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表面等离子体共振免疫传感器检测喹乙醇表面等离子体共振免疫传感器检测喹乙醇 谢春花1，柳 双1，王敏思1，王霞琳1，王 珅1，张志军2，宋 洋1,* （1.天津师范大学生命科学学院，天津市动植物抗性重点实验室，天津 300387；2.国家农产品保鲜工程技术研究中心（天津），天津市农产品采后生理与贮藏保鲜重点实验室，天津 300384） 摘 要：建立一种基于竞争形式的灵敏、稳定的表面等离子体共振免疫传感器，并用于检测饲料和水产养殖水样中的喹乙醇（olaquindox，OLA）。根据本研究的方法，OLA的灵敏度和检出限分别为4.7 µg/L和0.5 µg/L。用2.5 mmol/L NaOH溶液再生效果最好，芯片可重复利用60 次，检测时间为10 min。OLA与结构类似物的交叉反应结果显示了高灵敏度和良好特异性。在鱼、虾饲料和水产养殖水样的添加回收实验中均获得良好的回收率（84.7%～99.3%）和变异系数（1.2%～10.1%）。对饲料和养殖水实际样品进行测定，结果检测到2 个阳性样品，鱼养殖水与鸡饲料中OLA质量浓度分别为5.0、6.1 µg/L。该方法可以高效地检测大批量饲料和水样的OLA，具有检测时间短、检出限低、准确灵敏、操作简便等优点。 关键词：喹乙醇；表面等离子体共振；免疫传感器；饲料；养殖水 喹乙醇（olaquindox，OLA）是一种化学合成的生长促进剂而不是抗生素药物，可促进机体蛋白质合成代谢，提高饲料能量利用率，因此加快了生长发育，提高了个体瘦肉率[1-3]。尽管当时缺乏毒性和潜在机制的证据，OLA仍被广泛用作猪的饲料添加剂，以提高饲料转化效率[4-6]。近年来，在水产饲料中，OLA曾被称为“水产养殖瘦肉精”[7-8]。研究表明，大剂量的OLA可对动物产生毒性作用，并且OLA在体内累积，当在动物体内积累到一定程度时，会对动物和人类造成致畸、致癌和致突变作用。然而，该药物的毒性根据动物的种类不同变化很大。OLA对家禽和鱼类具有显著的毒性[9]和特定的遗传毒性[10]。因此，欧盟自1999年以来完全禁止使用OLA[11-12]。2018年1月11日，农业部第2638号公告公布，自2018年5月1日起，限制使用OLA[13]。澳大利亚允许猪和禽肉中OLA的最大残留限量为300 µg/kg[14]。在日本，猪肉、鸡肉和其他动物的OLA最大残留限量控制在300 µg/kg之内。 二是突出“支部”。主题党日活动能否见成效，重点在党支部，关键在支部书记。支部书记作为主题党日活动的策划者、组织者和执行者，其重视程度、能力水平、履职情况直接影响到活动的质量和成效，抓党日活动就要抓好 “领头雁”。支部书记要切实强化责任，自觉把落实党日制度作为加强党的基层组织建设的经常性基础性工作，像抓中心工作一样抓好党日活动的策划组织、检查督促、考核推动。 目前表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）技术被广泛用于食品安全检测。Karczmarczyk等[15]研究了一种基于竞争性免疫测定的策略，使用与酶（碱性磷酸酶）结合的二抗作为标记，改良的金丝网印刷电极（screen-printed gold electrode，AuSPE）对霉菌毒素（赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素M1）进行伏安检测，检出限到µg/L级别。Amjadi等[16]建立了基于银纳米棱柱（Ag nanoprisms，AgNPRs）的形态转化开发了一种灵敏的比色探针检测超痕量Se（IV），检出限为1.2 µg/L。该方法用于水和食品样品的分析。Song Yang等[17]使用PH-BSA固定的传感器芯片的SPR免疫测量苹果、桃子、卷心菜等样品中的亚胺硫磷残留量，样品的最低检出限为1.6 ng/L。赵芳等[18]采用表面自组装技术在金膜的表面修饰羧基基团，将玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）抗原与牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）偶联物（ZENBSA）通过共价键固定在芯片的表面，采用竞争法检测样品中的玉米赤霉烯酮毒素，检出限为8.2 µg/L。Pan Mingfei等[19]基于抑制形式制备了可重复的SPR免疫传感器，用于稳定和灵敏地检测动物源性食品中的4 种磺胺类药物，对纯牛奶、鸡蛋、鸡肉、牛肉与鱼样品进行检测，检测周期可在不到5 min内完成，每个SPR芯片可重复使用300 个分析周期。Zhang Lili等[20]以4-乙烯基苯硼酸为功能单体，聚乙二醇丙烯酸酯和2,2’-偶氮异丁基脒盐酸盐为交联剂和引发剂，制备了卡那霉素分子印迹SPR传感器对奶粉和蜂蜜中的卡那霉素进行检测。与非印迹传感器相比，印迹传感器对卡那霉素具有更好的印迹效果和选择性。潘明飞等[21]针对花生中高毒污染物黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1），开发一种可再生循环使用的抑制型SPR免疫传感器。该实验检出限（IC15）为0.004 9 µg/L，灵敏度（IC50）达到0.025 µg/L；对花生样品中AFB1的检出限（IC15）和灵敏度（IC50）分别达到0.13 µg/kg和0.74 µg/kg。 用于检测OLA免疫分析方法研究[22-24]有很多。Zhao Dan等[25]开发了用于测定动物饲料样品中OLA的高灵敏度和特异性间接竞争性酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）。OLA由N’N-羰基二咪唑激活并与BSA和卵清蛋白（ovalbumin，OVA）偶联。发现两种抗血清的灵敏度和特异性非常相似，IC50值分别为16 ng/mL和19 ng/mL。Zhao Dongyan等[26]通过使用亲水性分子印迹薄膜引入了一种替代生物抗体的新方法，开发了一种快速、新型的直接竞争仿生ELISA法测定雏鸡饲料中的OLA。在最佳条件下，灵敏度（IC50）和检出限（IC15）分别为（700f60）µg/L和（17.0f1.6）µg/L。Le Tao等[27]开发了免疫色谱（immunochromatography，ICG）条带，用于同时定量测定动物饲料中的5 种喹喔啉-1,4-二氧化物。为此目的，将具有基团特异性喹喔啉-1,4-二氧化物的多克隆抗体（PcAb）与胶体金颗粒缀合，作为ICG条带的检测试剂以测试喹喔啉-1,4-二氧化物。该方法在5～10 min内实现了喹喔啉-1,4-二氧化物的半定量检测。喹烯酮、喹赛多、卡巴氧、痢菌净和OLA条带的视觉下检出限分别为10、15、15、20 ng/mL和20 ng/mL。使用ICG条带读数器，对于喹烯酮、喹赛多、卡巴氧、痢菌净和OLA，分别计算IC50为9.1、13.5、16.6、20.2 ng/mL和21.3 ng/mL。Pei Xingyao等[28]建立了一种简单、快速、超灵敏、定量的金免疫层析法，用于分析动物饲料样品和地表水样品中的OLA，优化方法的IC50为饲料3.35 μg/L，环境水0.35 μg/L。Peng Tao等[29]基于荧光微球的ICG法已被建立用于同时检测环境水和动物食品中的5 种经典喹喔啉。在最佳条件下，它在15 min内实现了对5 种喹喔啉的定性和定量检测。环境水和动物食品中5 种喹喔啉的目测检出限分别为5～15 µg/L和100～250 µg/kg。 本实验拟建立一种基于SPR的免疫传感器，用于高效灵敏地检测动物饲料和水产养殖水中的OLA。基于全抗原芯片的SPR免疫传感器，并对实际样品进行测定。此外，针对芯片的寿命，对同源的单、多克隆OLA抗体结合芯片的稳定性进行比较。该实验可为实际样品中OLA的检测提供理论支持。 1.1 资料来源 采取整群随机抽样的方式随机选取2012年6月-2015年6月隆德地区2 050名3～6岁学龄前儿童为研究对象，在征得家长知情同意的情况下，进行视力情况检测和视力异常影响因素调查。视力异常影响因素调查采用自制问卷调查表，问卷调查采用国家卫计委制定的筛查表格，问卷调查登记内容包括家庭情况，父母及儿童一般情况，儿童出生状况及日常生活习惯，儿童日常饮食情况，家长对眼保健知识知晓情况，家长对孩子视力的保护行为等。 1 材料与方法1.1 材料与试剂饲料样品 天津市购；水样由天津市多个饲养池采集。 OLA（纯度99%）、喹烯酮（纯度99.6%）、卡巴多（纯度98.8%）、盐酸克伦特罗（纯度98%）、氯霉素（纯度99.9%） 美国Sigma Aldrich公司；乙酰甲喹（纯度97%） 加拿大TRC公司；1-(3-(二甲基氨基)丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基-琥珀酰亚胺（N-hydroxy-succinimide，NHS）、1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺（ethanolamine, 1-ethyl-3-(3-(di methylamino)propyl) carbodiimide，EDC）、乙醇胺（ethanolamine，EA）、10 mmol/L乙酸盐、10 mmol/L磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）、甘氨酸（Gly）-HCl（10 mmol/L）、HCl、NaOH Harmonia Testing Technology天津股份有限公司。用PBS制备1.0h102 mg/L OLA储备溶液并在25 ℃贮存。其他用甲醇稀释至500 mg/L的结构类似物，在4 ℃贮存。 今天，西安交大一附院胸外科通过一系列围手术期措施的改进，有效降低了肺部并发症的发生，从而促进了患者的快速康复。“在ERAS实践中，他们不但跟着规范走，还做了大胆的创新，形成了很好的经验，在行业树立了较好的标杆。”西安交大一附院院长施秉银对胸外科的实践赞不绝口。 OLA-OVA质量浓度为5.0 mg/mL，抗OLA抗体（单克隆和多克隆抗体）质量浓度均为4.3 mg/mL，由天津师范大学动植物抗性重点实验室制备。 1.2 仪器与设备BIAcore 3000 SPR仪 美国GE公司；羧甲基化葡聚糖CM5芯片 德国Xantec公司；高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪 美国Thermo Finnegan公司。 1.3 方法1.3.1 实验原理 3.90 后是新生代卡车司机，与前辈们不同，他们更爱彰显个性，但也习惯动脑思考，接受新事物的能力更强。 1.2 喂养方法 正常喂养组给予正常标准饲料，高脂喂养组给予高脂饲料(脂肪供能45%)；饲料均由上海斯莱克实验动物有限责任公司饲料部提供。每天记录体质量和进食量，共喂养8周。喂养4周后， NF+LBBR组、HF+LBBR组及HF+HBBR组分别予低浓度小檗碱(150 mg·kg-1·d-1)、低浓度小檗碱(150 mg·kg-1·d-1)及高浓度小檗碱(380 mg·kg-1·d-1)灌胃4周；小檗碱以0.5%羧甲基纤维素钠[生工生物工程(上海)股份有限公司]配至所须浓度。HF组予0.5%羧甲基纤维素钠干预4周。 将处理过的CM5芯片放入SPR仪器中。在基线稳定后，使用10 mmol/L PBS作为运行缓冲液。将NHS和EDC混合物注入仪器中以激活CM5芯片表面上的葡聚糖，注入OLA-OVA进行抗原的固定化。CM5芯片表面的葡聚糖活化后暴露出大量的羧基可以与OLA-OVA蛋白的氨基形成肽键，从而使OLA-OVA固定于芯片表面，用EA溶液封闭未结合的羧基位点。空白通道也做相应的处理。当目标抗体流过芯片表面时，抗体将特异性地与OLA-OVA结合，每次结合后用适合的再生液再生，再生液可以将结合的抗体与抗原断开，记录结合抗体后SPR信号的变化。流程如图1所示。  图1 SPR免疫传感器实验原理
Fig. 1 Schematic demonstration of the principle of the SPR immunosensor
1.3.2 SPR方法建立 1.3.2.1 预富集与抗原固定 在激活芯片之前，进行预富集实验以确定OLA-OVA稀释剂的pH值和质量浓度，以提高偶联效率并降低配体消耗。原理参考Lu Yang等[30]。预富集可以确定抗原OLAOVA的最佳质量浓度和pH值条件。在该实验中，分别用pH 5.0、4.5和4.0的乙酸钠缓冲液将OLA-OVA稀释200、100、50、25 倍和10 倍。PBS作为运行缓冲液，流速为10 µL/min，分别将不同的处理抗原以每次10 µL的体积注入反应池中，每次反应后，用50 mmol/L NaOH溶液进行冲洗，观察响应值，确定抗原稀释液pH值及质量浓度。 由网页端、手机移动端、微信公众平台三位一体的河长制信息化系统，将成为河长巡河、公众监督、流域管理的利器。其中，“人人护水APP”将成为促进公众与政府、公众与企业互动的网络监督平台。 EDC/NHS混合注入70 µL，活化芯片表面，将预富集选好的最适抗原质量浓度及pH值的抗原固定于芯片表面，PBS为运行缓冲液，流速10 µL/min，每次注入10 µL，根据固定的效果决定抗原固定量，用70 µL的EA封闭未偶联抗原的羧基，稳定基线10 min。 1.3.2.2 结合实验 使用10 mmol/L PBS作为运行缓冲液。将抗体分别稀释1 000、800、600、400 倍和200 倍，设置流速为20 µL/min，注射量为60 µL，解离时间为300 s，注入仪器与芯片表面的OLA-OVA进行结合。通过响应值判断结合程度，从而确定抗体的最佳质量浓度。每个质量浓度进行3 次注射，每次结合后用再生溶液进行再生，同时选择最佳再生溶液。在相同条件下，在注射抗体之前注射PBS作为对照组。 1.3.2.3 竞争实验 3.2.1推动种植业提质增效 推动长江流域省市加快粮食生产功能区和重要农产品保护区划定，高标准农田建设资金优先支持长江经济带流域第一批完成“两区”划定任务县。支持长江经济带11省(市)建立健全耕地质量监测网络，开展耕地质量调查评价，实施耕地轮作休耕试点。开展绿色高质高效创建，集成全环节绿色高效技术，构建全过程社会化服务体系，打造全链条产业融合模式。支持发展节水农业，培育推广耐旱品种，因地制宜推广管道输水等高效灌溉技术。 用PBS稀释OLA，使质量浓度为128、64、32、12、6、4、2、6 µg/L和0.1 µg/L。使用10 mmol/L PBS作为运行缓冲液，速率为20 µL/min。不同质量浓度OLA标准品和抗体以体积比1∶1混合，注射体积为60 µL，解离时间为300 s。通过响应值绘制OLA-OVA和OLA与OLA-Ab的结合曲线。每个OLA质量浓度重复3 次。 从标准定义可以看出，t_source只是针对能够响应从帧的源设备的要求，但是RPT并不在此范围内。标准中关于RPT的性能要求描述详见IEC 61375-3-1-2012中的5.3.1章节。其中，与本文所描述问题相关的标准中的第一条，从字面上理解为，RPT能够识别数据帧的初始方向并能保持稳定时间T_ST=2.0 μs，即RPT在从A侧向B侧转发数据帧结束后的2.0 μs时间内将无法转发B侧发来的数据帧。这正是本文中描述的列车通信故障所处的工况：主设备BA与从设备D3分别位于RPT的A、B两侧，中继器从A侧接受了主帧转发到B侧，然后又将B侧发来的从帧转发到A侧。 1.3.3 芯片的再生 芯片再现性是验证所建立的方法是否实用的重要评估参数。本实验比较4 种再生溶液：pH 2.2 Gly-HCl、pH 2.0 Gly-HCl、500 mmol/L NaCl和2.5 mmol/L NaOH。在每次结合实验后，分别重复注射4 种再生溶液2 次。观察并比较SPR响应的变化，选择最佳再生液。 1.3.4 交叉反应 所有结构类似物用PBS稀释至5 000、1 000、200、40、8 µg/L和1.6 µg/L。本实验选择的OLA结构类似物为喹烯酮、卡巴多、盐酸克伦特罗、氯霉素和乙酰甲喹。用IC50计算交叉反应率，如下式所示： 随着我国油气产业的发展，剩余资源中“边、低、难”资源的占比越来越大，因此油气田开发的难度将进一步加大，一些深井、超深井已纳入必将实现的目标。套管作为连接地面和油气生产层的重要通道，其质量好坏直接影响着钻井安全和油气井的使用寿命[1]。在超深井下套管过程中，由于套管尺寸比较大，固封段长，所以井口的载荷大，给下套管作业带来了许多难题。因此必须采取相应的技术措施来保障下套管的顺利进行。 
1.3.5 样品前处理 由2017年中国最好大学排名对评价高校设置的门槛可知，参与其排名的医药类院校均满足“本科招生规模在100 名以上且近5年发表论文数量在100 篇以上”的标准。根据评价指标体系的设置，2017年中国最好大学排名主要以“人才培养(45%)”和“科学研究(40%)”两项核心指标对高校的发展实力进行评价，辅之以“服务社会(10%)”和“国际化(5%)”指标，共细分为9个指标观测点[5]；详见表1。参照二级指标的内涵对评价指标进行归类发现，2017年中国最好大学排名以投入性指标为主，完全采纳客观的定量指标，既包含体现规模、总量的数量指标，又含有反映效率、均量的质量指标[6]。 饲料从当地的超市购买，养殖水从天津的水产养殖场采集。在加标和回收实验之前，通过HPLC验证每个测试样品不含有OLA。 水样：（避光）取2 mL的水样于4 mL的离心管中，加入OLA储备液，使最终质量浓度为5、20 µg/L和40 µg/L。超声波60 ℃加热振荡15 min，然后过0.22 µm滤膜待测，每个质量浓度3 个平行。 饲料样品：（避光）称取1 g饲料于10 mL的离心管中，加入OLA储备液至5、20、40 µg/kg，加入2 mL水，60 ℃超声波加热15 min，以6 000 r/min离心10 min，取上清液。将上清液过0.22 µm滤膜后于4 ℃保存待测，每个质量浓度3 个平行。 1.3.6 样品测定 样品来自不同的超市与水产养殖场。样品处理同1.3.5节，不需添加OLA标准品溶液，处理后于4 ℃保存待测，每个样品重复测试3 次。 1.4 数据处理及图表绘制每组数据的平行组均为3 组，数据统计结果均为平均值，关于SPR的直接响应值结果，在SPR仪上使用专门的软件Biacore进行图表绘制，其他图表用Origin进行绘制。 2 结果与分析2.1 芯片预富集和抗原固定化预富集实验中，用pH 4.0乙酸钠稀释时，抗原固定的效果明显高于其他pH值，抗原稀释10 倍时，结合量与稀释25 倍没有明显的增加，结果表明，OLA-OVA用pH 4.0乙酸钠缓冲液稀释，OLA-OVA的最佳稀释倍数为25 倍。选择原则是条件尽可能温和且成本低。 用EDC/NHS激活芯片。用pH 4.0的乙酸钠溶液将OLA-OVA稀释25 倍，以与芯片表面上的羧基结合。当注射体积为60 µL时，结合趋势基本保持不变。图2显示了绑定OLA-OVA到芯片表面的结果。  图2 芯片表面抗原的结合
Fig. 2 Binding of antigen on the chip surface
2.2 抗体结合质量浓度的确定将不同质量浓度的OLA-Ab与已结合到芯片表面的OLA-OVA进行结合。通过分析相应的响应值图，当抗体稀释200～400 倍，结合趋势减慢。为降低成本，确定OLA-Ab的最佳结合质量浓度为10.8 mg/L（抗体稀释400 倍）。每个质量浓度重复3 次，每次结合后要进行芯片的再生，结合结果如图3所示。  图3 不同质量浓度的抗体与OLA-OVA结合
Fig. 3 Binding of different concentrations of antibodies to OLA-OVA
2.3 再生液的确定如图4所示，经过实验对比，不同pH值的Gly-HCl不能将抗体与抗原分离，基线不能回到起始值，再生效果不理想；NaCl基线可以，但每次再生效果不稳定；NaOH再生效果良好，基线基本平坦，结合水平基本稳定，因此确定2.5 mmol/L NaOH溶液是最合适的再生剂。 老常说：“这个真没什么印象了，他一直在驾驶室里不下来，又是晚上，灯光比较暗，而且那人好像还戴了一顶长长的鸭舌帽。我当时还奇怪，这么热的天还戴这帽子干什么？现在想起来就明白了，他根本就是不想让我们看到他的长相。”  图4 不同再生剂的结果
Fig. 4 Regeneration efficiencies of different regenerants
2.4 OLA标准曲线建立传感器的检测原理基于分析物与其抗原的间接竞争性免疫反应。将抗体与OLA混合，混合物注入传感器芯片中。通过SPR检测与OLA-OVA结合的抗体，从而将SPR获得的响应与OLA质量浓度相关联。在该实验中，将OLA-Ab（10.8 mg/L）与等体积不同质量浓度的OLA混合，注入反应池。为OLA-OVA与0、0.6、2、4、6、12、32、64、128 µg/L OLA之间竞争抗体的结果见图5。 2018年，香奈儿推出第三款自制机心，续写品牌传奇篇章。全新CALIBER 3机心以其精密复杂而不失精致考究的设计，突显标志性 BOY·FRIEND腕表简约纯粹的线条。  图5 OLA与OLA-OVA竞争结果
Fig. 5 Results of competition between OLA and OLA-OVA
图6显示了抑制程度和OLA质量浓度之间的依赖性曲线，证明了OLA对OLA-Ab和OLA-OVA之间结合反应的抑制。抑制程度取决于与OLA-Ab混合的游离OLA质量浓度的线性变化。在最佳条件下，线性检测范围为0.5～64.0 µg/L OLA，检出限为0.5 µg/L（RSN=3），检测时间为10 min。  图6 OLA的SPR检测拟合性曲线
Fig. 6 Standard curve for SPR detection of OLA
2.5 特异性确定用SPR方法测定抗体与OLA及其结构类似物的交叉反应评估抗体的特异性。从表1可以看出，OLA抗体与OLA结构类似物（喹烯酮、卡巴多、盐酸克伦特罗、氯霉素和乙酰甲喹）的交叉率均小于5%，表明该抗体可以特异性地识别OLA。 表1 SPR中OLA与OLA结构类似物的交叉反应
Table 1 Cross-reactivity of OLA with analogues in SPR  物质 结构式 IC50/（µg/L） 交叉率/%O-O N+OLA N OH H 4.7 100 N+O-O-O N+喹烯酮117.5 4 N+O-N O卡巴多N+ NN H+O ＞1 000 ＜0.01 O-OCl NH2盐酸克伦特罗H-Cl ＞1 000 ＜0.01 N H Cl OH O O OH氯霉素N+O-Cl ＞1 000 ＜0.01 Cl OH NH O- O乙酰甲喹N+188 2.5 N+O-
2.6 样品检测结果基质效应包括饲料中的维生素、蛋白质、脂肪和水产养殖水中的固体杂质和微生物。对于含有蛋白质和脂肪的鱼饲料和鸡饲料样品，通过离心、稀释和超滤可以简单地减少基质干扰。对于含有固体杂质和微生物的鱼养殖水和虾养殖水样，可以通过滤膜消除基质效应。 在养殖水和饲料样品中加入5、20、40 µg/L OLA标准品。如表2所示，养殖水样：回收率为84.7%～99.3%，变异系数（coefficients of variation，CV）为1.2%～8.3%。饲料样品：回收率为89.3%～93.4%，CV为2.3%～10.1%。实验测得鱼饲料、鸡饲料、鱼养殖水、虾养殖水中的测定灵敏度分别为8.9、8.7、5.5 µg/L和5.9 µg/L。证明该方法可以用于实际样品检测。 表2 SPR生物传感器在3 个水平下的样品回收率实验（n= 3）
Table 2 Recoveries for samples at three spiked concentration levels (n= 3)  样品 加标量 测定结果 回收率/% CV/%鱼养殖水5 µg/L （4.9f0.1）µg/L 98.0 2.0 20 µg/L （19.3f0.3）µg/L 96.5 1.6 40 µg/L （39.7f2.1）µg/L 99.3 5.3虾养殖水5 µg/L （4.2f0.4）µg/L 84.7 8.3 20 µg/L （18.7f0.8）µg/L 93.3 8.3 40 µg/L （38.6f0.5）µg/L 96.4 1.2鸡饲料5 µg/kg （4.5f0.5）µg/kg 89.3 10.1 20 µg/kg （18.2f1.2）µg/kg 90.8 6.3 40 µg/kg （37.2f1.1）µg/kg 93.0 3.0鱼饲料5 µg/kg （4.6f0.3）µg/kg 91.3 6.7 20 µg/kg （18.4f0.8）µg/kg 92.2 4.2 40 µg/kg （37.4f0.9）µg/kg 93.4 2.3
为验证该方法，同时用HPLC对样品进行添加回收实验，SPR与HPLC这2 种方法的检测结果呈线性关系，线性方程式为y=0.983 5x+0.152 8，相关系数为0.997 2，表明两种方法有较高的一致性。 建立的SPR方法用于检测不同来源实际样品水产养殖水和饲料中OLA的含量。多次检测结果，在鱼养殖水中，OLA质量浓度为5.0 µg/L，鸡饲料中OLA质量浓度为6.1 µg/L；虾养殖水与鱼饲料中均未检测到OLA，结果如表3所示。 表3 SPR方法检测实际样品的结果（n=3）
Table 3 Results for detection of OLA in actual samples with SPR (n= 3)  注：ND.未检测到。 样品 样品个数 质量浓度/（µg/L） 检出率/%鱼养殖水 8 5.0 70.0虾养殖水 8 ND 0鸡饲料 8 6.1 80.0鱼饲料 8 ND 0
2.7 芯片重复性实验对结合同源单、多克隆OLA抗体的芯片使用率进行了对比，表4表明，单克隆抗体的亲和性高于多克隆抗体，检测时间比较短，但结合同源多克隆OLA-Ab的芯片用2.5 mmol/L NaOH溶液再生60 次，活性衰减只有2.5%，而结合单克隆抗体的芯片同样再生15 次，芯片的活性衰减已经为11.7%，检出限与灵敏度也是多克隆抗体芯片比较好，因此，结合同源多克隆OLA-Ab，稳定性和芯片回收率较好，该实验芯片具有良好的重复性，可重复使用。 表4 多克隆OLA-Ab与单克隆OLA-Ab的对比
Table 4 Comparison of polyclonal OLA-Ab with monoclonal OLA-Ab  检出限/（µg/L）多克隆OLA-Ab 2.5h108 60 2.5 10 4.7 0.5单克隆OLA-Ab 1.3h108 15 11.7 9 5.3 0.7项目 亲和常数Ka/（L/mol）芯片寿命/次活性衰减/%检测时间/min IC50/（µg/L）
虽然单克隆抗体的亲和力更强，但多克隆抗体可以识别多个表位，即使少量抗原表位被破坏或抗原的构象发生变化，实验结果也不会受到影响，同时成本比较低，目前大多研究中均使用多克隆抗体进行实验，在我们的工作中，使用多克隆OLA-Ab。 3 结 论本实验开发了一种固定在CM5芯片表面的OLA-OVA的SPR生物传感器，用于检测饲料和水样中的OLA。该方法可以在样品中检测OLA时实现高效、快速、简便。样品检测可在10 min内完成，包括结合180 s、解离300 s和再生60 次。OLA质量浓度在0.5～64 µg/L内有良好的线性，建立了SPR标准曲线。结合同源多克隆OLA-Ab，SPR芯片良好的稳定性，可以重复使用60 个循环，响应值衰减小于5%。研究SPR对鸡饲料、鱼饲料、鱼养殖水和虾养殖水中OLA定量的测定，回收率为84.7%～99.3%，CV为1.2%～10.1%（n=3），并且该SPR方法与HPLC方法具有良好的一致性。而该方法的灵敏度是Zhao Dan等[25]采用间接竞争性ELISA检测OLA的3～4 倍，且成本低、时间短；是Zhao Dongyan等[26]采用新型的直接竞争仿生ELISA法测定雏鸡饲料中的OLA的136～161 倍；也比Le Tao等[27]开发的ICG条带检测法更灵敏，是它的4 倍；比Peng Tao等[29]基于荧光微球的ICG法建立的用于同时检测环境水和动物食品中OLA的方法，用的时间更短，检测更加灵敏。该SPR方法可用于全面快速和选择性检测饲料和水样品中OLA。 参考文献： [1] GUO W T, HAO H H, DAI M H, et al. Development of quinoxaline 1,4-dioxides resistance in Escherichia coli and molecular change under resistance selection[J]. PLoS ONE, 2012, 7(8): e3322. DOI:10.1371/journal.pone.0043322. [2] LIU Z Y, HUANG L L, CHEN D M, et al. 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Development of a Surface Plasmon Resonance Immunosensor for Detecting Olaquindox XIE Chunhua1, LIU Shuang1, WANG Minsi1, WANG Xialin1, WANG Shen1, ZHANG Zhijun2, SONG Yang1,*
(1. Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance, College of Life Sciences, Tianjin Normal University, Tianjin 300387, China;2. National Engineering and Technology Research Center for Preservation of Agricultural Products (Tianjin),Tianjin Key Laboratory of Postharvest Physiology and Storage of Agricultural Products, Tianjin 300384, China) Abstract: A sensitive and stable competitive surface plasmon resonance (SPR) immunosensor was established and used to detect olaquindox (OLA) in feed and aquaculture water samples. Its sensitivity and limit of detection (LOD) were 4.7 and 0.5 μg/L,respectively. The best regeneration efficiency was obtained with 2.5 mmol/L NaOH solution, the chip could be reused 60 times and the detection time was only 10 min. The results of cross-reaction between OLA and structural analogs showed a high sensitivity and specificity. Additionally, good recoveries (84.7%–99.3%) and coefficients of variation (1.2%–10.1%)were obtained for spiked fish, shrimp feed and aquaculture water samples. When the method was applied to test actual samples of feed and culture water, two positive samples were detected. OLA contents in fi sh culture water and chicken feed were 5.0 and 6.1 µg/L, respectively. The method can efficiently detect OLA in large-volume feed and water samples, and has the advantages of short detection time, low detection limit, high accuracy and sensitivity, and convenient operation. Keywords: olaquindox; surface plasmon resonance; immunosensor; feed; water
收稿日期：2018-09-27 基金项目：天津市自然科学基金项目（18JCQNJC84400）；国家自然科学基金青年科学基金项目（31301487）；天津市科技计划项目（13JCQNJC14800；14ZCDGNC00098） 第一作者简介：谢春花（1992ü）（ORCID: 0000-0001-8409-9367），女，硕士研究生，研究方向为食品安全与检测。E-mail: 2438059329@qq.comDOI:10.7506/spkx1002-6630-20180927-295 中图分类号：X592 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2020）04-0293-07 引文格式：谢春花, 柳双, 王敏思, 等. 表面等离子体共振免疫传感器检测喹乙醇[J]. 食品科学, 2020, 41(4): 293-299. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180927-295. http://www.spkx.net.cnXIE Chunhua, LIU Shuang, WANG Minsi, et al. Development of a surface plasmon resonance immunosensor for detecting olaquindox[J]. Food Science, 2020, 41(4): 293-299. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180927-295. http://www.spkx.net.cn
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发表于 2021-1-31 22:17:21
