牛卵泡AGTR2序列结构及表达特性分析

奥鹏网院作业

牛卵泡AGTR2序列结构及表达特性分析
朱芷葳1，侯淑宁1，郝庆玲1，景炅婕2，吕丽华2，李鹏飞1

（1山西农业大学生命科学学院，山西太谷 030801；2山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801）

摘要：【目的】研究牛卵泡发育过程中关键调控蛋白CART的候选受体AGTR2的分子特征和立体结构，并结合AGTR2在不同生理状态牛卵泡的表达特性分析其功能。【方法】同期发情处理后，经B超声波连续监测（每12 h 一次）采集牛双侧卵巢，分离优势卵泡（dominant follicles, DF）和从属卵泡（subordinate follicles, SF）；其中3头牛DF和SF分别分离颗粒细胞（granulosa cells, GCs），抽提总RNA后，经反转录、引物特异性扩增、胶回收及测序，获得AGTR2基因全CDS区；生物信息学方法对其序列结构、亲缘关系及立体结构进行分析；设计AGTR2和内参基因RPLP0 qRT-PCR引物，分析AGTR2在牛DF和SF的差异表达情况；另1头牛DF和SF经4%多聚甲醛固定后，设定阳性、阴性对照组和试验组，应用免疫组织化学技术对AGTR2进行表达和定位分析。【结果】AGTR2 CDS区全长1 089 bp，编码362个氨基酸；牛卵泡AGTR2氨基酸序列与NCBI数据库获得的其他24种动物对应的氨基酸序列BLAST分析表明，该序列与印度水牛序列相似性最高（99.4%），与其他动物序列相似性为92.0%—98.9%；立体结构和功能域分析表明，AGTR2立体结构中包含有7个横跨细胞膜的平行的α螺旋结构，符合G蛋白偶联受体（G-protein-coupled receptors, GPCRs）的典型特征；qRT-PCR分析结果表明AGTR2 mRNA在DF的表达量极显著高于SF（P＜0.01），且差异表达倍数达7.47倍；免疫组织化学分析结果表明AGTR2在牛DF和SF颗粒层、膜层细胞均有表达，特异性显色强度表明AGTR2在SF膜层细胞表达量高于DF。【结论】AGTR2属于G蛋白偶联受体，符合神经肽CART受体的基本特征；本试验为进一步研究AGTR2在牛卵泡发育过程中调控信号通路和激素分泌的机理奠定基础，同时，对后期鉴定CART的受体、深入阐明CART调控牛卵泡发育的作用机理具有重要意义。

关键词：牛；卵泡发育；CART；G蛋白偶联受体；AGTR2

0 引言
【研究意义】牛属于单胎动物，发情期通常仅有一个成熟卵泡排卵，卵巢上其他卵泡最终不能发育为排卵卵泡而走向闭锁。因此，优良种畜卵母细胞来源严重制约着胚胎工程技术的广泛应用。可卡因-苯丙胺调节转录肽（cocaine and amphetamine regulated transcript peptide，CART）是下丘脑分泌的神经肽，其受体为G蛋白偶联受体（G-protein-coupled receptors，GPCRs）家族。课题组合作研究发现，在牛卵泡发育中CART是一个重要的卵泡发育调节因子[1-3]，并通过免疫共沉淀、蛋白分子建模和分子对接对CART的受体展开筛选，将血管紧张素Ⅱ受体-2型（angiotensin II receptor，type 2，AGTR2）作为CART的候选受体[4]。本研究通过牛卵泡AGTR2序列测定预测蛋白功能域，并对优势卵泡（dominant follicles，DF）和从属卵泡（subordinate follicles，SF）AGTR2表达模式进行分析，为后期CART受体的鉴定奠定基础。【前人研究进展】牛卵泡发育过程中，当卵泡波中形成了具有排卵潜力的卵泡时，在黄体素（luteinizing hormone，LH）的刺激下释放卵子，其他卵泡则丧失排卵能力[5-6]。在排卵期前，卵泡类固醇物质雄激素、雌激素和孕酮，在促性腺激素和调节因子的作用下，共同刺激牛卵泡颗粒细胞（granulosa cells，GCs）分泌前列腺素，诱导卵泡排卵[7-9]。AGTR2属于细胞膜GPCRs，在细胞信号转导和激素调控方面具有重要作用[10]。研究表明，肾脏AGTR2对心血管和交感神经调节、水和电解质平衡以及激素分泌具有调控作用[11-12]；AGTR2作为血管紧张素系统关键的一类生物活性肽，对刺激牛排卵前的卵泡发育[13]、兔卵巢正常发育和卵泡形成[14-15]具有重要调控作用。【本研究切入点】牛卵泡发育中卵泡优势化标志着排卵卵泡即将形成，该阶段发育卵泡分化为两类具有显著生理特征的DF和SF，其中DF具有发育为排卵卵泡的潜力，而SF则趋向闭锁。本研究以牛DF和SF作为研究对象，对CART的候选受体AGTR2结构功能域和表达模式进行研究，具有可靠的理论依据。【拟解决的关键问题】试验中运用序列测定、结构预测、表达和定位探讨性研究AGTR2在牛卵泡发育中的调控作用，也为进一步鉴定CART的受体提供依据。

1 材料与方法
1.1 试验动物及样品采集
繁峙县天河牧业肉牛养殖场选择4头12月龄健康的正常发情的海福特母牛，氯前列腺醇（宁波二厂）同期发情处理（2018年11月），B超声波监测并记录卵泡生长情况，出现优势化卵泡（1个卵泡的直径增长率显著高于其他卵泡，此时DF直径约8 mm左右）后，屠宰并采集双侧卵巢置于灭菌的DPBS中，带回实验室处理。分离最大卵泡（DF）和其他卵泡（SF），用于序列测定和qRT-PCR试验的DF和SF（n=3）分别置于灭菌DPBS平皿中分离GCs，-80℃保存备用；用于免疫组化试验的DF和SF（n=1）置于4%的多聚甲醛溶液中固定备用。

1.2 试验方法
1.2.1 总RNA提取与RT-PCR反应 Trizol法提取卵泡GCs总RNA，电泳和浓度测定合格后进行总RNA反转录，建立10 μL反应体系：5×Prime ScriptTMBuffer 2 μL，Prime ScriptTMRT Enzyme Mix1 0.5 μL，Oligo dT Primer 25 pmol，随机引物50 pmol，Total RNA 1 μL，DEPC水定容至10 μL。混匀后置于PCR仪器中，反应条件为37℃ 15 min，85℃ 5 s。

1.2.2 引物的设计与合成 根据Genbank上登录牛AGTR2 mRNA（XM_002699453.4）基因组预测序列，Primer 5.0设计特异性引物，交由Takara公司合成，引物序列见表1。

表1 试验中引物序列

Table 1 Primer sequences used in this study


F. 上游引物；R. 下游引物 F. Sense primers; R. Antisense primers

1.2.3 全CDS区扩增 扩增体系为：12.5 μL 2×Es TaqMasterMix（Cwbio），上下游PCR引物各0.5 μL，2 μL cDNA（稀释10×），9.5 μL ddH2O定容至25 μL。扩增程序：95℃预变性2 min；95℃变性30 s，62℃退火30 s，73℃延伸1 min，30循环；73℃延伸10 min。1%琼脂糖电泳检测后胶回收试盒纯化PCR产物，送交Takara公司测序。

1.2.4 生物信息学分析 测序结果CDS区分析应用ORF finder；NCBI在线BLAST 对24种动物核苷酸和氨基酸序列比对分析；3D结构和结构域用 Conserved Domain Search Services（CD Search）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析。

1.2.5 qRT-PCR检测 依据qRT-PCR试验要求，数据检测设定生物样本重复（n=3）、技术重复（n=3）和内参基因RPLP0（表1）校正。按照标准曲线和目的基因扩增条件进行qRT-PCR反应，反应体系：10 µL SYBR® Green premix Ex TaqTMⅡ，0.4 µL ROX Reference Dye Ⅱ（Takara），上下游引物各0.8 µL（AGTR2-R-F和AGTR2-R-R，表1），2 µL cDNA，ddH2O定容至20 μL。反应条件：95℃变性15 s，60℃1 min，45个循环。

1.2.6 免疫组化技术检测 参照李鹏飞等[3]的试验方法，固定24 h后脱色脱水包埋，连续切片厚度5 μm；二甲苯脱蜡后3% H2O2阻断；5% BSA封闭30 min，滴加100倍稀释兔抗AGTR2多抗（ab19134，Abcam），4℃孵育12 h；滴加二抗显色20 min；苏木精复染25 s后脱水透明并树胶封片。其中阳性对照组由PBS替代一抗；阴性对照组中，兔抗AGTR2一抗与10 μg·mL-1 AGTR2活性肽（ab157871，Abcam）4℃预孵育 12 h后替代一抗。

1.3 统计分析
采用ΔΔCT法计算AGTR2 mRNA相对表达量，基因相对表达水平= 2–ΔΔCT。结果采用均值±SE表示，经RPLP0表达量校正，以TEDDM1基因在DF的表达量作为对照组[16]，SPSS（V 18.0）进行t检验分析。

2 结果
2.1 RT-PCR分析
PCR扩增后，经凝胶电泳检测，可见大小为1 100 bp左右的条带，与AGTR2预期结果1 089 bp大小相符；同时可见电泳结果中有非特异性条带存在，但不影响目的条带的分离纯化（图1）。

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M．DNA Marker；T. AGTR2目的产物 M. DNA Marker; T. Target product of AGTR2

图1 目的片段RT-PCR电泳图

Fig. 1 Electrophoresis pattern of RT-PCR product

2.2 牛卵泡AGTR2序列分析
测序结果显示，牛卵泡AGTR2 CDS区全长1 089 bp，编码362个氨基酸；HMMTOP v2.0分析表明，AGTR2蛋白序列中存在7个跨膜区段（图2，下划线部分），分别位于45—68、77—101、118—139、160—179、210—233、258—282和297—321区段，符合GPCRs的结构特征。

2.3 AGTR2多序列比对及聚类分析
将牛卵泡AGTR2全CDS区序列翻译为氨基酸序列，经NCBI数据库搜索获得其他24种动物对应的氨基酸序列，BLAST分析软件对序列进行比对。结果表明，该序列与印度水牛序列相似性最高（99.4%），与其他动物序列相似性为92.0%—98.9%，表明AGTR2在物种进化过程中保守性较强（图3）。

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*：终止子；下划线：跨膜区段 *: Terminator; Underscore: Transmembrane section

图2 AGTR2序列分析

Fig. 2 AGTR2 sequence analysis

基于不同动物（包括偶蹄类、奇蹄类、鲸鱼、灵长类、食肉类和啮齿类）AGTR2氨基酸序列聚类分析，应用遗传距离邻近法系统发育分析（图4）表明，牛与印度水牛（Bubalus bubalis）遗传距离最近，与野猪（Sus scrofs）遗传距离最远。

2.4 牛AGTR2结构预测
由PDB数据库和CDD数据库预测AGTR2立体结构和功能结构域（图5），结果显示：氨基酸序列45—321之间共形成7个平行排列的螺旋结构（图5-A），并7次横跨胞膜；功能域分析也进一步表明7次跨膜结构（7tm）对AGTR2功能的决定作用，是典型的GPCRs（图5-B）。

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图3 多物种氨基酸序列比对

Fig. 3 Multi-species amino acid sequence alignment

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图4 AGTR2氨基酸序列构建系统发生树

Fig. 4 Phylogenetic tree based on amino acid sequences of AGTR2

2.5 AGTR2 mRNA在牛DF和SF表达分析
qRT-PCR分析结果见图6，由图可见AGTR2 mRNA在DF的表达量极显著高于SF（P＜0.01），且差异表达倍数达7.47倍。

2.6 牛卵泡AGTR2免疫组化定位分析
免疫组化分析结果显示：AGTR2在牛DF和SF颗粒层（GC）和膜层（TC）细胞均有表达（图7-B，E），在DF阳性和阴性对照组（图7-A，C）、SF阳性和阴性对照组（图7-D，F）中均无特异性显色反应；从显色强度上可看出SF膜层AGTR2表达量高于DF。

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图5 AGTR2立体结构和功能域预测

Fig. 5 Predicted 3D structure and functional domains of AGTR2

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**表示在显著水平0.01的结果

Superscript ** indicate significantly different at the level of 0.01

图6 AGTR2在牛DF与SF的表达差异分析

Fig. 6 qRT-PCR analysis of AGTR2 mRNA inbovine DF vs. SF

3 讨论
动物卵泡生长发育的整个过程受到各种内分泌激素和卵泡内生长因子的调控，为了进一步厘清有腔卵泡生长发育的内分泌调控机制，近年来课题组一直致力于筛选和识别参与卵泡生长发育的局部调控分子。该研究经RT-PCR技术获得牛卵泡AGTR2全CDS区，经生物信息学分析表明，牛卵泡AGTR2属于GPCRs，蛋白分子结构中存在7tm结构域。GPCRs属于一类膜受体的统称，其特点是空间结构中均有七个跨膜α螺旋，该结构域将受体蛋白分割为膜内C端、膜外N端、3个膜内Loop环和3个膜外Loop环；同时，在肽链C端和膜内Loop环上均有G蛋白结合位点[17]。由于GPCRs的空间结构在细胞膜内外都有较长的Loop环存在，因此，造成其立体结构的稳定性很差，通过X-射线衍射法获得其晶体结构时，必须通过剪切和修饰使其结构的稳定性提高。在应用型研究方面，通常GPCRs作为许多药物设计的靶点来发挥药物的功效，使得GPCRs具有广泛的应用前景[18]。

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A、B、C分别为优势卵泡阳性对照组、试验组和阴性对照组；D、E、F分别为从属卵泡阳性对照组、试验组和阴性对照组；GC：颗粒细胞；TC：膜细胞；比例尺20 μm

A, B, C: Control group, experiment group and negative control group of DF, respectively; D, E, F: Control group, experiment group and negative control group of SF, respectively; GC: Granulosa cells; TC: Theca cells; Scale 20 μm

图7 AGTR2在牛DF与SF的免疫组化分析

Fig. 7 Immunohistochemical analysis of AGTR2 inbovine DF vs. SF (400×)

蛋白质磷酸化修饰参与细胞增殖、发育、分化、信号转导以及神经调控等生命活动，如CDKs（Ser/Thr激酶）通过激活周期蛋白并形成复合物，参与细胞周期调控[19]，细胞内NADPH 氧化酶和电子传递链相关蛋白均存在磷酸化调控过程[20]。对AGTR2氨基酸序列结构分析表明，AGTR2蛋白分子中包含有5个O-糖基化、5个N-糖基化位点和41个磷酸化位点，这些蛋白修饰位点的存在使得AGTR2在成熟过程中，结构更复杂、调控更精确、作用更专一、功能更完善。

AGTR2分子从立体结构上看，由胞外N端和胞内C端组成，为细胞识别和信号转导功能的发挥提供了分子基础。胞外区域结合细胞外信号分子，胞内区域招募并结合下游信号分子如G蛋白和第二信使等，下游信号分子主要通过cAMP信号通路和磷脂酰肌醇信号通路参与调节体内多项生理活动[21]。目前，AGTR2的生物学功能还不是很清楚，研究的方向主要集中在：AGTR2可能对心脏、血管起保护作用[22-23]、可能与大脑发育和认知功能有关[24]，AGTR2也可能对AGTRl起负调控作用，参与抑制细胞生长、促进细胞凋亡的生物学过程[25-26]。研究表明，啮齿类动物AGTR2仅在有腔卵泡颗粒细胞层表达，对GCs雌激素的分泌有抑制作用[27-28]；然而，SCHAUSER等发现AGTR2仅在牛卵泡膜细胞层表达[29]，这与本研究免疫组化结果不符。AGTR2对牛卵泡发育的作用机理仍不清楚，在闭锁卵泡，AGTR2 mRNA表达量5倍高于正常发育卵泡，这表明AGTR2对卵泡发育具有重要作用[30]。本研究表明，AGTR2 mRNA在DF表达量极显著高于SF（P＜0.01），试验中通过B超声波监测采集的DF和SF，是发情期开始4—5 d，属于第一卵泡发育波；而母牛发情周期仅在最后一个卵泡波DF排卵，因此，推测AGTR2在第一卵泡波DF闭锁中发挥重要调控作用，对其影响卵泡发育的作用机理有待于进一步深入研究。

4 结论
牛卵泡血管紧张素Ⅱ受体-2型属于G蛋白偶联受体家族，在牛卵泡发育过程中，血管紧张素Ⅱ受体-2型可能通过调控颗粒细胞雌激素的分泌，参与卵泡的优势化或闭锁。

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Sequence Structure and Expression Characteristics Analysis of AGTR2 in Bovine Follicle

ZHU ZhiWei1, HOU ShuNing1, HAO QingLing1, JING JiongJie2, LÜ LiHua2, LI PengFei1

(1College of Life Science, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi; 2College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi)

Abstract:【Objective】The aim of study was to identify molecular characteristics and three-dimensional structure of AGTR2 in the bovine follicular development, and the function was analyzed by combining expression characteristics of AGTR2 in different physiological follicles.【Method】Ovaries in the bovine follicular were observed by B-type ultrasonography (twice a day), removed from cows when DF and SF appeared, and then separated DF and SF; GCs were isolated, total RNA was extracted and detected by RT-PCR, specific primers were amplified and sequenced, and CDS region sequence structure was obtained; the bioinformatics method was used to analyze its sequence structure, relationship and three-dimensional structure; the qRT-PCR primers of AGTR2 and reference gene RPLP0were designed to analyze differential expression level of AGTR2 in DF and SF; DF and SF of another cow were fixed with 4% paraformaldehyde, positive, negative control groups and experimental groups were set, expression level and localization of AGTR2 were analyzed by immunohistochemistry. 【Result】The results showed that total length of AGTR2 CDS region was 1 089 bp, encoding 362 amino acids; BLAST analysis of amino acid sequence of AGTR2 and the corresponding amino acid sequence of other 24 animals obtained by NCBI database indicated that the sequence had the highest similarity with buffalo (99.4%) and 92.0%-98.9% with other animals; The three-dimensional structure and functional domain analysis showed that AGTR2 possessed 7 parallel alpha helical structures across the cell membrane, which was a typical G protein-coupled receptor; the results of qRT-PCR analysis showed that expression level of AGTR2 mRNA in DF was significantly higher than SF (P＜0.01), and the differential expression multiple was up to 7.47 times. The immunohistochemical analysis showed that AGTR2 was expressed in GCs and membrane cells layer of DF and SF, and the specific color intensity showed that expression of AGTR2 in SF membrane cells was higher than DF. 【Conclusion】AGTR2 belonged to G protein-coupled receptor and conforms to basic characteristics of CART receptor, and the study laid a foundation for further study on mechanism of AGTR2 regulating signal pathway and hormone secretion during bovine follicular development, meanwhile, it was of great significance for identification of CART receptor and in-depth explanation of mechanism of CART regulating bovine follicular development.

Key words: bovine;follicular development; CART;G protein-coupled receptor;AGTR2

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：width=42.5,height=42.5

doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2020.07.016

收稿日期：2019-01-28；

接受日期：2020-01-13

基金项目：国家自然科学基金（31873002）、山西省国际科技合作项目（201603D421006）、山西省三晋学者和人才引进项目、山西省重点研发计划项目（201703D221020-1，201803D31062）、山西农业大学创新基金项目（zdpy201403/201503）、山西农业大学青年拔尖创新人才支持计划（TYIT201403）

联系方式：朱芷葳，E-mail：dental411@163.com。通信作者李鹏飞，E-mail：adamlpf@126.com。通信作者吕丽华，E-mail：lihualvsxau@126.com

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