牦牛曲拉源乳酸菌的产香性能比较

奥鹏网院作业

牦牛曲拉源乳酸菌的产香性能比较
文鹏程1，曹 磊1，杨 敏2，马瑞娟1，张忠明1，张卫兵1,*

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃农业大学理学院，甘肃 兰州 730070）

摘 要：以6 株牦牛曲拉源乳酸菌为研究对象，采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术检测分析发酵乳中的挥发性风味物质，结合相对气味活度值确定发酵乳中关键性风味物质，比较菌株的产香性能差异。结果表明：共鉴定出60 种挥发性风味物质，且不同乳酸菌菌株发酵产生的关键性风味物质的组成及含量存在明显差异。菌株G1产2-庚酮能力强；菌株G1和Q1产生异戊醇与己酸能力强；菌株G2产乙偶姻、糠醇和2-十三酮能力显著高于其他菌株；菌株G4产乙酸和丁酸能力较强。主成分分析结果也表明不同乳酸菌的产香性能存在差异。研究结果可为牦牛曲拉源乳酸菌的应用提供理论依据。

关键词：曲拉；乳酸菌；产香性能；主成分分析

发酵乳中的风味物质形成主要归因于发酵剂的作用，发酵剂中乳酸菌发酵产生的风味物质是发酵乳典型特征风味的基础，发酵剂中乳酸菌菌株的质量与活力对发酵乳的风味和品质影响较大[1-2]。牦牛曲拉是将牦牛乳脱脂后，在自然条件下进行发酵使酪蛋白凝结、干燥后制成的一种发酵乳制品[3-5]。牦牛曲拉不仅可以食用，还可作为制作酸奶的发酵剂，其中蕴藏着丰富的乳酸菌资源[6]。实验室前期从牦牛曲拉中筛选得到了几株发酵性能优良的乳酸菌，但对其产香性能尚不明确。

固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）技术具有灵敏度高、检出限低、分析范围广、萃取条件温和等特点，可直接与气相色谱-质谱（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）联用[7-9]。近年来，SPME-GC-MS技术在食品风味分析中有了快速发展，其在醋[10]、红酒[11]、果蔬[12]、绿茶[13]等相关研究中的应用越来越广泛。

本实验以牦牛曲拉源乳酸菌为研究对象，利用SPME-GC-MS检测分析发酵乳中挥发性风味物质，采用相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV）探讨分析发酵乳中的关键性风味物质，并利用主成分分析法对其产香性能进行比较，以期为青藏高原乳酸菌资源的利用开发提供参考依据。

1 材料与方法
1.1 材料与试剂
脱脂乳粉 黑龙江完达山乳业；MRS琼脂培养基、MRS肉汤培养基 青岛海博生物技术有限公司。

乳酸菌菌株：Q1嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus），Q2耐久肠球菌（Enterococcus durans），G1、G2、G3、G4瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）由甘肃农业大学食品科学与工程学院实验室保藏。

1.2 仪器与设备
SW-CJH-2FD型超净工作台 苏州净化设备有限公司；YX-280A型高压灭菌锅 上海三申医疗器械有限公司；HG303-4型电热恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；TRACE1310-ISQ型GC-MS联用仪 美国Thermo Scientific公司；DVB/CAR/PDMS型萃取头 美国Supelco公司。

1.3 方法
1.3.1 发酵酸乳样品的制备

参照万金敏[14]的方法。发酵酸乳的制作流程：原料乳→检验→标准化→巴氏杀菌（90 ℃，5 min）→加糖→均质（6 8～7 2 ℃，二级均质1.5×1 04、5×103 kPa）→接种（乳基发酵剂添加量为3%）→发酵（42 ℃，4～7 h）→降温→后发酵（4 ℃，24 h）→成品。

1.3.2 挥发性风味物质测定

萃取条件：取8 mL样品于顶空瓶并加入2 g NaCl，密封并摇匀。50 ℃平衡60 min，萃取头于50 ℃水浴锅中磁力搅拌吸附30 min；萃取头在250 ℃老化1 h；250 ℃解吸附3 min。

GC条件：HP-5毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；采用程序升温方式，起始温度35 ℃，保持5 min，以5 ℃/min上升至140 ℃，保持2 min，以10 ℃/min上升至250 ℃，保持3 min；汽化室温度250 ℃；载气为He，流速1.0 mL/min；不分流进样。

MS条件：电子电离源；电子能量70 eV；灯丝电流0.20 mA；离子源温度230 ℃；质量扫描范围m/z 40～500；发射电流100 μA。

1.3.3 定性与定量分析

挥发性成分利用MS全离子扫描模式下的总离子流图谱，以NIST08标准库自动检索获得各组分的质谱数据，通过峰面积归一化法计算各组分相对峰面积的百分含量。每份样品取样3 次，取平均值作为各风味物质组分的相对含量。

1.3.4 关键挥发性物质评价

参照刘登勇等[15]的方法，用ROAV法确定样品中关键挥发性风味物质。先定义对样品风味贡献最大的组分为ROAVmax=100，其他风味成分ROAV计算公式如下：

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式中：Ci和Ti分别为各挥发性物质的相对含量/%和对应的感觉阈值/（μg/L）；Cmax和Tmax分别为对样品总体风味贡献最大组分的相对含量/%和对应的感觉阈值/（μg/L）。

所有组分的ROAV不大于100，而且ROAV越大的组分对样品总体风味的贡献也越大。一般认为ROAV不小于1的组分为所测样品的关键风味化合物，0.1≤ROAV＜1的组分对所测样品的总体风味具有重要修饰作用[16]。

1.4 数据处理
采用Microsoft Excel 2010和SPSS 18.0（SPSS Inc.,USA）数据处理系统进行分析，采用ANOVA进行方差分析，用Duncan法进行多重显著性分析和标准偏差计算，利用Origin 8.0软件进行绘图。

2 结果与分析
2.1 单菌发酵乳中挥发性风味物质检测分析
利用SPME-GC-MS技术对6 株不同的乳酸菌发酵过程中产生的风味物质进行检测，得到挥发性成分的总离子流图，将每份样品取样3 次测定后，发现获得的总离子流图大体相同，结果如图1所示。

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图1 乳酸菌发酵乳中挥发性成分总离子流图
Fig. 1 Total ion current (TIC) chromatograms of volatiles extracted from fermented milk produced with pure cultures by SPME-GC-MS

表1 单菌发酵牛乳样品中挥发性风味物质SPME-GC-MS分析
Table 1 Major volatile compounds extracted from fermented milk produced with pure cultures by SPME-GC-MS

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注：—.未检测出；同行不同字母表示差异显著（P＜0.05）。

使用NIST08谱库检索得到发酵乳挥发性风味物质的组成和含量，结果如表1所示。筛选并除去一部分硅氧烷类杂质峰，6 株乳酸菌发酵共产生60 种挥发性物质，不同菌种发酵产生的风味物质组成和含量存在差异。由表1可知，发酵乳样品中的风味物质主要以酸、酮、醛和酯类物质为主，6 株菌发酵均产生2-庚酮、2-壬酮、2-十三酮、正丁酸、异戊醇、糠醇、乙偶姻、乙酸、己酸、癸酸和辛酸，且风味物质含量存在差异。菌株G1产2-庚酮能力显著高于其余菌株（P＜0.05），而在其余菌株之间含量差异不显著（P＞0.05）；菌株G1和Q1产生异戊醇与己酸能力强，显著高于其余菌株（P＜0.05）；菌株G2产乙偶姻、糠醇和2-十三酮能力显著高于其他菌株（P＜0.05）；菌株G4产乙酸和丁酸能力较强。

另由表1可知，4 株杆菌发酵均产生己醛，而在球菌发酵的样品中未检出，且菌株G1产己醛能力高于其他菌株；只在球菌发酵的样品中检测出2,3-戊二酮，且相对含量差异不显著（P＞0.05）。另外，乙基苯、正戊酸和萘为G1发酵产生的特有物质；双戊烯、麦芽醇、2-糠酸甲酯、二羟基丙酮为G2发酵产生的特有成分；间二甲苯为G3所特有的成分；G4发酵产生丙酸和2-丁酮；Q2发酵可产生棕榈酸。

王伟君等[17]研究发现，嗜热链球菌发酵产生的风味物质主要包括2,3-戊二酮和2,3-丁二酮，这与本研究的结果相似。雷华威等[18]研究发现瑞士乳杆菌发酵产生的风味物质中酸类物质占最高比重，与本实验结果一致，原因是本研究的瑞士乳酸菌的产酸能力较强。王丹等[1]研究嗜热链球菌发酵酸乳，结果发现在嗜热链球菌发酵时没有产生乙醛，与本实验结果一致。而Chaves等[19]发现嗜热链球菌具有较强的产乙醛的能力，这可能与不同来源的菌株间的代谢差异性有关。综上所述，不同乳酸菌发酵产生的代谢物质存在差异，因而导致发酵酸乳的风味物质组成有差异。

表2 单菌发酵牛乳中各类挥发性物质数量
Table 2 Compositions and contents of volatile compounds extracted from fermented milk produced with pure cultures

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由表2可知，菌株G1、G2、G3、G4、Q1、Q2发酵分别产生了29、36、30、32、25、27 种挥发性风味物质，其中，菌株G2和G4发酵的牛乳产生风味物质较多，风味物质组成不同及各组分相对含量的不同体现出菌株之间的差异性。酸类物质相对含量在31.18%～76.13%之间，对发酵乳风味的形成具有巨大贡献；酮和醇类物质在2.13%～13.49%范围内，相对含量较高。其余挥发性物质的含量较少，但对形成发酵乳的总体风味依然具有重要作用。王丹等[1]认为发酵乳中复杂多样的挥发性物质赋予发酵乳独特风味，而不同类型的乳酸菌产生这些风味物质的能力存在差异，这与本实验结果一致。在后续实验中不同乳酸菌的代谢差异性可以通过转录组、代谢组学的方法进一步深入研究。

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图2 单菌发酵牛乳样品中挥发性风味物质相对含量热图
Fig. 2 Heatmaps of volatile flavor substances in fermented milk samples produced with pure cultures

发酵乳样品中检测出的羧酸类化合物较多，对酸乳的风味影响很大，酸类物质用于食品中可有效预防杂菌繁殖，赋予食品微酸味而又不掩盖本身所具有的天然风味和香气。乳酸菌发酵产生较多的酮类和较少的醛类物质。酮类风味物质主要来源于多不饱和脂肪酸的氧化和微生物自身的代谢等[20-21]；虽然检测到的醛类物质组分相对较少，但醛类物质阈值整体相对较小，对风味影响巨大[22]。另外，本实验乳酸菌发酵产生少量的酯和内酯及醇类物质。内酯类化合物具有极低的阈值，因此对发酵酸乳风味贡献巨大[23]，酯类主要来源于微生物通过自身代谢产生和一部分脂肪酸水解形成，通过这些作用形成内酯和甲基酮等物质对发酵乳风味有重要影响[20]；虽然乳酸菌发酵产生了少量的醇类物质，但醇类物质阈值基本都很高，因此，其对整体风味影响极小，只有在较高浓度下才对风味产生影响[24]。

由图2可以看出，所有乳酸菌产生风味物质的组成及含量存在差异。根据热图中组成及含量的聚类分析可知，菌株G3和Q2发酵产生的风味物质含量和组成相似，可将其聚为一类，说明这两株菌的产香性能大致相似。另外，菌株Q1与菌株G3和Q2发酵产生的风味物质组成及含量接近。菌株G4与其余菌株发酵产生风味物质的差异最大，距离最远。因此，不同乳酸菌菌株产生风味物质组成及含量差异较大，说明了乳酸菌种间的差异性，其产香能力存在差异。

2.2 不同发酵乳中关键风味化合物的ROAV分析
表3 单菌发酵牛乳中关键性风味物质及对应ROAV
Table 3 ROAVs of key aroma compounds in fermented milk produced with pure cultures

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为进一步确定不同乳酸菌产香性能的差异，采用ROAV法对所发酵产生的风味物质组成和含量结合其感觉阈值进行完善分析，确定其中的关键性风味物质。如表3所示，对未查询到阈值的物质不作分析。6 株乳酸菌菌种发酵的酸乳中，发酵酸乳样品中关键性风味物质存在差异，说明不同乳酸菌的产香性能不同。菌株G1、G2、G3、G4、Q1、Q2发酵酸乳的关键性风味物质分别为10、11、9、8、10、7 种。

酸类物质中辛酸、丁酸和己酸为关键性风味物质（ROAV≥1），辛酸具有水果酸味和淡酸味[25]，乙酸能够呈现出醋酸的味道，丁酸有奶酪的味道[20,26]。其中，丁酸的ROAV在4.88～79.06范围内，在酸类物质中对风味的贡献大，在菌种G4和G1发酵样品中ROAV分别达到79.06和57.79，说明丁酸是这2 株菌发酵乳的关键性风味物质。酮类物质中有3 种关键性风味物质，分别为2-庚酮、乙偶姻和2-壬酮，2-庚酮具有药香气味[25]、乙偶姻具有奶香和强烈的奶油味[27]、2-壬酮具有奶香气味[28]。其中，2-壬酮的ROAV在47.16～100区间内，对风味贡献巨大，在G1和Q2菌株发酵的样品中ROAV分别为100和88.64，因此，这2 株菌产生的2-壬酮能够赋予发酵乳特殊的风味。另外，菌株G2发酵乳中乙偶姻的ROAV为72.34，为关键性风味物质，2-庚酮在菌株G1中发挥较大作用，其ROAV为11.26。

醇类物质中异戊醇和糠醇为所有菌株发酵产生的醇类关键性风味物质。异戊醇在菌株G1和Q1发酵乳中是关键性风味物质（ROAV≥1），在其余菌株发酵的酸乳中对风味具有修饰作用（0.1≤ROAV＜1）。糠醇只在菌株G2发酵的酸乳中是关键风味物质，对风味贡献较大；壬醛、己醛和乙醛是醛类物质中关键性风味物质（ROAV≥1），壬醛具有蜡香和脂肪香[29]、乙醛可赋予发酵乳清爽的芳香味[30]。其中，壬醛和己醛是菌株G1发酵产生的关键性风味物质，其ROAV分别为81.56和56.74，对酸乳的风味贡献较大。乙醛是菌株G2、G3和Q2发酵酸乳的关键性风味物质。酯类物质中己酸乙酯是菌株G1、G2、Q1的关键性风味物质，其ROAV分别为30.14、24.82和53.19，对风味的形成影响较大。

2.3 发酵乳中关键性风味物质的主成分分析
表4 主成分特征值及方差贡献率
Table 4 Eigenvalues of principal components and their variance contribution rates

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利用主成分分析研究ROAV大于0.1的风味物质，提取不小于1的主成分特征值，结果如表4所示。前3 个主成分的累计方差贡献率为79.36%。

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图3 发酵牛乳关键挥发性风味物质主成分载荷图
Fig. 3 Principal component analysis loading plots of key volatile compounds of fermented milk produced with pure cultures

由图3可知，第1、2、3主成分的方差贡献率分别为38.70%、21.27%和19.39%。其中，主成分1中载荷最高的正影响挥发性风味物质为苯乙醇，与主成分1呈高度负相关的挥发性风味物质为乙酸；主成分2中载荷最高的正相关挥发性风味物质为丁位辛内酯，呈高度负相关的挥发性物质为乙醛；主成分3中载荷最高的正相关挥发性风味物质为己醛，呈高度负相关的发挥性风味物质为癸酸。上述结果说明苯乙醇、乙酸、丁位辛内酯、乙醛、己醛和癸酸是不同菌株发酵产生风味物质含量有显著差异的挥发性物质。

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图4 发酵牛乳样品主成分得分图（A）和聚类图（B）
Fig. 4 Principal component analysis score plot (A) and clustering diagram (B) of fermented milk

由图4A可知，主成分1很好地将G4和其他菌株区分开，菌株G4发酵样品在主成分1的负半轴；菌株G1发酵样品在主成分2的正半轴，主成分2可以将其与其他菌株完全区分开。从图4观察到6 株乳酸菌发酵乳分别位于图中的4 个象限，表明PCA可以将不同菌株的产香能力完全分开，对其进行有效区分。由图4B可知，菌株G3和Q2距离最为较近，聚为一类，与其余菌株距离较远。G4和G1与其余菌株的距离最远，这一结果与图2分析结果一致。

3 结 论
采用SPME-GC-MS技术从6 株牦牛曲拉源乳酸菌的发酵乳中共鉴定出60 种挥发性风味物质，ROAV分析表明不同乳酸菌菌株发酵产生的关键性风味物质的组成及含量存在明显差异。菌株的产香能力比较结果表明，菌株G1产生2-庚酮能力显著高于其余菌株；菌株G1和Q1产生异戊醇与己酸能力强；菌株G2产乙偶姻、糠醇和2-十三酮能力显著高于其他菌株；菌株G4产乙酸和丁酸能力较强。主成分分析结果也说明不同乳酸菌的产香性能存在差异。

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Comparison of the Aroma-Producing Performance of Lactic Acid Bacteria from Qula as the Residue of Yak Milk after Ghee Making

WEN Pengcheng1, CAO Lei1, YANG Min2, MA Ruijuan1, ZHANG Zhongming1, ZHANG Weibing1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China;2. College of Science, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

Abstract: In this study, solid phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry (SPME-GCMS) was used to detect and analyze the volatile flavor substances in milk fermented with each of 6 strains of lactic acid bacteria isolated from Qula. The key flavor substances were determined by relative odor activity value (ROAV). The results showed that a total of 60 volatile flavor substances were identified in this experiment, and the compositions and contents of key flavor substances produced by the isolated strains were significantly different. Strain G1 had strong ability to produce 2-heptanone; strains G1 and Q1 possessed strong ability to produce isoamyl alcohol and caproic acid; the ability of strain G2 to produce acetoin, sterol and 2-tridecanth was significantly higher than that of the other strains; strain G4 produced acetic acid and its ability to produce butyric acid was strong. The results of principal component analysis also showed that there were differences in the aroma-producing performance of the 6 strains. The research results can provide a theoretical basis for the application of lactic acid bacteria isolated from Qula.

Keywords: Qula; lactic acid bacteria; aroma-producing performance; principal component analysis

收稿日期：2019-07-08

基金项目：国家自然科学基金地区科学基金项目（31560442；31760466）；企业研究转化与产业化专项（2018-SF-C29）；伏羲青年人才培育计划项目（Gaufx-02Y01）

第一作者简介：文鹏程（1982—）（ORCID: 0000-0002-4521-4067），男，副教授，博士，主要从事乳品科学教学科研工作。E-mail: wenpch@126.com

*通信作者简介：张卫兵（1974—）（ORCID: 0000-0003-4436-2735），男，教授，博士，主要从事乳品微生物教学科研工作。E-mail: 45330301@qq.com

DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190708-094

中图分类号：TS252.54

文献标志码：A

文章编号：1002-6630（2020）12-0099-07

引文格式：文鹏程, 曹磊, 杨敏, 等. 牦牛曲拉源乳酸菌的产香性能比较[J]. 食品科学, 2020, 41(12): 99-105. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190708-094 http://www.spkx.net.cn

WEN Pengcheng, CAO Lei, YANG Min, et al. Comparison of the aroma-producing performance of lactic acid bacteria from Qula as the residue of yak milk after ghee making[J]. Food Science, 2020, 41(12): 99-105. (in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190708-094. http://www.spkx.net.cn