小叶三点金提取物的抗炎作用及其机制研究

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小叶三点金提取物的抗炎作用及其机制研究Δ

摘 要 目的：研究小叶三点金提取物的抗炎作用及其机制，为该药用植物的进一步开发应用提供实验依据。方法：采用二甲苯、冰醋酸、角叉菜胶建立小鼠急性炎症模型，以地塞米松为阳性对照（0.005 g/kg），考察灌胃不同剂量小叶三点金提取物（50、30、15 g/kg）对二甲苯致正常小鼠和肾上腺摘除小鼠耳肿胀、冰醋酸致正常小鼠腹腔毛细血管通透性增加、角叉菜胶致正常小鼠和肾上腺摘除小鼠足肿胀的抑制作用，并对角叉菜胶致炎模型肾上腺摘除小鼠足趾炎性部位中的丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）水平进行检测；另设空白组小鼠为对照（灌胃等体积水）。结果：与空白组比较，小叶三点金提取物高、中剂量组正常小鼠和肾上腺摘除小鼠耳肿胀度均显著降低，而耳肿胀抑制率显著升高；小叶三点金提取物各剂量组正常小鼠腹腔毛细血管通透性均显著降低；小叶三点金提取物高、中剂量组正常小鼠和肾上腺摘除小鼠足肿胀度均显著降低，而足肿胀抑制率显著升高（P＜0.05或P＜0.01）；小叶三点金提取物高、中剂量组肾上腺摘除小鼠足趾炎性部位中MDA、NO水平均显著降低，SOD水平均显著升高（P＜0.05）。结论：小叶三点金提取物对小鼠急性炎症有明显抑制作用；其抗炎作用机制与降低MDA、NO水平并提高SOD水平有关，且该抗炎作用的发挥不依赖于下丘脑-垂体-肾上腺轴系统。
关键词 小叶三点金；提取物；抗炎；作用机制；下丘脑-垂体-肾上腺轴系统；小鼠
小叶三点金为豆科山蚂蝗属植物小叶三点金草[Dcsmodium microphyllum（Thunb.）DC.]，别名“斑鸠窝”“爬地香”“哮灵草”“小叶山绿豆”“辫子草”“碎米柴”等，以其根及全草入药[1-2]。小叶三点金在民间常用于治疗尿路感染、糖尿病、泌尿系结石、慢性胃炎、慢性气管炎等病症，具有清热解毒、健脾利湿、消炎止血、止咳平喘、活血化瘀等功效，也被广泛用于治疗毒蛇咬伤、痈疮溃烂、漆疮、痔疮等[1-5]。已有研究表明，蚂蟥属植物具有良好的抗炎、镇痛、抗氧化和保护血管等作用[2]。关于小叶三点金中的主要成分黄酮类[6-7]、酚酸类[2]、生物碱类[2]、萜类和甾醇类[8]等有较多研究，然而关于其相关药理作用及机制的研究鲜有报道。仅有Govindarajan R等[9]研究报道，小叶三点金具有良好的镇痛、抗炎、抗氧化、保护血管等作用。本课题组通过对小叶三点金的前期预实验发现，其具有较好的抗炎活性。考虑到该植物抗炎作用及机制的研究报道较少，因此本课题组在前期研究基础上，考察小叶三点金70%乙醇提取物的抗炎活性并初步探讨其作用机制，为该药用植物的进一步开发应用提供实验依据。
1 材料
1.1 仪器
GL124-1SCN型电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；UV-1780型紫外-可见分光光度计[岛津仪器（苏州）有限公司]；TGL-16GB型离心机（上海安亭科学仪器厂）；全波长型酶标仪[帝肯（上海）贸易有限公司]；BXM-30R型立式压力蒸汽灭菌器（上海迅博实业有限公司医疗设备厂）；RE-1002型旋转蒸发仪（常州市国旺仪器制造有限公司）。
1.2 药品与试剂
醋酸地塞米松片（浙江仙琚制药股份有限公司，批号：180119，规格：0.70 mg）；头孢克肟分散片（浙江莎普爱思药业股份有限公司，批号：180162E，规格：50 mg）；二甲苯、冰醋酸、伊文思蓝（国药集团化学试剂有限公司，批号分别为F20180618、T20180912、20180725）；角叉菜胶（上海源叶生物科技有限公司，批号：YY18704）；水合氯醛（成都市科龙化工试剂厂，批号：2018020102）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）酶联免疫吸附（ELISA）检测试剂盒（批号分别为20180308、20180305、20180316）均购自南京建成生物工程研究所；其余试剂均为分析纯或由实验室自行配制；生理盐水为0.9%氯化钠注射液，水为纯化水。
1.3 药材
小叶三点金药材采自广西南宁市上林县，经广西中医药大学药学院陈勇教授鉴定为豆科山蚂蝗属植物小叶 三 点金 草 [Dcsmodium microphyllum（Thunb.）DC.]全草。
1.4 动物
清洁级昆明种小鼠，雄性，体质量18～22 g，由广西医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK桂2014-0001。小鼠在实验前于清洁级动物房适应性喂养3 d，环境温度为（25±1）℃、湿度约为65%、人造光周期为12 h明暗交替。小鼠自由摄食饮水，饲料为标准啮齿类动物饲料，饮水为纯化水。动物饲料、垫料均由广西医科大学实验动物中心提供。
2 方法
参考文献方法[10-11]进行小叶三点金提取物的抗炎活性作用考察。
2.1 小叶三点金提取物的制备
取小叶三点金药材5 kg，打成粗粉，以70%乙醇在约82℃条件下回流提取3次，每次溶剂倍量分别为12、8、6倍（L/kg），提取时间分别为2、1.5、1 h；滤过，合并滤液，用旋转蒸发仪在水浴条件下减压浓缩，然后于55℃水浴中挥干溶剂，称定质量，得率为12.85%。
2.2 二甲苯致小鼠耳肿胀实验
取小鼠60只，按体质量随机分为空白组、阳性对照组（地塞米松，0.005 g/kg；剂量根据人给药剂量换算并结合预实验结果制定）和小叶三点金提取物高、中、低剂量组（50、30、15 g/kg，以所含原生药量计算，下同；剂量根据急性毒性实验与预实验结果制定），每组12只。各给药组小鼠分别灌胃给药（分别将地塞米松片和小叶三点金提取物以水配制成相应药液），给药体积均为20 mL/kg，qd，连续给药7 d；空白组小鼠同法灌胃等体积水。末次给药1 h后，于小鼠右耳正反两面各涂抹二甲苯10 μL致炎（剂量根据预实验结果设定）；15 min后脱颈椎处死小鼠，沿耳根部剪下两耳，用6 mm打孔器在两耳相同部位打下等面积圆耳片，称定质量，计算耳肿胀度及肿胀抑制率。耳肿胀度（mg）＝右耳片质量－左耳片质量；耳肿胀抑制率（%）＝[（空白组平均耳肿胀度－实验组平均耳肿胀度）/空白组平均耳肿胀度]×100%。
2.3 冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加实验
取小鼠60只，按“2.2”项下方法分组、给药。末次给药1 h后，对各组小鼠尾静脉注射0.3%伊文思蓝溶液10 mL/kg、腹腔注射0.6%冰醋酸溶液10 mL/kg致炎（剂量根据预实验结果设定）；15 min后脱颈椎处死小鼠，腹腔注射生理盐水6 mL冲洗腹腔，轻揉其腹部1 min后，剪开腹腔收集腹腔液；腹腔液以3 000 r/min离心12 min，取上清液，采用紫外-可见分光光度计于590 nm波长处测定光密度（OD）。以OD值表示毛细血管通透性，OD值越高则毛细血管通透性越大。
2.4 角叉菜胶致小鼠足肿胀实验
取小鼠60只，按“2.2”项下方法分组、给药。末次给药1 h后，在各组小鼠右后足趾部皮下注射1%角叉菜胶溶液0.02 mL致炎（剂量根据文献[11]设定）；15 min后脱颈椎处死小鼠，剪取其后双足趾相同部位，称定质量，计算小鼠足肿胀度及肿胀抑制率。足肿胀度（mg）＝小鼠右后足趾质量－小鼠左后足趾质量；足肿胀抑制率（%）＝[（空白组平均足肿胀度－实验组平均足肿胀度）/空白组平均足肿胀度]×100%。
2.5 二甲苯致肾上腺摘除小鼠耳肿胀实验
取小鼠60只，于术前1天灌胃头孢克肟60 mg/kg（以水配制，下同）给药预防感染。以5%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射麻醉小鼠，剃去背部毛，以70%乙醇消毒皮肤后，在其胸腰椎交界处，沿背部正中线、背肋后缘切一约0.5 cm长的切口，以小镊子扩大切口并轻轻推开腹腔脏器和组织，轻轻摘除左右两侧肾上腺腺体（肾上腺在脊柱下方肾脏前内侧可见，呈淡黄色，与周围不规则的脂肪组织有明显区别）。切口以棉球稍止血后缝合肌肉和皮肤，然后涂以碘伏消毒，术后第2天对小鼠灌胃头孢克肟60 mg/kg，术后3 d内以5%葡萄糖生理盐水溶液代替水饲养。术后第3天时，按“2.2”项下方法分组、给药，并进行二甲苯致耳肿胀实验，计算耳肿胀度及肿胀抑制率。
2.6 角叉菜胶致肾上腺摘除小鼠足肿胀实验
取小鼠60只，按“2.5”项下方法进行双侧肾上腺摘除手术。术后第3天时，按“2.4”项下方法分组、给药，并进行角叉菜胶致足肿胀实验，计算足肿胀抑制率。同时，取其右足足趾炎性部位，剪碎，以生理盐水4 mL浸泡，冰上匀浆后，以3 000 r/min离心10 min，取上清液于－20℃保存。参照相应试剂盒说明书操作，采用ELISA法以酶标仪测定组织中MDA、NO、SOD的水平。
2.7 统计学方法
采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析。实验数据均以±s表示，采用单因素方差分析，如果方差齐则采用LSD法进行组间比较，方差不齐则用Dunnett’s T3法进行组间比较。P＜0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 小叶三点金提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响
与空白组比较，阳性对照组和小叶三点金提取物高、中剂量组小鼠耳肿胀度均显著降低，耳肿胀抑制率均显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与阳性对照组比较，小叶三点金提取物低剂量组小鼠耳肿胀度显著增高，耳肿胀抑制率显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），而小叶三点金提取物高、中剂量组小鼠耳肿胀度及肿胀抑制率差异均无统计学意义（P＞0.05），详见表1。
3.2 小叶三点金提取物对冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加的影响
与空白组比较，阳性对照组和小叶三点金提取物各剂量组小鼠腹腔毛细血管通透性均显著增加，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与阳性对照组比较，小叶三点金提取物各剂量组小鼠腹腔毛细血管通透性差异无统计学意义（P＞0.05），详见表2。
表1 各组小鼠耳肿胀度及肿胀抑制率（±s，n＝12）
Tab 1 Ear swelling degree and swelling inhibition rate of mice in each group（±s，n＝12）

注：与空白组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与阳性对照组比较，ΔP＜0.05
Note：vs.blank group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.positive control group，ΔP＜0.05
表2 各组小鼠腹腔毛细血管通透性（±s，n＝12）
Tab 2 Abdominal capillary permeability of mice in each group（±s，n＝12）

注：与空白组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01
Note：vs.blank group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01
3.3 小叶三点金提取物对角叉菜胶致小鼠足肿胀的影响
与空白组比较，阳性对照组和小叶三点金提取物高、中剂量组小鼠足肿胀度均显著降低，足肿胀度抑制率显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与阳性对照组比较，小叶三点金提取物低剂量组小鼠足肿胀度显著升高，足肿胀抑制率显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），而小叶三点金高、中、低剂量组小鼠足肿胀度及肿胀抑制率差异均无统计学意义（P＞0.05），详见表3。
表3 各组小鼠足肿胀度及肿胀抑制率（±s，n＝12）
Tab 3 Toe swelling degree and swelling inhibition rate of mice in each group（±s，n＝12）

注：与空白组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与阳性对照组比较，ΔP＜0.05
Note：vs.blank group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.positive control group，ΔP＜0.05
3.4 小叶三点金提取物对二甲苯致肾上腺摘除小鼠耳肿胀的影响
与空白组比较，阳性对照组和小叶三点金提取物高、中剂量组肾上腺摘除小鼠耳肿胀度均显著降低，耳肿胀抑制率显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与阳性对照组比较，小叶三点金提取物低剂量组肾上腺摘除小鼠耳肿胀度显著增高，耳肿胀抑制率显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），而小叶三点金提取物高、中剂量组肾上腺摘除小鼠耳肿胀度及肿胀抑制率差异均无统计学意义（P＞0.05），详见表4。
表4 各组肾上腺摘除小鼠耳肿胀度及肿胀抑制率（±s，n＝12）
Tab 4 Ear swelling degree and swelling inhibition rate ofadrenalectomized mice in each group（±s， n＝12）

注：与空白组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与阳性对照组比较，ΔP＜0.05
Note：vs.blank group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.positive control group，ΔP＜0.05
3.5 小叶三点金提取物对角叉菜胶致肾上腺摘除小鼠足肿胀的影响
3.5.1 肿胀度 与空白组比较，阳性对照组和小叶三点金提取物高、中剂量组肾上腺摘除小鼠足肿胀度均显著降低，足肿胀抑制率显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与阳性对照组比较，小叶三点金提取物低剂量组肾上腺摘除小鼠足肿胀度显著增高，足肿胀抑制率显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），而小叶三点金提取物高、中剂量组肾上腺摘除小鼠足肿胀度及肿胀抑制率差异均无统计学意义（P＞0.05），详见表5。
表5 各组肾上腺摘除小鼠足肿胀度及肿胀抑制率（±s，n＝12）
Tab 5 Toe swelling degree and swelling inhibition rate of adrenalectomized mice in each group（±s， n＝12）

注：与空白组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与阳性对照组比较，ΔP＜0.05
Note：vs.blank group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.positive control group，ΔP＜0.05
3.5.2 足趾炎性部位中MDA、SOD、NO水平 与空白组比较，阳性对照组和小叶三点金提取物高、中剂量组肾上腺摘除小鼠足趾炎性部位中MDA、NO水平均显著降低，SOD水平均显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与阳性对照组比较，小叶三点金提取物低剂量组肾上腺摘除小鼠足趾炎性部位中MDA、NO水平均显著降低，SOD水平显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05），而小叶三点金提取物高、中剂量组肾上腺摘除小鼠足趾炎性部位中MDA、SOD、NO水平差异均无统计学意义（P＞0.05），详见表6。
表6 各组肾上腺摘除小鼠足趾炎性部位中MDA、SOD、NO水平（±s，n＝12）
Tab 6 The levels of MDA，SOD and NO in inflammatory site of toes in adrenalectomized mice in each group（±s，n＝12）

注：与空白组比较，＊P＜0.05；与阳性对照组比较，ΔP＜0.05
Note：vs.blank group，＊P＜0.05；vs.positive control group，ΔP＜0.05
4 讨论
中药以其种类繁多、成分复杂多样、药理作用广泛、毒副作用少等特点成为抗炎药物研究的首选对象。炎症通常会改变机体的正常生理指标，诱发多种急、慢性炎症疾病[12]，并使含血管系统的生物机体产生复制的防御反应[13-14]。目前，临床治疗抗炎药物是仅次于抗感染药物的第二大类药物，除肾上腺皮质激素类与非甾体类抗炎药物以外，还涉及部分中药，应用较为广泛[15]。许多清热解毒及抗凝血化瘀中药具有抗炎、改善血液循环功能，其在防治急慢性炎症、腹腔感染性疾病等方面具有明显疗效[16-17]。实验研究证实，中药的抗炎作用机制具多途径作用的特点，主要包括影响下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴（HPAA）系统功能、抑制花生四烯酸代谢、干扰炎症细胞、抗血栓生成、清除氧自由基等方面，与现代药理学炎症机制研究相对应，其研究和开发价值越来越受到学者的重视[18-19]。
本研究采用二甲苯、醋酸、角叉菜胶等分别建立小鼠炎症模型，并考察了不同剂量的小叶三点金提取物的抗炎作用。结果显示，高、中剂量的小叶三点金提取物对二甲苯致正常小鼠和肾上腺摘除小鼠的耳肿胀均有明显的抑制作用；不同剂量小叶三点金提取物对冰醋酸致正常小鼠腹腔毛细血管通透性增加均具有明显的抑制作用；不同剂量小叶三点金提取物对角叉菜胶致正常小鼠足肿胀有明显抑制作用，高、中剂量小叶三点金提取物对角叉菜胶致肾上腺摘除小鼠足肿胀有明显的抑制作用。
进一步对角叉菜胶致炎模型肾上腺摘除小鼠足趾炎性部位中MDA、SOD、NO水平进行考察后发现，高、中剂量小叶三点金提取物能显著降低小鼠炎性部位中MDA、NO水平，升高SOD水平。MDA是脂质氧化终产物，会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，且具有细胞毒性；SOD是生物体内重要的抗氧化酶，具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质[20]；NO是一种重要的炎症介质，能够诱导促炎症因子，如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）等的产生[21]。本研究表明，小叶三点金提取物可通过降低大鼠足趾炎性部位中MDA、NO水平和提高SOD水平来发挥抗炎作用。
在炎症过程中，体内的抗炎机制对于机体稳态的维持至关重要。HPAA系统是机体神经-内分泌-免疫调节网络中一条重要的体液免疫调节通路，该系统分泌的激素不仅来源于内分泌腺，亦可来自外周淋巴细胞，其与炎症免疫关系密切[22]。为此，本研究在正常小鼠的基础上，还以肾上腺摘除小鼠为对象，考察了小叶三点金提取物的抗炎作用。结果显示，小叶三点金提取物对摘除或不摘除肾上腺的小鼠均具有明显的抗炎活性，提示其抗炎作用机制可能与HPAA系统功能无关。
综上所述，小叶三点金提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀、冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加、角叉菜胶致小鼠足肿胀等急性炎症均有明显抑制作用，显示出良好的抗炎活性；其抗炎作用机制与降低MDA、NO水平并提高SOD水平有关，且该抗炎作用的发挥不依赖HPAA系统。
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