套袋对‘瑞雪’苹果香气成分的影响及相关基因表达分析

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套袋对‘瑞雪’苹果香气成分的影响及相关基因表达分析
冯帅帅，闫成太，张天皓，张 莉，吉苗苗，王 帆，高 华*
（西北农林科技大学园艺学院，陕西 杨凌 712100）
摘 要：以‘瑞雪’苹果为材料，对盛花期后165、180、195、210 d套袋和不套袋果实采样。采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对果实香气成分分析，采用气相色谱仪对果实乙烯含量测定分析，对与香气及乙烯合成的相关基因定量分析。研究发现，‘瑞雪’苹果果实中共检测到68 种香气物质，其中套袋46 种，不套袋62 种。套袋果实的醛类含量要明显高于不套袋果实，酯类含量和烯类含量明显低于不套袋。套袋果实乙烯受体基因表达明显下调，乙烯含量低于不套袋果实。在套袋果实中脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）基因，醇脱氢酶（alcoholdehydrogenase，ADH）基因显著下调。由此推测套袋果实乙烯合成减少导致MdLOX和MdADH基因下调，影响果实香气物质的合成，进而改变苹果果实的风味品质。
关键词：苹果香气；气相色谱-质谱联用；套袋；基因表达
‘瑞雪’是由‘秦富1号’ב粉红女士’杂交选育而成的黄色晚熟苹果品种，其果实肉质细脆，酸甜适口，汁液多，风味浓[1-2]。特别是‘瑞雪’果实具有的独特风味被广泛关注，而果实香气是风味品质形成的重要因素之一。套袋是苹果栽培普遍使用的技术，对于改善果实外观、提高果面光洁度、降低果锈指数和日灼果的发生率有明显作用，但相关研究表明套袋会降低果实的内在品质，不利于果实整体风味的形成[3]。
套袋会降低‘红星’和‘长富2号’果肉中酯类、糖、有机酸含量的积累量，以及苹果果皮中酚类化合物的浓度[4-6]。但套袋如何影响香气物质的合成，目前的研究报道较少。研究表明脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）、醇脱氢酶（alcoholdehydrogenase，ADH）、脂氢过氧化物裂解酶（hydrogen peroxide repressible enzyme，HPL）、醇酰基转移酶（alcohol acyltransferase，AAT）是影响‘南果梨’香气物质合成的关键酶[7]。自美味番茄以来[8]，在生物信息学方面，果实香气的研究已经成为当前的热点。研究表明MdAAT和MdLOX基因在苹果风味挥发物表达中起重要作用，同时全基因组关联研究揭示苹果挥发物质的遗传与果实质地结构存在互作，证明部分挥发物质与果胶酶基因相互关联，说明果实质地结构在苹果香气释放中起到关键作用[9-10]。这些研究为本实验提供理论依据。
本实验在前人研究基础上，对套袋‘瑞雪’果实和不套袋‘瑞雪’果实香气成分的差异进行研究，并与基因表达和果袋内外温湿度差异相结合。为进一步推测套袋如何降低苹果果实的香气物质种类和香气物质总含量，以及提高‘瑞雪’苹果的风味品质，进一步改良苹果品质提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
实验于2018年在陕西省白水县西北农林科技大学苹果试验站进行，选取8 a生M26自根砧栽培的‘瑞雪’苹果树3 株，重复3 次。在盛花期后60 d，对果实进行套袋处理。在套袋后165、180、195、210 d 4 个时期采样，选取无病虫害、无机械损伤的果实。每次采样严格按照每棵果树不同部位均匀采摘6 个果实，分别对套袋和不套袋果实进行后期实验处理。实验果树的立地栽培条件、生长势基本一致，管理水平相同。
1.2 仪器与设备
PAL-1手持数显折光仪 日本爱拓公司；Fruit Acidzty Meter GMK-835型酸度计 韩国G-WON公司；Trace GC Ultra气相色谱仪、ISQ & Trace ISQ气相色谱-质谱联用仪 美国赛默飞科技有限公司；ABI StepOnePlusTM荧光定量仪器 美国应用生物系统公司；ZDR-20温湿度记录仪 浙江大学电气设备厂。
1.3 方法
1.3.1 温湿度测定
采用ZDR-20温湿度记录仪记录‘瑞雪’苹果自套袋开始共128 d的温湿度数据，具体方法：将2 个ZDR-20温湿度记录仪悬挂于树上，1 个探头放置于袋内，1 个放置袋外，测量袋内外温湿度。
1.3.2 乙烯含量测定
根据Nimitkeatkai等[11]的方法进行测定。将6 个苹果放入密封罐中，并在25 ℃密闭2 h，抽取1 mL气样，使用Trace GC Ultra气相色谱仪测定，重复3 次。
1.3.3 色谱条件
HP-INNOWax毛细管色谱柱（60 mh0.25 mm，0.25 μm）；载气为高纯氦气，流速1.0 mL/min；进样口温度230 ℃；不分流进样。采用程序升温，起始温度40 ℃，保持3 min；以5 ℃/min升至150 ℃，再以10 ℃/min升至220 ℃，保持5 min。
1.3.4 质谱条件
电子电离源；电子能量70 eV；离子源温度240 ℃；传输线温度240 ℃；开始采集时间2.0 min。
1.3.5 定性与定量
未知化合物质谱图经计算机检索同时与NIST 05质谱库相匹配，确认各种挥发性成分；定量方法按峰面积归一化法求得各成分相对含量，并选择2-壬酮为内标进行定量。
1.3.6 总RNA提取和cDNA合成
总RNA的提取采用改良十六烷基三甲基溴化铵法，参照Gambino等[12]的方法，对提取步骤进一步优化改良，然后根据Takara公司提供的PrmieScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒和方法步骤进行cDNA合成。
1.3.7 实时定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）分析
用于实时定量PCR分析的寡核苷酸引物设计和方法步骤采用Espley等[13]的方法，或采用EST序列信息同源比对设计，或者参考相关文献[14-15]基础上引用。所获得引物核苷酸序列见表1，然后使用Vazyme提供的试剂ChamQTM SYBRR qPCR Master Mix和方法进行定量分析，使用ABI StepOnePlusTM荧光定量仪测定。使用MdActin进行归一化，重复3 次，同时使用盛花期后165 d套袋‘瑞雪’苹果的样本（指定一个任意数量的“1”）作为校准器，计算结果的相对数量。
表1 实时定量PCR引物核苷酸序列
Table 1 Nucleotide sequences of primers used for quantitative RT-PCR

1.4 数据处理
本研究通过Excel 2007进行实验数据的汇总处理，SPSS 21.0软件进行果实香气物质的主成分分析，运用SigmaPlot 12.5软件作图分析。
2 结果与分析
2.1 套袋对‘瑞雪’果实内在品质的影响

图1 套袋对‘瑞雪’果实品质的影响
Fig. 1 Effect of bagging on the quality of ‘Ruixue’ apples
绝大多数的香气物质是植物次生代谢的产物，次生代谢的进行是以初生代谢为基础，而可溶性固形物主要是由植物初生代谢产物构成。图1A表明，‘瑞雪’苹果果实可溶性固形物含量随着采摘时间的延长，逐渐增加，盛花期后210 d数据显示，不套袋的果实可溶性固形物质量分数可达到18.15%，套袋果实为17.00%，数据分析显示两者差异显著。如图1B所示，可滴定酸含量随着时间延长呈现逐渐减少的趋势，其中在盛花期后180、195 d，不套袋果实和套袋果实差异显著，但到210 d两者差异不显著。如图1C所示，‘瑞雪’果实糖酸比在逐步增加，在210 d，不套袋果实糖酸比为60.41，套袋果实为59.61，但套袋果实和不套袋果实整体看，差异并不显著，这与郭梦月等[2]研究结果一致。以上数据表明，虽然在糖酸比上套袋果实和不套袋果实每个采摘时期相对差异不明显，但在可溶性固形物和可滴定酸方面，每个时期还是有一定差异。整体看不套袋果实可溶性固形物含量高于套袋果实。
2.2 套袋对‘瑞雪’苹果香气成分的影响
香气成分用气相色谱-质谱检测，每个时期的样本分别进行3 次平行检测，取其平均值，由表2可知，在‘瑞雪’苹果中共检测出68 种香气物质，其中套袋果实有46 种物质，不套袋果实共有62 种物质。套袋果实165 d时香气种类一共有23 种，到210 d达到36 种，不套袋果实则由165 d的26 种增加到210 d的46 种，说明香气物质的种类会随着果实成熟度增加而增加，这与乜兰春等[16]研究一致。其中14 种香气物质在套袋和不套袋果实中每个时期都被检测出，它们分别为正己醛、3-己烯醛，2-己烯醛、反-2-辛烯醛、乙酸己酯、丙酸己酯、辛乙烯二醇单正十二烷基酯、异戊酸己酯、2-甲基丁酸戊酯、丁酸丁酯、2-甲基丁酸-2-甲基丁酯、1-辛烯-3-酮、甲基庚烯酮、α-法呢烯。
表2 套袋处理‘瑞雪’果实挥发性成分的气相色谱-质谱分析
Table 2 GC-MS analysis of volatile compounds in bagged ‘Ruixue’ apples

续表2

注：ND.未检测到。
由表2可以看出，套袋果实和不套袋果实在香气物质的种类和相对含量上存在明显差异，14 种共有物质表明在套袋果实中正己醛、2-己烯醛的组分相对含量远高于不套袋果实，但是乙酸己酯、丙酸己酯、异戊酸己酯、2-甲基丁酸戊酯的组分相对含量不套袋果实高于套袋果实。同时由图2可以看出，套袋果实总香气物质由165 d的775.11 μg/kg上升到210 d的2 960 μg/kg，在180～195 d总香气物质上升明显。在165 d醛类占总香气物质的71.40%，远高于不套袋果实的37.05%。不套袋果实总香气物质由165 d的2 113.37 μg/kg上升到210 d的4 488.42 μg/kg，可以看出套袋果实总香气物质在每个采样期都低于不套袋果实。同时不套袋果实每个时期的酯类相对含量分别为32.72%、39.73%、46.52%、56.27%，高于套袋果实的17.66%、18.46%、37.26%、41.45%。同时还发现在195 d以前，套袋处理α-法呢烯含量远低于不套袋果实。相关研究表明，酯类和法尼烯类物质是对苹果风味贡献最大的2 类挥发性化合物[17]。本实验说明套袋会降低总香气物质含量，延迟醛类物质向酯类物质的转化。

图2 套袋对总香气物质含量和各类香气组分的影响
Fig. 2 Effect of bagging on contents of total aroma substances and various aroma components
2.3 套袋处理对‘瑞雪’香气合成基因的影响


图3 套袋对香气合成基因表达的影响
Fig. 3 Effect of bagging on the expression levels of genes related to aroma synthesis
通过对表1的12 个与香气合成的基因定量分析，由图3可知，在不套袋‘瑞雪’果实里参与香气合成的MdBCAT2和MdAADC基因的相对表达量显著降低，而其他10 个基因的相对表达量要高于套袋果实，特别是MdLOX和MdADH3基因差异最为显著，不套袋‘瑞雪’MdLOX基因在195 d时的相对表达量是套袋果实的8 倍，而MdADH3基因的相对表达量在180 d是套袋果实相对表达量的90 倍。MdLOX基因是LOX通路的关键基因，LOX通路又是脂肪酸形成的重要通路之一[18]。ADH成员基因作为LOX通路和丙酮酸通道的重要组成部分，也参与了酯类的合成。MdArAT、MdACP2、MdMCAT、MdACPD、MdHPL、MdAOS、MdPDC2、MdAAT2这8 个基因在套袋处理中也出现不同程度的下调，它们也是参与香气合成中的关键基因[19]。结果表明虽然在果实的不同采摘时期随着果实的成熟度增加各个基因的相对表达量都在变化，但综合分析表明套袋会影响苹果果实香气合成的相关基因的表达，从而抑制苹果香气物质的合成。
2.4 套袋对‘瑞雪’苹果乙烯释放量的影响

图4 套袋对‘瑞雪’苹果乙烯释放量（A）和相关基因表达量（B）的影响
Fig. 4 Effect of bagging on ethylene release (A) and related gene expression levels (B) in ‘Ruixue’ apples
苹果是呼吸跃变型果实，乙烯的释放量是果实成熟度衡量的标准之一，为此对样本各时期的乙烯释放量和乙烯合成基因MdERS2的相对表达量测定分析。图4A表明，不套袋‘瑞雪’苹果的乙烯释放量由165 d的0.43 mg/（kggh）上升到210 d的17.37 mg/（kggh），套袋果实乙烯释放量则由165 d的0.38 mg/（kggh）上升到210 d的5.70 mg/（kggh）。套袋果实的乙烯释放量要明显低于不套袋果实，MdERS2基因定量结果也同样表明在套袋果实的相对表达量要低于不套袋果实（图4B）。相关研究表明，乙烯释放量与MdERS2表达正相关，同时乙烯的释放也会调控‘南果梨’香气的产生[20-21]。研究结果表明套袋会减少苹果果实乙烯的释放量，负调控苹果香气的合成。
2.5 套袋对‘瑞雪’苹果袋内温湿度的影响
表3 套袋对果实逆境环境时长的影响
Table 3 Effect of bagging on fruit growth under adverse environment h

为探究造成套袋果实和不套袋果实香气合成的差异的原因，采用ZDR-20温湿度记录仪对苹果果袋内和果袋外温湿度进行实时测量。自套袋开始，共测量了3 312 h。果袋内与果袋外相比在白天温度和夜晚湿度两方面差别较大。套袋果实袋内最高温度为35.81 ℃，不套袋则为31.82 ℃。特别是在套袋60～90 d时，白天果袋内平均温度要比果袋外高2～4 ℃。湿度表现在夜间果袋内要比果袋外的高，特别是在套袋后60～90 d时。同时还发现果袋内温湿度昼夜变化明显比果袋外温湿度变化大。由表3可知，果袋外的不良环境时长为336 h，果袋内则为670 h，两者相差将近2 倍。苹果在逆境环境下会导致醛类物质积累，特别是温度对果实酸浓度和糖代谢的降低有明显的影响，其中年平均温度、最低温度和4ü10月平均温度对果实质量影响较大[22-23]。相关研究表明，低温会抑制乙烯的生物合成[24]，研究发现果袋内低温高湿环境时长是195 h，是果袋外的2.75 倍。表明套袋形成了独特的微域环境，这会给苹果的生长带来逆境胁迫，影响苹果香气物质的合成。
3 结 论
套袋为苹果果实的生长发育提供了微域环境，这种环境增加了果实的逆境胁迫时间。这种胁迫对苹果摘袋后变红，有促进作用[25]，但本研究表明套袋会抑制苹果果实香气物质的产生，降低果实总香气物质含量和香气物质种类。根据前人研究报道，芳香生物合成途径中的某些点受到乙烯的调控，乙烯积累量增加会促进香气物质的产生[26-32]。本研究表明套袋会明显抑制苹果乙烯释放和相关基因的表达。本实验对12 个基因做了相关定量表达，结果表明套袋上调的基因有2 个，分别为MdBCAT2和MdAADC，前人实验证明乙烯处理苹果果实会下调这2 个基因表达，1-MCP处理会上调这2 种基因的表达[28]。MdArAT、MdACP2、MdMCAT、MdACPD、MdLOX、MdHPL、MdAOS、MdPDC2、MdADH3、MdAAT2这10 个基因在套袋果实中下调。这10 个基因都已被证实会促进香气物质的产生[28-29]。特别是不套袋果实中MdLOX基因在195 d的相对表达量是套袋果实的8 倍，而MdADH3基因的相对表达量在180 d是套袋果实相对表达量的90 倍。而MdLOX、MdADH3基因是苹果果实香气合成中最重要的基因。同时对可溶性固形物的测定发现，套袋会降低果实可溶性固形物含量。由于香气物质大多是次生代谢产物，而次生代谢产物是在初生代谢基础上进行，推测这也会影响香气物质的合成。
根据实验数据，推测套袋造成的逆境环境包括高温高湿、高温低湿、低温低湿、低温高湿，这种环境胁迫会抑制苹果果实乙烯的生物合成，而乙烯调控香气合成相关基因表达，结果导致套袋苹果果实香气物质的合成减少。同时套袋也会导致苹果果实可溶性固形物含量减少，但目前还没有直接研究表明可溶性固形物含量的多少与苹果香气释放的直接联系。可溶性固形物和香气的关联原因可以利用代谢组学的知识和方法，有待进一步研究。
目前，苹果香气方面的研究随着分子生物信息学发展有了很大的进步，但对于香气物质合成的关键基因功能验证并不深入。关于苹果香气阈值的测定和各个组分的相互作用，以及探究影响调控的相关基因进而明确香气物质合成的机理是未来科研的主要方向，这对苹果品质的改良和遗传育种具有重要意义。
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Effect of Bagging on Aroma Volatiles and Related Gene Expression in ‘Ruixue’ Apple Fruit
FENG Shuaishuai, YAN Chengtai, ZHANG Tianhao, ZHANG Li, JI Miaomiao, WANG Fan, GAO Hua*
(College of Horticulture, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)
Abstract: The aroma components of bagged and non-bagged ‘Ruixue’ apples picked on day 165, 180, 195 and 210 after full bloom were analyzed by head-space solid-phase micro extraction gas chromatography-mass spectrometry (HS-SPME-GCMS), and their ethylene contents were determined by gas chromatography (GC). Besides, the expression levels of the genes associated with the synthesis of aroma and ethylene were analyzed by qRT-PCR assay. A total of 68 aroma components were detected in the apples, among which, 46 were found to be present in bagged apples and 62 in non-bagged apples. The aldehyde content in the bagged fruit was significantly higher than that in the un-bagged fruit, while the contents of ester and olefins were significantly lower than those in the un-bagged fruit. The level of ethylene receptor gene expression was significantly down-regulated in the bagged fruit, and the content of ethylene was lower than that in the un-bagged fruit. The expression levels of the genes encoding lipoxygenase (LOX) and alcohol dehydrogenase (ADH) were significantly downregulated in the bagged fruit. Our results implied that the reduction of ethylene synthesis in the bagged fruit resulted in the down-regulated expression of MdLOX and MdADH genes, affecting the synthesis of aroma components and consequently the fl avor quality of apple fruit.
Keywords: apple aroma compounds; gas chromatography-mass spectrometry; bagging; gene expression
收稿日期：2019-03-20
基金项目：“十三五”国家重点研发计划重点专项（2016YFD0201131）；陕西省重点研发计划项目（2017ZDXM-NY-021）；西北农林科技大学推广专项（TGZX2017-39）
第一作者简介：冯帅帅（1991ü）（ORCID: 0000-0003-2053-781X），男，硕士研究生，研究方向为果树育种与分子生物技术。E-mail: 1126426152@qq.com
*通信作者简介：高华（1970ü）（ORCRD: 0000-0001-8435-8808），男，研究员，硕士，研究方向为苹果新品种选育以及示范推广。E-mail: gaohua2378@163.com
DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190320-253
中图分类号：S661.1
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2020）04-0185-08
引文格式：冯帅帅, 闫成太, 张天皓, 等. 套袋对‘瑞雪’苹果香气成分的影响及相关基因表达分析[J]. 食品科学, 2020, 41(4):185-192. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190320-253. http://www.spkx.net.cn
FENG Shuaishuai, YAN Chengtai, ZHANG Tianhao, et al. Effect of bagging on aroma volatiles and related gene expression in ‘Ruixue’ apple fruit[J]. Food Science, 2020, 41(4): 185-192. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190320-253. http://www.spkx.net.cn