人源重链铁蛋白纯化及其纳米粒制备

奥鹏网院作业

人源重链铁蛋白纯化及其纳米粒制备
夏小雨1，李 晗1，王震宇1，谭晓怡2，程述震2，杜 明1,*

（1.大连工业大学食品学院，国家海洋食品工程技术研究中心，辽宁 大连 116034；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

摘 要：为探究可逆自组装活性纳米笼形铁蛋白的成熟高效制备技术，以构建的人源重链铁蛋白（recombinant human H-chain ferritin，rHuHF）大肠杆菌原核表达系统（BL21-pET3a-rHuHF）为对象，在发酵罐内进行高效表达，并对搅拌转速、空气通量及诱导表达时间3 个关键工艺参数进行优化。采用透射电子显微镜和动静态光散射仪对rHuHF的纳米结构及粒径进行表征。结果显示：搅拌转速200 r/min、空气通量1.6 L/min、表达时间9 h为最佳表达条件。经鉴定，铁蛋白存在于菌体胞内可溶物部分且具有良好的自组装活性和单分散笼形结构，9 次实验中表达量最高达290 mg/L，明显高于相同条件下摇瓶培养的表达量；pH 7时rHuHF粒径为（11.23±0.10）nm，pH 2时rHuHF粒径为（2.73±0.10）nm。本实验可对铁蛋白在纳米靶向递送系统中的应用等工作提供一定的科学依据。

关键词：人源铁蛋白；原核表达；蛋白纯化；可逆自组装

自然界中存在着一类具有天然笼形结构的蛋白质，其在结构上具有良好的对称性、稳定性和运载性，近年来逐渐吸引研究者关注。将笼形蛋白中心的物质去除可形成中空的蛋白笼，通常粒径较小的晶体单质分散蛋白载体被称为蛋白质纳米笼[1]。这类结构可以为它所包封的物质提供良好的保护并改善被包封物质的性质[2]，常见的有病毒衣壳、热休克蛋白和铁蛋白（ferritin，Fn）。蛋白质纳米笼作为递送载体具有明显优势[3]：一是其存在于生物体，因而有良好的生物相容性、生物降解性和生物安全性；二是其笼状结构唯一且有良好的稳定性和均一性[4]；三是蛋白质本身的活性基团可通过改性赋予蛋白新功能或增强靶向性[5-6]；四是氨基酸组成多样决定了其可包封的物质多样[7-9]。

Fn是一种广泛存在于生物体内具有储铁和调节铁平衡功能的蛋白质，可作为吸收利用率极高的生物补铁源[10]。Fn纳米笼具有保守的结构，即由24 个亚基组成432 点对称的十二面体球形结构，外径12 nm，内径8 nm，空腔可形成铁核，具有良好的热稳定性（＞70 ℃）等优良特性[11]；Fn能够简单通过调节体系pH值（＜2或者＞11）实现自我可逆解聚与重组装，为纳米载体系统的建立提供了条件；Fn受体大量存在于人体内的各种器官及屏障组织中，如脾脏、肝脏等[12]，使Fn复合纳米颗粒的运送、靶向识别及胞内释放成为可能。Fn的空腔最多可贮存4 500 个铁原子，天然Fn可以作为一种铁补充剂，随着部分Fn可耐受胃环境而被小肠的专一受体吸收的机制逐渐被广泛认同[13]，Fn在作为矿质元素和有机小分子营养强化剂载体上的潜力逐渐显现。Li Meiliang等[14]证明载钙的Fn可被Caco-2细胞吸收，且钙由于免受体系外膳食因子干扰而吸收率显著提高；Chen Lingli等[15]将β-胡萝卜素包进Fn，实现了油溶性活性物在水体系中的稳定存在；Zhang Tuo等[16]验证了Caco-2细胞对Fn-花青素的吸收，这些充分说明Fn作为可食生物纳米载体和营养强化剂具有可实现性和安全性，具有良好的应用价值。

大量分离纯化高纯度的Fn是生物纳米运载体系研究的前提和基础。然而，目前Fn的制备通常采用摇瓶培养含Fn基因的工程菌株的方法[17-19]，虽蛋白质表达效率高但经纯化后获得的纯品量仍然有限，严重限制了其广泛应用。因此，本研究采用原核表达系统于发酵罐内高效表达人源重链铁蛋白（recombinant human H-chain ferritin，rHuHF），进而对搅拌转速、空气通量及诱导表达时间3 个关键工艺参数进行优化，确定大量表达目的蛋白质的最佳表达条件，以多技术组合的方法分离纯化获得具有可逆自组装特性的rHuHF纯品。采用透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）和动态光散射（dynamic light scattering，DLS）对rHuHF的纳米结构及粒径进行表征，DLS、紫外光谱、荧光光谱鉴定rHuHF的可逆自组装活性，以期为基于可逆自组装蛋白纳米运载系统的研究及开发提供理论支持。

1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株与质粒

重组rHuHF原核表达工程菌株BL21-pET3arHuHF（该菌株携带人H铁蛋白基因，其NCBI登录号为NM002032.3）、感受态大肠杆菌菌株JM109和BL21（DE3）由本实验室制备保存；原核扩增质粒pMD18-T、原核表达质粒pET3a载体 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.2 试剂

试剂盒Prime Script™ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（6110A）、San Prep柱式DNA胶回收试剂盒、pMD18-T载体聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）产物快速连接试剂盒、TaKaRa LA Taq®PCR试剂盒（RR002A）、宝生物T4 Ligation试剂盒日本TaKaRa公司；异丙基硫代-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）、氨苄青霉素溶液（ampicillin，AMP）、三羟甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris） 上海生工生物工程有限公司；丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺、β-巯基乙醇、考马斯亮蓝R-250、溴酚蓝 美国Sigma公司；SDS电泳Marker、Native电泳Marker、弱阴离子高流速琼脂糖凝胶（DEAE）Sepharose Fast Flow 美国GE Healthcare公司；10 kDa超滤管 德国Millipore公司；醋酸铀上海阿拉丁公司；其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 仪器与设备
2720 Thermal Cycler PCR扩增仪 美国应用生物系统公司；AE-8135垂直电泳 日本ATTO公司；MF-Chemi BIS2.0凝胶成像系统 以色列DNR公司；SCIENTZ-IID超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；RLPHR1-4真空冷冻干燥机 德国Marin Christ公司；H-7650 TEM 日本日立公司；3D-DLS型动静态光散射仪 瑞士LSI公司；Milli Q Plus 185超纯水净化系统 美国Millipore公司。

1.3 方法
1.3.1 rHuHF的mRNA提取

用棉签刮取人口腔内壁表皮细胞，蘸入1.5 mL离心管内1 mL超纯水中，4 ℃、9 000 r/min离心10 min，取沉淀作为mRNA提取原料，向沉淀中加入1 mL Trizol，室温放置1 min后，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，取上清液至新的1.5 mL离心管中，向上清液中加入0.2 mL预冷的氯仿，旋涡混合器剧烈振动15 s，室温放置10 min后，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，取最上层清液于新的1.5 mL离心管中。向最上层清液中加入0.5 mL预冷的异丙醇，轻轻摇匀至出现乳白色絮凝，室温放置10 min后，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，弃去上清液，留片状沉淀。加入1 mL体积分数70%乙醇洗涤片状沉淀，4 ℃、8 000 r/min离心10 min，弃去清液。将洗涤操作进行2～3 次重复，将片状沉淀自然晾干。向沉淀中加入100 μL超纯水，用微量光吸收酶标仪测A260 nm/A280 nm和提取的mRNA浓度（即模板mRNA）。根据琼脂糖凝胶水平电泳仪操作方法电泳，进行28S、18S、5S条带验证。

1.3.2 pET3a-rHuHF载体构建

引物及rHuHF蛋白原核表达载体构建参考Zou Wenyan等[20]的方法，略有改动。采用试剂盒Prime Script™1st Strandc DNA Synthesis Kit（6110A）进行反转录过程，将mRNA反转录成cDNA。以cDNA为模板，根据NCBI网站查看目的基因序列（NM002032.3），设计引物序列，上游引物序列：5’-catatgacgaccgcgtccacctcg-3’（下划线为NdeI酶切位点），下游引物序列：5’-gaatt cttagctttcattatcactgtc-3’（下划线为EcoRI酶切位点，加粗体为插入的终止密码子），扩增rHuHF DNA，PCR条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35 次循环；72 ℃延伸10 min。将目的基因与pMD18-T载体连接，经琼脂糖凝胶水平电泳验证扩增结果和DNA胶回收后，分别将插入rHuHF基因的pMD18-T质粒与空载质粒pET-3a用NdeI/EcoRI双酶切，T4 DNA连接酶连接酶切后片段，得重组质粒pET3arHuHF。将重组质粒pET3a-rHuHF热激转化到克隆菌株JM109中扩增，经有氨苄青霉素的琼脂平板筛选后进行菌液PCR和琼脂糖凝胶水平电泳验证扩增结果，委托苏州泓迅生物科技有限公司测序鉴定，结果与NCBI网站GenBank比对。

1.3.3 rHuHF诱导表达及发酵条件优化

将通过测序验证的重组质粒pET3a-rHuHF转化到工程菌株BL21（DE3）中，摇菌培养并做电泳条带验证，得到转化成功的工程菌株BL21-pET3a-rHuHF，-80 ℃条件下甘油保藏菌株。

采用恒温摇床培养（500 mL体系）与发酵罐发酵（3 500 mL体系）2 种方式比较蛋白表达量差异，验证发酵罐表达目标蛋白的稳定性和高产性。将工程菌BL21-pET3a-rHuHF活化，以4%的体积分数接种于含工作浓度AMP的LB液体培养基中，置于37 ℃、200 r/min摇床培养10 h，获得种子液，再以5‰的体积分数种入新的含工作浓度AMP的LB培养基中。在分别对发酵罐搅拌转速、发酵罐空气通量及诱导表达时间进行单因素试验的基础上，控制其他因素保持不变，改变发酵罐搅拌转速、空气通量和诱导表达时间（表1），针对以上3 个因素进行IPTG诱导表达的正交试验[21]，确定最佳表达条件。发酵过程中每隔1 h取样检测菌液浓度（OD600 nm）及菌液pH值变化，当OD600 nm值接近为1.0时，加入IPTG溶液至终浓度0.1 mmol/L[22]，表达结束得发酵菌液。

表1 rHuHF表达条件正交试验因素与水平
Table 1 Independent variables ad their levels used in experimental design for optimization of rHuHF expression conditions

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1.3.4 rHuHF表达位置鉴定

发酵菌液8 000 r/min、4 ℃离心10 min，分离培养液和菌体沉淀，用等质量的50 mmol/L Tris-HCl溶液（pH 7.5）重悬菌体，置于冰浴中进行超声细胞破碎，功率300 W，每超声3 s停4 s，总时长15 min，10 000 r/min、4 ℃离心10 min分离上清细胞可溶物和细胞不溶物，再以缓冲液洗涤细胞不溶物2 次并入上清细胞可溶物溶液，以未导入含rHuHF基因载体的BL21（DE3）菌株作为对照，将分离各部分溶液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）鉴定rHuHF蛋白的表达位置，8 个样品的总蛋白质量浓度为1 mg/mL，上样量均为5 μL，胶配方和电泳方法参照Wu Chao等[23]的方法。目的蛋白存在于细胞上清液，表明蛋白为可溶性表达；目的蛋白存在于胞内沉淀则为包涵体表达。在此基础上对比摇床培养与发酵罐发酵两种方式所得目标蛋白的可溶性比例，验证发酵罐表达目标蛋白的稳定性，摇床培养样品总蛋白质量浓度均为1 mg/mL，上样量为20 μL。

1.3.5 rHuHF纯化及纯度鉴定

取含rHuHF的溶液以60 ℃水浴加热10 min，10 000 r/min、4 ℃离心10 min，上清液加60%饱和度的(NH4)2SO4，4 ℃磁力搅拌40 min后静置6 h，离心取沉淀并用等质量的50 mmol/L Tris-HCl溶液（pH 7.5）重悬。采用3 500 Da透析袋以50 mmol/L Tris-HCl溶液（pH 7.5）透析3 次，每6 h换一次透析液，用0.45 μm滤膜过滤，采用SDS-PAGE和Native-PAGE检验蛋白表达强度，BCA法测定蛋白浓度。将rHuHF粗蛋白溶液进行弱阴离子交换层析-凝胶过滤层析。弱阴离子交换层析以50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）平衡DEAE-Sepharose Fast Flow柱，上样后以含1 mol/L NaCl的50 mmol/L Tris-HCl溶液（pH 7.5）梯度洗脱，流速1 mL/min，检测波长280 nm，SDS-PAGE分析纯度。Superdex200分子筛层析以50 mmol/L Tris-HCl溶液（pH 7.5）平衡分子筛并洗脱，流速1 mL/min，检测波长280 nm，分离单体和多聚体rHuHF，单体溶液以10 kDa超滤浓缩除盐，冻干得到黄色固体絮状粉末。

1.3.6 rHuHF纳米结构观察

rHuHF纯品的透射电镜制样过程参考Zheng Bowen等[24]的方法。使用JEM-2100（UHR）TEM以200 kV在50 nm比例尺下拍摄0.5 μmol/L rHuHF蛋白的负染结构成像，成像经过了至少3 次独立的平行观测且每次均在5 个以上区域进行观察。

1.3.7 rHuHF粒径表征

rHuHF的粒径以DLS测定并拟合得到，0.5 μmol/L rHuHF蛋白溶液过0.2 μm水系滤膜，在样品温度20 ℃（室温）、测试角度90°条件下连续测定8 h，获得良好的衰减曲线，利用LSI correlator acquisition软件分析得出rHuHF的水动力粒径分布，进行3 次平行测定以避免偶然性。

1.4 统计分析
运用Origin 9.0软件进行数据处理分析，所有数据均经过3 次及以上平行实验。

2 结果与分析
2.1 工程菌BL21-pET3a-rHuHF诱导表达可溶性Fn
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图1 rHuHF蛋白发酵罐内表达过程的OD值（A）和pH值（B）变化
Fig. 1 Changes in OD value (A) and pH (B) during the expression of rHuHF protein in the fermentation tank

通过扩增得到的rHuHF基因全长为552 bp，编码183 个氨基酸，蛋白分子质量为504 kDa。由图1A可知，工程菌BL21-pET3a-rHuHF在发酵罐内培养过程中菌体量呈近似对数增长，培养液浑浊度逐渐上升，OD600 nm逐渐增加。由图1B可以看出，新配制的灭菌LB培养基自然pH值约为6.0，培养期间菌液pH值经短暂的小幅下降后持续上升到发酵结束时的8.0左右。对发酵结束的菌液进行培养液和菌体分离、菌体细胞可溶物（细胞破碎上清液）与不溶物（细胞破碎沉淀）分离，通过SDS-PAGE鉴定目标蛋白的表达位置。

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图2 鉴定发酵罐发酵rHuHF蛋白在大肠杆菌BL21中表达位置的SDS-PAGE
Fig. 2 SDS-PAGE pto file for the position identi fication of rHuHF protein expression in E. coli BL21 cultured in fermentation tank

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图3 鉴定摇瓶法所得rHuHF蛋白在大肠杆菌BL21中表达位置的SDS-PAGE
Fig. 3 SDS-PAGE pro file for the position identi fication of rHuHF protein expression in E. coli BL21 cultured in shaking flask

由图2可知，1、2泳道对比可证明发酵液中几乎没有蛋白质存在；与未导入pET3a-rHuHF重组质粒的大肠杆菌BL21（泳道3）相比，工程菌BL21-pET3a-rHuHF（泳道4）在接近20.1 kDa的位置明显多出了一种不属于大肠杆菌BL21本身的蛋白表达条带，说明目标蛋白表达在菌体细胞内部且表达量较高；泳道4和泳道5、6（细胞破碎沉淀）对比可知，导入重组质粒前后的细胞破碎沉淀所含蛋白种类有略微差别，目标蛋白大部分未在细胞破碎沉淀内表达；对比泳道4和泳道7、8（胞内可溶物）可知，导入重组质粒的细胞破碎上清液所含蛋白种类有明显增加，泳道8出现目标蛋白条带，综上所述，目标蛋白大部分表达在胞内可溶物部分，为可溶性表达。

采用摇瓶法培养与发酵罐发酵对比验证发酵罐表达目标蛋白的稳定性，由图3可以看出，摇瓶法表达的目标蛋白分布在菌体胞内可溶部分和菌体胞内不溶物部分。图2、3比较可知，发酵罐表达目标蛋白比摇瓶表达更易产出可溶性形式，原因可能是发酵罐表达条件更加稳定可控，更利于可溶性目标蛋白产出。

2.2 rHuHF蛋白发酵罐诱导表达条件的优化
为了提高rHuHF蛋白的诱导表达量，对发酵罐发酵培养工程菌BL21-pET3a-rHuHF的关键工艺参数进行优化。前期对表达过程的条件进行了单因素试验，并考虑节约发酵过程的能耗，本实验选择工程菌株培养温度37 ℃、罐内搅拌转速150～250 r/min、空气通量0.8～1.6 L/min、加入IPTG后诱导表达时间8～10 h作为优化范围，所选条件范围内目标蛋白的诱导表达量较多，通过BCA试剂盒定量比较出平均每升发酵液表达目标蛋白量得出最优参数。因为OD600 nm值为1.0时，工程菌的生长进入到平台期[25]，生长速度趋缓，所以选择此时加入诱导剂IPTG，有研究已证明提高大肠杆菌BL21（DE3）的诱导剂终浓度后，杂蛋白表达量也增加[26]且IPTG对细菌有一定毒性[27]，故诱导剂IPTG的终浓度确定为0.1 mmol/L。由表2可知，第7次试验所得每升菌液的目标蛋白含量最高，因素优组合为搅拌转速200 r/min、空气通量1.6 L/min、诱导表达9 h，且空气通量为最主要影响因素，故从节约能源和尽量获得目标蛋白考虑，选择试验的中等搅拌转速。综上所述，选择搅拌转速200 r/min、空气通量1.6 L/min、诱导表达9 h为最佳表达条件。

所进行的9 次发酵中每升发酵液的rHuHF表达量最高可达约290 mg/L（表2），采用最佳条件进行摇床培养所得rHuHF表达量约为190 mg/L，相比之下，发酵罐发酵表达目的蛋白的得率显著提高，具有较高的表达效率。Zou Wenyan等[20]在发酵表达过程中共表达了可产生分子伴侣的pG-Tf2载体因子辅助增强菌体内的正确折叠率和可溶性表达量，rHuHF纯度在90%以上时的产量为15 mg/L，说明本研究构建的工程菌和采用的发酵条件在目标蛋白表达产量上与相关研究比较[28-29]具有明显优势。

表2 rHuHF诱导表达条件优化正交试验设计与结果
Table 2 Experimental design with results for optimization of rHuHF expression conditions

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2.3 rHuHF蛋白的纯化
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图4 DEAE弱阴离子交换层析（A）和Superdex200分子筛层析（B）
Fig. 4 DEAE anion exchange chromatogram (A) and Superdex200 molecular sieve chromatogram (B)

采用热处理法、沉淀法及透析法结合提取菌体细胞上清液中的粗rHuHF蛋白，经过SDS-PAGE和Native-PAGE验证目标蛋白。以预先优化的弱阴离子交换层析洗脱梯度及分子筛条件进行DEAE弱阴离子交换层析和Superdex200分子筛层析检测到的纯化过程曲线如图4所示。从图4A可以看出，NaCl溶液占流动相比例为20%时洗脱出的峰为目标蛋白峰，其保留体积为180.38 mL，且与其他峰较好地分离，洗脱的rHuHF约占上柱前总蛋白的96%；图4B中保留体积41.18 mL处为目标蛋白峰单体，其左右两个小峰为其多聚体。由图5可得，弱阴离子交换层析纯化出的目标蛋白达到了电泳纯度且只由相对分子质量接近20 kDa的单亚基构成，与其他研究所述一致[30]，由图6可知，rHuHF在pH 7.5体系内几乎被纯化至均质，表观相对分子质量约440 kDa，目标蛋白条带上方浓度较低的大分子蛋白可能是单体rHuHF蛋白的多聚体形式。综上可说明rHuHF的纯化情况良好，纯度达到电泳纯。

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图5 经过弱阴离子交换层析rHuHF蛋白的SDS-PAGE
Fig. 5 SDS-PAGE for identification of rHuHF by weak anion exchange chromatography

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图6 经过弱阴离子交换层析rHuHF蛋白的Native-PAGE
Fig. 6 Native-PAGE for identification of rHuHF by weak anion exchange chromatography

2.4 rHuHF纳米结构观察及粒径表征

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图7 rHuHF透射电镜负染结构图
Fig. 7 TEM image of rHuHF

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图8 rHuHF蛋白粒径及光谱表征
Fig. 8 Particle size distribution and spectroscopic characterization of rHuHF protein

将纯化所得单体rHuHF蛋白进行TEM负染成像。从图7可以看出，纯化所得rHuHF蛋白具有良好的单分散性和完整的纳米球状结构，与图例的观测尺寸对比可得rHuHF纳米笼的外径小于10 nm，与报道的Fn外径尺寸相接近[31]，由于醋酸铀负染色液通过通道进入Fn腔内，Fn内部充满醋酸铀染液，故在腔内可见黑色的铀核，与其他研究现象一致[32]。由图8A可知，经DLS测定并拟合得到的rHuHF粒径为（11.23±0.10）nm，粒径分布窄且均一性较强，与已报道的Fn外径12 nm基本相符[30,33]，rHuHF溶液在体系pH值为2时拟合得出的水动力半径为（2.73±0.10）nm（图8B），说明大分子rHuHF纳米笼在pH 2环境下发生解离，从图8C可看出，rHuHF在pH值重新恢复到7后复性，其粒径恢复至（12.03±0.10）nm，紫外和荧光特性均与变性复性前没有明显区别（图8D、E），说明rHuHF在这一过程中保持有良好的可逆解聚和重聚合能力，由于拟合所得水动力半径与H单亚基的宽度和厚度（2～2.5 nm）相接近却小于H亚基的长度，说明极端pH的解离环境可能对蛋白结构有一定的破坏，与Zhang Shengli等[34]的研究结果一致。

3 讨 论
构建BL21-pET3a-rHuHF原核表达系统和制备rHuHF主要有两个原因：1）在cDNA文库中，Fn重链基因被鉴定为一种高表达基因，其在菌体生长和表达蛋白的后期不会发生水平下调，rHuHF在表达及分离纯化过程中的产量远远高于天然Fn[25]；2）rHuHF是H亚基的均聚体，其在体内有确定的受体TfR1[35-36]，因此rHuHF在体内的稳定性和识别性均有所增强，而且rHuHF的结构和其他化学性质与天然Fn相同，为后续Fn包埋及靶向递送系统的研究奠定基础。为探究rHuHF的高效制备技术，本研究构建了重组质粒pET3a-rHuHF，将其转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行原核表达。由于重组蛋白在原核表达系统中过表达时往往倾向于形成包涵体，条件优化有助于提高重组蛋白的可溶表达量，因此通过优化发酵罐表达rHuHF的关键参数获得了最佳发酵条件，从结果明显可以看出表达的rHuHF包涵体形式很少，而且目标蛋白产量显著高于摇瓶法表达量和相关研究报道的表达产量[20]，推测原因是罐内发酵条件可控性强、发酵条件稳定，接下来会对发酵表达过程继续研究，通过尝试添加共培养因子[37-39]等方式促进目标蛋白在工程菌内的正确折叠，进一步增加有效目标蛋白得量。这一过程可为开发Fn作为新型营养补充剂和Fn纳米载药系统的研究工作奠定一定的基础。

以所建立和优化的DEAE弱阴离子交换层析洗脱条件可纯化出电泳纯的rHuHF蛋白，极大缩短了rHuHF蛋白的纯化时间，且通过TEM、DLS以及变性和非变性电泳的表征可看出纯化的rHuHF蛋白具有完整球形结构、良好的单分散性和稳定性以及正确的相对分子质量和粒径大小，DLS、UV光谱、荧光光谱显示其具有良好的可逆自组装活性，从发酵菌液中纯化rHuHF的步骤为进一步提高蛋白纯化效率的研究提供了参考。

4 结 论
本研究优化发酵罐高效表达rHuHF的关键工艺参数，得到的最佳表达条件为搅拌转速200 r/min、空气通量1.6 L/min、表达时间9 h，发酵表达量最高可达290 mg/L；TEM显示表达的单分散性均一rHuHF直径尺寸接近10 nm，rHuHF在pH 7时水动力粒径为（11.23±0.1）nm，pH 2时水动力粒径为（2.73±0.1）nm。本研究对基于可逆自组装Fn的纳米靶向运输系统的研究及开发等工作具有重要意义。

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Purification and Preparation of Nanoparticles of Human H-chain Ferritin

XIA Xiaoyu1, LI Han1, WANG Zhenyu1, TAN Xiaoyi2, CHENG Shuzhen2, DU Ming1,*
(1. School of Food Science and Technology, National Engineering Research Center of Seafood, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China; 2. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Abstract: In order to explore an efficient method for the preparation of reversible self-assembled active ferritin nanocage,we constructed prokaryotic expression system based on Escherichia coli for the recombinant human H-chain ferritin (BL21-pET3a-rHuHF) to express rHuHF efficiently in a fermentation tank. Three key parameters including stirring speed, air flux and induced expression time were optimized. A transmission electron microscope (TEM) and a light scattering instrument were used to characterize the nanostructure and particle size of rHuHF, respectively. The results showed that the optimum expression conditions were as follows: stirring speed 200 r/min, air flux 1.6 L/min, and expression time 9 h. According to the results of identification, ferritin existed in the soluble part of bacteria cells and had good self-assembly activity and monodisperse cage-like structure. The highest expression yield in 9 experiments was 290 mg/L, which was significantly higher than that in a shaking flask under the same conditions. The particle size of rHuHF was (11.23 ± 0.10) nm at pH 7 and(2.73 ± 0.10) nm at pH 2. This research can provide a scientific basis for the application of ferritinin nanometer-targeted delivery system.

Keywords: ferritin; prokaryotic expression; protein purification; self-assembly

收稿日期：2019-10-17

基金项目：国家自然科学基金重点项目（31730069）

第一作者简介：夏小雨（1995—）（ORCID: 0000-0002-3095-7124），女，硕士研究生，研究方向为蛋白质资源开发与利用。E-mail: xiaxy2526@163.com

*通信作者简介：杜明（1977—）（ORCID: 0000-0001-5872-8529），男，教授，博士，研究方向为蛋白质资源开发与利用。E-mail: duming121@163.com

DOI:10.7506/spkx1002-6630-20191017-171

中图分类号：Q34

文献标志码：A

文章编号：1002-6630（2020）12-0091-08

引文格式：夏小雨, 李晗, 王震宇, 等. 人源重链铁蛋白纯化及其纳米粒制备[J]. 食品科学, 2020, 41(12): 91-98. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20191017-171. http://www.spkx.net.cn

XIA Xiaoyu, LI Han, WANG Zhenyu, et al. Purification and preparation of nanoparticles of human H-chain ferritin[J].Food Science, 2020, 41(12): 91-98. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20191017-171.http://www.spkx.net.cn