GC-MS分析慢性氨气应激对肉鸡血清代谢物的影响

奥鹏网院作业

GC-MS分析慢性氨气应激对肉鸡血清代谢物的影响
孙永波，王亚，萨仁娜，张宏福

（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所/动物营养学国家重点实验室，北京 100193）

摘要：【目的】随着养殖业集约化和规模化的发展，舍内环境对畜禽生长的影响日益突出。在密闭舍饲条件下，不断产生有毒有害气体，其中氨气的危害最大，降低畜禽生产性能，威胁动物健康。为此开展慢性氨气应激对肉鸡血清代谢物影响的研究，从小分子物质和代谢途径方面探究氨气导致机体代谢发生的变化，为舍内氨气的合理调控提供数据支持。【方法】试验采用单因素完全随机设计，将96只21日龄健康AA肉鸡随机分成对照组和试验组，每组设4个重复，每个重复12只鸡。对照组氨气浓度为0 mg·kg-1，试验组氨气浓度为45 mg·kg-1。试验在人工模拟呼吸舱内进行，呼吸舱采用全自动化控制温湿度等养殖条件，采用网上平养，自由采食和饮水，24h 光照，试验期为21d。在肉鸡42日龄时，从每个重复中随机抽取2只，翅静脉采血，分离血清。将血清样品预处理后，采用气相色谱/质谱联用技术（gas chromatograph tandem mass spectrometer technology, GC-MS）检测代谢产物，利用质谱数据库对其进行鉴定。通过主成分分析、偏最小二乘法判别分析、正交偏最小二乘法判别分析、t-检验等，寻找差异代谢物，并利用生物信息学方法对差异代谢物进行通路富集分析。【结果】（1）利用 GC-MS 方法，结合质谱数据库对检测到的代谢物进行快速鉴定，在肉鸡血清中共检测到204种代谢物。将代谢组数据导入SIMCA-P软件进行多元统计分析，结合t-检验筛选出 23种差异代谢物，其中上调19个，下调4个。（2）差异代谢物主要涉及能量代谢（乳酸、α-酮戊二酸）、氨基酸代谢（L-别苏氨酸、L-高丝氨酸、烟酰甘氨酸）、脂肪酸代谢（硬脂酸、亚麻酸、亚油酸、胆固醇）以及核苷酸代谢（次黄嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶）等。（3）代谢通路富集分析表明，氨气应激主要影响了肉鸡血清的脂肪代谢通路，如亚油酸代谢、花生四烯酸代谢以及α-亚麻酸代谢。【结论】GC-MS较为全面地检测到血清的代谢物，能够准确地筛选出差异代谢物，同时慢性氨气应激显著影响肉鸡的血清代谢物含量，主要影响脂肪代谢通路，为阐明氨气应激影响营养代谢的机制提供参考。

关键词：肉鸡；代谢组学；血清；代谢物；气相色谱/质谱联用技术

0 引言
【研究意义】血液理化指标能够反映动物的健康状况，分析肉鸡血液指标的变化情况能够了解其生理状态[1]。由于粪便和垫料等含氮有机物的发酵，畜禽舍内持续性的存在低浓度的氨气。动物经呼吸作用吸入氨气，一部分直接与呼吸系统黏膜接触并溶于黏膜表面，一部分通过肺泡的气血屏障进入血液循环[2]。因此，通过测定长期氨气应激肉鸡的血清代谢物的变化，对于了解氨气的有害作用及对肉鸡代谢通路的影响，分析其对畜禽健康影响的作用机制，进而科学调控养殖环境具有重要意义。【前人研究进展】氨气是一种无色、强刺激性的有毒气体，是畜禽舍内危害较大的气体，长期氨气应激损害动物的健康、诱发各种疾病[3-4]。氨气通过呼吸作用到达肺泡，然后进入血液，与血液中的血红蛋白结合，使血红素变为正铁血红素，进而降低血红蛋白的携氧能力，降低畜禽的抵抗力[5]。随着鸡舍氨气浓度的升高，血清GSH-Px活性呈二次曲线降低，CAT活性呈线性降低[6]。氨气应激显著降低肉鸡的抗氧化能力，使血液中抗氧化酶活性降低，丙二醛含量升高[7]。BORELL等[8]研究报道，50mg·kg-1浓度氨气导致保育猪血液中巨噬细胞数量、淋巴细胞数量及皮质酮含量显著增加。WEI等[9]研究表明，70 mg·kg-1浓度氨气导致肉鸡血清球蛋白含量和溶菌酶活性降低。宋弋等[10]发现，高浓度氨气显著降低肉鸡血液中溶菌酶活性以及NK细胞杀伤活性。氨气应激还影响血液中细胞因子的含量，损害肉鸡的免疫功能[11]。李聪等[12]研究舍内不同浓度氨气对肉鸡免疫反应的作用，发现50 mg·kg-1处理组显著降低42日龄肉鸡血清中IL-6以及IL-1β浓度。【本研究切入点】目前国内外研究大多数集中在氨气应激对肉鸡血液中少量的理化指标的影响，缺乏系统性的研究。代谢组学能够反应机体出现的动态复杂的代谢应答和变化，具备其他技术所不具备的优势，在近些年越来越得到广泛的应用[13-15]。目前，有关氨气应激对肉鸡血清代谢物影响的研究未见报道。【拟解决的关键问题】本试验使用气相色谱－质谱联用（gas chromatography- mass spectrum，GC-MS）技术，研究慢性氨气应激条件下肉鸡血清中小分子代谢产物浓度的变化，探究氨气对肉鸡代谢的影响及可能的作用机理，从代谢方面揭示氨气的危害性，为畜禽舍舒适环境参数的制定以及合理调控舍内环境提供依据。

1 材料与方法
1.1 试验设计
试验于2018年4—6月在人工呼吸代谢舱内进行（动物营养学国家重点实验室昌平基地），呼吸舱内环境参数（如温湿度等）通过计算机进行有效控制，使得养殖环境条件保持一致。本试验利用单因子完全随机设计，将21日龄爱拔益加（AA）雄性雏鸡共96只，随机分为2组，每组设置4个重复，每个重复有12只肉仔鸡。对照组氨气浓度为（0±3）mg·kg-1，试验组氨气浓度为（45±3）mg·kg-1。舱外连接氨气瓶，通过减压阀和流量计控制舱内的氨气。每个舱通过Innoval 1412红外光声谱气体监测仪实时监测舱内氨气浓度，保证试验期舱内氨气浓度稳定。试验期3周。

1.2 饲粮与管理
基础饲粮为玉米-豆粕型，参照中国鸡饲养标准（2004）营养需要量配制，代谢能和蛋白质含量分别为12.76 MJ·kg-1和19.94%。肉鸡饲养于单层平养鸡笼内，自由采食和饮水，按照AA肉鸡饲养管理手册进行日常管理，24 h 连续光照。

1.3 测定指标和方法
1.3.1 样品采集 试验结束时（42日龄），禁食12h后在每个重复中随机选择2只健康肉鸡，进行翅静脉采血，收集血液，自然倾斜静置一段时间后，进行离心，3 000r/min处理5min，分离血清后保存在-80℃冰箱中，待测。

1.3.2 样品前处理及GC/MS 分析 肉鸡血清样品从-80℃冰箱中取出后在 4℃冰箱解冻，每管取出 80 μL血清样品转移至 1.5 mL EP管中；加入 10 μL的内标（L-2-氯-苯丙氨酸，0.3 mg·mL-1，甲醇配置），混匀。加入240 μL甲醇-乙腈（2﹕1）溶液，混匀。超声提取后在-20℃下静置，然后低温离心10min（12 000 r/min，4℃），取上清液于衍生瓶中，冷冻干燥挥干样本后加入浓度为15mg·mL-1的甲氧胺盐酸吡啶溶液 80 μL的，混匀， 37℃肟化反应1.5 h；然后加入80 μL的衍生试剂（含1%TMCS的BSTFA）和 20 μL的正己烷，混匀，70℃反应1 h。最后取出样本，室温静置，待上机分析。

气相色谱质谱联用仪型号为7890A-5975C（Agilent,USA）。1μL衍生化后的样品用无分流模式注入GC-MS 系统，经毛细管柱分离后进入质谱系统进行检测。本试验所用载气是高纯度的氦气，流速设置为1.0 mL·min-1。程序升温设置如下：初始温度设定为60℃，以8℃·min-1的速度升温至 310℃，并维持 6 min。电子轰击离子源（EI）温度设置为 230℃，四极杆温度设置为 150℃，电子能量 70EV。扫描方式为全扫描模式（SCAN），质量扫描范围：m/z 在50—600；采用随机顺序进行连续样本分析，尽量降低或避免因仪器信号波动而造成的影响。

1.4 数据分析
本试验中GC-MS 的原始下机数据经 Chroma TOF软件预处理，然后导出数据的矩阵，去除假阳性峰以及内标峰，去冗余以及峰合并。使用工作站软件对每个化合物的特征离子片段谱的碎片质荷比和丰度与 NIST 数据库、Feihn代谢组学数据库的标准离子片段谱库进行比对，以及进行物质结构定性[16]。将数据归一化，然后导入 SIMCA-P 14.0 软件包，进行无监督的主成分分析（PCA），偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）以及正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）。变量权重值（variable important in projection, VIP）大于 1 的变量被认为是差异代谢物。采用200 次响应排序检验的方法来评价模型拟合程度。OPLS-DA 和t-检验相结合，筛选对照组和氨气应激组肉鸡血清的差异代谢物（VIP>1，P<0.05）。利用MetaboAnalyst进行代谢通路富集分析及拓扑分析。

2 结果
2.1 代谢物总离子流色谱图
图1 为肉鸡血清代谢物 GC-MS 的总离子流色谱图。可以看出，氨气应激组与对照组肉鸡血清中各种小分子物质分离情况较好，通过与NIST 数据库比对，共鉴定出204种代谢物。为了进一步深入分析不同处理组代谢物质种类和含量的变化，结合多元变量分析，对差异的代谢物进行定性、定量分析并进行生物学阐释。

2.2 主成分分析
对数据进行无监督的PCA分析后得到得分散点图（图2），每个点代表一个样本。由图可知，对照组和氨气应激试验组间不能较好地区分开。此外，该模型的R2X=0.569，Q2=0.0352，Q2<0.5（Q2>0.5表明模型拟合较好），组内各试验动物间分布也比较离散，需要对数据进一步分析。

2.3 偏最小二乘判别分析（PLS-DA）
为了消除其他因素的影响，采用有监督PLS-DA分析，主要是消除组内差异，凸显组间差异。对肉鸡血清样本代谢组数据进行PLS-DA分析，详见图3。结果显示，对照组和试验组之间无明显的交叉重叠部分，区分度较好（R2X=0.399，R2Y=0.989，Q2=0.744），说明试验处理组长期氨气应激对肉鸡血清代谢物的影响显著。

width=366.95,height=337.05
图1 肉鸡血清总离子流色谱图（A为对照组，B为试验组）

Fig. 1 Total ion chromatograms of serum of broilers. (A is the control group and B is the experimental group)

width=228.15,height=180.75
C1代表对照组样本1，T1代表试验组样本1，其他类推。下同

C1 represents control sample 1, T1 represents test sample 1, and so on. The same as below

图2 肉鸡血清代谢物的主成分分析图

Fig.2 The PCA score scatter plot of serum metabolites in broilers

2.4 正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）
OPLS-DA对PLS-DA模型进行正交矫正，可以更好地区分组间差异，提高模型的有效性和解析能力。为了找出发生显著变化的生物标志物，对数据进行OPLS-DA分析（图4）。由图4可知，试验组和对照组能够很好地分开（R2X=0.399，R2Y=0.989 ，Q2=0.635），说明两组之间的代谢物发生明显改变。PLS-DA 模型置换检验（200 次迭代）的结果见图5，R2=（0.0，0.784）Q2=（0.0，-0.271），图中所有 Q2均在R2之下，且 Q2的回归直线与 y 轴的交点在负半轴，说明OPLS-DA模型未过度拟合，是稳健可靠的。

width=227.65,height=185.05
图3 肉鸡血清代谢物偏最小二乘判别分析图

Fig. 3 The PLS-DA score scatter plot of serum metabolites in broilers

width=227.65,height=183.75
图4 肉鸡血清代谢物正交偏最小二乘判别分析图

Fig. 4 The OPLS-DA score scatter plot of serum metabolites in broilers

2.5 差异代谢物的筛选
OPLS-DA 分析后，根据以下条件：VIP>1，t检验P<0.05，共筛选到23个差异代谢物，其中上调19个，下调4个（表1）。由表1可知，氨气应激肉鸡的血清代谢物α-酮戊二酸、肌醇、3-羟基丁酸、L-高丝氨酸等含量显著升高，而次黄嘌呤、尿嘧啶、乳酸、胸腺嘧啶等含量显著降低。主要引起了肉鸡核苷酸代谢、碳水化合物代谢以及氨基酸代谢等的变化。

width=229.05,height=156.45
图5 OPLS-DA 模型验证图

Fig. 5 Model validation plots of OPLS-DA

火山图（图6）中每个点代表一个代谢物，在图中显示了两个重要的指标，横坐标表示变化差异倍数（取以2为底的对数，试验组/对照组），纵坐标表示t检验的P-value（取以10为底的对数），能够直观且合理地筛选出试验组和对照组间的显著性生物标志物。由图6可知，氨气应激导致肉鸡血清中显著升高2倍以上的代谢物有3-羟基丁酸、反式-9-十八碳烯酸、亚麻酸、L-别苏氨酸，显著降低2倍以上的代谢物有胸腺嘧啶、次黄嘌呤。这些代谢物可以作为氨气应激对肉鸡血清代谢物影响的潜在标志物，有待进一步研究。

2.6 代谢物通路分析
对所鉴定出的显著差异代谢物利用在线工具MetaboAnalyst 3.0进行代谢通路富集分析以及拓扑分析，筛选标准为影响因子>0.2及P<0.05，结果见图7。图中横坐标Pathway impact表征由拓扑分析计算所得的代谢通路的重要性值（值越大，表明试验处理对此代谢通路影响越大），纵坐标−lg(P)表示代谢通路富集分析的显著性水平。与对照组相比，氨气慢性应激主要影响了肉鸡的脂肪代谢通路，如花生四烯酸代谢、亚油酸代谢以及α-亚麻酸代谢等。

3 讨论
3.1 肉鸡血清代谢谱
动物机体的代谢产物在基因调控、信号转导以及蛋白质功能等互作网络的最下游位置，是基因组、转录组、蛋白组等受到机体内外双重因素影响后的最终结果[17]。通过定性和定量分析代谢产物，能够从整体上比较全面的评价动物机体功能状态及其变化，是生物学现象的最终表现[18]。目前，代谢组学技术的应用在动物营养研究中已经越来越普遍，如聂存喜等[19]研究报道了酵母发酵豆粕对肉鸡脂质代谢的影响；孙玲伟等[20]分析了临床酮病、亚临床酮病和健康的奶牛血浆代谢谱差异；范子玲等[21]观测了卵巢静止奶牛和正常发情奶牛的血浆差异代谢物；肖英平等[22]在分析了仔猪早期断奶过程中血清氨基酸代谢谱的动态变化情况下，研究了谷氨酰胺对仔猪代谢的改善作用；AMETAJ等[23]应用代谢组学分析了奶牛饲喂不同比例大麦谷物，瘤胃代谢产物的差异。GC-MS具有一系列的优点，如其灵敏度高、分辨率高、无需衍生化处理等，能够较为敏捷地识别代谢物并进行分析；此外，GC-MS具有较完备的数据库供检索，能够同时测定有机酸、氨基酸、糖、脂肪酸等上百种化合物[24]。本试验基于气相色谱质谱联用技术研究氨气应激对肉鸡血清代谢物的影响，获得了大量有效的代谢物数据，结合SIMCA-P、NIST等分析软件和数据库能够准确的分析鉴定出204种代谢物，其中23种发生显著变化，应用MetaboAnalyst 3.0分析参与的代谢途径，氨气应激主要影响了肉鸡血清的脂肪代谢通路。本研究分析了养殖环境因子氨气影响肉鸡血清代谢产物的变化情况，为阐释氨气应激影响肉鸡健康的作用机制提供了依据。

width=343.55,height=209.75
每个点代表一个代谢物，红色代表上调2倍及以上，蓝色代表下调2倍及以上

Each point represents a metabolite, the red representative is up 2 times and above, and the blue represents 2 times and more

图6 肉鸡血清代谢物火山图

Fig. 6 Volcano plot of serum metabolite of broilers

width=222.75,height=229.5
A：亚油酸代谢；B：α-亚麻酸代谢；C：花生四烯酸代谢。颜色越深表明P值越小

A：Linoleic acid metabolism；B：alpha-Linolenic acid metabolism；C：Arachidonic acid metabolism. The darker the color, the smaller the P value

图7 代谢通路变化

Fig. 7 Topology analysis of metabolic pathways identified in the serum

表1 肉鸡血清主要差异代谢物

Table 1 main significant metabolites in serum of broilers


“↑”表明上调“↓”表明下调；“↑” means up-regulated expression, and “↓” indicates down-regulated

3.2 长期氨气应激对肉鸡代谢的影响
宋弋等[25]研究报道，氨气通过呼吸道经肺泡进入血液循环，一部分转化为尿酸，但是大部分的氨气存留在肉鸡血液中，升高了血氨浓度。高血氨可能影响肉鸡的能量代谢。乳酸是糖酵解的产物，本研究发现氨气应激导致肉鸡血清乳酸含量显著降低，表明在氨气刺激条件下肉鸡的糖酵解途径被减弱。有研究表明，PM2.5应激导致大鼠血清和肝脏乳酸含量显著降低[26-27]。结合本试验结果，表明环境污染可能导致糖酵解代谢通路发生改变，影响机体能量代谢。三羧酸循环（tricarboxylic acid，TCA）是三大营养物质氧化供能的共同代谢途径，是机体能量代谢水平的综合反映，其中α-酮戊二酸（alpha-ketoglutarate，AKG）是TCA重要中间代谢产物，在能量代谢中起到关键作用。有研究发现，脂肪肝[28]或慢性心衰[29]导致血液中的α-酮戊二酸含量升高。本试验结果显示，试验组肉鸡的血清α-酮戊二酸含量显著升高，可能由于肉鸡长期缓慢吸入有害气体，对心脏和肝脏等器官造成损伤，出现糖代谢和脂肪代谢紊乱。但也有研究发现[30]，高血氨使体外培养的人原代肝细胞代谢产物柠檬酸、α-酮戊二酸和苹果酸等表达水平显著降低。这种差异与处理因素、作用时间、剂量以及靶器官相关，具体途径需有针对性的深入研究。

张西雷等[31]报道，舍内高浓度氨气（770 mg·kg-1）显著升高肉鸡血清总蛋白、球蛋白含量，表明高浓度氨气影响肉鸡的蛋白质代谢。氨基酸是构成蛋白质的基本组分，是机体内许多重要的含氮化合物的前体物质，还是构成机体免疫系统的基本物质。本研究发现慢性氨气应激导致肉鸡血清L-别苏氨酸、L-高丝氨酸、烟酰甘氨酸含量显著升高。有研究表明，肝性脑病患者血清中别苏氨酸含量升高[32]；糖尿病大鼠血清高丝氨酸含量显著升高[33]；烟酰甘氨酸是烟酸与甘氨酸结合产物，是代谢综合征的潜在生物标志物，糖尿病患者烟酰甘氨酸含量显著升高[34]。本试验结果显示，慢性氨气应激影响肉鸡氨基酸代谢，以及肉鸡糖代谢，说明氨气影响了肝脏功能，导致肉鸡亚健康并诱发潜在疾病。

研究表明，随着氨气浓度的升高，肉鸡血清中高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和高、低密度脂蛋白胆固醇之比呈线性增加，当氨气浓度达到75 mg·kg-1时，血清中HDL-C含量显著升高[35]；此外，氨气应激显著改变肉鸡腿肌脂肪酸组成，进而影响肉鸡的脂肪代谢[36]。陈威妮等[37]研究报道，糖尿病患者体内具有较高的游离脂肪。郭延生等[38]研究发现，热应激导致奶牛血液亚麻酸、亚油酸、棕榈酸等含量显著升高，表明应激奶牛通过增强脂肪酸β-氧化，释放大量的能量来抵抗应激。本试验结果显示，慢性氨气应激导致肉鸡血清硬脂酸、亚麻酸、亚油酸、反式-9-十八碳烯酸、棕榈酸、十八烯酸、花生四烯酸、D-甘油酸、胆固醇等含量显著升高，脂质代谢出现紊乱，这可能由于氨气应激导致能量负平衡，进而引发机体的脂肪动员。代谢物通路分析表明，氨气慢性应激影响了肉鸡的脂肪代谢通路，主要是亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢和花生四烯酸代谢等。此外，本试验还发现慢性氨气应激导致肉鸡血清中2-羟基丁酸和3-羟基丁酸含量显著升高。2-羟基丁酸是由α-酮丁酸产生的，后者与苏氨酸、蛋氨酸以及谷胱甘肽代谢有关[39]，本试验2-羟基丁酸含量的增加可能是由于慢性氨气应激使肉鸡氧化应激加强[6]，后者导致肝脏谷胱甘肽合成增加，以及胰岛素抵抗引起脂肪氧化增加引起的[40]。3-羟基丁酸是脂肪酸在肝脏氧化分解产生的代谢物，是线粒体氧化还原状态的标识物，其含量高低反映肝脏中的脂肪酸氧化以及生酮氨基酸分解代谢[41]。本试验3-羟基丁酸水平升高，表明肝脏脂类代谢异常，可能是由于氨气应激引起TCA障碍而导致肝脏脂肪动员增加，肝外组织能量利用障碍，因此，慢性氨气应激与机体氧化应激反应有关，造成机体脂肪代谢异常。

尿酸是由嘌呤类核苷酸在酶的作用下生成的代谢物。魏凤仙等研究表明，高氨显著升高肉仔鸡血清尿酸含量[42]。姚中磊等[43]研究报道，随鸡舍中氨气浓度的升高，肉鸡血清尿酸浓度逐渐升高。王琼叶等[30]利用人原代肝细胞建立了高血氨细胞模型，发现高氨处理使黄嘌呤和尿嘧啶、胞嘧啶等水平降低。本研究发现氨气应激导致肉鸡血清次黄嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶等含量显著降低，与上述研究结果相似，表明慢性氨气应激使嘌呤嘧啶代谢受到影响。

4 结论
本试验研究了慢性氨气应激条件下肉鸡血清小分子代谢物的改变，总共筛选到23个差异代谢物，主要涉及脂肪代谢、糖代谢、氨基酸代谢和核酸代谢等。代谢物通路分析表明，氨气应激主要影响了肉鸡的脂肪代谢通路，为今后深入探讨氨气影响肉鸡健康的机制，改善养殖环境，提高畜禽抗病能力提供了新的方向。

References

[1] 乔娜, 干驰, 朱佳琪, 徐旭俊, 陈建泉, 成国祥. 转hLF基因山羊血液生理生化指标检测分析. 南京农业大学学报, 2016, (3): 483-487.

QIAO N, Gan C, Zhu J Q, XU X J, CHEN J Q, CHENG G X. Hematological and biochemical indices in blood of hLF transgenic goat. Journal of Nanjing Agricultural University, 2016, (3): 483-487. (in Chinese)

[2] 魏宝兴. 氨气对仔猪肺部结构及纤维化相关基因表达的影响[D]. 武汉:华中农业大学, 2016.

WEI B X. The influence of ammonia on structure and gene expression of fibrosis of pulmonary tissue in piglets[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2016. (in Chinese)

[3] 高航, 袁雄坤, 姜丽丽, 王军军, 臧建军. 猪舍环境参数研究综述. 中国农业科学, 2018, 51(16): 3226-3236.

GAO H, YUAN X K, JIANG L L, WANG J J, ZANG J J. Review of environmental parameters in pig house. Scientia Agricultura Sinica, 2018, 51(16): 3226-3236. (in Chinese)

[4] 李聪, 卢庆萍, 唐湘方, 张继泽, 丁泽民, 张宏福. 不同氨气浓度对肉鸡生长性能及肉质性状的影响. 中国农业科学, 2014, 47(22): 4516-4523.

LI C, LU Q P, TANG X F, ZHANG J Z, DING Z M, ZHANG H F. Influence of ammonia concentration on growth performance and meat quality of broilers. Scientia Agricultura Sinica, 2014, 47(22): 4516-4523. (in Chinese)

[5] 阳艳林, 薛国聪.畜舍内氨的产生、危害及调控措施. 养猪, 2009, (2): 46-48.

YANG Y L, XUE G C. Produce, harm and control measures of ammonia in the animal house. Swine Production, 2009, (2):46-48. (in Chinese)

[6] 邢焕, 栾素军, 孙永波, 萨仁娜, 张宏福. 舍内不同氨气浓度对肉鸡抗氧化性能及肉品质的影响. 中国农业科学, 2015, 48(21): 4347-4357.

XING H, LUAN S J, SUN Y B, SA R N, ZHANG H F. Effect of ammonia in broiler houses on the antioxidant activity and meat quality of broiler. Scientia Agricultura Sinica, 2015, 48(21): 4347-4357. (in Chinese)

[7] LU M, BAI J, XU B, SUN Q Y, WEI F X, TANG X F, ZHANG H F, LI J, WANG G L, YIN Q Q. Effect of alpha-lipoic acid on relieving ammonia stress and hepatic proteomic analyses of broilers. Poultry Science, 2017, 96(1): 88-97.

[8] BORELL V, OZPINAR E, ESLINGER A, SCHNITZ K M, ZHAO A L, MITLOEHNER Y, BORELL V, OZPINAR E, ESLINGER A. Acute and prolonged effects of ammonia on hematological variables, stress responses, performance, and behavior of nursery pigs. Journal of Swine Health and Production, 2007, 15(15):137-145.

[9] WEI F X, HU X F, XU B, ZHANG M H, LI S Y, SUN Q Y, LIN P. Ammonia concentration and relative humidity in poultry houses affect the immune response of broilers. Genetics and Molecular Research Gmr, 2015, 14(2):3160-3169.

[10] 宋弋, 王忠, 姚中磊, 汪以真.慢性氨气暴露对肉鸡NK细胞杀伤活性和血清新城疫抗体效价和溶菌酶的影响.中国畜牧杂志, 2009, 45(7):47-50.

SONG Y, WANG Z, YAO Z L, WANG Y Z. Effects of chronic ammonia exposure on natural killer cell activity, newcastle disease antibody titer and serum lysozyme levels of broiler.Chinese Journal of Animal Science, 2009, 45(7):47-50. (in Chinese)

[11] 魏凤仙, 胡骁飞, 张敏红, 李绍钰, 徐彬, 蔺萍, 孙全友,李浩.相对湿度和氨气应激对肉仔鸡血氨水平及细胞因子含量的影响.动物营养学报, 2013, 25(10):2246-2253.

WEI F X, HU X F, ZHANG M H, LI S Y, XU B, LIN P, SUN Q Y, LI H. Effects of relative humidity and ammonia stress on plasma ammonia level and cytokine contents of broilers. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2013, 25(10):2246-2253. (in Chinese)

[12] 李聪.不同浓度氨气对肉鸡生长性能及呼吸道黏膜屏障的影响[D]. 北京:中国农业科学院, 2014.

LI C. Effects of Atmospheric ammonia concentration on broiler growth performance and airway mucous barrier[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2014.(in Chinese)

[13] 李亚娟, 王东升, 张世栋, 严作廷, 杨志强, 杜玉兰, 董书伟, 何宝祥. 基于 GC-MS 技术的蹄叶炎奶牛血浆代谢谱分析. 中国农业科学, 2016, 49(21):4255-4264.

LI Y J, WANG D S, ZHANG S D, YAN Z T, YANG Z Q, DU Y L, DONG S W, HE B X. Plasma metabolic profiling analysis of dairy cows with laminitis based on gc-ms. Scientia Agricultura Sinica, 2016, 49(21): 4255-4264. ( in Chinese)

[14] 王林枫, 贾少丹, 杨改青, 朱河水, 柳如意, 严平, 李明,杨国宇. 脂多糖对奶山羊肝脏代谢组学的影响. 中国农业科学, 2015, 48(18):3701-3710.

WANG L F, JIA S D, YANG G Q, ZHU H S, LIU R Y, YAN P, LI M, YANG G Y. Study on the Effect of lipopolysaccharide on hepatic metabolism in dairy goat liver. Scientia Agricultura Sinica, 2015, 48(18): 3701-3710. ( in Chinese)

[15] 孙雨航, 许楚楚, 李昌盛, 夏成, 徐闯, 吴凌, 张洪友.基于1 H NMR 技术的乳热奶牛血清代谢组学分析.中国农业科学, 2015, 48(2):362-369.

SUN Y H, XU C C, LI C S, XIA Cheng, XU C, WU L, ZHANG H Y. 1HNMR-based serum metabolomics analysis of dairy cows with milk fever. Scientia Agricultura Sinica, 2015, 48(2): 362-369. (in Chinese)

[16] CHAN E C Y, KOH P K, MAL M, CHEAH P Y, KONG W E, BACKSHALL A, CAVILL R, NICHOLSON J K, KEUN H C. Metabolic profiling of human colorectal cancer using high-resolution magic angle spinning nuclear magnetic resonance (hr-mas nmr) spectroscopy and gas chromatography mass spectrometry (GC/MS). Journal of Proteome Research, 2009, 8(1):352-361.

[17] PATTI G J, YANES O, SIUZDAK G. Innovation: Metabolomics: the apogee of the omics trilogy. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2012, 13(4):263.

[18] REZZI S, RAMADAN Z, FAY L B, KOCHHAR S. Nutritional metabonomics: applications and perspectives. Journal of Proteome Research, 2007, 6(2):513-525.

[19] 聂存喜.酵母发酵棉粕对肉鸡脂类代谢的影响及其代谢组学研究[D].石河子:石河子大学, 2015.

NIE C X. Effect of Fermented cottonseed meal with yeast on lipid metabolism of broiler chickens and its metabolomic research[D]. Shihezi: Shihezi University. ( in Chinese)

[20] 孙玲伟, 包凯, 李影, 李兰, 张洪友, 夏成, 吴凌. 奶牛临床和亚临床酮病的血浆代谢组学研究. 中国农业科学, 2014, 47(8): 1588-1599.

SUN L W, BAO K, LI Y, LI L, ZHANG H Y, XIA C, WU L. Plasma metabolomics study of dairy cows with clinical and subclinical ketosis. Scientia Agricultura Sinica, 2014, 47(8):1588-1599. ( in Chinese)

[21] 范子玲, 许楚楚, 舒适, 肖鑫焕, 王刚, 白云龙, 张江,赵畅, 夏成. 基于 GC/MS 技术的产后卵巢静止奶牛血浆代谢谱分析. 中国农业科学, 2017, 50(15):3042-3051.

FAN Z L, XU C C, SHU S, XIAO X H, WANG G, BAI Y L, ZHANG J, ZHAO C, XIA C. Plasma metabolic profiling of postpartum dairy cows with inactive ovaries based on gc/ms technique. Scientia Agricultura Sinica, 2017, 50(15):3042-3051. ( in Chinese)

[22] 肖英平.早期断奶仔猪血清代谢组学研究及谷氨酰胺对日粮消化吸收和代谢的影响[D].杭州:浙江大学, 2012.

XIAO Y P. Metabolomic study of serum in early weaned piflets and effects of L-glutamine on nutrient digestibility and metabolism[D]. Hangzhou:Zhejiang university, 2012. ( in Chinese)

[23] AMETAJ B N, ZEBELI Q, SALEEM F, PSYCHOGIOS N, LEWIS M J, DUNN S M, XIA J, WISHART D S. Metabolomics reveals unhealthy alterations in rumen metabolism with increased proportion of cereal grain in the diet of dairy cows. Metabolomics, 2010, 6(4): 583-594.

[24] 代童童, 李耀坤, 刘德武, 柳广斌, 孙宝丽.代谢组学在反刍动物营养研究中的应用进展.动物营养学报, 2017, 29(9):3044-3050.

DAI T T, LI Y K, LIU D W, LIU G B, SUN B L. Advance in the application of metabonomics to nutrition research of ruminants. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2017, 29(9): 3044-3050. (in Chinese)

[25] 宋弋, 王忠, 姚中磊, 孟庆平, 王友明, 汪以真, 呙于明.氨气对肉鸡生产性能、血氨和尿酸的影响研究.中国家禽, 2008, 30(13): 10-12.

SONG Y, WANG Z, YAO Z L, MENG Q P, WANG Y M, WANG Y Z, GUO Y M. Effects of atmospheric ammonia on growth performance, plasma ammonia and uric acid in broilers. China Poultry, 2008, 30(13):10-12. ( in Chinese)

[26] 李扬帆.大气 PM2.5染毒大鼠血清和尿液代谢组学研[D].太原: 山西医科大学, 2016.

LI Y F. Metabolism studies on serum and urine of the ambient fine particulate matter exposure in rats[D]. Taiyuan: Shanxi Medical University, 2016. ( in Chinese)

[27] 石磊. 苯并 (a) 芘及大气 PM2.5染毒大鼠肝和脑代谢组学研究[D]. 太原: 山西医科大学, 2017.

SHI L. Metabolism studies on liver and brain in rats exposed to benzo (a) pyrene and atmospheric fine particulate matter[D]. Taiyuan: Shanxi Medical University, 2017. ( in Chinese)

[28] SAHEBKAR A, SANCHO E, ABELL D, CAMPS J, JOVEN J. Novel circulating biomarkers for non‐alcoholic fatty liver disease: A systematic review. Journal of Cellular Physiology, 2018, 233(2): 849-855.

[29] 陈平安. 慢性心力衰竭患者血清 α 酮戊二酸水平的变化及其临床意义的研究[D]. 广州: 南方医科大学, 2014.

CHEN P A. Variety and clinical significance of serum α 2- oxoglutarate in chronic heart failure[D]. Guangzhou: Southern Medical University, 2014. ( in Chinese)

[30] 王琼叶.高血氨诱导肝细胞损伤及其代谢组学的研究[D]. 郑州: 郑州大学, 2015.

WANG Q Y. A study on hyperammonemia-induced hepatocyte injury and its metabonomics[D]. Zhengzhou: Zhengzhou University, 2015. ( in Chinese)

[31] 张西雷.氨气对肉鸡的影响及地衣芽孢杆菌对氨气减量排放的技术研究[D].泰安:山东农业大学, 2006.

ZHANG X L. The study of effect of the NH3 concentration on the livestock breed and bacillus licheniform let-reducing technology[D]. Tanan: Shandong Agricultural University, 2006. ( in Chinese)

[32] 钟宇, 姚春, 姚凡, 黄国初, 王萌, 杨小徽. 29 例轻微型肝性脑病患者血清中特异性代谢物. 世界华人消化杂志, 2015, 23(34): 5452-5457.

ZHONG Y, YAO C, YAO F, HUANG G C, WANG M, YANG X W. Serum metabolic profling in 29 patients with minimal hepatic encephalopathy.World Chinese Journal of Digestology, 2015, 23(34): 5452-5457. ( in Chinese)

[33] 杨宇峰, 滕飞, 徐娜, 石岩. 脾气虚证2型糖尿病大鼠血液代谢组学研究.中华中医药杂志, 2014, 29(08): 2464-2466.

YANG Y F, TENG F, XU N, SHI Y. Metabolomics research on spleen qi deficiency syndrome T2DM in rat blood. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy, 2014, 29(08): 2464-2466. ( in Chinese)

[34] HUANG C F, CHENG M L, FAN C M, HONG C Y, SHIAO M S. Nicotinuric Acid: A potential marker of metabolic syndrome through a metabolomics-based approach. Diabetes Care, 2013, 36(6): 1729-1731.

[35] SA R, XING H, LUAN S, SUN Y, SUN C, ZHANG H. Atmospheric ammonia alters lipid metabolism-related genes in the livers of broilers (Gallus gallus). Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, 2018, 102(2):941-947.

[36] XING H, LUAN S, SUN Y, SA R, ZHANG H. Effects of ammonia exposure on carcass traits and fatty acid composition of broiler meat. Animal Nutrition, 2016, 2(4):282-287.

[37] 陈威妮.基于代谢组学技术的2型糖尿病中医证的动态研究 [D].广州:广州中医药大学, 2012.

CHEN W N. Dynamic development of traditional Chinese medicine patterns in type 2 diabetes mellitus based on metabonomics analysis[D]. Guangzhou: Guangzhou University of Chinese Medicine, 2012. ( in Chinese)

[38] 郭延生, 贾启鹏, 陶金忠. 基于GC-MS策略的奶牛热应激血液代谢组学研究.畜牧兽医学报, 2015, 46(8):1356-1362.

GUO Y S, JIA Q P, TAO J Z. Blood metabolomic studies of heat stress cow with GC-MS. Acta Veterinaria Et Zootechnica Sinica, 2015, 46(8): 1356-1362. ( in Chinese)

[39] 柳清, 汪永忠, 姜辉, 韩燕全,李钰馨. 基于 GC-TOF-MS 研究威灵仙总皂苷对佐剂性关节炎大鼠血清代谢谱的影响.中国中药杂志, 2016, 41(12): 2321-2328.

LIU Q, WANG Y Z, JIANG H, HAN Y Q, LI Y X. Effect of total saponins of Clematidis Radix et Rhizoma on serum metabolic profile in adjuvant arthritis rats based on GC-TOF- MS. China Journal of Chinese Materia Medica, 2016, 41(12): 2321-2328. ( in Chinese)

[40] GALL W E, BEEBE K, LAWTON K A, ADAM K P, MITCHELL M W, NAKHLE P J, RYALS J A, MILBURN M V, NANNIPIERI M, CAMASTRA S. Alpha-hydroxybutyrate is an early biomarker of insulin resistance and glucose intolerance in a nondiabetic population. PLoS One, 2010, 5(5):e10883.

[41] MIYAZAKI T, HONDA A, IKEGAMI T, IWAMOTO J, MONMA T, HIRAYAMA T, SAITO Y, YAMASHITA K, MATSUZAKI Y. Simultaneous quantification of salivary 3-hydroxybutyrate, 3- hydroxyisobutyrate, 3-hydroxy-3- methylbutyrate, and 2-hydroxybutyrate as possible markers of amino acid and fatty acid catabolic pathways by LC–ESI–MS/MS. Springerplus, 2015, 4(1):494.

[42] 魏凤仙. 湿度和氨暴露诱导的慢性应激对肉仔鸡生长性能、肉品质、生理机能的影响及其调控机制[D].杨凌:西北农林科技大学, 2012.

WEI F X. Effects of exposure to humidity and ammonia induced chronic stress on growth performance,meat quality, physiological function in broilers and its regulating mechanism[D]. Yangling: North West Agriculture and Forestry University, 2012. ( in Chinese)

[43] 姚中磊. 不同氨气浓度对肉仔鸡生长、免疫和血液生理生化指标的影响[D].杭州:浙江大学, 2008.

YAO Z L. Effects of different ammonia concentrations on growth, immunity and physiological-biochemical parameters in broiler chickens[D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2008. ( in Chinese)

Effects of Chronic Ammonia Stress on Serum Metabolites of Broilers Based on GC-MS

SUN YongBo, WANG Ya, SARENNA, ZHANG HongFu

(State Key Laboratory of Animal Nutrition, Institute of Animal Science/Chinese Academy of Agricultural Science, Beijing 100193)

Abstract:【Objective】With the development of intensive and large-scale broiler breeding, the impact of environmental conditions on the growth of livestock and poultry has become increasingly prominent. Under high-density feeding conditions, a large amount of toxic and harmful gases is generated constantly, among which ammonia is the most harmful gas which reduces the performance of livestock and poultry and threatens animal health. The purpose of this experiment was to study the effects of chronic ammonia stress on serum metabolites in broiler chickens, and to explore the changes of metabolism caused by ammonia stress in terms of small molecules and metabolic pathways, so as to provide data support for reasonable regulation of ammonia in the poultry house. 【Method】Ninety-six 21-day-old healthy AA broilers were randomly divided into control group and experimental group by a single factor completely random design, with 4 replicates in each group and 12 chickens per replicate. The control group ammonia concentration was 0 mg·kg-1, the test group ammonia concentration was 45 mg·kg-1. The experiment was carried out in an artificial simulated respiratory chamber, which was fully automated to control the temperature and humidity and the other environmental conditions. Broilers were raised in the nets and the feed and water were provided ad libitum during the entire experimental period. The trial lasted 21 days with 24 h lighting program. They were routinely managed according to the AA broiler feeding manual and immunized according to the routine procedures. Two broiler chickens pre replicate from each treatment were chosen randomly and blood samples were collected from the wing vein at 42 day-old. After pretreatment of serum samples, the metabolites were detected by GC-MS technology, and identified by mass spectral database. Principal component analysis (PCA), partial least-squares discriminant analysis (PLSDA), orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLSDA) and t-test were used to find the different metabolites, and then the bioinformatics methods was used to analyze the differential metabolic pathways. 【Result】Results showed that: (1) A total of 204 metabolites were detected in serum of broiler chickens by GC-MS combining with rapid identification of the detected metabolites performed with a mass spectrometry database. Metabolomics data were imported into SIMCA-P software for multivariate statistical analysis, and then t-test. Twenty-three different metabolites were identified, of which 19 were up-regulated and 4 were down-regulated. (2) Differential metabolites mainly involved energy metabolism (lactic acid, α-ketoglutaric acid), amino acid metabolism (L-Allothreonine acid, L-Homoserine, Nicotinylglycine), fatty acid metabolism (stearic acid, linolenic acid, linoleic acid, cholesterol) and nucleotide metabolism (hypoxanthine, uracil, thymine) and so on. (3) Metabolic pathway enrichment analysis showed that ammonia stress mainly affected the fat metabolism pathway in serum of broiler chickens, including linoleic acid metabolism, arachidonic acid metabolism and α-linolenic acid metabolism. 【Conclusion】 It can be seen that GC-MS can detect serum metabolites comprehensively, and screen differential metabolites accurately. Chronic ammonia stress significantly affected serum metabolites content of broilers, mainly affected fat metabolism pathway.

Key words: broiler; metabonomics; serum; metabolites；GC-MS

收稿日期：2019-04-29；

接受日期：2019-07-03

基金项目：国家重点研发计划（2016YFD0500509）、现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-41）、中国农业科学院科技创新工程（ASTIP-IAS07）

联系方式：孙永波，E-mail：ybsun2014@163.com。通信作者萨仁娜，E-mail：sa6289@126.com

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：width=42.5,height=42.5

（责任编辑 林鉴非）