不同酿酒葡萄果实类黄酮及香气物质差异分析

奥鹏网院作业

不同酿酒葡萄果实类黄酮及香气物质差异分析
胡 丽,彭文婷,卢浩成,王 军*

(中国农业大学食品科学与营养工程学院,葡萄与葡萄酒研究中心,农业农村部葡萄酒加工重点实验室,北京 100083)

摘 要：利用高效液相色谱-质谱联用和气相色谱-质谱联用技术,分析欧亚种葡萄‘赤霞珠’(无性系338和685)、‘宝石解百纳’和山葡萄品种‘双优’、‘双红’、‘双丰’,以及山欧杂种葡萄品种‘北冰红’果实中花色苷、黄酮醇、黄烷-3-醇和香气化合物含量和组成的差异。结果表明,山葡萄总花色苷含量远高于欧亚种葡萄,以花色素双糖苷为主,山葡萄未检测出酰化的花色苷;欧亚种葡萄只检测出花色素单葡萄糖苷;山欧杂种葡萄既含有花色素单葡萄糖苷,又含有花色素双糖苷,还含有2 种酰化的花色素双糖苷。欧亚种葡萄槲皮素类黄酮醇含量最高,而山葡萄的杨梅酮类黄酮醇含量最高;欧亚种葡萄果皮黄烷-3-醇的平均聚合度高于种子,而山葡萄则相反;山葡萄的C6/C9类挥发性香气物质含量显著高于欧亚种葡萄。通过分析和总结供试品种(品系)果实类黄酮及香气物质含量和组成的差异,这些指标可以为区分欧亚种葡萄、山葡萄和山欧杂种葡萄品种提供参考。

关键词：欧亚种葡萄;山葡萄;山欧杂种葡萄;类黄酮物质;香气物质

决定酿酒葡萄果实品质的因素很多,主要包括糖、酸、单宁、酚类以及香气物质的含量和组成等[1-2]。酚类物质主要存在于葡萄种子和葡萄果皮中,是一类非常重要的次生代谢产物,可赋予葡萄果实和葡萄酒以不同的风味。酚类物质不仅可以帮助植物抵御强烈紫外线照射、抵抗一些病原菌和害虫的伤害,还因其含有的羟基和不饱和双键易被氧化而具有良好的抗氧化性[3]。根据代谢路径的不同,葡萄果实的酚类物质可分为主要在果肉中积累的非类黄酮化合物和主要在外果皮、种子和茎中积累的类黄酮化合物。类黄酮化合物是自然界中分布较广的酚类物质,主要包括花色苷、黄酮醇和黄烷-3-醇等。

花色苷是由具有C6—C3—C6骨架的类黄酮花色素和糖配体组成[4],是糖基化的花色素,葡萄糖与花色素通过糖苷键结合可以形成稳定的花色苷,而葡萄糖又可以进一步通过酯化、乙酰化、香豆酰化或者咖啡酰化被取代,如此形成的各类花色苷在不同的pH值条件下会呈现不同的色调,这对葡萄酒的颜色起着至关重要的作用[5]。黄酮醇是一种多以糖苷形式存在于葡萄果实中的类黄酮物质,且主要存在于果皮中,具有防护紫外线损伤、辅色素化、清除自由基和促进花粉管伸长等生理功能[6];在红葡萄酒中,黄酮醇中的辅色素分子如杨梅苷和槲皮素等可以与单体花色苷相互作用生成稳定的复合物使红葡萄酒颜色更加稳定[7]。黄烷-3-醇是葡萄果实中含量最多的类黄酮化合物,主要存在于葡萄的皮和种子中。黄烷-3-醇类物质不仅赋予葡萄酒以苦味和涩味,还对葡萄酒的陈酿潜力有一定影响。

葡萄和葡萄酒中的香气物质种类丰富,主要包括醇类、酯类、醛类、酸类、萜烯类、降异戊二烯类和甲氧基吡嗪类,这些化合物的含量差异很大,有的质量浓度能达到mg/L级,有的仅痕量ng/L级,有的甚至检测不到[8]。根据存在形式可将这些化合物分为游离态和糖苷结合态2 种形式,游离态香气物质具有挥发性,而糖苷结合态香气物质本身不具有挥发性,但可在酶解或酸解的作用下转变为具有挥发性的、游离态的香气物质,因而糖苷结合态香气物质是一种重要的、潜在的香气成分[9]。挥发性香气物质是葡萄中重要的风味物质,这些物质的种类、含量、感官阈值及其之间的相互作用不仅决定葡萄果实的风味,还决定葡萄酒的风味和典型性[2]。

葡萄果实的酚类物质含量以及挥发性香气成分因种群、品种、产地、栽培等不同而具有较大差异,邢婷婷等[10]对14 个欧亚种红色酿酒葡萄品种(品系)的花色苷组成和含量进行了分析,得出不同品种单体花色苷所占比例有明显差异,花色苷可作为化学指纹区分这14 个葡萄品种(品系);张娟等[11]对采自黄土高原产区的20 种酿酒红葡萄品种中的酚类物质进行了差异分析,表明根据不同葡萄酚类物质的特性,可有选择性的进行葡萄选育工作;涂正顺等[12]对吉林地区的山葡萄果实香气成分进行气相色谱-质谱(gas chromatographymass spectrometry,GC-MS)联用技术分析,结果表明‘双优’、‘双红’、‘左优红’果实中分别含有45、47、48 种香气物质。类似上述的研究在国内有较多报道[13-15],但其中有关欧亚种葡萄和山葡萄果实类黄酮及香气物质含量和组成的差异比较研究较少。因此,本研究以7 个遗传背景不同的成熟葡萄果实为材料,供试材料分别为欧亚种葡萄‘赤霞珠’(无性系338和685)和‘宝石解百纳’,山葡萄品种‘双红’、‘双优’和‘双丰’,以及山欧杂种葡萄品种‘北冰红’,利用高效液相色谱-质谱(high performance liquid chromatographymass spectrometry,HPLC-MS)联用和GC-MS联用技术检测葡萄果实中的类黄酮和香气物质,比较酿酒葡萄不同品种(品系)果实类黄酮及香气物质含量和组成的差异,为后续的品种鉴定和利用提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料

本实验于2018年在北京市海淀区中国农业大学上庄实验站(40°08′12.15″N,116°10′44.83″E)进行,供试葡萄品种(品系)信息如表1所示。南北行向,栽植密度为2.5 m×1.2 m,叶幕形为改良的垂直叶幕形[16],叶幕高度120 cm左右,宽度70 cm左右,留梢量为12～15 支每延长米(行),葡萄园灌溉方式为滴灌,葡萄园管理采用常规管理。

葡萄果实于成熟期(2018/8/21—9/26)采集。采样时选择叶幕两侧,果穗的曝光和背光两面,随机采集果穗底部、中部和顶部无物理性损伤、发育健康的果实,每次重复采集约300 粒浆果,重复3 次。采集样品装入冰盒运回实验室,取50～100 粒浆果进行理化指标分析,其余浆果用液氮速冻后保存于-40 ℃冰箱中,用于类黄酮物质及香气化合物的测定与分析。

表1 供试葡萄品种（品系）信息
Table 1 Information about different grape varieties (clones)investigated in this study

pagenumber_ebook=235,pagenumber_book=226
注:CS338.赤霞珠338;CS685.赤霞珠685;RC.宝石解百纳;BBH.北冰红;SY.双优;SH.双红;SF.双丰。下同。

1.1.2 试剂

乙酸钠、甲醇、二氯甲烷、丙酮(均为分析纯)北京化工厂;类黄酮标准品:二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、儿茶素(catechin,C)、表儿茶素(epicatechin,EC)、表棓儿茶素(epigallocatechin,EGC)、表儿茶素没食子酸酯(epicatechin gallate,ECG)、槲皮素-3-O-葡萄糖苷 美国Sigma公司;乙腈、甲酸、甲醇(均为色谱纯) 美国Fisher公司;AR2000糖苷酶 法国DSM公司。

1.2 仪器与设备
FD-1C-50冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司;RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;Micro 17R离心机 美国赛默飞世尔公司;1100系列LC/MSD Trap-VL HPLC-离子阱质谱联用仪(配有二极管阵列检测器)、1200系列LC/MSD Trap-VL HPLC-三重四极杆质谱联用仪、1200系列HPLC串联Bruker系列离子阱质谱联用仪(配有可变波长检测器)、6890-5975GCMS仪 美国Agilent公司;Cleanert PEP-SPE固相萃取柱(150 mg/6 mL) 美国Bonna-Agela科技公司。

1.3 方法
1.3.1 葡萄果皮花色苷的提取和测定

参照Downey等[17]的方法。准确称取0.100 g葡萄果皮冻干粉于2 mL离心管中,加入50%甲醇溶液1 mL,低温避光超声萃取20 min后,4 ℃、8 000 r/min离心15 min,随后转移上清液于新的离心管中,残渣重复上述步骤,合并2 次提取的上清液,充分混匀后,用0.22 μm有机膜过滤,用于HPLC-MS检测,每个样品重复进样2 次。花色苷的定性根据中国农业大学葡萄酒研究中心建立的葡萄与葡萄酒花色苷指纹谱库[18],花色苷定量用外标法,以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷为外标物做标准曲线,检测出各类花色苷类物质均以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的含量计。标准曲线:y＝59.221x+16.112 8,相关系数为0.998 9。果皮中的花色苷含量以果实鲜质量表示,单位为mg/kg。

HPLC-MS条件:花色苷定性和定量分析使用1100系列HPLC-离子阱质谱联用仪,色谱柱为Kromasil100-5-C18(250 mm×4.6 mm),柱温50 ℃,进样量30 μL,检测波长525 nm,流速1 mL/min。流动相A:水-甲酸-乙腈(92∶2∶6,V/V);流动相B:水-甲酸-乙腈(44∶2∶54,V/V)。洗脱程序:0～1 min,100%～90% A,0%～10% B;1～18 min,90%～75% A,10%～25% B;18～20 min,75% A,25% B;20～30 min,75%～60% A,25%～40% B;30～35 min,60%～30% A,4 0%～7 0% B;3 5～4 0 m i n,3 0%～0% A,7 0%～1 0 0% B。离子阱质谱检测器的采集参数为电喷雾离子源,正离子模式,离子扫描范围为100～1 500 m/z,雾化器压力为30 psi,干燥器流速为10 L/min,干燥气温度为325 ℃。

1.3.2 葡萄果皮黄酮醇的提取和测定

参照1.3.1节花色苷的提取方法,提取后的上清液用0.22 μm有机膜过滤,用于HPLC-MS检测,每个样品重复进样2 次。黄酮醇物质定性方法参照参考文献[19],黄酮醇定量用外标法,以槲皮素-3-O-葡萄糖苷为外标物做标准曲线,检测出的黄酮醇类物质均以槲皮素-3-O-葡萄糖苷的含量计。标准曲线:y＝59.029x-42.801,相关系数为0.997。果皮中的黄酮醇含量以果实鲜质量表示,单位为mg/kg。

HPLC-MS条件:黄酮醇定性和定量分析使用1200系列HPLC串联Bruker系列的离子阱质谱联用仪,色谱柱为ZorbaxEclipseXDB-C18(250 mm×4.6 mm)。柱温40℃,进样量50 μL,检测波长360 nm,流速0.63 mL/min。流动相A:水-甲酸-乙腈(86.5∶8.5∶5,V/V);流动相B:甲酸-水-乙腈-甲醇(8.5∶21.5∶25∶45,V/V)。洗脱程序:0～24.2 min,100%～85.8% A,0%～14.2% B;24.2～27 min,85.8%～84.3% A,14.2%～15.7% B;27～33.4 min,84.3%～81.2% A,15.7%～18.8% B;33.4～39 min,81.2%～76.5% A,18.8%～23.5% B;39～45 min,76.5%～74% A,23.5%～26% B;45～47 min,74%～72.6% A,26%～27.4% B;47～51.6 min,72.6%～68% A,27.4%～32% B;51.6～61.8 min,68%～60% A,32%～40% B;61.8～67.8 min,60%～0% A,40%～100% B;67.8～78.4 min,0%～100% A,100%～0% B。离子阱质谱采用电喷雾离子源,负离子模式,离子扫描范围为m/z 0～1 000,雾化气压力为30 psi,干燥气流速为10 L/min,干燥气温度为325 ℃。

1.3.3 葡萄果皮和种子黄烷-3-醇的提取和测定[20]

游离黄烷-3-醇提取:准确称取0.050 g葡萄果皮/种子冻干粉于2 mL的离心管中,加入含0.5%抗坏血酸的70%丙酮溶液500 μL,充分振荡5 min后,4 ℃、8 000 r/min离心10 min,取上清液转移至新的5 mL离心管中,重复上述操作3 次,将3 次所得上清液合并后摇匀。再取400 μL上述提取液于2 mL离心管中,在常温避光条件下进行氮吹。吹干后加入200 μL含1% HCl的甲醇溶液溶解,再加入200 μL的200 mmol/L乙酸钠溶液中和,将溶解后的溶液经0.22 μm有机膜过滤,用于HPLC-MS检测,每个样品重复进样2 次。

裂解黄烷-3-醇提取:准确称取0.100 g果皮/种子冻干粉于2 mL的离心管中,加入间苯三酚缓冲液(0.5%抗坏血酸,0.3 mol/L盐酸,50 g/L间苯三酚甲醇溶液)1 mL,在50 ℃避光水浴20 min后,加入0.2 mol/L的乙酸钠溶液1 mL终止反应。4 ℃、8 000 r/min离心15 min,取上清液转移至新的离心管中,重复上述操作3 次,将3 次所得上清液合并后摇匀,经0.22 μm有机膜过滤,用于HPLC-MS检测,每个样品重复进样2 次。

黄烷-3-醇的定性根据中国农业大学葡萄酒研究中心建立的葡萄与葡萄酒黄烷-3-醇指纹谱库[20]。黄烷-3-醇的聚合体在酸性条件下发生裂解反应释放游离态的末端单元及与间苯三酚结合形成新的复合物延伸单元[21],用质谱信息对延伸单元进行定性,用标准曲线对各种末端单元、延伸单元和游离单元进行定量。果皮和种子中黄烷-3-醇物质含量的单位为mg/g,计算末端单元和延伸单元的总物质的量与末端单元的总物质的量的比值可得到平均聚合度(mean degree of polymerization,mDP)[22]。黄烷-3-醇定量分别以C、EC、EGC、ECG为外标物,计算4种黄烷-3-醇的含量。果皮和种子中的黄烷-3-醇含量以果实鲜质量表示,单位为mg/kg。标准曲线如下:

C:y＝965.16x+558.87(y＜20 000),相关系数为0.999 7;y＝526.93x+17 110(y≥20 000),相关系数为0.997 2;EC:y＝1 407.6x+929.52(y＜30 000),相关系数为0.999 2;y＝444.48x+28 086(y≥30 000),相关系数为1;ECG:y＝2 850.6x+3 530.3(y＜50 000),相关系数为0.998 1;y＝710.51x+137 514(y≥50 000),相关系数为0.997 9;EGC:y＝19.42x-28.647,相关系数为0.998 1。

HPLC-MS条件:黄烷-3-醇定性和定量分析使用1200系列HPLC串联三重四极杆质谱仪,色谱柱为Poroshell120 EC-C18 column(150 mm×2.1 mm,2.7 μm)。柱温55 ℃,进样量1 μL,检测波长280 nm,流速0.4 mL/min。流动相A为0.1%甲酸溶液,流动相B为加入0.1%甲酸的甲醇-乙腈(1∶1,V/V)的溶液。洗脱程序:0～28 min,90%～54% A,10%～46% B;28～29 min,54%～90% A,46%～10% B。质谱采用电喷雾离子源,负离子模式,雾化气压力为35 psi,干燥气流速为12 L/h,干燥气温度为350 ℃,喷雾电压为4 kV。采用多反应检测模式对目标化合物进行分析。

1.3.4 葡萄果实香气化合物的提取和测定

取保存于低温(-40 ℃)冰箱的葡萄果实50 g,去除果柄和种子,依次加入抑制内源糖苷酶活性的0.5 g D-葡萄糖酸内酯和1 g防止氧化的交联聚乙烯吡咯烷酮,并且破碎至粉末状;4 ℃静置浸渍4 h后于4 ℃、12 000 r/min离心10 min,收集上层澄清葡萄汁。参照Lan Yibin等[23]的顶空固相微萃取(head space-solid phase microextraction,HS-SPME)条件萃取游离态香气物质。

结合态香气物质提取方法参照Lan Yibin等[23]的方法,在活化后的固相萃取柱中加入2 mL葡萄汁,然后依次加入2 mL水和5 mL二氯甲烷,最后糖苷态香气物质用20 mL甲醇溶液洗脱。收集洗脱后的甲醇溶液,在30 ℃真空条件下用旋转蒸发仪蒸干,使用含0.1 g糖苷酶的柠檬酸/磷酸氢二钾缓冲液(0.2 mol/L,pH 5)10 mL重新溶解,随后转移至密闭离心管,37 ℃恒温酶解16 h。释放的结合态香气物质经HS-SPME后进样至GC-MS检测,每个样品重复进样2 次。

HS-SPME条件:准确称取1.0 g NaCl放入15 mL进样小瓶,加入5 mL葡萄汁或糖苷水解液和10 μL作为内标的4-甲基-2-戊醇(1.038 8 g/L),迅速将进样小瓶用带有聚四氟乙烯隔垫的盖子密封。样品瓶在40 ℃、500 r/min加热搅拌30 min,然后将SPME萃取头插入样品瓶顶空部分,继续40 ℃加热搅拌30 min。SPME萃取头在GC进样口(250 ℃)解吸8 min完成进样。

GC-MS条件:参考Wu Yuwen等[24]实验方法。香气化合物定性采用自动解卷积技术对GC-MS全扫描数据文件进行解卷积分析,根据各物质的保留时间以及C7～C24正构烷烃在相同色谱条件下的保留时间对比计算其相应的保留指数,与标样保留指数、质谱图以及NIST Chemical WebBook文献中收录的极性柱条件下测得的保留指数比较,差值绝对值小于50的组分可定性为该化合物。定量方法参考Zhang Mingxia等[25]实验方法,利用标准样品香气物质在模拟葡萄汁溶液中的标准曲线对己有标准样品的物质定量;利用化学结构、官能团相似、碳原子数相近的标样香气物质对没有标样的物质的标准曲线进行半定量,样品及标准曲线均通过相同浓度的4-甲基-2-戊醇作为内标对仪器的响应状态进行矫正。香气物质的含量以果实鲜质量计算,单位表示为μg/kg。

1.4 数据处理
每个品种3 个重复,实验结果以pagenumber_ebook=237,pagenumber_book=228表示。使用Microsoft Excel 2016、SPSS 23.0和Origin 8.5软件进行数据处理和作图。

2 结果与分析
2.1 供试葡萄品种(品系)果实理化指标分析
表2 供试葡萄品种（品系）果实理化指标
Table 2 Physiochemical parameters of different grape varieties (clones)

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注:同列不同小写字母表示差异显著,P＜0.05。

酿酒葡萄理化指标是决定葡萄酒品质高低的关键因素,对供试葡萄品种(品系)成熟期果实的可溶性固形物、pH值、可滴定酸(以酒石酸计)和百粒浆果质量等理化指标进行测定,结果如表2所示。供试品种的可溶性固形物含量在17.13～20.35 °Brix之间,其中山葡萄的可溶性固形物含量最低。比较果汁的pH值看出,山葡萄和山欧杂种葡萄的pH值普遍低于欧亚种葡萄,尤其是‘双丰’的pH值最低(2.79)。可滴定酸的质量浓度在8.76～20.46 g/L之间,其中‘双丰’含量最高。百粒浆果质量在93.51～176.65 g之间,‘宝石解百纳’(176.65 g)百粒浆果质量最大,其次是‘赤霞珠’(685),‘双丰’和‘双红’百粒浆果质量最小。

2.2 供试葡萄品种(品系)果皮花色苷分析
2.2.1 含量分析

表3 供试葡萄品种（品系）花色苷含量
Table 3 Anthocyanin contents of different grape varieties (clones)mg/kg

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注:同行不同小写字母表示差异显著,P＜0.05;-.未检测到。下同。

如表3所示,共检测出26 种花色苷,包括未酰化、乙酰化、香豆酰化和咖啡酰化的花色苷。在欧亚种葡萄果皮中共检测出19 种花色苷,总花色苷含量范围在400～1 200 mg/kg,其中花色苷总量最多的是‘宝石解百纳’(1 100.57 mg/kg);在山葡萄和山欧杂种葡萄中共检测到21 种花色苷,其中包括7 种双糖苷和14 种单糖苷,总花色苷含量最多的是‘双红’(2 636.05 mg/kg),其次是‘双丰’(2 036.64 mg/kg),最少的是‘北冰红’(772.03 mg/kg)。葡萄果皮中的花色苷总量很大程度上取决于葡萄本身的遗传信息,对比3 个品种类别,可以明显看出山葡萄果皮花色苷总量显著高于欧亚种葡萄,而山欧杂种品种‘北冰红’果皮花色苷总量介于欧亚种葡萄和山葡萄之间。

2.2.2 组成分析

研究表明,欧亚种葡萄常含的花色苷种类主要包括有单糖苷化的花青素、花翠素、甲基花翠素、甲基花青素和二甲花翠素的3-葡萄糖苷衍生物[26-31],而非欧亚种葡萄含有花色素双糖苷[32],典型的非欧亚种葡萄如山葡萄均含有花色素双糖苷[33]。在本研究检测到的花色苷种类中,欧亚种葡萄检测到的花色苷都是单糖苷,其中非酰化5 种、乙酰化5 种、香豆酰化7 种、咖啡酰化2 种,含量最高的是二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷,在‘赤霞珠’338中没有检测到甲基花青素-3-O-咖啡酰化葡萄糖苷。在有山葡萄遗传背景的4 个品种中共检测到了7 种花色素双糖苷,分别为二甲花翠素-3,5-O-双葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-香豆酰化葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-乙酰化葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷、花翠素-3,5-O-双葡萄糖苷、甲基花翠素-3,5-O-双葡萄糖苷、甲基花青素-3,5-O-双葡萄糖苷、花青素-3,5-O-双葡萄糖苷,且二甲花翠素-3-O-香豆酰化葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷和二甲花翠素-3-O-乙酰化葡萄糖苷-5-O-葡萄糖苷只在山欧杂种品种‘北冰红’中检测到,这7 个双糖苷中含量最高的是二甲花翠素-3,5-O-双葡萄糖苷;而在山葡萄遗传背景的4 个品种中都没有检测到花青素的单糖苷,在山葡萄品种‘双丰’、‘双优’和‘双红’中都没有检测到酰化的花色苷。

比较花色苷含量的组成(图1),3 个欧亚种葡萄均是由非酰化、乙酰化、咖啡酰化和香豆酰化的花色苷组成,而3 个山葡萄品种均只检测到非酰化的花色苷;山欧杂种品种‘北冰红’同时检测到非酰化、乙酰化和香豆酰化的花色苷。总体来看4 种花色苷含量占总花色苷含量的比例为非酰化＞乙酰化＞咖啡酰化＞香豆酰化,‘双优’、‘双红’、‘双丰’和‘北冰红’中没有检测到咖啡酰化的花色苷,香豆酰化的花色苷所占比例在4 种花色苷中最低。香豆酰化的花色苷含量在品种间差异较大,其中含量最高的是山欧杂种品种‘北冰红’(24%),其次是欧亚种葡萄,山葡萄中不含有香豆酰化的花色苷。非酰化的花色苷在山葡萄和山欧杂种葡萄中的比例高于欧亚种葡萄,均大于70%。

在本研究中,由于只在山葡萄和山欧杂种葡萄中检测到花色素双糖苷,分析其5 类花色苷中单双糖苷的比例如图2所示,这4 个品种主要是以花色素双糖苷为主。在山欧杂种品种‘北冰红’中检测到少量的花青素类单糖苷,而在山葡萄品种‘双优’、‘双红’和‘双丰’中并未检测到花青素类单糖苷,且在‘北冰红’中检测到的甲基花翠素类和二甲花翠素类单糖苷的含量显著高于3 个山葡萄品种。在3 个山葡萄品种中,5 类花色素双糖苷的比例远高于花色素单糖苷,在山葡萄和山欧杂种葡萄中最主要的花色素双糖苷是二甲花翠素类的双糖苷。

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图1 不同葡萄品种（品系）花色苷组成比例
Fig. 1 Anthocyanin composition of different grape varieties (clones)

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图2 山葡萄和山欧杂种葡萄单双糖苷组成比例
Fig. 2 Proportions of mono-and bis-glucosidic anthocyanins in V. amurensis and interspecific hybrid of V. vinifera and V. amurensis

2.3 供试葡萄品种(品系)果皮黄酮醇分析
2.3.1 含量分析

表4 供试葡萄品种（品系）黄酮醇含量
Table 4 Flavonol contents of different grape varieties (clones)mg/kg

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如表4所示,共检测到12 种黄酮醇化合物,其中包括杨梅酮类(3 种)、槲皮素类(4 种)、西伯利亚落叶松黄酮(1 种)、山柰酚类(2 种)、异鼠李素(1 种)和丁香亭(1 种)。在欧亚种葡萄和山欧杂种葡萄中12 种黄酮醇化合物均被检测到,而在山葡萄品种‘双优’、‘双红’和‘双丰’中没有检测到山柰酚类化合物,在‘双丰’葡萄中只检测到4 种黄酮醇,分别为杨梅酮-3-O-半乳糖苷、杨梅酮-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷和杨梅酮-3-O-葡萄糖醛酸苷。不同品种总黄酮醇含量差异较大,山葡萄总黄酮醇含量显著高于欧亚种葡萄;山欧杂种品种‘北冰红’总黄酮醇含量显著高于欧亚种葡萄‘赤霞珠’,而与‘宝石解百纳’差异不显著;其中总量最多的是‘双红’(399.77 mg/kg),总量最少的是‘赤霞珠’(338)(83.37 mg/kg);在山葡萄中含量最多的化合物是杨梅酮-3-O-半乳糖苷,约占总量的2/3。

2.3.2 组成分析

对供试葡萄品种(品系)果皮中不同种类黄酮醇占总黄酮醇的比例进行分析(图3),7 个品种中共检测到了在葡萄果实中存在的6 种糖苷配基,分别为杨梅酮、槲皮素、山柰酚、西伯利亚落叶松黄酮、异鼠李素和丁香亭,其中杨梅酮类和槲皮素类黄酮醇含量最多。在欧亚种葡萄中槲皮素类黄酮醇占总黄酮醇比例最高,其中‘赤霞珠’最高且都大于70%;而与欧亚种葡萄相比,山葡萄和山欧杂种葡萄中含量最多的是杨梅酮类黄酮醇,尤其是‘双红’和‘双丰’,其比例高达88%;其中‘双丰’只含有杨梅酮、槲皮素两类黄酮醇。山欧杂种品种‘北冰红’与欧亚种葡萄相比,其杨梅酮类黄酮醇含量明显高于欧亚种葡萄,约占总量的55%;与3 个山葡萄品种相比,其西伯利亚落叶松黄酮、异鼠李素、丁香亭和山柰酚类黄酮醇含量明显高于山葡萄。可见,具有欧亚种葡萄血缘和山葡萄血缘的‘北冰红’,其各类黄酮醇含量介于两者之间。

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图3 不同葡萄品种（品系）黄酮醇组成比例
Fig. 3 Flavonol composition of different grape varieties (clones)

2.4 供试葡萄品种(品系)果皮和种子黄烷-3-醇含量和组成分析
如表5、6所示,葡萄果皮中游离黄烷-3-醇主要包括3 个基本单元,分别为C、EC和EGC。比较游离单元、末端单元和延伸单元可知,延伸单元所占比例最高,接近90%,延伸单元主要由EC组成,其次是EGC,ECG和C的含量较低。检测成熟期葡萄果皮中黄烷-3-醇发现,EGC、C和EC均可作为末端单元,并且C是主要的末端单元,其次是EGC。相比于欧亚种葡萄果皮中的黄烷-3-醇总量,山葡萄和山欧杂种葡萄中的黄烷-3-醇远低于欧亚种葡萄,其中含量最少的是‘双红’(224.75 mg/kg)。比较mDP可知,欧亚种葡萄的平均聚合度高于山葡萄,其中最高的是‘赤霞珠’(685)(104.47),该结果与韩梅梅等[22]研究结果不同,可能是由于产地、年份等生态环境不同的原因,而山葡萄果皮中黄烷-3-醇的mDP都小于20,最低的是‘双优’(7.81)。

葡萄种子中检测到的游离黄烷-3-醇主要包括C、EC、ECG和EGC 4 种基本单元。在种子的黄烷-3-醇中延伸单元所占比例最高,延伸单元主要是由EC组成,其次是ECG,而EGC和C含量很少。检测成熟期葡萄种子中黄烷-3-醇发现,EGC、C和EC均可作为末端单元,并且C是主要的末端单元,其次EGC。其中,山葡萄种子中的黄烷-3-醇总量差异较大,最多的是‘双红’(6 705.55 mg/kg),最低的是‘双丰’(2 0 9 7.5 1 m g/k g)。一般来说,在欧亚种葡萄中,种子中的mDP低于果皮,但是计算成熟期种子的黄烷-3-醇的mDP可知,‘宝石解百纳’种子的mDP(45.98)高于葡萄果皮中的(19.1)。而山葡萄品种‘双丰’、‘双红’和‘双优’与山欧杂种品种‘北冰红’的种子mDP远高于果皮,差别最大的是‘双优’,在种子中的mDP能达到128.39,但在果皮中的mDP却为7.81,表现出与欧亚种葡萄明显的不同。相比之下,‘北冰红’因为含有欧亚种葡萄血缘,种子与果皮中的mDP的差异不是特别大,但是种子的mDP(45.07)还是高于果皮(28.64)。

表5 供试葡萄品种（品系）果皮黄烷-3-醇含量
Table 5Flavanol-3-ol contents in the skin of different grape varieties (clones)mg/kg

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表6 供试葡萄品种（品系）种子黄烷-3-醇含量
Table 6Flavanol-3-ol contents in the seeds of different grape varieties (clones)mg/kg

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2.5 供试葡萄品种(品系)果实香气物质含量和组成分析
采收期供试葡萄品种(品系)果实中香气化合物组成复杂,这些香气化合物以游离态和糖苷结合态的形式存在,共66 种;根据其化学机构的不同可分为酸类(2 种)、醇类(9 种)、苯类(2 种)、C6/C9类(13 种)、羰基化合物(7 种)、酯类(16 种)、降异戊二烯类(1 种)、萜烯类(5 种)以及其他(11 种)。表7和表8分别表示供试葡萄品种(品系)果实中游离态和糖苷结合态香气物质的含量。

供试葡萄品种(品系)果实中共检测到58 种游离态香气物质,在7 个不同品种(品系)中C6/C9类是游离态香气物质中含量最丰富的化合物,如图4A所示,占总游离香气物质含量的比值均在85%以上;C6/C9类化合物能够提供青草香,对葡萄酒的香气非常重要,在检测出的C6/C9类香气物质中以(E)-2-己烯醛的含量最高,它也决定了葡萄果实游离态C6/C9类香气物质的含量。其中山葡萄的C6/C9类香气物质含量显著高于欧亚种葡萄和山欧杂种葡萄,含量最高的是‘双丰’(23 991.12 μg/kg),含量最低的是‘北冰红’(10 499.01 μg/kg)。其次游离态香气物质中含量最丰富的化合物是酯类,含量比值范围在3%～8%之间。

供试葡萄品种(品系)果实中结合态香气物质共检测到45种,其中醇类是‘赤霞珠’(338)、‘宝石解百纳’、‘双丰’和‘北冰红’葡萄果实中最主要的结合态香气物质,如图4B所示,占总结合香气物质含量的30%以上;‘赤霞珠’(685)中含量最丰富的是C6/C9类和萜烯类香气物质,以及其他类型香气化合物;酯类物质在‘双优’和‘双红’中含量最高,分别为1 236.64、1 160.9 μg/kg,分别占总结合态香气物质的41%、26%;而C6/C9类香气物质在‘双丰’中含量最多,为1 241.41 μg/kg,占总结合态香气物质的34%。综上,山葡萄的C6/C9类香气物质含量显著高于欧亚种葡萄。因此,C6/C9类香气物质含量的多少可以作为区分山葡萄和欧亚种葡萄的依据。

表7 供试葡萄品种（品系）果实游离态香气物质含量
Table 7 Contents of free aroma compounds in different grape varieties (clones)μg/kg

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表8 供试葡萄品种（品系）果实结合态香气物质含量
Table 8 Contents of conjugated aroma compounds in different grape varieties (clones)μg/kg

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图4 不同葡萄品种（品系）果实游离态香气物质（A）和结合态香气物质（B）组成比例
Fig. 4 Composition of free (A) and conjugated (B) aroma compounds in different grape varieties (clones)

3 结 论
本研究通过对7 个酿酒葡萄(来源于欧亚种葡萄、山葡萄和山欧杂种葡萄)果实类黄酮及香气物质含量和组成的测定,明确了不同种葡萄之间的差异。其中,山葡萄花色苷总量显著高于欧亚种与山欧杂种葡萄;在山葡萄中未检测出酰化的花色苷;在欧亚种葡萄中只检测出花色素单糖苷;在山欧杂种品种‘北冰红’中检测到2 种酰化的花色素双糖苷。在黄酮醇方面,山葡萄黄酮醇总量显著高于欧亚种与山欧杂种葡萄;山葡萄和欧亚种葡萄分别以杨梅酮类和槲皮素类黄酮醇含量最多;在山葡萄品种中均未检测出山柰酚类黄酮醇。对比分析葡萄果皮和种子中的黄烷-3-醇及其mDP,欧亚种葡萄果皮中的黄烷-3-醇总量显著高于山葡萄与山欧杂种葡萄;欧亚种葡萄果皮的mDP高于种子的mDP,而山葡萄和山欧杂种葡萄则相反。果实香气方面,C6/C9类香气物质的含量占香气总量的比值最大;山葡萄中C6/C9类香气物质的含量显著高于欧亚种葡萄。综上所述,不同种葡萄果实类黄酮及香气物质含量和组成的差异明显,未来可以将这些差异指标作为区分欧亚种葡萄、山葡萄和山欧杂种葡萄的理论依据。

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Analysis on Differences in Flavonoids and Aroma Compounds of Different Wine Grape Varieties

HU Li, PENG Wenting, LU Haocheng, WANG Jun*
(Center for Viticulture and Enology, Key Laboratory of Viticulture and Enology, Ministry of Agriculture and Rural Affairs,College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Abstract: In this paper, the differences in the contents and compositions of anthocyanins, flavonols, flavanol-3-ols and aroma compounds in the Vitis vinifera cultivars ‘Cabernet Sauvignon’ (clones 338 and 685) and ‘Ruby Cabernet’, the Vitis amurensis cultivars ‘Shuangyou’, ‘Shuanghong’ and ‘Shuangfeng’, and the interspecific hybrid of the two cultivars‘Beibinghong’ were analyzed by high performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS) and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The results showed that the total anthocyanin content of V. amurensis was much higher than that of V. vinifera, and it was dominated by bis-glucosidic anthocyanins but did not contain acylated anthocyanins. V. vinifera contained only monoglucosidic anthocyanins, while the hybrid cultivar contained both monoglucosidic anthocyanins and bis-glucosidic anthocyanins, as well as two acylated bis-glucosidic anthocyanins.V. vinifera contained the highest content of quercetins, while V. amurensis contained the highest content of myricetins. The mean degree of polymerization of flavanol-3-ols in the skin was higher than that in the seeds of V. vinifera, whereas the opposite was true for V. amurensis. The content of C6/C9 volatile aroma compounds in V. amurensis was significantly higher than that in V. vinifera. The differences in the contents and compositions of flavonoids and aroma compounds of different wine grape varieties (clones) can provide evidence for distinguishing among them.

Keywords: Vitis vinifera; V. amurensis; interspecific hybrid of V. vinifera and V. amurensis; flavonoids; aroma compounds