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超高压协同碱性蛋白酶制备玉米黄粉ACE抑制肽超高压协同碱性蛋白酶制备玉米黄粉ACE抑制肽 刘子毅，顾丰颖，王博伦，张 帆，刘 昊，王 锋* （中国农业科学院农产品加工研究所，农业部农产品加工综合性重点实验室，北京 100193） 摘 要：为增加玉米黄粉酶解产物的血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制活性，并提高酶解效率，采用超高压协同碱性蛋白酶制备玉米黄粉ACE抑制肽，实验比较分析了超高压协同酶解、超高压预处理后酶解、常压酶解对ACE抑制率的影响；探讨超高压协同酶解的底物质量分数、时间、压力、pH值、温度对ACE抑制率的影响；采用响应面分析法优化制备条件。结果表明，与常压相比，超高压协同碱性蛋白酶酶解产物的ACE抑制率（酶解时间15 min）提高了55%；与超高压预处理后再酶解相比，ACE抑制率提高了30%。在超高压协同酶解时，影响ACE抑制率的主要因素为pH值，其次为压力、底物质量分数和时间，温度影响不明显。在底物质量分数4.78%、高压时间14 min、压力372 MPa、pH 8.4、温度35 ℃条件下，ACE抑制率可达74.30%。超高压协同碱性蛋白酶制备玉米黄粉ACE抑制肽，不仅提高了ACE抑制率，且酶解时间缩短到15 min以内，为玉米功能肽的绿色高效制备提供了参考。 关键词：超高压；玉米黄粉；碱性蛋白酶；ACE抑制率；响应面 高血压是危害人类健康的主要疾病之一，血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE）是影响人体血压平衡的重要因素[1]。ACE是一种含锌二肽羧肽酶，通过肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）和激肽释放酶-激肽系统（kallikrein-kinin system，KKS）发挥作用导致血压升高。在RAS系统中，它作用于血管紧张素I使其转化为有升压活性的血管紧张素II，致血压升高；在KKS系统中，ACE能够使舒缓激肽失活，从而引起血压的升高[2]。目前，治疗高血压的药物多为化学合成的ACE抑制剂，长期服用可能会对人体造成不良影响，而天然来源的动植物蛋白水解制备的ACE抑制剂，不仅具有良好的降血压效果，而且不会造成毒副作用，备受关注[3-6]。玉米黄粉是玉米淀粉湿法加工后的主要副产物，含有大约60%的蛋白质[7]，其中玉米醇溶蛋白占68%左右，醇溶蛋白含有高比例的脯氨酸（9.0%～10.5%）、丙氨酸（8.3%～10.5%）、亮氨酸（19.3%～21.1%）等疏水性氨基酸[8]，通过酶解作用可以制备出具有降血压等[9-10]多种活性的肽类。而且，当末端氨基酸为疏水氨基酸时，ACE抑制肽的抑制活性较高[11-12]。由于玉米黄粉中存在高含量的醇溶蛋白，导致原料的水溶性差，在水溶液环境下玉米黄粉的酶解效率极低[13-14]。王晓杰等[15]研究表明，采用Flavourzyme和Protamex双酶分步水解玉米黄粉，ACE抑制率可达（99.35f3.55）%，但酶解时间长达5 h；毛舒云[16]、王凯[17]等研究表明，扫频超声处理玉米醇溶蛋白能够提高酶解效率，提高ACE抑制率，在最佳条件下ACE抑制率可达48.48%。因此，提高水介质下玉米黄粉的酶解效率，建立绿色高效的ACE抑制肽制备方法，有利于提高玉米黄粉附加值，促进副产物的综合利用，避免了资源浪费。 Zhang Yuhao等[18]研究表明，经超高压处理后的胶原蛋白再进行碱性蛋白酶酶解，酶解产物的ACE抑制率有所提高；Garcia-Mora等[19]研究表明，Savinase和Corolase7086酶解产物的ACE抑制活性随着压力的增加而增大，在300 MPa下Savinase酶解扁豆蛋白得到的ACE抑制活性最高为69.5%和70.8%。根据团队前期蛋白酶的选择实验得出碱性蛋白酶进行酶解不仅效果好，而且成本低，故本研究拟借助超高压协同碱性蛋白酶酶解玉米黄粉制备ACE抑制肽，提高ACE抑制率，缩短制备时间。实验通过比较分析超高压协同酶解、超高压预处理后酶解、常压酶解等酶解方式对产物ACE抑制率的影响，得到最佳酶解方式；采用响应面分析法优化制备条件，以期获得高活性的ACE抑制肽，同时提高酶解效率。 1 材料与方法1.1 材料与试剂玉米黄粉2017年6月由山东寿光巨能金玉米开发有限公司提供，抽真空保存。 碱性蛋白酶（≥20h104 U/g）、碱性蛋白酶活性检测试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；ACE、N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸（N-[3-(2-furylacryloyl)]-L-phenyalanyl-glycyl-glycine，FAPGG）、4-羟乙基哌嗪乙黄酸（N-(2-hydroxyethyl)-N-(3-sulfopropyl)-piperazine，HEPES） 西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；氢氧化钠 北京化工厂。 1.2 仪器与设备RHP-100高速多功能粉碎机 浙江荣浩工贸有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 郑州科创仪器有限公司；ME104E/02电子天平、Five Easy PlusTM FE28 pH计梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；HPP.L2-600/2超高压设备 天津市华泰森淼生物工程技术有限公司；真空封口机 爱博士有限公司；数显恒温水浴锅常州普天仪器制造有限公司；H/T 16MM台式高速常温离心机 湖南赫西仪器装备有限公司；DHG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；Spectra Max 190酶标仪 美国Molecular Devices公司。 1.3 方法1.3.1 超高压前后碱性蛋白酶活性的检测 SCAP是导致老年人死亡常见的感染性危重病。近年来随着病原体的变迁、细菌耐药率及免疫系统疾病的增加，SCAP的发病率和病死率越来越高，尽管抗感染治疗和器官支持技术的应用使SCAP的病死率有所控制，但仍高达27%～67%[10]。近年来由于抗生素的合理使用，普通CAP已经取得了明显的治疗效果，但老年人由于临床表现不典型、合并其他基础疾病等，肺部感染往往容易被掩盖，导致早期治疗被忽视。因此为使老年CAP患者获得较为有效的治疗，需要有敏感的临床指标来评估其病情和预后。 采用碱性蛋白酶活性检测试剂盒进行测定。 腌渍方式：在制作脆皮鸡时，先加盐、味精等调味料进行前期腌渍，再加入新鲜的蒜苗和蒜瓣等蔬菜一同腌制，然后再刷脆皮水。 1.3.2 玉米黄粉酶解产物的制备 体育作为一种运动的形式，其本身就带有竞技色彩，所以说，在体育教学中，教师不能忽视竞赛情景的创设，因为通过竞赛，教师可以更好地看清学生目前的水平，而且还可以借助比赛的输赢来激励学生进行不断的训练，不断地突破自我、超越自我。具体而言，教师可以定时在体育课上开展运动比赛，通过排名的形式，激发学生的潜力和斗志，这样一来，成绩靠前的学生会想要保持自己的纪录而更加重视身体的锻炼，成绩不好的学生更会为了能够取得好的成绩而加强锻炼，形成良性循环，最终有助于学生身体素质的提升，也有助于体育课效率的提高。 将玉米黄粉粉碎，过100 目筛，配制玉米黄粉混合液，在35 ℃进行碱性蛋白酶酶解，水解反应结束后，95 ℃灭酶15 min，6 732hg离心分离15 min，取上清液，4 ℃保存备用。各实验组处理条件如表1所示。 表1 各实验组处理条件
Table 1 Treatment conditions for each experimental group  酶解时间/min超高压 A 5.00 8.0 400 1.05h104 15 B 5.00 8.0 400 1.05h104 15常压（大气压）实验 序号 底物质量分数/% pH 压力/MPa酶添加量/（U/g）C 5.00 8.0 0.1 1.05h104 15 D 5.00 8.0 0.1 1.05h104 60
1.3.3 ACE抑制率的测定 参照丁青芝[20]的方法略有修改。称取HEPES 1.910 g，NaCl 1.755 g，加适量的蒸馏水溶解，调pH值至8.3，加水定容至100 mL，4 ℃保存。称取FAPGG 19.97 mg，加HEPES缓冲溶液溶解并定容至50 mL，4 ℃避光保存。ACE配制为0.1 U/mL，各加样量见表2。 表2 加样量
Table 2 Sample loadings  组分 空白孔/μL 样品孔/μL ACE 50 50 HEPES缓冲液 50 0待测样品 0 50 FAPGG 100 100
在340 nm波长处，分别测定对照孔和样品孔的初始吸光度，37 ℃保温30 min后再测定其吸光度。ACE抑制率按下式计算： 由于目前海水捕捞的虾是按照鱼粉的生产设备和工艺进行生产，所以较高的温度会导致较为强烈的焦糊味。因此，在对焦糊味的判别中注意辨别是否含有虾、蟹成分，并结合显微镜分析可以进行定性和半定量的虾、蟹成分判定。 玉米淀粉10%、花生粉1.5%、黄豆粉2.5%、淀粉酶(沈丘酶制剂厂生产，酶活2 000 IU/ml)0.004%、氯化钠0.25%、硫酸铵0.5%、碳酸钙0.7%、蛋白胨1.4%、酵母粉0.2%、硫酸镁0.025%、豆油1.25 ml/30 ml培养基，培养基装量30 ml/300 ml三角瓶，在温度(29.0±0.5)℃,转速260 r/min条件下培养166 h。 
式中：A为对照孔的吸光度减少值；B为样品孔的吸光度减少值。 1.3.4 单因素试验 配制5.00%的玉米黄粉混合液，用1 mol/L的NaOH溶液调体系pH 8.0，在搅拌状态下加入1.05h104 U/g（以底物质量计）的碱性蛋白酶，并将其密封在聚氯乙烯袋中，充分混匀后迅速置于超高压容器中，在400 MPa，35 ℃的条件下水解15 min。水解反应结束后，95 ℃灭酶15 min，6 732hg离心分离15 min，取上清液，4 ℃保存备用。 固定基本水解条件不变，分别改变超高压酶解过程中底物质量分数、时间、压力、pH值和温度参数，各因素梯度水平如表3所示，研究其对酶解产物ACE抑制率的影响。 表3 单因素试验因素与水平
Table 3 Level and code of factors used for one-factor-at-a-time design  因素 水平1 2 3 4 5底物质量分数/% 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00时间/min 5 10 15 20 25压力/MPa 100 200 300 400 500 pH 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0温度/℃ 25 30 35 40 45
1.3.5 响应面分析 经济条件方面，场地宜选址在丘陵沟谷中，占用土地以荒地为宜，附近200 m以内有运输道路，距运输站距离小于10 km的区域，不宜选址在林地、耕地和交通闭塞区域。 在单因素试验结果的基础上，运用Design-Expert软件，根据Box-Behnken设计原理，选择底物质量分数（A）、时间（B）、压力（C）、pH值（D）对ACE抑制率影响显著的因素作为响应因素，以ACE抑制率为响应值，设计4因素3水平的响应面试验，设计如表4所示。 表4 Box-Behnken响应面试验设计因素与水平
Table 4 Level and code of factors used for Box-Behnken design  水平 因素A底物质量分数/% B时间/min C压力/MPa D pH-1 4.00 10 300 7.0 0 5.00 15 400 8.0 1 6.00 20 500 9.0
1.4 数据分析所有实验均重复3 次，数据采用fs；采用SPSS 24及Design-Expert 8.0.6软件处理实验数据。 农村教育信息化 祝智庭认为：教育信息化是指在教育领域利用现代化的信息技术手段来促进教育改革和发展的一个过程[2]。从教育发展的维度上看，农村教育既要适应现代化的发展需要，又要适应本地区的政治、经济、文化和发展的需要。农村教育信息化是以信息技术为主要推动力，辐射在农村教育发展的各个方面和各个领域之中。农村教育信息化作为一个发展的过程，它是以新的教育思想为基础，在各个领域相互配合中起积极的指导作用，用信息化的观点保证教育系统良好运行。它没有明确固定的目标或者指标体系，在每一个发展阶段都有不同的努力方向和主题。 2 结果与分析2.1 超高压对碱性蛋白酶活性的影响实验中所用碱性蛋白酶的活性为（21.03f0.07）×104 U/g，经超高压处理后，蛋白酶活性为（24.19f0.05）×104 U/g。经400 MPa处理此碱性蛋白酶活性增加。吴溪[21]研究发现木瓜蛋白酶分别经过100、200、300 MPa处理后活性由常压下的（1.94f0.08）×104 U/g分别提高到（2.15f0.13）×104、（2.43f0.18）×104、（2.09f0.13）×104 U/g；陶敏等[22]也发现菠萝汁中的菠萝蛋白酶活性经过300 MPa处理后酶活性提高，达到最大为120%；杨新颖[35]在研究高压对脂肪酶的影响时发现当压力为450 MPa时酶活性达到最大，当压力大于450 MPa时酶活性又开始下降。研究认为压力能够影响酶的三级结构，导致酶三级结构的重构或崩溃，使酶的活性中心物质发生凝聚或破坏，而影响催化活性。因此，推测本实验中酶活性升高可能是因为400 MPa下碱性蛋白酶的活性中心物质发生凝聚，进而提高了酶的活性[23-24]。 蒋海峰的脸阴得怕人，额上爆出青筋，眼露凶光，充满杀气，只等紫云把话说完。紫云觉得气氛不对，故作轻松，假装去倒茶水。经过大门口时，她来了一个急转身，溜出去了。 2.2 超高压对玉米黄粉酶解产物ACE抑制率的影响超高压协同碱性蛋白酶酶解玉米黄粉，得到产物的ACE抑制率可达72.03%，均高于常压酶解以及超高压预处理后再酶解。由图1可知，在相同的酶解时间下（15 min），超高压酶解产物ACE抑制率（A、B组）比常压酶解（C组）提高了22%～55%。这与Garcia-Mora等[25]采用超高压协同酶解制备得到的产物ACE抑制率要比常压下酶解产物高28%～50%的结果相似。同时，本团队前期实验研究表明，在常压下，其酶解产物的ACE抑制率达到最高（D组：62.37%）时，也远低于超高压协同酶解组的ACE抑制率，而且酶解时间长达1 h。因为压力的存在能够促进蛋白与酶的结合，同时促进了酶与产物复合物的分离[26]。 讲析：（1）“巧妇难为无之炊”，是指没有米这种客观实在性的东西，就没法做饭。说明物质决定意识，这是唯物主义的观点。（2）“掩耳盗铃”说的是盗铃人怕别人听到钟声而捂住自己的耳朵。声音是客观存在的，决定它的也是客观性的东西，不论你怎样捂住耳朵，它都不会因此而消失。这是主观唯心主义的做法。  图1 不同处理对ACE抑制率的影响
Fig. 1 Effects of different treatments on ACE inhibition rate
与超高压预处理后再酶解（B组）相比，超高压协同酶解（A组）ACE抑制率高30%以上。超高压预处理后再酶解ACE抑制活性较低，可能是玉米黄粉高含量的疏水基团在释压后重新进行了组合。Yin Shouwei等[27]对芸豆进行研究发现，经过高压处理后的芸豆蛋白分离物，疏水基团和SH基团暴露出来，在压力释放后，它们又参与新的疏水作用形成新的二硫键，使蛋白重新发生聚合。因此，选择超高压协同酶解制备玉米黄粉ACE抑制肽。 2.3 超高压协同酶解单因素试验结果
 图2 超高压协同酶解各因素不同水平对ACE抑制率的影响
Fig. 2 Effects of various factors of UHP-assisted enzymatic hydrolysis on ACE inhibition rate
2.3.1 底物质量分数对酶解产物ACE抑制率的影响 底物质量分数为5%时抑制率达到最大，为72.81%。由图2A可知，随着玉米黄粉底物质量分数的增大，ACE抑制率呈现出先增大后降低的趋势。因为适当的增加底物质量分数，可以增加酶与底物的结合位点，当底物质量分数过大时，酶解反应变弱，ACE抑制率开始下降，朱振宝等[28]在采用酶解法制备核桃ACE抑制肽时，也发现了类似的变化趋势。靳冬武等[29]研究超高压酶解酪蛋白时发现，当底物质量分数达到一定比例再继续增大，会降低酶在溶液中的溶解度，使二者之间的接触机会减少，从而降低反应速率。推测认为，本实验中底物质量分数达到5%后继续增大，会减少碱性蛋白酶与玉米黄粉的接触机会，降低反应速率，产物的ACE抑制率开始下降。因此，在底物质量分数为5%时抑制率最大。 2.3.2 超高压时间对酶解产物ACE抑制率的影响 当超高压处理时间为15 min时，ACE抑制率达到最大72.35%。继续延长超高压时间，ACE抑制率开始下降，因为随着时间的不断延长，蛋白过度水解，酶活也会随着时间的延长受到影响[30]。Perreault等[31]研究了不同高压时间对亚麻籽蛋白结构、水解反应等的影响，发现高压能诱导蛋白的分离，但随着时间的延长又会形成大分子的聚合物，进而影响酶解反应。因此，本实验中ACE抑制率会随着时间的延长先增大后减小，在超高压处理15 min为最适处理时间。 2.3.3 压力对酶解产物ACE抑制率的影响 在超高压协同酶解过程中，压力也是主要影响因素。由图2C可知，随着压力的增大，ACE抑制率呈现出先增大后降低的趋势，在压力为400 MPa时ACE抑制率达到最大，为71.05%。因为随着压力的增大蛋白变的越来越松散，继续增大压力，蛋白之间又会重新发生聚集[25]。Angioloni等[32]研究了压力对青豌豆酶解的影响，发现随着压力的增大，蛋白的溶解度先增大后减小。推测认为，ACE抑制率随压力变化，主要是由于超高压状态下玉米黄粉的分散体系的性状及性质的改变引起的，在400 MPa时玉米黄粉最分散，因此，在400 MPa时ACE抑制率最大。 2.3.4 pH值对酶解产物ACE抑制率的影响 对于快递包装回收，国家有关部门制定了一个时间表。2017年，国家十部门联合发布的《关于协同推进快递业绿色包装工作的指导意见》明确，到2020年，可降解的绿色包装材料应用比例将提高到50%，基本淘汰重金属等特殊物质超标的包装物料，基本建成专门的快递包装物回收体系。主要快递品牌协议客户电子运单使用率达到90%以上，平均每件快递包装耗材减少10%以上，推广使用中转箱、笼车等设备，编织袋和胶带使用量进一步减少。基本建立快递业包装治理体系。2019年1月1日实施的《电商法》中第五十二条规定，快递物流服务提供者应当按照规定使用环保包装材料，实现包装材料的减量化和再利用。 在本实验中，pH值为8.0时ACE抑制率达到最大，为71.98%（图2D）。张淼[33]、郑明洋[34]等认为玉米黄粉中主要为疏水性的醇溶蛋白，在碱性条件下溶解度会增加。因此，碱性条件下可以提高底物的溶解度，提高酶与底物接触面积，提高产物制备效率。杨新颖[35]的研究表明，高压会改变酶的最适pH值，使脂肪酶的最适pH值较常压条件下向碱性偏移了0.5。前期在常压条件下的预试验中，酶解产物ACE抑制率随着pH的增大先增大后减小，在pH 9.0时达到最大，超高压协同处理中显示出碱性蛋白酶的最适pH值的变化，由常压的9.0下降至8.0，分析认为超高压条件可能改变了酶蛋白的结构，从而影响其最适pH值。因此，pH值为8.0是超高压协同酶解实验的最适pH值。 2.3.5 温度对酶解产物ACE抑制率的影响 在本实验中，35 ℃为超高压协同酶解的最适温度（图2E）。由图2E可知，随着温度的增大，ACE抑制率呈现出先增大后降低的趋势，但变化幅度较小。施瑛等[36]研究认为在一定的温度范围内随着温度的升高，使蛋白底物与酶分子间相互碰撞的机会增大，提高了酶的催化效率。前期在常压条件下的预实验中，酶解产物ACE抑制率45 ℃时，达到最大，在本研究中，碱性蛋白酶由常压下最适温度45 ℃下降至35 ℃，这与田美玲[37]的研究结果相似，高压可以改变酶的最适温度。因此，在超高压协同酶解实验中确定温度为35 ℃。 2.4 超高压协同酶解工艺条件的优化2.4.1 Box-Behnken设计结果与分析 通过探讨底物质量分数、时间、压力、pH值、温度对ACE抑制率的影响可知，温度对ACE抑制率的影响不明显，故在35 ℃时选择其他4 个因素设计响应面试验（表5）。应用Design-Expert软件对表5所得的试验数据进行回归分析，得到的二次多元回归模型如下：Y=72.03-5.29A-0.87B-7.21C+11.65D+3.43AB+5.81AC-0.32AD-0.33BC-2.43BD-8.11CD-16.86A2-10.63B2-21.64C2-16.70D2（Y为ACE抑制率的预测值）。由表6可知，回归模型极显著（P＜0.000 1），R2和R2Adj分别为0.997 1和0.994 2，说明模型对试验拟合良好，失拟项不显著，表明该模型能够较好地反映实际情况；CV值越低，说明模型的置信度越高[38]。本实验的CV值只有2.88%，表明置信度较高，模拟方程能够较好的反应真实实验值，可以用该模型来分析响应面的变化[39]。回归方程各项方差分析表明，A、B、C、D、AB、AC、BD、CD、A2、B2、C2、D2对ACE抑制率有显著的影响（P＜0.05），各因素对ACE抑制率的影响依次是pH值、压力、底物质量分数和时间。 We can subdivide their content into two main areas: religious and secular. The first is exemplified by the Prajnaparamita in 25,000 stanza and Tantric rituals scriptures.The second includes poetry, biography and other local documents, all of which have important historical value. 表5 响应面试验设计与结果
Table 5 Experimental design and results for response surface analysis  注：1～24为析因试验，25～29为中心试验。 质量分数B时间C压力D pHACE抑制率/%1 -1 -1 0 0 54.00 2 0 0 1 -1 24.00 3 0 1 -1 0 47.26 4 1 0 -1 0 29.00 5 0 0 -1 -1 21.60 6 0 -1 -1 0 49.12 7 -1 0 -1 0 50.29 8 0 -1 1 0 33.96 9 -1 1 0 0 46.00 10 -1 0 1 0 25.06 11 -1 0 0 1 58.01 12 1 1 0 0 43.37 13 1 0 0 1 44.80 14 1 -1 0 0 37.66 15 0 1 1 0 30.78 16 -1 0 0 -1 32.00 17 0 1 0 -1 35.00 18 1 0 1 0 27.00 19 0 1 0 1 52.00 20 0 0 1 1 30.46 21 1 0 0 -1 20.07 22 0 0 -1 1 60.52 23 0 -1 0 -1 31.69 24 0 -1 0 1 58.43 25 0 0 0 0 72.03 26 0 0 0 0 71.96 27 0 0 0 0 72.36 28 0 0 0 0 72.53 29 0 0 0 0 71.29试验号 A底物
表6 回归方程系数显著性分析
Table 6 Analysis of variance of quadratic polynomial regression equation and significance test  注：*.差异显著（P＜0.05），**.差异极显著（P＜0.01）。 方差来源 自由度 平方和 均方 F值 P值模型 14 8 028.8 573.49 341.75 ＜0.000 1**A底物质量分数 1 335.6 335.6 199.99 ＜0.000 1**B时间 1 9.1 9.1 5.42 0.035 4*C压力 1 623.95 623.95 371.82 ＜0.000 1**D pH值 1 1 630.07 1 630.07 971.38 ＜0.000 1**AB 1 46.99 46.99 28 0.000 1**AC 1 134.91 134.91 80.39 ＜0.000 1**AD 1 0.41 0.41 0.24 0.628 9 BC 1 0.44 0.44 0.26 0.618 3 BD 1 23.72 23.72 14.13 0.002 1*CD 1 263.41 263.41 156.97 ＜0.000 1**A2 1 1 844.47 1 844.47 1 099.14 ＜0.000 1**B2 1 696.4 696.4 415 ＜0.000 1**C2 1 3 037.3 3 037.3 1 809.97 ＜0.000 1**D2 1 1 808.55 1 808.55 1 077.74 ＜0.000 1**残差 14 23.49 1.68失拟性 10 22.58 2.26 9.91 0.203纯误差 4 0.91 0.23总离差 28 8 052.3 R2=0.997 1 R2 Adj=0.994 2 CV=2.88%
2.4.2 双因素交互作用分析  图3 各试验因素对ACE抑制率的交互影响
Fig. 3 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on ACE inhibition rate
图3 为底物质量分数、时间、压力、pH值任意2 个因素取零水平时，其余2 个因素对ACE抑制率的影响，2 个因素的交互作用可由响应面三维立体图直观反映出来，图形越陡峭，说明对ACE抑制率的影响越显著，即为主要影响因素[40-41]。 由图3A可知，当底物质量分数不变，随着高压时间的延长，ACE抑制率表现出先升高后下降的趋势，趋势不太明显；当高压时间不变，随着底物质量分数的增大，ACE抑制率表现出先升高后下降的趋势，趋势较明显。由此可知，与时间相比，底物质量分数为主要影响因素。由图3B可知，当底物质量分数不变，随着压力的增加，ACE抑制率表现出先升高后下降的趋势，趋势较陡；当压力不变，随着底物质量分数的增大，ACE抑制率表现出先升高后下降的趋势，趋势较明显。由此可知，与底物质量分数相比，压力为主要影响因素。同理，从图3C～F可以看出，pH值对ACE抑制率的影响最大，其次是压力、底物质量分数和时间。 2.4.3 超高压协同碱性蛋白酶制备玉米黄粉ACE抑制肽条件确定和验证 根据Box-Behnken试验得到结果和回归方程，预测试验范围内的最佳工艺条件为底物质量分数4.78%、高压时间14.38 min、压力372.49 MPa、pH 8.43，预测模型的ACE抑制率为76.15%。 为验证回归方程模型，考虑到实际情况，将模型预测出的最佳工艺条件进行修正，修正后的条件为底物质量分数4.78%、高压时间14 min、压力372 MPa、pH 8.4、温度35 ℃，在此条件下进行3 次实验，计算得到ACE抑制率的平均值为（74.30f0.45）%，与预测值76.15%相符，表明该模型能够较好的预测出实际的ACE抑制率。 3 结 论超高压协同碱性蛋白酶酶解不仅可以提高酶解产物的ACE抑制率，而且可以缩短酶解时间至15 min以内。通过探讨底物质量分数、超高压时间、压力、pH值、温度对ACE抑制率的影响，采用响应面设计，优化制备条件，得到水解物的ACE抑制率在底物质量分数为4.78%、高压时间14 min、压力372 MPa、pH 8.4，温度35 ℃的条件下，可达到最大值为74.30%。其中，pH值是主要影响因素，其次是压力、底物质量分数和时间。 参考文献： [1] QU W J, MA H L, ZHONG L P, et al. 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Preparation of Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory Peptides from Corn Gluten Meal by Ultra-high Pressure-Assisted Alcalase Hydrolysis LIU Ziyi, GU Fengying, WANG Bolun, ZHANG Fan, LIU Hao, WANG Feng*
(Key Laboratory of Agro-Products Processing, Ministry of Agriculture, Institute of Food Science and Technology,Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China) Abstract: An ultra-high pressure (UHP)-assisted alcalase hydrolysis process was established to prepare angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory peptides for corn gluten meal (CGM) in order to simultaneously increase the ACE inhibitory activity of CGM hydrolysate and the hydrolysis ef fi ciency. A comparative analysis of the effect of UHP-assisted enzymatic hydrolysis, enzymatic hydrolysis after UHP pretreatment and enzymatic hydrolysis under atmospheric pressure was made on the inhibition rate of ACE. In the UHP-assisted enzymatic hydrolysis method, the operating parameters substrate concentration, time, pressure, pH and temperature were evaluated for their effects on the inhibition rate of ACE.These preparation conditions were optimized by response surface methodology (RSM). The ACE inhibition rate of the hydrolysate obtained by UHP-assisted hydrolysis (for 15 min) was increased by 55% compared with that obtained under atmospheric pressure, and 30% higher than that obtained with UHP pretreatment. pH was found to be the main factor affecting the ACE inhibition rate, followed by pressure, substrate concentration and time. The effect of temperature was not obvious. The results indicated that the ACE inhibition rate was up to 74.30% under the optimized conditions: substrate concentration 4.78%, high pressure holding time 14 min, pressure 372 MPa, and pH 8.4. UHP-assisted alcalase hydrolysis could not only increase the ACE inhibition rate but also shorten the hydrolysis time to within 15 min, which would provide a basis for the green and ef fi cient preparation of corn protein-derived functional peptides. Keywords: ultra-high pressure; com gluten meal; alcalase; ACE inhibitory peptide; response surface methodology
收稿日期：2019-01-23 基金项目：国家自然科学基金面上项目（31871730）；农业部引进国际先进农业科学技术计划（948计划）项目（2016-X31）；中国农业科学院协同创新工程项目（CAAS-XTCX 2016005）；农业部大宗粮食加工重点实验室开放基金项目（DZLS201707） *通信作者简介：王锋（1974ü）（ORCID: 0000-0002-0147-0691），男，研究员，博士，研究方向为谷物加工及品质调控。E-mail: fengwang88@163.comDOI:10.7506/spkx1002-6630-20190123-304 中图分类号：TS239 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2020）04-0222-07 引文格式：刘子毅, 顾丰颖, 王博伦, 等. 超高压协同碱性蛋白酶制备玉米黄粉ACE抑制肽[J]. 食品科学, 2020, 41(4): 222-228.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190123-304. http://www.spkx.net.cnLIU Ziyi, GU Fengying, WANG Bolun, et al. Preparation of angiotensin converting enzyme inhibitory peptides from corn gluten meal by ultra-high pressure-assisted alcalase hydrolysis[J]. Food Science, 2020, 41(4): 222-228. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190123-304. http://www.spkx.net.cn
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发表于 2021-1-31 22:08:42
