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黄瓜抗白粉病突变体筛选与鉴定黄瓜抗白粉病突变体筛选与鉴定 亓飞，林姝，宋蒙飞，张孟茹，陈姝延，张乃心，陈劲枫，娄群峰 （南京农业大学园艺学院/作物遗传与种质改良国家重点实验室，南京 210095） 摘要：【目的】白粉病是危害黄瓜产量、品质的最严重的病害之一，抗白粉病材料的发掘与研究，可以实现从根本上解决病害问题。对获得的‘长春密刺’突变体材料进行分析，旨在筛选出黄瓜抗白粉病突变体材料，丰富育种群体。【方法】对400份‘长春密刺’突变体材料进行苗期接种白粉病菌试验，通过叶片病斑观察结合病情指数分析，初步筛选出抗病材料，将筛选出的抗病材料在大田环境下自然发病进一步观察表型。对初步筛选出的抗病材料进行苗期生理鉴定，测定并分析超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶活性以及叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素、可溶性蛋白含量等生理指标，通过田间自然发病进一步筛选抗病材料，并测定其蒸腾速率、胞间二氧化碳浓度、气孔导度、净光合速率等光合作用指标及乙烯、茉莉酸、水杨酸激素含量，并通过荧光定量PCR分析叶片中乙烯、茉莉酸、水杨酸、木质素、病程相关蛋白等防御信号途径中相关基因的表达。【结果】与感病材料相比，抗病材料的表面菌斑少，净光合速率、气孔导度都优于对照‘长春密刺’，胞间CO2浓度低于‘长春密刺’。在防御激素方面，抗病材料的乙烯、茉莉酸、水杨酸含量同样优于感病材料，而在成熟期叶片的防御信号途径相关基因表达上，抗病材料的表达高于感病材料。通过苗期接种白粉病菌和田间自然发病综合筛选出了两份抗白粉病突变体材料：Mu-86-2、Mu-58-9。【结论】通过对突变体库的筛选可以获得抗白粉病新材料，这些材料的获得对黄瓜抗白粉病的遗传研究和新品种培育具有重要价值。 关键词：黄瓜；突变体；抗白粉病；筛选鉴定 0 引言【研究意义】黄瓜是一种非常重要的蔬菜作物[1]。黄瓜在生产上易感染多种病害，其中白粉病是危害最严重的病害之一。黄瓜的产量每年都会因白粉病的发生而大幅度降低[2]。黄瓜白粉病病菌的分布范围很广且传播速度快，在适合的条件下，它可以迅速繁殖[3]。白粉病菌一般从下部叶片开始染病，随后霉菌逐渐覆盖整个叶片，这不但降低植株的光合效能，同时病菌持续感染下去甚至导致整个植株萎黄枯干、早衰死亡，进而使植株产量和果实品质下降[4]。目前生产上主要使用化学杀菌剂控制，然而，过多的使用化学杀菌剂导致白粉病菌产生抗药性，同时不利于环境保护和公共卫生。因此，培育对白粉病菌具有抗性的品种是控制该病的最有效和环保的措施[5]。【前人研究进展】国际上认为黄瓜白粉病病原菌是子囊菌亚门白粉菌属E.cichoracearum和单囊壳属S. fuliginea，这两种白粉病在各个国家的分布不尽相同[6]。抗病黄瓜品种的选育已经进行了几十年，但到目前为止尚未对潜在的抗性基因进行功能性鉴定[7]。‘长春密刺’是典型的华北市场型黄瓜自交系，具有高收获性，对白粉病病原体敏感。是一种易感基因型品种。周凤珍等[8]在对黄瓜白粉病抗性鉴定的研究中发现，在使用浓度为4.8×105—6×105/mL的孢子悬浮液接种黄瓜第二真叶期幼苗发现材料的感病率达到100%。对于白粉病的分级大多采用5个级别表示不同的染病情况，根据病情指数作出相应的抗性分级。植物病原菌侵入植物体后会引起很多复杂的变化，除了肉眼可见的外表变化外，在寄主植物体内还会发生复杂的生理生化变化[9]，以抵御外来病原菌的入侵。植物在逆境胁迫条件下，体内活性氧产生和消除的代谢平衡受到破坏，这将导致活性氧过剩，继而引发和加剧膜脂过氧化作用，从而破坏膜的结构与功能，对植物产生毒害[10-11]。同时，病菌入侵植物体后还会使植物光合作用能力下降，叶绿素含量降低[12]，导致植物产量下降，严重会造成植株死亡。在遭受病菌入侵后，植物能够通过细胞膜上的受体来识别病原菌从而触发复杂的信号传导途径，以此来应对入侵。最主要的有ET、SA、JA介导的3条信号途径，这3条信号途径分别参与不同的互作类型，引发不同的防御反应[13-14]，而植物通过自身发生不同的防御反应来共同抵御外来病原物的入侵。【本研究切入点】近年来，随着人们生活质量的不断提高，对于蔬菜品质的要求也越来越高，加上长期使用杀菌剂使白粉病菌产生抗药性[15]，人们迫切希望能通过育种工作来选育优良品种。通过人工诱变育种来获得优良品种是一种有效的方式。【拟解决的关键问题】本研究利用已经建立的‘长春密刺’突变体库，通过苗期接种白粉病菌处理，依照病级以及病情指数、幼苗相关的生理指标分析筛选出苗期抗白粉病的突变体单株，然后在大田环境下进一步观察，在表型观察的基础上，分析其光合指标及防御相关激素及与防御信号途径相关基因的表达。综合各项指标，最终筛选出抗性好的黄瓜突变体材料。 1 材料与方法试验于2017年10月至2019年3月在南京农业大学园艺学院进行。 1.1 材料与处理本试验所用材料由南京农业大学葫芦科作物遗传与种质创新实验室提供。前期已获得华北型黄瓜品种‘长春密刺’经甲基磺酸乙酯诱变处理后自交三代的突变体材料，挑选饱满度和整齐度都较高的种子用于试验。 苗期抗病性筛选：对400份突变体材料进行编号，每个编号取5粒籽粒饱满、大小一致的种子置于纸杯中，用56℃的温水浸泡6 h后将水倒掉，置于光照培养箱中进行催芽。种子出芽后将种子播于72孔穴盘中，待长到二片真叶时进行人工接种。接种用的病原菌孢子取自当季病叶，用毛笔将病叶上的病原孢子刷下来，收集到无菌水中，搅拌均匀后用血球计数板测定孢子浓度，所用的孢子悬浮液浓度为5×105个/mL，采用喷雾法进行接种，喷至叶片上沾满水珠为止。重复3次。接种后将材料放于温室中，温度控制在白天22—26℃，夜晚18—20℃，湿度在80%左右。接种后进行病情指数统计，病情指数分级采用Sakata等[16]的方法。 田间抗病性筛选：将从苗期筛选出的抗病突变体材料播种催芽，催芽方式与苗期筛选相同，将突变体材料与抗性对照材料‘IL52’[17]种植于南京农业大学白马基地，自然发病，进行田间观察，在结果期对植株的功能叶进行光合参数和防御相关激素含量的测定分析。 1.2 显微观察取接种后7 d的叶片，用磷酸缓冲液冲洗样品，采用Lecia DVM6数码视频显微镜对叶片表面病菌进行显微观察；取接种后7 d的叶片，用磷酸缓冲液清洗样品，清洗后将样品切成1 cm2的小块，用2.5%戊二醛固定，样品制备参考康振生[18]的方法，样品制备完成后在日立S-3000N扫描电子显微镜下观察并拍照。 钻孔井口为1 m×1 m×20 mm钢板1块，预埋螺栓M20×630 mm 4套，20 mm肋板4块；钻孔井下托盘为1 m×1 m×10 mm钢板1块，4块300 mm×300 mm×12 mm四角托盘，17.8×8000 mm锚索4套。 1.3 酶及叶绿素、可溶性蛋白含量的测定超氧化物歧化酶（SOD）活性测定采用氮蓝四唑光化还原法；过氧化物酶（POD）活性测定采用愈创木酚法；过氧化氢酶（CAT）活性测定采用紫外分光光度计法；叶绿素含量测定采用乙醇溶液浸提法；可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法。 1.4 光合参数测定采用LI-6400XT光合仪，在晴天中午光强为6 000 lx时选取不同编号同一部位的第7—8节叶片测量净光合速率、蒸腾速率、胞间CO2浓度、气孔导度。 1.5 内源激素测定取第7—8节叶片（功能叶）0.5 g，采用ELISA法[19]测定乙烯、茉莉酸、水杨酸含量，试剂盒由南京森贝伽生物科技有限公司提供。每份样品进行3次重复。 1.6 RNA提取、反转录和实时荧光定量PCR在成熟期采植株第7—8节叶片，总RNA的提取采用Trizol法，反转录利用反转录试剂盒（TaKaRa）。合成CTR EIN2 ETR EDS5 NPR1 CCR PAL COI1 PDF PR2及内参基因Action的引物[20]。利用CFX96荧光定量PCR仪（Bio-Rad公司）以及SYBR Green1试剂盒（TaKaRa）进行扩增。反应条件为95℃ 3 min，95℃10 s，60℃ 30 s，共40个循环，对PCR结束后样品进行熔解曲线分析，确定为特异性扩增。所有样品进行3次重复，采用2－ΔΔCT法进行基因相对表达量分析。 2 结果2.1 黄瓜突变体苗期抗白粉病材料的筛选2.1.1 抗病性病情指数分析 在黄瓜幼苗长到二叶一心，用5×105个/mL浓度的白粉病原菌悬浮液对幼苗进行喷洒接种，观察发现，不同编号材料的抗病性表现不一。依照病情指数将400份突变体材料分类，其中高抗材料3份，占接种材料总数的0.75%；中抗材料8份，占2%；中感材料30份，占7.50%；其余的为感病材料，共359份，占总数的89.75%。 根据病情指数分析，将选出的3份抗性材料和8份中抗材料进一步进行幼苗期抗性相关指标的鉴定分析（表1）。 表1 初步筛选的抗病突变体的病情指数分析 Table 1 Analysis of disease index of primary screening resistant mutants  编号Code病情指数Disease index抗性类型Disease resistance编号Code病情指数Disease index抗性类型Disease resistance Mu-86-2 2.22抗RMu-104-220.20中抗MR Mu-58-9 3.33抗RMu-106-322.22中抗MR Mu-50-10 4.18抗RMu-59-822.22中抗MR Mu-9-9 9.00中抗MRMu-150-323.23中抗MR Mu-60-510.00中抗MRMu-118-224.24中抗MR Mu-84-815.56中抗MR
2.1.2 感染白粉病菌叶片的显微观察 通过接种白粉病菌，7 d后在对照幼苗叶片部位可以清楚的观察到一层白粉，取其中的一份抗病材料Mu-58-9，通过显微观察在抗病材料未能观察到菌丝体（图1-A），而在感病材料‘长春密刺’叶片上能清楚的观测到病原菌丝体（图1-B）。 如果要证明命题的的结论是成立的，但通过其他常规方法证明又比较困难时，可以采用反证法，即从这个结论的否定面着手，通过一系列推理研究致使该结论是矛盾的，则可以证明此结论成立。 通过扫描电镜观察发现在不同病级的材料上，白粉病菌丝的生长情况不同，在高抗材料Mu-86-2叶片上未观察到菌丝体（图2-A），在中抗材料上仅观察到很少的孢子，随着感病程度加强，病原菌丝体也逐渐明显。在感病材料上能观察到从菌丝中出现长且为圆柱形的分生孢子，孢子直立地分开分枝，直至布满整个叶片。 2.1.3 生理生化指标 如表2所示，与对照（CK）‘长春密刺’相比，黄瓜突变体材料中叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量均有不同程度变化。其中，除Mu-104-2、Mu-9-9、Mu-50-10的叶绿素a和叶绿素b指标低于对照，其他材料的3种色素指标均高于对照，且叶绿素a和叶绿素b的变化较类胡萝卜素明显。  A：Mu-58-9；B：‘长春密刺’Changchunmici 图1 接种病菌处理后在显微观察下的白粉病菌丝生长情况 Fig. 1 Growth of Podosphaera fusca mycelium under microscopic observation after inoculation 表2 接种白粉病菌后对黄瓜突变体幼苗色素含量影响 Table 2 Effect of inoculation of Podosphaera fusca on the pigment content of cucumber mutant seedlings  编号 Code叶绿素a含量 Chlorophyll a content叶绿素b含量 Chlorophyll b content类胡萝卜素 Carotenoids content CK13.556±1.089abcd4.713±1.081b2.420±0.987b Mu-86-214.869±0.521abc5.536±0.179ab2.946±0.195ab Mu-58-916.723± 0.536a6.298±0.504ab2.887±0.484ab Mu-50-1011.825±3.908d4.566±0.756ab2.501±0.942b Mu-9-911.597±2.778bcd4.291±0.886b2.526±0.450b Mu-60-514.317±2.577abc5.342±0.709ab2.853±0.356ab Mu-84-814.921±2.864abc5.635±1.691ab2.950±0.296ab Mu-104-211.845±1.490cd4.557±0.526b2.609±0.475b Mu-106-314.333±2.758abc5.599±0.923ab2.993±0.292ab Mu-59-815.372±3.327abc5.930±1.075ab3.042±0.938a Mu-150-314.749±0.876abc5.594±0.886ab2.858±0.466ab Mu-118-215.839±1.838ab6.100±0.822a2.783±0.185ab
CK：对照‘长春密刺’。不同字母表示不同处理间差异显著（P＜0.05）。下同 CK: Control Changchunmici. The different letters indicate significant difference at 0.05 level among different treatments. The same as below  A：Mu-86-2；B：Mu-150-3；C：Mu-1-5；D:‘长春密刺’ Changchunmici 图2 接种白粉病菌后不同材料的SEM（扫描电镜）观察 Fig. 2 SEM observation of different materials after inoculation with Podosphaera fusca 如表3所示，有3个材料的POD活性显著高于对照，4个突变体材料SOD活性显著高于对照，4个突变体材料CAT活性显著高于对照，其中Mu-86-2和Mu-58-9的这3种酶活性显著高于对照。在这3种活性酶中，突变体材料与‘长春密刺’相比，SOD、CAT上升较少，POD的活性比对照上升明显。 表3 接种白粉病菌后对黄瓜突变体幼苗抗氧化酶活性的影响 Table 3 Effects of inoculation of Podosphaera fusca on the activities of antioxidant enzymes in cucumber mutants  编号CodePOD活性POD activity(U·g-1·min-1)SOD活性SOD activity (U·g-1)CAT活性CAT activity (U·g-1·min-1) CK0.876±0.011bc0.331±0.041bcde13.104±0.381c Mu-86-22.143±0.651a0.450±0.108b16.906±0.565ab Mu-58-92.186±0.311a0.415±0.028bc18.800±2.630a Mu-50-101.836±0.526b0.588±0.024a14.960±0.876bc Mu-9-91.588±0.503b0.309±0.003cde13.120±0.155c Mu-60-51.208±0.520b0.358±0.085bcde14.040±0.501bc Mu-84-81.245±0.497b0.302±0.115bcde18.506±0.966a Mu-104-20.832±0.119bc0.327±0.049bcde11.920±0.969d Mu-106-30.589±0.237c0.441±0.091bc15.093±1.927ab Mu-59-82.272±0.404a0.247±0.046e13.040±0.855c Mu-150-30.977±0.228bc0.268±0.087de14.640±1.222bc Mu-118-20.964±0.152bc0.380±0.031bcd14.340±0.650bc
如图3所示，不同突变体可溶性蛋白质含量存在差异。其中Mu-58-9、Mu-86-2、Mu-50-10幼苗的可溶性蛋白的含量显著高于对照，抗性更好；Mu-84-8、Mu-106-3的可溶性蛋白含量显著低于对照；其他突变体材料与对照相比无显著差异。 去城南的游人比较多，但去城北的比较少。雪萤一贯喜欢人少的地方，一杭便只好同意。两人在终点站下了车，开始步行。那天没有云，也没有风。冬天的成都平原，干冷干冷的。他们像深入一片绿色的森林，毫无目的地往前走。先还远远近近地看到不少农家小院儿，掩映在茂林修竹之间。慢慢地，人烟少了，开阔的平原上，绿绿的油菜苗已经长起来，还有青幽幽的厚皮菜。在一条蚯蚓一样细小的泥路尽头，出现一条逶迤的小河。 2.2 黄瓜抗白粉病突变体田间筛选2.2.1 突变体材料田间抗病性的表型观察 通过苗期筛选得到的材料在田间进行观察，发现除Mu-86-2、Mu-58-9外，其他材料抗性较差。在田间自然状态下，抗病材料Mu-58-9相对于感病材料叶片表面白粉病斑更少。感病材料白粉病斑浓厚，严重的导致植株死亡（图4）。 上周（11月12日-11月16日）国内环保压力加大，尿素开工率有所下跌，市场价格保持高位。11月19日中国尿素批发价格指数（CNPI）为 2119.37点，环比上涨13.31点，涨幅为0.63%；同比上涨303.96点，涨幅为16.74%；比基期上涨256.12点，涨幅为13.75%。11月19日中国尿素零售价格指数（CNRI）为2221.62点，环比上涨5.04点，涨幅为0.23%；同比上涨304.30点，涨幅为15.87%；比基期上涨316.66点，涨幅为16.62%。 2.2.2 光合指标测定 如表4所示，在对田间自然发病品种的光合指标测定分析中发现，抗性材料Mu-58-9、Mu-86-2、IL52在净光合速率、气孔导度方面都优于对照。其中，Mu-58-9的净光合速率相比‘长春密刺’上升6.366 μmol·m-2·s-1，升高38%；气孔导度上升0.604 mmol·m-2·s-1，升高106%。Mu-86-2比‘长春密刺’净光合速率上升6.366 μmol·m-2·s-1，升高38%；气孔导度上升0.255 mmol·m-2·s-1，升高45%。IL52比‘长春密刺’净光合速率上升7.1 μmol·m-2·s-1，升高43%；气孔导度上升0.22 mmol·m-2·s-1，升高38%；而蒸腾速率与对照相似，胞间CO2浓度低于对照。  图3 接种白粉病菌后黄瓜突变体幼苗的可溶性蛋白质含量 Fig. 3 Soluble protein content of cucumber mutant seedlings after inoculation with Podosphaera fusca  A：‘长春密刺’Changchunmici；B：Mu-58-9 图4 田间黄瓜突变体抗性情况 Fig. 4 Resistance of cucumber mutants in the field 2.2.3 防御激素含量测定 如表5所示，3份抗性材料的3种激素含量都高于对照‘长春密刺’，Mu-58-9的茉莉酸含量比对照上升349.603 pmol·L-1，升高26%；Mu-86-2上升405.906 pmol·L-1，升高30%；IL52上升345.675 pmol·L-1，升高25%。在水杨酸含量上，与对照相比，Mu-58-9上升154.193 pmol·L-1，升高16%；Mu-86-2上升103.828 pmol·L-1，升高11%；IL52上升49.59 pmol·L-1，升高5%。在乙烯含量上，与对照相比，Mu-58-9上升30.235 ng·L-1，升高19%；Mu-86-2上升35.185 ng·L-1，升高22%；IL52上升63.196 ng·L-1，升高40%。表明在防御外界病原菌入侵时，3种激素起到了重要作用。 《中华人民共和国侵权责任法》第八十一条规定：动物园的动物造成他人损害的，动物园应当承担侵权责任，但能够证明尽到管理职责的，不承担责任；《中华人民共和国侵权责任法》第三十七条：宾馆、商场、银行、车站、娱乐场所等公共场所的管理人或者群众性活动组织者，未尽到安全保障义务，造成他人损害的，应当承担侵权责任。因此，在本次案件之中，动物园是否有尽到自己的职责就显得极为重要了。 2.2.4 防御信号途径中相关基因表达分析 如图5所示，利用Real-time PCR方法分析田间自然发病条件下防御信号途径中相关基因的表达，在黄瓜成熟期叶片的基因表达分析显示，与对照材料‘长春密刺’相比，Mu-58-9、Mu-86-2、IL-52中乙烯相关基因CTR1、EIN2、ETR表达量均较高，且ETR表达最明显。水杨酸相关基因NPR1在抗性材料中呈现高表达。茉莉酸相关基因在COI1在抗性材料中呈现高表达。病程相关蛋白基因PR2在Mu-58-9、Mu-86-2、IL-52中比在对照中表达要高。 在保证教学过程完整，体现素质教育教学观念和树立终身体育思想基础上，按照教学目标，创造出多种教学模式。同时，学校应改进评价内容和方法，由单一的评价内容与方法向综合考评内容与方法转变，促进学生的多方面发展。  图5 田间自然发病条件下防御信号途径中相关基因的表达 Fig. 5 Expression of related genes in defense signaling pathways under natural pathogenesis in the field 表4 田间感染白粉病菌后对突变体材料光合指标影响 Table 4 Effect of photosynthetic indicators on mutant materials after field infection with Podosphaera fusca  编号Code净光合速率Net photosynthetic rate (μmol·m-2·s-1)气孔导度Stomatal conductance (mmol·m-2·s-1)胞间CO2浓度Intercellular CO2 concentration (μmol·mol-1)蒸腾速率Transpiration rate (mmol·m-2·s-1) CK16.500±1.252b0.569±0.042b302.666±9.865a10.866±0.351a Mu-58-922.866±1.625a1.173±0.188a286.000±1.000b10.666±0.650a Mu-86-222.866±2.281a0.824±0.155b278.000±10.000b10.123±0.849a IL5223.600±0.435a0.789±0.074 b295.666±3.780b11.133±0.416a
表5 田间感染白粉病菌后对突变体材料防御激素含量影响 Table 5 Effect of defensive hormone content on mutant materials after field infection with Podosphaera fusca  编号Code茉莉酸含量Jasmonic acid content (pmol·L-1)水杨酸含量Salicylic acid content (pmol·L-1)乙烯含量Ethylene content (ng·L-1) CK1346.912±25.758b960.066±23.283d159.509±3.868d Mu-58-91696.515±31.178a1114.259±19.026b189.744±5.398b Mu-86-21752.818±51.115a1063.894±29.433a194.694±6.823b IL521692.587±47.625a1009.656±10.652c222.705±5.158a
3 讨论本研究获得抗白粉病黄瓜突变体Mu-58-9、Mu-86-2。这为进一步研究黄瓜抗病机制提供了材料。植物在受到病原菌侵害后，病菌迅速繁殖，造成叶片组织受损进而使其光合速率下降、叶绿素含量降低[21]。在本研究中，通过研究发现受到病菌侵害后的不同突变体材料叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素均有不同程度的下降，且叶绿素a、叶绿素b的含量变化明显大于类胡萝卜素。叶绿素a主要存在于两个光系统的PS Ⅰ、PS Ⅱ核心复合物中，叶绿素b主要是两个光系统的天线组分，类胡萝卜素是光合作用的辅助色素。白粉病菌侵染后，使黄瓜叶片光合膜全链D电子传递受损，受损的主要部位在光系统Ⅱ[22]。叶绿素a比其他两种色素对白粉病菌更敏感。本研究还发现，抗性材料的净光合速率、气孔导度比对照高。黄瓜在遭受到病菌侵害后，由于叶肉细胞光合活性下降从而造成光合速率下降[23]，进而影响植株正常生长。 现代社会客观上要求建立高度自由开放的社会秩序，美国自由主义传统注重维护个人和地方权利，使历史上美国社会的自由开放度一定程度上处于相对领先地位;与此同时，自由主义原则强调通过加强公共权力维护人与公民权利的特性，对于维护美国的相对统一和社会的相对稳定也具有重大意义。但是，美国历史表明，即便是标榜“自由”的政治理念，即便在自我标榜为自由社会“标本”的国家，一种政治理念一旦被强调为绝对的政治信仰和价值权威，就会在一定程度上形成狭隘性和排他性，形成损害民众权利的“思想专制”和“使偏执成为罪恶”的现象。 为抵御病原物侵染或逆境的影响，体内防御酶活性的次生代谢物含量或发生明显变化[24]。多数学者认为植物体内防御性酶POD、SOD、CAT等的活性变化与植物的抗病性具有一定的关系[25]。SOD、POD、CAT能够有效清除过量的活性氧，减少对膜结构和功能的破坏。SOD活性的增加和减少经常与疾病抗性和易感性相关，植物受到病原菌侵入后需要增加SOD的活性来催化氧化爆发期间H2O2的合成以防止超氧化物的积累[26]。CAT是保护植物免受ROS氧化损伤的重要酶[27]，几种酶共同协同来去除O2-和H2O2[28]。通过对防御性酶的研究发现，与对照相比，3种防御酶的活性有不同程度的变化，高抗材料较对照活性最强。在对材料的表型进行观察时，发现在苗期筛选得到的中抗材料在田间成熟下发病严重，叶片上布满白粉，幼苗期的表型与成熟期有差异。在对苗期进行病情分级时或许应该采用更严格的分级。 植物体内的防御反应机制十分复杂，植物通过多条途径对外来的病原物产生反应，研究最深入的抗病信号途径主要是乙烯、茉莉酸、水杨酸途径[29]。植物抗病性受到乙烯的调控，乙烯在植物抗病性上的作用目前存在分歧，Cooper等[30]研究发现在番茄果实中低浓度的乙烯可以提高抗炭疽病能力。外源施用水杨酸可以增强蚕豆抗黄叶病毒能力[31]。茉莉酸在植物防卫反应和抗病性方面起到重要的作用，植物通过茉莉酸信号的传导对病原菌的入侵产生主动反应[32]。对3种内源激素的研究发现，与对照相比，Mu-58-9、Mu-86-2及选择的抗性材料IL52的激素含量明显增高。相关研究表明乙烯在成熟阶段起到了一定作用，但由于乙烯还对植物的生长和发育过程起着重要作用[33]，尚不清楚其是否参与了抗病过程。而茉莉酸、水杨酸在抗病性上起到了一定的作用。NPR1、EDS5是水杨酸信号途径中的关键基因，武健东等[34]发现在玉米感染小斑病原菌后会诱导NPR1的上调。鲁秀梅等[35]在研究甜瓜接种蔓枯病后，抗蔓枯病材料在接种后期EDS5的表达水平高于感病材料。本研究中，植株在成熟阶段的抗病材料中NPR1、EDS5的表达量高于感病材料，说明在整个生长阶段，水杨酸信号途径相关基因在病原入侵中启发，进而积累水杨酸，从而发挥作用。茉莉酸信号途径相关基因的表达与水杨酸信号途径的表达情况相似，这两个途径是相互协同的。病程相关蛋白在受到外来胁迫时其表达量上升，植物生成自我防卫系统防御外来侵害[36]。成熟期，基因PR2在抗性材料中表达高于感病材料‘长春密刺’，表明在成熟阶段，植物能不断的产生防卫信号来防御外来物入侵。抗病信号途径相关基因和活性酶参与了植物的防御过程，本研究通过叶片表型观察与多项生理指标综合评价材料的抗病性，筛选出的突变体幼苗的各项指标均较好，但在成熟期的激素相关基因表达上与IL-52有一定差别。其中的原因还需要做进一步研究。植物的抗病机制十分复杂，受外界环境的影响很大，本试验选取黄瓜突变体幼苗期和成熟期2个时期对抗性水平进行综合对比，最终筛选出抗性材料。 4 结论通过苗期接种白粉病菌和田间自然发病综合筛选出两份抗白粉病突变体材料：Mu-86-2、Mu-58-9；抗病材料成熟期叶片的防御信号途径相关基因表达高于感病材料，抗病材料的获得对黄瓜抗白粉病的遗传研究和新品种培育具有重要价值和意义。 References [1] Berg J A, Appiano M, Bijsterbosch G, Visser R G F, Schouten H J, Bai Y L. 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(in Chinese) Screening and Identification of Cucumber Mutant Resistant to Powdery MildewQI Fei, LIN Shu, SONG MengFei, ZHANG MengRu, CHEN ShuYan, ZHANG NaiXin, CHEN JinFeng, LOU QunFeng (College of Horticulture, Nanjing Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing 210095) Abstract:【Objective】Powdery mildew is one of the most serious diseases that effects cucumber yield and quality. The discovery and research of materials resistant to powdery mildew can fundamentally solve the disease problem. To screen out materials of cucumber resistant to powdery mildew and enrich the breeding population, the Changchunmici mutants were investigated and analyzed in the study.【Method】Totally, 400 Changchunmici mutant lines were inoculated with powdery mildew at seedling stage, and resistant materials were screened preliminarily based on leaf lesion observation combined with disease index analysis. The selected resistant materials were further observed in the natural environment in the field environment.Physiological indexes of resistant materials in the seedling stages were analyzed, including the activities of superoxide dismutase, peroxidase and catalase activity, and physiological indicators such as the contents of chlorophyll a, chlorophyll b, carotenoids and soluble protein. The resistant materials were screened by natural pathogenesis in the field and were further analyzed for the photosynthetic indexes such as transpiration rate, intercellular carbon dioxide concentration, stomatal conductance and net photosynthetic rate. And the contents of ethylene, jasmonic acid and salicylate were determined, and expression of related genes in defense signaling pathways such as ethylene, jasmonic acid, salicylic acid, lignin, and disease-related proteins in leaves were analyzed by real-time PCR. 【Result】Compared with susceptible materials, the resistant materials had less plaque. The net photosynthetic rate and stomatal conductance of resistant materials were higher than those of wild-type Changchunmici, and the intercellular CO2 concentration of them was lower than that of Changchunmici. In terms of defensive hormones, the contents of ethylene, jasmonic acid and salicylate of resistant materials were higher than those in control. The expression of defense signal related genes in mature leaves of resistant materials was higher compared with susceptible materials. Two powdery mildew resistance materials, Mu-86-2 and Mu-58-9 were screened by inoculation of powdery mildew in seedling stage and natural disease. 【Conclusion】The new materials resistant to powdery mildew could be obtained by screening mutant libraries. The acquisition of these materials had the important value for the genetic research and new varieties breeding of cucumber resistance to powdery mildew. Key words: cucumber; mutant; resistance to powdery mildew; screening and identification doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2020.01.016 开放科学（资源服务）标识码（OSID）： 收稿日期：2019-06-03； 接受日期：2019-10-23 基金项目：国家“十三五”重点研发计划子课题（2016YFD0100204-25）、江苏省农业科技自主创新项目[CX(17)3016]、江苏省农业重大新品种创制项目（PZCZ201719）、江苏高校“青蓝工程”人才项目 （责任编辑 赵伶俐）
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发表于 2021-2-23 21:51:05
