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驴乳粉蛋白的特性、结构与组成分析

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发表于 2021-8-13 13:18:30 | 显示全部楼层 |阅读模式
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驴乳粉蛋白的特性、结构与组成分析
樊雨梅1,2,帖 航3,解 晓1,2,史传超1,2,周广运1,2,苏 宁3,*,廖 峰1,2,*

(1.国家胶类中药工程技术研究中心,山东 东阿 252201;2.东阿阿胶股份有限公司,山东 东阿 252201;3.中国检验检疫科学研究院,北京 100176)

摘 要:采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、圆二色谱和基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱法研究德州驴乳粉蛋白质的性质、结构和组成,为德州驴乳的深层次开发提供依据。结果表明,驴乳粉蛋白质量分数为16.10%,等电点均匀分布在4.5~6.5之间,分子质量主要集中在10~20 kDa和53~78 kDa的乳清蛋白区域,以及28~36 kDa酪蛋白区域。通过与马科蛋白图库进行对比,检索出386 种可识别的蛋白,其中有139 种蛋白首次在驴乳中发现,为揭示驴乳的生理功效提供理论基础。

关键词:驴乳粉;基本特性;结构表征;蛋白质组分

目前,驴乳以其营养价值和潜在的健康效益逐渐引起人们的关注。与其他原料乳相比,驴乳最重要的特征是其化学成分与母乳类似[1]。因此,在牛乳蛋白过敏的情况下,与其他反刍动物乳相比,驴乳是良好的婴儿营养替代品[1]。此外,驴乳的生理保健和疾病预防也引发了医学界的关注,流行病学和机制研究已初步证明了驴乳具有一定的减轻氧化应激、抗菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤、改善免疫功能等作用[2-6]。

国内外研究主要集中在探究驴乳的组成、物化和营养性质以及功效,其中2011年在分子水平研究驴乳蛋白质组成取得了重要的进展[7]。此后,关于驴乳蛋白质组学的报道大量增加。研究表明,不同品种、同一品种中的个体动物之间的乳蛋白质含量和相对蛋白质组成不同[8-9]。虽然,目前关于驴乳的研究较多,但是德州驴作为我国主要品种之一,蛋白质组成的研究较少。因此,本实验以德州驴乳粉为研究对象,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)、二维电泳、圆二色谱和基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization-time of fight-mass spectrometry,MALDITOF/TOF-MS)等技术手段揭示德州驴乳粉蛋白质的性质、结构和组成,以期为德州驴乳的深层次开发提供依据。

1 材料与方法
1.1 材料与试剂
冻干驴乳粉 东阿阿胶股份有限公司。

乙腈、甲醇、甲酸(均为质谱纯) 百灵威科技有限公司;牛血清白蛋白、尿素、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)、CHAPS 北京索莱宝科技有限公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒 天根生化科技(北京)有限公司;Tris-base 美国阿拉丁公司;苯甲基磺酰氟 上海碧云天生物技术有限公司;Bio-Lyte 3-10 buffer、Ready Strip IPG Strips、Modified Trypsin(Sequencing Grade,Promega)SDS-PAGE Marker、毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis,CGE)Marker美国Bio-Rad公司;HiLoad 16/60 Superdex 200 pg制备级分子筛分离柱 美国通用电气公司。

1.2 仪器与设备
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MALDI-TOF/TOFMS、Multiskan GO多功能酶标仪 美国Thermo公司;Mini Protean 3 Cell SDS-PAGE仪、Protean IEF cell双向凝胶电泳(2-dimensional gel electrophoresis,2-DE)仪美国Bio-Rad公司;P/ACETM MDQ CGE仪 美国贝克曼库尔特有限公司;AKTA蛋白纯化系统 美国通用电气公司;MOS 450圆二色谱仪 法国Bio Logic公司。

1.3 方法
1.3.1 蛋白质特性的测定

1.3.1.1 BCA法测定蛋白质含量

按照BCA蛋白浓度测定试剂盒的方法检测驴乳粉的蛋白质含量。

1.3.1.2 SDS-PAGE测定蛋白质分子质量范围

根据刘晓等[10]的方法稍作修改。10%驴乳粉溶液稀释10 倍后,加入等量含DTT的2×Loading Buffer缓冲液,充分混匀,沸水浴5 min。浓缩胶5%,分离胶12%。上样量10 μL,将凝胶扫描电子图谱保存,电泳所用的Marker分子质量范围为10~250 kDa。

1.3.1.3 CGE分析蛋白质相对丰度

参考文献[11]的方法,略有改动。毛细管规格为内径100 μm,总长31 cm,有效长度20 cm,柱体温度40 ℃,电动进样,进样电压-10 kV,进样时间1 s,分离电压-12.4 kV,紫外检测波长280 nm,样品贮存温度30 ℃。

1.3.1.4 2-DE分析蛋白质等电点范围

根据陈静廷等[12]的方法,稍作修改。200 μL 10%驴乳粉溶液与800 μL的水化液混匀。取200 μL加载到电泳池,等电聚焦程序见表1。

表1 7 cm胶条的等电聚焦程序
Table 1 IEF program for 7 cm latex

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等电聚焦后立即进行胶条平衡。平衡分两步,每次15 min,分别使用5 mL含1% DTT平衡液和5 mL含2.5%碘乙酰胺平衡液。将平衡好的胶条置于12%聚丙烯酰胺凝胶上,并用1%的琼脂糖固定胶条,进行第二向电泳。凝胶用考马斯亮蓝染色后,以脱色液脱去背景颜色,使用凝胶成像设备扫描成电子图片保存。

1.3.2 蛋白质二级结构的表征

1.3.2.1 蛋白质的分离纯化

酪蛋白的纯化:称取一定量的驴乳粉,加入2.5 倍质量的50~55 ℃水充分溶解乳粉,将配制好的醋酸-醋酸钠溶液缓慢加入驴乳溶液中,直至淡黄色块状胶体完全沉淀为止。在加入缓冲液过程中,使用pH计控制缓冲液的pH值范围在4.6~4.8之间。3 000 r/min离心15 min,上清液为乳清蛋白粗品,沉淀为粗品酪蛋白。将粗品酪蛋白用无水乙醇沉淀3 次,每次洗涤后3 000 r/min离心15 min,最终得到白色洁净的酪蛋白,将酪蛋白移至表面皿中进行减压真空干燥。

乳清蛋白纯化:乳粉乳清蛋白质粗品经0.22 μm滤膜过滤,备用。利用分子筛纯化驴乳粉乳清蛋白。具体条件如下:层析柱条件:HiLoad 16/60 Superdex 200 pg制备级分子筛纯化层析柱,内径16 mm,柱床高度600 mm,柱床体积120 mL,分离范围10~600 kDa;AKTA纯化系统运行参数:流速恒定2 mL/min,室温环境纯化(20~25 ℃),最大压力0.3 MPa,缓冲体系pH 8.0(含100 mmol/L氯化钠的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液),上样量3 mL,检测器包含紫外检测器(280、254、215 nm)、pH检测器、电导率检测器和温度检测器。

1.3.2.2 圆二色谱法检测蛋白质二级结构

参考文献[13]的方法,略有改动。0.5 mg/mL左右的蛋白质样品经过0.45 μm微孔滤膜处理后进行远紫外圆二色谱扫描,超纯水作为空白。测定条件:0.1 cm石英比色杯,温度25 ℃,光径0.1 cm,带宽1 nm,扫描范围250~190 nm,扫描速率0.5 nm/s,用平均残基摩尔椭圆率[θ]表示圆二色谱光谱数据,单位为(deg·cm2)/dmol,通过在线引擎采用SELCON3程序估算蛋白质的二级结构(http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/home.shtml),匹配方式为Closest matching solution with all proteins。

1.3.3 蛋白质组成分析

驴奶粉经SDS-PAGE分离后,将3 个明显的蛋白区域分成3 份切开,转移至EP管中。蛋白质的脱色酶切方法参考文献[14]。浓缩液与基质混合后,采用MALDI-TOF/TOF-MS分析。利用Mascot软件的SwissPort数据库进行搜索。检索分类(Taxonomy)为Equus caballus,Mascot检索P值小于0.05和Mascot得分大于41 分的结果被认为鉴定成功。

1.4 数据处理
以3 次重复实验每次同时做平行实验所得的数据为结果,用平均值表示。

2 结果与分析
2.1 蛋白质的基本性质
2.1.1 蛋白质含量的分析

利用BCA法测定驴乳粉蛋白质质量分数为16.10%,折合驴乳蛋白质质量分数约为1.61%,这与相关研究[15-16]结果一致。

2.1.2 蛋白质分子质量的分布

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图1 驴乳粉SDS-PAGE图
Fig. 1 SDS-PAGE profile of donkey milk powder

如图1所示,分子质量主要分布在3 个区域,10~20 kDa小分子质量的乳清蛋白区域,28~36 kDa的酪蛋白区域,53~78 kDa的大分子乳清蛋白区域。通过分子标记物条带和相关报道[15,17-20]的驴乳蛋白质迁移模式,识别出以下蛋白:乳铁蛋白(分子质量约为75 kDa)、血清白蛋白(分子质量约为67 kDa)、免疫球蛋白(分子质量约为60 kDa)、酪蛋白(分子质量约为28~36 kDa)、β-乳球蛋白(分子质量约为18 kDa)、溶菌酶(分子质量约为15 kDa)、α-乳清蛋白(分子质量约为14 kDa)。

2.1.3 蛋白质丰度

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图2 驴乳粉GCE结果
Fig. 2 GCE spectra of donkey milk powder

由图2可以看出,驴乳粉蛋白质主要集中在酪蛋白区域和小分子质量乳清蛋白区域,且酪蛋白丰度低于小分子质量乳清蛋白丰度,这与Salimei[17]、张岩春[21]、Malacarne[22]等的报道一致。人乳乳清蛋白约占总蛋白50%,而牛乳的乳清蛋白不足20%[23],由此可见,与牛乳相比,驴乳更接近于人乳,更易被消化吸收。酪蛋白与乳清蛋白的比值是牛乳致敏能力的重要影响因素[24],Cunsolo等[8]通过综合分析驴乳的相关临床研究发现,低酪蛋白与乳清蛋白比率是驴乳低致敏性的主要因素之一。

2.1.4 蛋白质等电点

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图3 驴乳粉2-DE图
Fig. 3 2-DE profile of donkey milk powder

如图3所示,水平方向为第一固相pH值梯度等电聚焦,垂直向为第二向垂直板SDS-PAGE。驴乳粉蛋白的等电点均匀分布在4.5~6.5之间,与人体pH值酸碱环境相近。驴乳蛋白质条带清晰单一,结构完整,与Vincenzetti等[25]的报道驴乳蛋白质二维电泳结果一致。A区域分子质量为28~36 kDa,pI在4.5~6之间;B区域分子质量约为19 kDa,pI在5~5.5之间;C区域分子质量为7~19 kDa,pI在5~6之间;D区域分子质量约为19 kDa,pI在6.5左右。根据驴乳常见蛋白分子质量的大小和pI可推断[8,25],A区域蛋白为酪蛋白,B区域蛋白为β-乳球蛋白,C区域蛋白为α-乳清蛋白。

2.2 蛋白质结构的表征
2.2.1 蛋白质的分离纯化

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图4 驴乳粉分子筛纯化洗脱图
Fig. 4 Molecular sieve gel chromatographic patterns of donkey milk powder

从图4可以看出,组分1和组分2之间并无明显280 nm吸收峰,且电泳图谱中也并未发现明显酪蛋白条带,由此可见,经第1步粗分离后,酪蛋白和乳清蛋白已基本分离。第2步经分子筛纯化,由图4可以找到3 个典型性蛋白峰,非常明显3 个典型性蛋白质峰对应3 个不同分子质量的区域的蛋白质,分别为大分子质量乳清蛋白和2 个不同分子质量的小分子质量乳清蛋白。由图4可知,在驴乳粉纯化蛋白质峰前,有一个215 nm吸收峰,该处峰可能为糖类分子及其他大分子杂质。经冻干称质量计算驴乳粉蛋白质综合回收率在90%以上。

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图5 纯化驴乳粉SDS-PAGE图
Fig. 5 SDS-PAGE patterns of puri fied donkey milk powder

由图5可以看出,经等电点沉淀分离酪蛋白,再经分子筛纯化乳清蛋白,电泳条带非常清晰,可得到较为单一的蛋白质组分。由此可见醋酸-醋酸钠等电点沉淀配合Superdex分子筛纯化乳粉中的蛋白质方法较为理想,为后期靶向研究蛋白功能,开发功能性蛋白分子提供理论依据。

2.2.2 蛋白质二级结构分析

表2 各纯化蛋白质组分的二级结构分析
Table 2 Secondary structures of purified protein components from donkey mild powder

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如表2所示,驴乳粉中的酪蛋白二级结构主要以β-折叠、无规卷曲和β-转角为主;大分子质量乳清蛋白α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲比例较为均衡;小分子质量乳清蛋白仍主要以β-折叠、无规卷曲和β-转角为主。这与预期结果一致,Aspre等[26]报道驴乳主要富含脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。而脯氨酸具有环状结构有利于β-转角的形成,缬氨酸和异亮氨酸易形成β-折叠。刘微等[27]也报道人乳β-酪蛋白单体二级结构以β-折叠、无规卷曲和β-转角为主,推测驴乳酪蛋白二级结构与母乳类似,可能是驴乳低致敏性的原因之一。

2.2.3 蛋白质组成的分析

表3 驴乳粉常见蛋白质分析结果
Table 3 Analysis of common protein components in donkey milk

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利用SDS-PAGE结合MALDI-TOF/TOF-MS的方法,共鉴定出386 种蛋白质,显著高于Cunsolo等[7]报道的106 种蛋白、古丽巴哈尔·卡吾力等[14]报道的283 种蛋白、张新浩等[28]报道的216 个乳清蛋白。鉴定出的386 种蛋白质,其中有72 种蛋白为未命名蛋白,剩余314 种已命名蛋白。在314 种已命名蛋白质中,101 种成分是常见的驴乳蛋白,包括87 种免疫λ轻链可变区片段,剩余的14 种蛋白主要是酪蛋白、α-乳清蛋白、β-乳球蛋白、溶菌酶、血清白蛋白,见表3。除常见驴乳蛋白外,有139 种(约占总识别蛋白的36.01%)蛋白首次在驴乳中鉴定出的蛋白,见表4。

根据驴乳蛋白2-DE图谱,酪蛋白部分存在一些蛋白斑点,经MALDI-TOF/TOF-MS鉴定后,发现驴乳蛋白存在3 种酪蛋白:一种是β-酪蛋白(27 kDa,pI 4.91)和2 种α-S2-酪蛋白(27.2 kDa,pI 4.72;25.4 kDa,pI 4.8)。α-S2-酪蛋白的异质性主要取决于磷酸化程度和RNA错误剪接事件产生的内部缺失异构体[8]。研究表明,分子质量25.4 kDa的蛋白与α-S2-酪蛋白的区别在于Asn176~Gln180五肽的缺失[29]。驴乳α-乳清蛋白A和α-乳清蛋白B/C(14.2 kDa)的发现与Bertino等[30]报道一致,α-乳清蛋白(16.3 kDa),是乳清蛋白(Met 90)的氧化甲硫氨酸形式,这是由于体内氧化应激导致的α-乳清蛋白同种型[31]。驴乳β-乳球蛋白存在2 种不同的形式,β-乳球蛋白I和β-乳球蛋白II(同分异构体II B、C、D)[25],但是在本次鉴别中只发现了3 种同分异构体,可能与所使用的鉴别方法的低敏感性有关。在驴乳中,已鉴定出2 个溶菌酶的变体,分子质量分别为14.6 kDa和16.8 kDa,分子质量的差异主要与49、52、61位氨基酸残基不同有关[32]。值得注意的是,此次鉴别出的驴乳血清白蛋白含有607个氨基酸,分子质量为68.3~68.6 kDa,与Cunsolo等[8]报道的驴乳血清白蛋白含有583 个氨基酸,分子质量为65.584 kDa略有不同,但是与鲜马奶血清白蛋白含有的氨基酸及分子质量(607 个氨基酸,68.3 kDa)一致[13]。

表4 驴乳粉首次鉴定蛋白组分分析
Table 4 Analysis of donkey milk powder protein components first identified in this study

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续表4

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续表4

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续表4

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3 结 论
本实验主要研究德州驴乳粉蛋白质的性质、结构和组成。研究表明,驴乳粉蛋白质质量分数为16.10%,等电点均匀分布在4.5~6.5之间,分子质量主要集中在10~20 kDa小分子质量的乳清蛋白区域、28~36 kDa的酪蛋白区域和53~78 kDa的大分子乳清蛋白区域。驴乳粉酪蛋白和小分子质量乳清蛋白二级结构主要以β-折叠、无规卷曲和β-转角为主,大分子质量乳清蛋白二级结构较为均衡。通过与马科蛋白图库进行对比,检索出386 种可识别的蛋白,其中有139 种蛋白首次在驴乳中发现,为揭示驴乳的生理功效提供理论基础。

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Analysis of Characteristics, Structure and Composition of Protein in Donkey Milk Powder

FAN Yumei1,2, TIE Hang3, XIE Xiao1,2, SHI Chuanchao1,2, ZHOU Guangyun1,2, SU Ning3,*, LIAO Feng1,2,*
(1. National Engineering Research Center for Gelatin-based Traditional Chinese Medicine, Dong’e 252201, China;2. Dong’e Ejiao Co. Ltd., Dong’e 252201, China;3. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100176, China)

Abstract: Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), circular dichroism spectroscopy and matrix assisted laser desorption ionization time-of-f l ight mass spectrometry (MALDI-TOF/TOF-MS) were used to reveal the properties, structure and composition of milk powder protein from Dezhou donkeys, aiming to provide a basis for the deep exploitation of Dezhou donkey milk. The results showed that the protein content of the milk powder was 16.10%, the isoelectric point was evenly distributed between 4.5 and 6.5, and the molecular mass was mainly concentrated in the range of 10-20 and 53-78 kDa for whey protein, and 28-36 kDa for casein. By matching against the equine protein library, 386 proteins were identified, 139 of which were first discovered in donkey milk. This study provides a theoretical basis for revealing the physiological effects of donkey milk.

Keywords: donkey milk powder; basic properties; structural characterization; protein fractions

收稿日期:2019-07-11

基金项目:山东省泰山产业领军人才传统产业创新类项目(TSCY20170233)

第一作者简介:樊雨梅(1992—)(ORCID: 0000-0001-5238-1106),女,硕士,研究方向为天然功效成分。E-mail: bzguo9@163.com

*通信作者简介:

苏宁(1979—)(ORCID: 0000-0002-2031-7772),男,副研究员,硕士,研究方向为毒理学安全评价。E-mail: sun@caiq.org.cn

廖峰(1981—)(ORCID: 0000-0001-6251-6772),男,正高级工程师,博士,研究方向为天然产物功效研究与应用。E-mail: liaofengcd@163.com

DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190711-162

中图分类号:TS252.1

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2020)12-0221-07

引文格式:樊雨梅, 帖航, 解晓, 等. 驴乳粉蛋白的特性、结构与组成分析[J]. 食品科学, 2020, 41(12): 221-227. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190711-162. http://www.spkx.net.cn

FAN Yumei, TIE Hang, XIE Xiao, et al. Analysis of characteristics, structure and composition of protein in donkey milk powder[J]. Food Science, 2020, 41(12): 221-227. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190711-162. http://www.spkx.net.cn

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