspension, and inoculum volume 5 μL. The accuracy of this method was up to 90% when it was verified with 10 randomly selected samples. It proved to be a simple and convenient method. Keywords: fresh-cut lotus roots; spoilage; fluorescence; total colony count; detection
收稿日期：2019-10-17 基金项目：国家自然科学基金面上项目（31571867）；中央引导地方科技发展专项（2018CT5010）；湖南省教育厅科学研究项目（17B016；17C0059；18C0233） DOI:10.7506/spkx1002-6630-20191017-166 中图分类号：TS255.7 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2020）08-0270-05 引文格式： 刘永乐, 唐倩, 俞健, 等. 鲜切莲藕腐败的荧光检测方法[J]. 食品科学, 2020, 41(8): 270-274. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20191017-166. http://www.spkx.net.cnLIU Yongle, TANG Qian, YU Jian, et al. Fluorescence detection of the spoilage of fresh-cut lotus roots[J]. Food Science, 2020,41(8): 270-274. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20191017-166. http://www.spkx.net.cn
| 
|Archiver|手机版|小黑屋|www.openhelp100.com
( 冀ICP备19026749号-1 )
发表于 2021-2-3 22:06:00
