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孔石莼多糖锌结构表征与体外降血糖活性

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发表于 2021-2-2 16:57:28 | 显示全部楼层 |阅读模式
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孔石莼多糖锌结构表征与体外降血糖活性孔石莼多糖锌结构表征与体外降血糖活性
汤陈鹏,吕 峰*,王蓉琳
(福建农林大学食品科学学院,福建 福州 350002)
摘 要:以孔石莼多糖为参照,采用气相色谱-质谱联用法、凝胶渗透色谱-多角度激光光散射-示差检测器联用法、刚果红实验、紫外-可见光谱、傅里叶变换红外光谱、X射线衍射、扫描电子显微镜、原子力显微镜等手段对孔石莼多糖锌络合物的理化性质与结构进行检测分析,并考察其对α-葡萄糖苷酶与α-淀粉酶的抑制作用。结果表明:孔石莼多糖是由鼠李糖、岩藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成的杂多糖,其单糖基的物质的量比为1.00∶0.06∶0.93∶0.45∶2.29∶0.07;经过络合锌改性后产物中孔石莼多糖的分子质量及其含量均明显下降,三螺旋结构消失,糖链中的—COO-、—CH3、—OSO3-等基团与Zn2+发生了结合;孔石莼多糖锌的表面形貌变化明显,其分子尺寸较原多糖的减小,但其分子团聚性增强;且孔石莼多糖锌对α-葡萄糖苷酶与α-淀粉酶的抑制效果均强于原多糖。说明孔石莼多糖经过络合锌改性后,结构发生了明显的变化,体外降血糖活性增强。
关键词:孔石莼多糖锌;结构表征;体外降血糖活性
孔石莼(Ulva pertusa)又称海菠菜、海条等,是一种隶属于石莼科的大型绿藻;其风味鲜美、营养丰富,具有清热解毒、软坚散结等功效[1]。孔石莼多糖是孔石莼中的主要生物活性物质[2],有关研究表明,孔石莼多糖具有降血糖[3]、抗氧化[4]、降血脂[5]、抗肿瘤[6]等多种生物活性。
通过分析和调查2018年9月动物疫情来看,想要提升动物疾病防治工作管理,就必须要深入到动物养殖动物,动物疾病控制的各个方面,只有这样才能确保人们的使用安全。本文以动物疾病防治工作中存在的问题,动物疾病防治工作的改进办法两方面,详细论述笔者观点,希望可以引发相关部门的重视,提升对于动物疾病防治工作的管理。
锌是人体必需的微量元素之一[7],在体内酶和受体功能的调节中起着重要的作用[8]。缺锌可导致人体营养不良、皮肤炎症、免疫力低下等一系列症状。近年来,国内外研究表明,将天然多糖与锌进行络合改性制备得到多糖锌络合物,与常见的无机补锌剂相比,其生物利用率高、副作用小,且同时兼具多糖与锌的生理功能,具有广阔的应用前景[9]。目前已见报道的多糖锌有酵母多糖锌[10]、夏枯草多糖锌[11]、竹荪多糖锌[12]、大米胚芽多糖锌[13]、金针菇多糖锌[14]等。
本研究以实验室自制的孔石莼多糖为参照,对孔石莼多糖锌络合物的结构与体外降血糖活性进行表征与探究,以期为孔石莼资源的高值化利用和新型多糖补锌剂的开发提供一定的理论参考依据。
1 材料与方法1.1 材料与试剂
孔石莼多糖、孔石莼多糖锌(锌质量分数10.24%),均为福建农林大学食品科学学院保鲜基地实验室自制[15]。
α-葡萄糖苷酶(比活力50 U/mg)、α-淀粉酶(猪胰腺,比活力10 U/mg)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside,PNPG)上海源叶生物科技有限公司;硫酸、刚果红、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、可溶性淀粉、苯酚、氢氧化钠、亚硫酸氢钠、酒石酸钾钠、3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)均为分析纯。
1.2 仪器与设备
BSA223S分析天平 北京赛多利斯科学仪器有限公司;HH-4数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司;PHB-3 pH计 上海三信仪表厂;SYNERGY酶标仪 美国伯腾仪器有限公司;HP-INNOWAX毛细管色谱柱、5500原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)、7890A气相色谱仪 美国Agilent公司;OHpak SB-806M HQ凝胶色谱柱 日本Shodex公司;DAWN HELEOS-II多角度激光光散射检测器、OPtilab rex示差折光检测器 美国Wyatt技术公司;UV2600紫外-可见分光光度计 日本岛津仪器设备公司;Nicolet IS50傅里叶变换红外光谱仪 美国Thermo Fisher科技公司;X’ pert3 and Empyrean X射线衍射(X-ray diffraction,XRD)仪 荷兰Panalytical公司;Nova NanoSEM 230场发射扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM) 美国FEI公司。
1.3 方法
1.3.1 孔石莼多糖及其锌络合物的理化性质及结构表征
1.3.1.1 孔石莼多糖的单糖组成分析
采用气相色谱-质谱联用(gas chromatographymass spectrometer,GC-MS)仪对孔石莼多糖的单糖组成进行分析,样品的酸解糖腈乙酰化衍生反应参考吕明霞[16]的研究。色谱条件为色谱柱:HP-INNOWAX(30 m×0.32 mm,0.25 μm);载气:N2;程序升温:起始温度190 ℃,2 ℃/min升至240 ℃后保持8 min,再以10 ℃/min升至260 ℃,保持2 min。质谱条件为:电子轰击电离(70 eV),离子源温度200 ℃,接口温度250 ℃,扫描范围:m/z 30~600。
国家防总充分发挥决策指挥调度和组织协调作用,国务院有关部门和国家防总成员单位主动承担防汛抗灾任务。在抗洪抢险的最艰难时刻,解放军、武警部队31位将军带领2.5万名官兵日夜奋战在抗洪抢险前线一线,累计解救、转移、安置群众17.1万人,加固堤坝850km,封堵渗漏、管涌2 500余处,充分发挥了主力军和突击队作用。
1.3.1.2 总糖质量分数测定
孔石莼多糖及其锌络合物总糖含量的测定参考冯学珍等[17]的苯酚-硫酸法,并略作修改。绘制葡萄糖的标准曲线,并计算得到回归方程,y=0.005 9x+0.025 5(R2=0.992 8),其中x为葡萄糖含量,y为溶液吸光度。
活灵魂:联结新旧世界的智利精品佳酿(Almaviva— an extraordinary Franco-Chilean journey),活灵魂酒庄是法国菲利普罗思柴尔德男爵公司与智利干露集团合作的结晶,出产兼具新旧世界“血统”的杰出佳酿,酒庄的首个年份(1996)是第一款采用法国酒庄概念酿造的智利葡萄酒,今年上海活动的大师班中,首席酿酒师Michel Friou(上图)带领爱好者们依次品鉴了包括1996年份在内共八个优异年份的活灵魂葡萄酒。
分别量取孔石莼多糖及其锌络合物样液2.0 mL,加入质量分数6%的苯酚溶液1.0 mL、浓硫酸5.0 mL,充分混匀,静置冷却30 min后,于490 nm波长处测定溶液的吸光度,根据葡萄糖标准曲线与吸光度计算得到两者的总糖含量。
1.3.1.3 凝胶渗透色谱-多角度激光光散射-示差检测器联用法分析
采用凝胶渗透色谱-多角度激光光散射-示差检测器体系(gel permeation chromatography-multi-angle laser light scattering-refractive index,GPC-MALLS-RI)对孔石莼多糖及其锌络合物的分子特征参数进行检测[18-19]。色谱条件为色谱柱:OHpak SB-806M HQ;流动相:0.1 mol/L NaCl;流速:0.5 mL/min;进样量:200 μL;样品质量浓度:1 mg/mL。
1.3.1.4 刚果红实验
2.1 年龄、病程、月经及生育 目前研究证实 ,年龄是EAOC的主要危险因素。一项根据台湾NHIRD数据库的研究结果显示,EAOC的IR随年龄的增长而增加,<30岁女性的IR为4.99/万。30~50岁女性的IR为35.81/万[4]。关于病程的影响尚无定论,普遍认为病程长恶变率高,但一项对台湾人群的研究表明,EAOC的发生不受子宫内膜异位症暴露时间的影响[5]。月经周期短、初潮早、绝经晚、孕产次低等因素可使经血逆流盆腔、排卵次数及上皮损伤概率提高,从而增加了子宫内膜异位症发生率,并且增加其恶变率。
采用刚果红实验分析孔石莼多糖及其锌络合物的螺旋构象[20]。将孔石莼多糖及其锌络合物分别配制成质量浓度为1 mg/mL的待测样液,分别与等体积的80 μmol/L刚果红溶液混匀后,加入1 mol/L NaOH溶液,梯度调节混合溶液中NaOH的浓度为0~0.50 mol/L,浓度梯度为0.05 mol/L,并测定各个NaOH浓度下混合溶液的最大吸收波长;空白对照以相同体积的蒸馏水取代待测样液,配制同样浓度NaOH的刚果红溶液,并测定其最大吸收波长。
1.3.1.5 紫外-可见光谱分析
分别称取适量孔石莼多糖及其锌络合物样品粉末,均配制成1 mg/mL的溶液,采用紫外-可见分光光度计进行扫描,对两者的结构特征进行初步表征,扫描范围为200~800 nm[21]。
1.3.1.6 傅里叶变换红外光谱分析
分别称取2 mg孔石莼多糖及其锌络合物样品粉末,与适量溴化钾粉末混合、研磨并压制成薄片,使用傅里叶变换红外光谱仪在400~4 000 cm-1范围内进行扫描[22],探究孔石莼多糖及其锌络合物的官能团特征。
1.3.1.7 XRD分析
采用XRD仪研究孔石莼多糖及其锌络合物的结构状态[23]。XRD条件为:管压45 kV,管流40 mA,阳极为Cu靶,最小步长0.001°,发散狭缝0.76 mm,扫描速率5°/min。
1.3.1.8 SEM观察
分别称取一定量的孔石莼多糖及其锌络合物样品粉末,粘着于样品台上,置于真空喷镀仪内镀导电膜,使用SEM对孔石莼多糖及其锌络合物的表面形貌进行观察[24]。
1.3.1.9 AFM观察
数据采用SPSS Statistics 17.0软件分析,不同处理间差异显著性检验采用 Duncan法(P<0.05)。
分别配制质量浓度为10 μg/mL的孔石莼多糖及其锌络合物溶液,各取5 μL样液滴于新剥离的云母片表面,静置,待其风干后采用AFM通过轻敲模式对两者分子的微观形貌进行观测[25]。
1.3.2 孔石莼多糖锌体外降血糖活性测定
1.3.2.1 α-葡萄糖苷酶抑制能力测定
企业签约服务模式适用于后方陆域狭小和未建设船舶污染物接收设施的码头。因为多数码头在建设阶段,通常仅考虑港口生产、人员生活产生的污染物的接收和处置,没有考虑营运期船舶污染物的接收情况;老旧码头新建船舶污染物接收处置设施多数受场地制约。船舶污染物接收单位主要接收船舶残油、含油污水和船舶垃圾。企业签约服务模式是目前主流的模式,具有企业负担小的优点。如莆田的东吴和秀屿港区由莆田市海神船务有限公司负责含油污水的接收工作。
参考陈浩[26]的实验方法,稍作修改。取孔石莼多糖及其锌络合物分别配制成质量浓度依次为5、10、15、20、25 mg/mL的待测样液;采用100 mmol/L、pH 6.8的磷酸钠缓冲液分别配制5 mmol/L的PNPG溶液与0.1 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液。分别移取50 μL待测样液于96 孔板孔中,各加入50 μL PNPG溶液,于37 ℃下温孵10 min,各加入50 μL α-葡萄糖苷酶溶液,置于酶标仪中37 ℃反应30 min后,于405 nm波长处测定其吸光度A1。以等体积蒸馏水取代待测溶液,测定其吸光度A0;以等体积磷酸钠缓冲液取代α-葡萄糖苷酶溶液,测定其吸光度A2,以等体积蒸馏水和磷酸钠缓冲液分别取代待测溶液和α-葡萄糖苷酶溶液,测定其吸光度A3。用式(1)计算抑制率。
   
1.3.2.2 α-淀粉酶抑制能力测定
采用DNS比色法[27]进行检测,并略作修改。将孔石莼多糖及其锌络合物分别配制成质量浓度为5、10、15、20、25 mg/mL的待测样液;采用25 mmol/L、pH 6.9的磷酸盐缓冲液分别配制10 U/mL的α-淀粉酶溶液和质量分数1%的可溶性淀粉溶液。向各试管中分别加入300 μL不同质量浓度的待测溶液及300 μL的α-淀粉酶溶液,混合均匀,于37 ℃下温孵15 min,再分别加入300 μL可溶性淀粉溶液开始反应,15 min后再各加入500 μL DNS试剂显色,并立即煮沸灭酶10 min终止反应;将混合体系定容至10 mL,于540 nm波长处测定其吸光度A1。以等体积蒸馏水取代待测溶液,测定其吸光度A0;以等体积磷酸盐缓冲液取代α-淀粉酶溶液,测定其吸光度A2,以等体积蒸馏水和磷酸盐缓冲液分别取代待测溶液和α-淀粉酶溶液,测定其吸光度A3。用式(2)计算抑制率。
   
1.4 数据处理与统计分析
采用DPS V7.05软件对实验数据进行方差分析,各数据之间的多重比较使用最小显著性差异法,其中,以P>0.05为差异不显著,P<0.05为显著,P<0.01为极显著。使用Microsoft Excel 2007软件绘图。
2 结果与分析2.1 孔石莼多糖及其锌络合物的理化性质及结构表征
2.1.1 孔石莼多糖的单糖组成分析结果
采用GC-MS分析孔石莼多糖的单糖组成(图1),通过与单糖标准品保留时间与离子碎片进行对比,确定孔石莼多糖是由鼠李糖、岩藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成的杂多糖,其构成单糖基的物质的量比为1.00∶0.06∶0.93∶0.45∶2.29∶0.07。
     
图1 标准单糖(a)与孔石莼多糖(b)的色谱图
Fig. 1 Chromatograms of monosaccharide standards (a) and Ulva pertusa polysaccharides (b)

2.1.2 总糖质量分数测定结果
教学性的比较主要考察例题呈现方式和引导学生思考两个方面.例题多样化的呈现方式(文字、图表、符号),会对学生数学问题解决产生深刻影响[10],因此,例题表征形式的多元化非常重要.引导学生思考主要关涉教材如何启发、点拨、导引学生去发现问题、分析问题并解决问题.其比较结果如表4所示.
苯酚-硫酸法测定孔石莼多糖及其锌络合物的总糖含量。经计算,孔石莼多糖和孔石莼多糖锌中总糖质量分数分别为53.35%和49.40%,可以看出经过络合锌改性,孔石莼多糖中的总糖含量有所下降。
2.1.3 GPC-MALLS-RI分析结果
表1 孔石莼多糖及其锌络合物的分子特征参数
Table 1 Molecular parameters of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex
     
分子特征参数 孔石莼多糖 孔石莼多糖锌数均分子质量Mn/(g/mol) 3.050×105 6.223×104重均分子质量Mw/(g/mol) 4.903×105 1.319×105 z均分子质量Mz/(g/mol) 1.123×106 5.921×105多分散指数Mw/Mn 1.607 2.120数均均方根旋转半径Rn/nm 35.3 28.1重均均方根旋转半径Rw/nm 35.6 28.6 z均均方根旋转半径Rz/nm 36.5 31.1

表1数据显示,孔石莼多糖锌的重均分子质量(Mw)为1.319×105 g/mol,重均均方根旋转半径(Rw)为28.6 nm,均明显低于孔石莼多糖的Mw(4.903×105 g/mol)和Rw(35.6 nm),而多分散指数(Mw/Mn)为2.120,明显高于孔石莼多糖的(1.607)。该结果说明经过络合锌反应,孔石莼多糖锌的分子质量、分子尺寸明显减小,而分子质量分布则较原多糖变宽,与Wei Dongfeng等[28]在制备红芪多糖硒络合物时得到的结果相似,推测可能是制备时反应体系使用稀盐酸调节pH值,由于盐酸为强酸,故导致络合反应过程中部分多糖发生了降解。
易非呆呆地站着,妈却自己醒了,她拍了拍枕头,说:“睡呀,非。”妈喊他们仨都是只喊一个字,“易非”喊“非”,“向南”喊“南”。
城市过程中,为了一味地追求经济的快速发展,同时一些地方政府为了追求自身的业绩,不惜以破坏环境为代价高速发展当地的经济,大力拓展城市面积。片面追求建设的高速度,这种做法忽视了城市建设的规律,造成了政府资金的浪费,同时也没有发挥城市的综合性作用,是一种片面的建设思想。
     
图2 孔石莼多糖(a)及其锌络合物(b)的空间构象
Fig. 2 Spatial conformation of Ulva pertusa polysaccharides (a) and polysaccharides-zinc complex (b)

图2 为孔石莼多糖及其锌络合物的分子质量与均方根旋转半径之间的关系曲线图,可显示样品的多糖链构象[29]。从图2中可看出,孔石莼多糖及其锌络合物的谱图线性关系均较差,两者均呈类似U型的曲线,提示两者的分子构象均为高支化度结构,该现象与曾红亮[30]对金柑多糖的GPC-MALLS-RI分析结果类似。
2.1.4 刚果红实验结果
     
图3 孔石莼多糖及其锌络合物与刚果红反应体系的最大吸收波长
Fig. 3 Congo-red reactions of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex

刚果红能够与具有三螺旋结构的多糖发生络合反应,与刚果红溶液相比,络合物的最大吸收波长发生红移,并在一定的NaOH浓度范围内呈现亚稳性[31]。从图3中可看出,刚果红与孔石莼多糖混合后,其最大吸收波长发生了明显的红移,且在NaOH浓度0.15~0.50 mol/L范围内无明显变化,出现了亚稳区,而刚果红与孔石莼多糖锌混合溶液的最大吸收波长则没有出现这种特征的明显变化。由此可推测孔石莼多糖具有三螺旋结构,而其锌络合物中的孔石莼多糖的三螺旋结构基本被破坏。
2.1.5 紫外-可见光谱分析结果
两组均予以血液检验,采用EDTA2钾抗凝管,抽静脉血两毫升(真空采血),,使用SYSMEX全血细胞分析仪检测,严格按SOP进行操作。
     
图4 孔石莼多糖及其锌络合物的紫外-可见光谱图
Fig. 4 UV-VIS spectra of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex

由图4可知,两条曲线在260、280 nm波长处均无吸收峰,且孔石莼多糖锌在紫外区的吸收强度明显小于孔石莼多糖,说明孔石莼多糖及其锌络合物均基本不含有核酸和蛋白质,且络合物中的生色基或助色基与Zn2+发生络合反应[32],形成了化学键束缚,从而导致紫外吸收强度有所减弱。
2.1.6 傅里叶变换红外光谱分析结果
由图5可知,孔石莼多糖在2 981.46 cm-1处的峰为甲基(—CH3)中C—H非对称伸缩振动的吸收峰,1 621.20 cm-1处的峰为羧基(—COO-)中C=O非对称伸缩振动的吸收峰,1 230.86 cm-1处的峰为硫酸基(—OSO3-)中S=O的伸缩振动峰;经过络合锌反应,这3 处峰分别移动至2 992.55 、1 632.91、1 215.40 cm-1处,提示络合锌改性对孔石莼多糖的这些基团造成了一定的影响;此外,图4还显示,孔石莼多糖锌在1 391.89 cm-1与997.03 cm-1处较其原多糖多出两个特征峰。综上可知,孔石莼多糖络合锌的反应主要体现在其糖链上的—COO-、—CH3、—OSO3-等基团与Zn2+发生反应,而非简单的物理混合。
     
图5 孔石莼多糖及其锌络合物的傅里叶变换红外光谱
Fig. 5 Fourier transform infrared spectra of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex

2.1.7 XRD分析结果
     
图6 孔石莼多糖及其锌络合物的XRD图
Fig. 6 X-ray diffraction patterns of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex

从图6中可看出,孔石莼多糖及其锌络合物均只在20°左右存在一不明显的包峰,且多糖锌的包峰强度高于原多糖的,但并未发现硫酸锌的特征衍射峰,提示二者均为无定形结构,同时再次证明孔石莼多糖与Zn2+确实发生了络合作用,推测Zn2+可能均匀地分散在孔石莼多糖的糖链上,生成络合物。
王良指出,制定新旧动能转换促进条例是贯彻落实省委重大决策部署的重要举措,省人大常委会高度重视这项立法。这次立法调研,有关部门、单位、企业和人大代表等各方面结合实际提出了一些很有针对性、建设性的意见建议,对修改完善三件法规草案具有很好的参考作用。王良要求省人大法制委员会和常委会法工委对有关问题进行深入研究论证,积极吸收采纳这些意见建议,把法规草案修改好完善好,确保法规立得住、行得通、真管用,为推进全省新旧动能转换重大工程,实现高质量发展等提供良好法治保障。
2.1.8 SEM观察结果
从图7a1、b1中可发现孔石莼多糖与其锌络合物均呈层叠堆积的片状,表面较为平整,但两者的形貌均无规整性,参考相关文献的研究结果,推测该现象可能是由于分子链之间互相交联聚集形成的[33-34],提示两样品的分子间均存在很强的相互作用,且均呈无定形结构,与XRD分析中得到的结果相符;此外,两者均含多孔的蜂巢状结构,这可能是冻干过程中冰晶升华而形成。通过对比图7a2与b2,可发现孔石莼多糖表面较为光滑、紧密,而其锌络合物则较为粗糙,存在许多龟裂,两者表面均存在一些较小的碎屑状颗粒,但孔石莼多糖锌表面的颗粒物明显多于孔石莼多糖,由此亦可推断,孔石莼多糖除了与Zn2+之间发生络合反应外,还可能存在物理吸附现象。
     
图7 孔石莼多糖(a)及其锌络合物(b)在不同放大倍数下的SEM图
Fig. 7 SEM images of Ulva pertusa polysaccharides (a) and polysaccharides-zinc complex (b)

2.1.9 AFM分析结果
黑龙江农垦齐齐哈尔管理局依安农场始建于1956年,耕地8.5万亩,人口5000多人。经过60多年几代农场人的艰苦奋斗,如今农业结构调整基本到位,城镇建设管理日趋完善,职工生活水平普遍高于区域平均水平,打造富裕、文明、和谐、亮丽的花园式农场初步实现,先后获得国家生态示范区、省优美城镇、省平安农场、省级文明单位、省优秀企业等多项荣誉。
     
图8 孔石莼多糖(a)及其锌络合物(b)在AFM下的照片
Fig. 8 Atomic force microscopic images of Ulva pertusa polysaccharides (a)and polysaccharides-zinc complex (b)

由图8可知,孔石莼多糖及其锌络合物分子链的大小、形状均不均等,呈山峰状、链状颗粒,两样品的分子链宽度在几十至几百纳米不等,明显大于天然多糖分子链的宽度(0.1~1 nm),证明两样品的分子均是由多股糖链互相交联缠结形成的聚集体,该现象与Wang Kaiping等[35]的研究结果相似;对比两者的谱图还可看出,孔石莼多糖分子聚集体整体分布相对较为均匀,高度约为1~2 nm左右,体积较小;而孔石莼多糖锌分子聚集体明显较原多糖的大,且整体分布参差不齐,聚集体高度分布在2~7 nm范围,体积较大,此现象与黄靖等[23]在观察肉苁蓉多糖锌络合物时得到的相似,提示经过络合改性,孔石莼多糖分子的团聚性增强。
2.2 孔石莼多糖及其锌络合物的体外降血糖活性
2.2.1 α-葡萄糖苷酶抑制能力测定结果
     
图9 孔石莼多糖及其锌络合物对α-葡萄糖苷酶的抑制效果
Fig. 9 Inhibitory effects of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex on α-glucosidase

如图9所示,孔石莼多糖及其锌络合物样液均在质量浓度大于5 mg/mL时才体现对α-葡萄糖苷酶的抑制活性,且两者的抑制率均随质量浓度的增加而极显著增大(P<0.01)。相同质量浓度下,孔石莼多糖锌的抑制率显著或极显著大于原多糖(P<0.05或P<0.01)。当质量浓度为25 mg/mL时,孔石莼多糖及其锌络合物样液对α-葡萄糖苷酶抑制率均达到最大值,分别为(26.64±0.95)%、(54.66±1.20)%。经计算,两者抑制α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)分别为42.87、23.63 mg/mL;IC50越小,抑制能力越强,可知同条件下,孔石莼多糖锌样液对α-葡萄糖苷酶的抑制能力是孔石莼多糖样液的1.81 倍。
2.2.2 α-淀粉酶抑制能力测定结果
     
图10 孔石莼多糖及其锌络合物对α-淀粉酶的抑制效果
Fig. 10 Inhibitory effects of Ulva pertusa polysaccharides and polysaccharides-zinc complex on α-amylase

从图10中可以看出,相同质量浓度下,孔石莼多糖锌的抑制率极显著大于原多糖(P<0.01)。孔石莼多糖及其锌络合物样液对α-淀粉酶的抑制率均在质量浓度为25 mg/mL时达到最大值,分别为(46.34±1.20)%、(76.94±0.73)%。经计算,两者抑制α-淀粉酶的IC50分别为27.22、10.66 mg/mL,可知同条件下,孔石莼多糖锌样液对α-淀粉酶的抑制能力达到孔石莼多糖样液的2.55 倍。
3 结 论
本研究以实验室自制的孔石莼多糖为试材,制备孔石莼多糖锌络合物,采用GS-MS、GPC-MALLS-RI、刚果红实验、紫外-可见光谱、傅里叶变换红外光谱、XRD、SEM、AFM等对孔石莼多糖及其锌络合物进行结构表征,并通过α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制实验比较两者的体外降血糖活性,探究络合锌改性对孔石莼多糖结构与重要生物活性的影响,主要结论如下:1)孔石莼多糖是由鼠李糖、岩藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成的杂多糖,其中各单糖基的物质的量比为1.00∶0.06∶0.93∶0.45∶2.29∶0.07;经过络合锌反应,产物中孔石莼多糖的总糖质量分数有原来的53.35%下降至49.40%。2)GPC-MALLS-RI分析结果显示,孔石莼多糖锌的分子质量、分子尺寸较原多糖明显减小,但分子质量分布范围明显变宽,两者的构象均为高支化度结构;刚果红实验结果显示,经过络合锌改性,产物中孔石莼多糖的三螺旋结构基本消失。3)结合紫外-可见光谱与红外光谱检测结果推测,孔石莼多糖中的—COO-、—CH3、—OSO3-等基团与Zn2+发生了反应;XRD检测结果表明,孔石莼多糖及其锌络合物均为无定形结构,且Zn2+高度分散在后者的糖链上。4)SEM观察结果提示,孔石莼多糖及其锌络合物的表面形貌产生明显差异,孔石莼多糖与Zn2+除了发生络合反应外,还可能存在物理吸附现象;AFM结果显示,孔石莼多糖锌的分子形貌较原多糖的发生了明显变化,其分子团聚性显著增强,分子聚集体尺寸明显增大,且整体分布差别变大。5)孔石莼多糖及其锌络合物在实验的质量浓度范围内均具有一定的体外降血糖活性,且存在量效关系;相同质量浓度下,孔石莼多糖锌对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制率均显著或极显著(P<0.05或P<0.01)高于孔石莼多糖,前者的抑制能力分别是后者的1.81、2.55 倍。推测可能是经过络合反应,孔石莼多糖的活性基团与Zn2+产生了协同作用,从而增强了其体外降血糖活性。此外,在络合过程中多糖发生了部分降解,使得更多的活性基团得到暴露,亦可能是孔石莼多糖锌体外降血糖活性强于原多糖的原因之一。
综上,络合锌改性使孔石莼多糖锌的分子结构特征较原多糖发生明显改变,体外降血糖活性显著增强,其作为一种新型的多糖补锌剂,具有广阔的开发前景。
对“物资采购、工程建设、合资合作、油品销售”等对外交易重点领域缺乏有效的监管措施,存在潜在的违规风险隐患;对商业伙伴的合规管理,限于资质审查,对于商业伙伴的合规情况,调查较少,有的项目甚至没有进行合规调查。
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Structural Characterization and Hypoglycemic Activity in Vitro of Ulva pertusa Polysaccharides-Zinc Complex
TANG Chenpeng, LÜ Feng*, WANG Ronglin
(College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)
Abstract: The physicochemical properties and structure of Ulva pertusa polysaccharides before and after complexation with zinc ions were determined by gas chromatography-mass spectroscopy, gel permeation chromatography-multi-angle laser light scattering-refractive index detection, Congo-red test, ultraviolet-visible (UV-VIS) spectroscopy, infrared spectroscopy, X-ray diffraction, scanning electron microscopy (SEM) and atomic force microscopy. The inhibitory effect of the polysaccharidezinc complex on α-glucosidase and α-amylase was investigated. Results showed that Ulva pertusa polysaccharides were composed of rhamnose, fucose, xylose, mannose, glucose and galactose, with a molar ratio of 1.00:0.06:0.93:0.45:2.29:0.07.After the complexation reaction, the molecular mass and total sugar content of the polysaccharides were decreased, and the triple-helical structure disappeared. Zn2+ reacted with -COO-, -CH3, - in the polysaccharides. The surface morphology of Ulva pertusa polysaccharides changed apparently, the molecular size was decreased, and the molecular aggregation ability was enhanced after complexation with zinc ions. The inhibitory effect of Ulva pertusa polysaccharides-zinc complex on α-glucosidase and α-amylase was stronger than that of the native polysaccharides. These results con fi rmed that the structure of Ulva pertusa polysaccharides changed obviously after complexation with zinc ions, and the hypoglycemic activity in vitro was enhanced.
Keywords: Ulva pertusa polysaccharide-zinc complex; structural characterization; hypoglycemic activities in vitro

收稿日期:2019-03-20
基金项目:福建省自然科学基金项目(2018J01695)
第一作者简介:汤陈鹏(1994—)(ORCID: 0000-0002-4106-9659),男,硕士研究生,研究方向为食品化学与营养。E-mail: 475629233@qq.com
*通信作者简介:吕峰(1964—)(ORCID: 0000-0001-7948-1414),女,教授,博士,研究方向为天然产物的综合利用、农产品加工及贮藏。E-mail: 1245075427@qq.com
DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190320-263
中图分类号:TS201.2
文献标志码:A
文章编号:1002-6630(2020)07-0052-07
引文格式:汤陈鹏, 吕峰, 王蓉琳. 孔石莼多糖锌结构表征与体外降血糖活性[J]. 食品科学, 2020, 41(7): 52-58. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190320-263. http://www.spkx.net.cn
TANG Chenpeng, LÜ Feng, WANG Ronglin. Structural characterization and hypoglycemic activity in vitro of Ulva pertusa polysaccharides-zinc complex[J]. Food Science, 2020, 41(7): 52-58. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190320-263. http://www.spkx.net.cn




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