|
乳清蛋白/矢车菊素-3-O-葡萄糖苷纳米粒的制备乳清蛋白/矢车菊素-3-O-葡萄糖苷纳米粒的制备 钱 柳，米亚妮，陈 雷，滕 慧* （福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002） 摘 要：采用纳米粒度仪、透射电镜、傅里叶红外光谱技术研究乳清蛋白（whey protein，WP）/矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，C3G）纳米粒的微观结构变化，并分析纳米粒的体外消化稳定性和贮藏稳定性。WP 80 ℃水浴加热30 min后，调节pH值至中性，以C3G与WP体积比1∶80混匀，再加入8 mmol/L CaCl2制备纳米粒，此时纳米粒子的直径为（275.51±3.15）nm，PdI值为（0.28±0.01），电位为（-16.92±1.04）mV，包埋率为（97.09±2.39）%，载药量为（2.43±0.05）%。透射电镜表明WP包埋C3G后，纳米粒子由空心纳米球状变为典型的“核-壳”结构。红外光谱结果显示WP二级结构与C3G结合后发生改变，α-螺旋和β-转角减少，β-以向折叠和无规卷曲增加。在模拟体外消化中，WP-C3G纳米粒中C3G释放率达到（87.25±3.72）%，与未结合WP的C3G相比，其降解率下降（51.34±0.52）%。在避光贮藏20 d后，C3G的最终保留率为（42.62±2.33）%，而WP-C3G中C3G的保留率为（64.14±1.70）%。结果表明，C3G与WP结合后能够有效改善其胃肠消化稳定性和贮藏稳定性。 关键词： 乳清蛋白；矢车菊素-3-O-葡萄糖苷；纳米粒子；体外消化 花色苷由花青素和各种糖以糖苷键结合而成，主要分为天竺葵色素、矢车菊素、飞燕草色素、芍药色素、牵牛色素和锦葵色素6大类[1-2]，其中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，C3G）是自然界中分布最广的天然色素[3]。C3G具有抗氧化、抗糖尿病、抗微生物、抗癌、保护心血管、保护神经、保护视力等多种生理功能，能够调节机体功能，有效预防慢性疾病的发生[4-6]。自然界中存在的C3G易受环境因素和食品加工条件影响，使其水解或开环降解，从而导致C3G的大量损失[7]，所以研究如何通过修饰C3G结构和提高其稳定性具有重要意义。 乳清蛋白（whey protein，WP）是从乳清中得到的球状蛋白质，约占牛乳总蛋白的20%，含有所有的必需氨基酸[8]，具有营养价值高，易消化吸收等特点[9]。WP具有凝胶性、乳化性、起泡性和涂层性[10]，研究表明，通过物理或生化手段使WP多肽链或氨基酸发生变化，可以引起其分子空间结构发生变化，从而改变WP的功能特性[11-12]。Schong等[13]发现将WP进行加热碱化处理，并进行喷雾干燥后，可以形成稳定的WP微球，在不同pH值条件下，粒径会发生可逆变化。Arroyo-Maya等[14]发现将WP进行酸热处理后，加入果胶组装成生物纳米颗粒，能够有效包埋花色苷，提升花色苷的热稳定性，但是对其颜色稳定性方面无明显作用。Hu Yan等[15]研究表明热改性WP可通过疏水相互作用或氢键对柑橘皮中的类黄酮物质进行封装保护，包埋后的类黄酮物质在体外模拟消化中能够实现靶向释放，大大提高其生物利用度。Chen Lei等[16]发现利用微囊化技术，对多酚类化合物进行封装，可以提高酚类化合物的生物利用度。这些发现都表明WP可作为一种极具潜力的多酚类物质的递送载体，不仅提高多酚物质的稳定性，大幅度提高其生物利用率，而且成本低、风险小，能够在食品加工中发挥巨大作用。 处理之后北侧JC3、JC2稳定在现在的标高上，其他JC1、JC4基础平稳缓慢地被抬升但仍未达到规范要求。因此采用八台液压千斤顶加以电脑辅助顶升控制，井架快速回倾至规范允许值以内井架垫板下口加塞大截面钢板补衬，用C50高标号砼二次灌注。经矿方地测部门长期观测，井架未发生新的倾斜。 本研究利用热改性方法构建WP纳米粒子运输载体，通过纳米粒的粒径电位和载药性能变化确定WP-C3G纳米粒的最佳组成比例，采用透射电镜（transmission electron microscope，TEM）和傅里叶红外光谱（Fourier transform infrared，FTIR）研究纳米粒的结构变化，探讨了WPC3G纳米粒在体外消化中的缓释性和稳定性，并进一步研究WP在贮藏中对C3G的保护作用，为花色苷在应用加工方面提供理论依据。 1 材料与方法1.1 材料与试剂C3G（≥98%）、WP（≥80%） 上海源叶生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。 1.2 仪器与设备Zetasizer Nano ZS纳米粒度分析仪 英国Malvern公司；HT-7700 TEM 日本Hitachi公司；Vertex 70 FTIR仪 德国Bruker公司；1260 Infinity高效液相色谱仪美国Agilent公司。 “地平线欧洲”下，欧盟将通过联合科技计划、联合资助，甚至在欧盟法律允许的范围内共建新合作机制/机构等多种方式，不断提高该计划的国际化程度，从而网罗全球优势科技资源服务欧盟科技战略目标。 1.3 方法1.3.1 溶液配制和复合纳米粒的制备 采用Hu Yan[15]和Giroux[17]等方法进行一定改进。准确称取WP和C3G分别溶于水溶液中配制2 mg/mL WP和2 mg/mL C3G溶液，室温以500 r/min连续搅拌2 h，4 ℃静置过夜后，调节WP溶液pH值为7.0，80 ℃水浴加热30 min，5 000 r/min离心30 min后取上清液，将溶液放在4 ℃避光保存。 将C3G溶液与WP溶液分别以体积比为0∶1、1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100混匀，500 r/min搅拌1 h，分别加入不同量的1 mol/L CaCl2溶液使最终Ca2+浓度为8 mmol/L，连续振荡搅拌2 h，超声30 min后，制得样品1～6号纳米溶液，4 ℃避光保存。 首先明确胃镜检查的适应证和禁忌证[3-4]。掌握了适应证可以避免漏诊，进行合理的筛查，提高检出率；熟知禁忌证可以降低胃镜检查的风险及避免检查中出现意外导致严重后果，甚至危及患者生命的重大事件。因此在做胃镜检查前，需详细询问患者病史，及完善必要的检查。根据实际情况做仔细而又有针对性的检查。还应熟知胃镜检查中可能出现的并发症，提高警惕性与安全性，具备处理胃镜检查过程中突发事件的应急能力[5]。此外，检查前与患者做细致的医患沟通，告知患者检查前需要做的准备及检查后的注意事项，消除患者的紧张感。以上都是保证胃镜检查顺利完成的重要因素。 在传统教学模式中，大多数教师对学生进行填鸭式教育。这种教学方法只注重学生的学习成绩以及他们的升学率，丝毫不注重学生对所学知识内容的掌握程度。教师只是一味地给学生灌输知识，学生也像机器一样被动接受知识。这就极大地限制了学生的自主学习能力以及他们的创新能力。国家对学生的要求不再是考试拿到好成绩，更要注重学生学习的全面发展，尤其是他们的自主创新能力。这种能力将会伴随学生一生的发展，在学习文化知识时，找到学习乐趣，并注重发挥自己的特长，在兴趣的带动下激发自身的创造能力。 1.3.2 高效液相色谱法测定C3G含量 高效液相色谱条件：将样品过0.2 μm有机滤膜，色谱柱为SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A为0.2%磷酸溶液，流动相B为乙腈。洗脱梯度：0～15 min，8%～20% B；15～17 min，20%～8% B；17～20 min，8% B，流速为1 mL/min。紫外检测器的检测波长：520 nm，进样量：10 μL。 取3.00mL硫酸根标准溶液，依照1.3.3步骤，分别用氨水(1+1)调节溶液pH值为6、7、8、9、10、11时进行测定。结果表明：随着溶液pH值的增大，显色体系的吸光度值先增大后保持稳定。可能是因为当溶液的pH值调至微酸性或中性时，溶液中的铬酸根完全转化为重铬酸根，相当于反应方程式黄色(橙色)+H2O的平衡向右移动，即显色时需要测定的铬酸根不能被完全置换出来，此时测定结果偏低；当溶液的pH值调至碱性时，相当于上述方程式的平衡向左移动，显色时需测定的铬酸根可被完全置换出来；当溶液的pH值大于9时，硫酸根的测定结果趋于稳定。因此，显色时需用氨水将溶液调至柠檬黄色，控制pH值在9～10之间。 1.3.3 WP浓度的测定 参照BCA蛋白浓度测定试剂盒法进行测定。 1.3.4 纳米粒载药量和包埋率的测定 参考Hu Yan等[15]的方法进行一定改进。将C3G溶于水中配制与5号样品中C3G最终质量浓度相同的7号样品，将样品在12 000 r/min离心20 min，采用高效液相色谱法计算上清液中游离C3G的质量分数。 矿区内圈出Ⅰ号、Ⅱ号铅锌矿体，赋存于硅化强烈的阿克沙克组灰岩中，矿体呈透镜状，其长轴方向与围岩走向平行，产状与围岩基本一致(图5)，局部有穿层现象，同时在铅锌矿体中亦可见灰岩的残留体。 
式中：W0为7号样品中C3G质量分数；W1为2～6号样品上清液中C3G质量分数；W为2～6号样品中WP-C3G纳米粒的总质量分数。 1.3.5 粒径与电位的分析 将1～6号纳米溶液分别用水溶液稀释100 倍，将样品充分振荡摇匀，用纳米粒度仪测量溶液的粒径大小分布与电位值。 1.3.6 TEM分析 采用TEM分析1号与5号样品形态变化，分别取一滴溶液于铜网上，自然晾干后，用2%磷钨酸溶液进行染色，负染30 min后，用滤纸吸走多余染液。将铜网置于TEM下观察并拍照。加速电压为80 kV。 1.3.7 FTIR的分析 将1号和5号样品冷冻干燥成粉末，用KBr压片法进行FTIR分析，测定波数为500～4 000 cm-1，分辨率为4 cm-1，扫描次数设为32 次，数据用Nicolet Omnic v8.0和Origin 9.0软件进行分析。 1.3.8 模拟体外消化分析 参考Chen Lei等[18]的方法进行一定改进。模拟胃消化：将0.125 g胃蛋白酶、0.25 g氯化钠完全溶于250 mL水中，配制胃消化液。分别取12 mL的5号和7号样品，加入8 mL胃液，用6 mol/L HCl溶液调节溶液pH值至2.0。将混合液37 ℃水浴振荡（200 r/min）2 h，分别在以应第0、5、30、60、90、120分钟取样，消化液放于-20 ℃待测。 模拟肠消化：将0.05 g胰蛋白酶、0.625 g猪胆盐完全溶于250 mL水中，配制肠消化液。分别取5号和7号样品的胃消化液，加入8 mL肠液，用1 mol/L NaHCO3溶液调节pH值至7.0。将混合液37 ℃水浴振荡（200 r/min）4 h，分别在以应第0、15、60、120、180、240分钟取样，用1 mol/L HCl溶液调节溶液pH值至2.0，消化液放于-20 ℃待测。 2.3.4栽培后管理夏季高温天气常现高温相伴，天麻易发生病虫害，应搭棚遮阴。随时检查，保持茎质湿度约50%。在降雨量大的8～9月，适时盖膜防雨，并疏通排水沟每年11～12月，栽培的天麻必须加盖薄膜或干草，保温防冻。栽培场地的四周，每隔2米打桩，将裁成60厘米宽的薄膜绑在桩上，用泥土将底边盖严实，可取得较好的效果。 1.3.9 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析 将WP与WP-C3G消化样品进行SDS-PAGE分析，并将消化前后的纳米溶液进行对比分析。 就中小城市商业银行而言，应该真正履行其为小微企业提供融资服务的社会职能，而不能像目前一样一味追求大型企业客户，盲目扩张规模，这需要地方政府和城商行的共同努力。 1.3.10 C3G保留率和释放率的测定 消化液在12 000 r/min离心10 min，取上清液。采用高效液相法测溶液中C3G质量分数，不同时间C3G的保留率和释放率计算公式如下： 
式中：W0为上清液中C3G的质量分数；W1为C3G消化量；W为加入的C3G总质量分数。 1.3.11 C3G贮藏稳定性分析 将5号和7号样品置于4 ℃避光贮藏20 d，每隔4 d测定溶液中C3G质量分数和颜色变化，采用pH示差法计算溶液中C3G的保留率。 
式中：N为0、1、2、3……20。 1.4 数据分析实验均做3 组平行，结果以 ±s表示。采用SPSS 20软件处理数据，P＜0.05，差异显著；运用Origin 9.0 进行绘图。 2 结果与分析2.1 纳米粒粒径与电位分析表1 样品1～6号的粒径大小分布及电位值
Table 1 Particle size distribution, PdI and Zeta-potential of samples 1 through 6  注：同列肩标不同字母表示差异显著（P＜0.05）。 样品 C3G∶WP 粒径/nm PdI 电位/mV 1 0∶1 242.42±2.31d 0.23±0.01c -24.71±1.95d 2 1∶20 739.57±34.74a 0.63±0.14a -7.24±0.21a 3 1∶40 395.55±9.82b 0.43±0.03b -10.60±0.11b 4 1∶60 359.72±5.57b 0.42±0.04b -10.73±0.76b 5 1∶80 275.51±3.15cd 0.28±0.01c -16.92±1.04c 6 1∶100 300.82±9.46c 0.28±0.01c -11.01±0.00d
当WP经过热处理后，由表1可知WP溶液粒径为（242.42±2.31）nm＜1 μm时，可确认为纳米级溶液，与Hu Yan等[15]中WP纳米粒相比，样品1具有较大的粒径，但是其PdI值为（0.23±0.01），电位为（-24.71±1.95）mV，溶液分布更均一稳定。样品2中溶液粒径为最大值（739.57±34.74）nm，其PdI值高达（0.63±0.14），电位值仅为（-7.24±0.21）mV，溶液分布集中且不稳定，主要是因为C3G可充当多齿状配基，作为桥联剂使WP形成二聚体或多聚体，所以溶液中未被包埋的C3G可促使WP发生聚集以应[19]。在样品2～5中，随着WP体积比增加，WP-C3G纳米粒的粒径和PdI值逐渐降低，电位值则逐渐升高，表明纳米溶液分布逐渐均匀且稳定，当C3G与WP体积比为1∶80时，粒径（275.51±3.15）nm、PdI（0.28±0.01）和电位（-16.92±1.04）mV均达到最小值，粒径越小表示纳米粒间结构联系更紧密[20]，而W P包埋小分子C 3 G后也可导致纳米颗粒表面积增加，所以WP-C3G相比于WP纳米粒子具有较大的表面积。随着WP的比例增加，6号样品粒径（（300.82±9.46）nm）和电位值（（-11.01±0.00）mV）也随之增加，而溶液分布状态不变，可能是因为WP与C3G体积比小于临界值，并发生相互作用导致溶液中WP产生一定程度的聚集。 2.2 纳米粒蛋白质量浓度、包埋率和载药量分析表2 1～6号样品的蛋白质量浓度、包埋率及载药量
Table 2 Protein concentrations, encapsulation and loading efficiencies of samples 1 through 6  样品 C3G∶WP 蛋白质量浓度/(g/L) 包埋率/% 载药量/%1 0∶1 0.98±0.07 2 1∶20 0.93±0.05 84.38±3.02 8.12±0.24 3 1∶40 0.96±0.06 89.92±1.49 4.44±0.06 4 1∶60 0.95±0.04 95.57±2.61 3.18±0.07 5 1∶80 0.97±0.06 97.09±2.39 2.43±0.05 6 1∶100 0.97±0.06 69.99±4.37 1.41±0.07
如表2所示，样品1号溶液中实际蛋白质量浓度为（0.98±0.07）g/L，蛋白质量浓度主要与C3G和WP的比例有关。在2～5号样品中，纳米粒的包埋率逐渐升高，而载药量逐渐降低，其中5号样品的包埋率最高（97.09±2.39）%，此时纳米粒的载药量为（2.43±0.05）%，而6号样品中的包埋率和载药量为最低值（（69.99±4.37）%、（1.41±0.07）%）。结果表明，5号纳米粒中C3G的包封效果最为显著，WP能够有效构建纳米粒子运输载体，此时C3G和WP最优组合比例为1∶80。纳米粒的载药性能是包埋过程的重要特征参数，而随着纳米粒的包埋率增加，载药量却降低，这一结果与Jelvehgari等[21]报道一致，其中纳米粒的载药量与C3G在纳米溶液中的含量有关，而WP与C3G之间的相互作用也可能影响纳米粒的包埋率和载药量，导致其包埋率和载药量都减少。 推动长江经济带发展，是云南必须承担的历史责任。新时期国家区域发展战略，特别是长江经济带战略，提升了包括云南在内的广大地区的战略定位和发展空间，云南在国家整体发展战略中承担的角色更加重要。与长江中下游省市相比，云南省经济社会发展相对滞后，发展不足仍是面临的最大问题。云南金沙江流域，拥有良好的生态环境，同时又是生态环境较为脆弱敏感的地区，迪庆、丽江、大理、楚雄、昆明、曲靖、昭通7个州（市），贫困区县、贫困人口较为集中，亟须通过长江经济带建设保护生态、绿色发展、改善民生。云南积极融入长江经济带建设，要不断强化机遇意识和担当意识，在积极融入服务国家战略中不断提升自己。 第五，加强资金和项目的管理，这一点也非常重要。政府资金要一分钱花出一分钱的效益，要加强管理，加大监督检查和审计稽查的力度。在大型工程上坚持“四制”，在小型工程上要探索报账制和吸引农民参与、农民自管自建等一些新的办法，以提高建设资金的使用效率。还有一点，刚才提到的，现在水利资金的投资渠道比较多，还是要以县级为单位，加大各方面的整合力度，以提高资金的使用效率。总之，通过采取以上五个方面的措施，进一步搞好西部地区的水利建设，以支撑新一轮的西部大开发。 2.3 TEM分析 图1 WP和WP-C3G TEM图像
Fig. 1 TEM images of WP and WP-C3G
WP经过热处理后（图1A、B），通过二硫键与氢键形成蛋白膜，其溶液中纳米粒子都为规则的空心纳米球状，粒子呈均匀分散状态，其中含有较大粒径的蛋白粒子主要是因为在Ca2+的作用下，WP间产生聚集体。而WP与C3G结合后（图1C、D），粒子表面明显像是覆盖了一层薄涂层，形成了典型的“核-壳”结构，这表明C3G与WP分子间发生强烈的相互作用，并被其完全包埋。而纳米粒径有所降低，可能是因为C3G与WP结合形成的共价复合物粒径小于WP的分子聚集物。样品在TEM中的粒径均小于纳米粒度仪的测量结果，主要是因为TEM是利用普通光学成像原理，从而分析和观察样品的内部结构，而纳米粒度仪是运用动态光散射法分析，根据纳米粒在溶液中做布朗运动的速率测量其粒度和分布情况，其结果具有真实性和有效性[21]，所以纳米粒的粒径以纳米粒度仪测量结果为准。 2.4 FTIR分析 图2 WP和WP-C3G FTIR图
Fig. 2 FTIR spectra of WP and WP-C3G
WP的FTIR光谱可显示不同酰胺带，其中蛋白酰胺I谱带为1 600～1 700 cm-1，其由C＝O拉伸引起；酰胺II谱带为1 500～1 600 cm-1，而出现在小于1 548 cm-1的区域为C—N伸展和N—H弯曲导致[22-23]。如图2所示，WP中酰胺I带的峰值从1 645.25 cm-1移到1 643.31 cm-1，酰胺II带的峰值从1 544.95 cm-1移到1 552.67 cm-1。酰胺I和II谱带的变化是由于C3G与WP的C＝O、C—N和N—H基团相结合以及WP结构中氢键的发生变化导致。FTIR光谱变化证实，加入C3G后，WP的二级结构发生变化，酰胺I带的减弱，表明WP的α-螺旋程度降低，这与He Zhiyong等[24]报道的结果一致。 图3则对酰胺I带中不同子峰对应的二级结构变化进行定量分析，其中1 610～1 640 cm-1为β-折叠，1 641～1 650 cm-1为无规卷曲，1 651～1 660 cm-1为α-螺旋，1 661～1 700 cm-1为β-转角[25]。WP结合C3G后，其二级结构变化主要表现为α-螺旋从17%降至15%，β-转角从33%降至32%，β-以向折叠从34%升至36%，无规卷曲从16%升至17%。结果与He Zhiyong等[24]通过圆二色谱对WP与C3G结合前后的二级结构变化分析基本相同，进一步表明，与C3G结合后，WP的二级结构发生明显变化，其中WP的氢键发生断裂，二级结构的氢键化程度发生改变，导致螺旋结构被破坏，蛋白伸展。而β-以向折叠和无规卷曲增多，则表明WP的结构松散，其空间构象稳定性降低。  图3 WP（A）和WP-C3G（B）蛋白二级结构分析
Fig. 3 Secondary structure analysis of WP (A) and WP-C3G (B)
2.5 模拟体外消化分析2.5.1 SDS-PAGE分析 WP中的主要蛋白质为β-乳球蛋白和α-乳白蛋白，含量分别为55%和24%，都含有大量的氨基酸[26]，而Ca2+则与这些氨基酸的游离羧基结合，形成交联盐桥。如图4A所示，对照蛋白Marker，β-乳球蛋白的分子质量约为18 kDa，α-乳白蛋白分子质量约为14 kDa，这与Ballerini等[27]的研究基本相同，与C3G结合后，WP的分子质量和多肽链无明显变化。如图4B所示，加入胃蛋白酶后，α-乳白蛋白迅速分解，生成小分子质量多肽，随着消化时间的延长，其他蛋白质也逐渐分解，而β-乳球蛋白无明显酶解以应，这是因为β-乳球蛋白是WP中疏水性最强的部分，其中疏水性氨基酸在多肽链中易造成空间位阻，降低酶解以应速率[28]。而β-乳球蛋白对胰蛋白酶的极其敏感，由图4C所示，胃消化液加入胰蛋白酶后，β-乳球蛋白迅速酶解，也表明WP在人体内能较易被消化吸收。但经过胃肠模拟消化后，WP的分解过程与C3G结合前后并无明显变化。 比如，某学生屡屡迟到，传统做法可能是，了解学生迟到原因，帮助学生找到避免迟到的方法，同时辅以必要的惩戒。而设计思维的做法是引导学生对人生有目标，对学习感兴趣，对班级产生归属感，对交往有渴望等，然后再根据这些更高层次的目标设计解决方案。 
 图4 WP和WP-C3G的SDS-PAGE图谱
Fig. 4 SDS-PAGE patterns of WP and WP-C3G A：a. WP；b. WP-C3G；B. WP-C3G胃消化；C. WP-C3G肠消化。
2.5.2 C3G保留率分析  图5 WP-C3G和C3G模拟体外消化中C3G的保留率
Fig. 5 Retention rates of C3G and WP-C3G during in vitro digestion A.胃消化；B.肠消化。下同。
由图5A所知，在模拟胃消化环境中，C3G酶解速率极低，消化2 h后保留率依然有（96.4±0.2）%，而WPC3G在消化开始5 min后就出现缓慢酶解趋势，消化2 h后保留率为（86.25±0.81）%。如图5B所示，加入胰蛋白酶后，C3G出现大量降解，仅有（28.21±0.33）%残留，其降解率高达（62.09±0.53）%，在4 h酶解后，最终剩余（9.14±1.32）%。而WP-C3G则保持一定的下降趋势进行酶解，加入胰蛋白酶后，有（75.59±0.77）% C3G残留，降解率仅为（10.80±0.01）%，与未结合WP的C3G相比，降解率降低（51.34±0.52）%，其降解程度有明显改善，消化4 h后，最终消化液中还剩（31.43±2.40）% C3G。研究表明，C3G在酸性模拟胃消化环境中，中性条件下的花色苷醌式碱转化为黄烊盐阳离子，几乎不发生降解，而在进入中性模拟肠消化环境中，C3G的不稳定性导致迅速分解[29]，其降解速率大于消化速率，使其生物利用度极低。C3G在结合WP后，由于α-乳白蛋白对于胃蛋白酶的敏感性，在模拟胃消化环境中，包裹了C3G的α-乳白蛋白迅速酶解，部分C3G也随之消化分解，而进入到肠模拟消化环境中，由于WP在碱性条件下并不会迅速分解，其中的C3G保持一定的速率逐渐被消化分解，进一步证明WP纳米粒子可将C3G进行定向运输，提高了C3G的生物利用度。 2.5.3 C3G释放率分析  图6 WP-C3G模拟体外消化中C3G释放率
Fig. 6 Release rate of C3G from WP-C3G during in vitro digestion
如图6所示，在加入胃蛋白酶30 min后，C3G释放率达到（10.57±1.72）%，消化2 h后，释放率为（18.02±1.01）%。在肠模拟环境中，C3G释放率显著提高，在消化1～2 h时，释放速率最快，而2～3 h时，释放速率最低，消化4 h后，C3G释放率达到（87.25±3.72）%。结果显示，α-乳白蛋白会在加入胃蛋白酶30 min后大量酶解，随后C3G缓慢释放，而在模拟肠液中，由于胰蛋白酶的酶解作用，C3G被大量释放，消化4 h后，释放率提高69%，显然模拟肠消化环境是C3G被释放的主要场所，而且WP-C3G纳米粒在体外模拟消化后的C3G释放率远高于Flores等[30]的研究结果，这说明WP纳米粒子对于C3G有很好的缓释性。WP-C3G中的C3G浓度在模拟肠液中是呈现动态变化趋势，一方面WP酶解释放C3G，另一方面C3G在中性环境下不断降解，当C3G释放率大于降解率时，消化液中C3G浓度升高；C3G释放率小于降解率时，消化液中C3G浓度降低，所以模拟肠胃消化后的WP-C3G中的C3G浓度高于未结合WP的C3G中的含量，而实验结果也证明WP对于C3G能起到很好的缓释包埋作用。 2.6 C3G贮藏稳定性分析 图7 WP和 WP-C3G贮藏20 d内C3G含量变化
Fig. 7 Degradation rates of free C3G and WP-C3G during 20 days of storage
如图7所示，在贮藏0～8 d时，C3G的降解速率最大，其中第8天时，WP-C3G的降解率为28%，C3G的降解率为38%，之后C3G的降解速率明显降低，WP-C3G的降解速率约为0.7%，而未结合WP的C3G的降解速率为1.3%。在第8～12天内，C3G溶液以1%的速率降解，C3G溶液在贮藏20 d后，最终C3G保留率为（42.62±2.33）%，而WP-C3G中的保留率为（64.14±1.70）%，比未结合WP的C3G中的C3G保留率提高了1.9 倍。加入Ca2+可以在蛋白质分子间发生离子结合以应，由于Ca2+具有较高的离子强度，也可有效的降低蛋白质单体之间的静电排斥，从而促进蛋白质与单体之间的聚合，使C3G与WP通过疏水相互作用结合形成低孔隙的致密结构，减慢氧气向颗粒中的扩散，并减缓C3G在中性条件下的降解速率 [31]。结果表明WP可以对C3G起到显著保护作用，能够有效降低C3G发生降解以应。 3 结 论经过热处理变性的WP，在中性条件下加入金属离子Ca2+形成纳米粒子，纳米粒子能与C3G结合形成生物聚合性复合物，并显著提高C3G的稳定性。通过纳米粒度仪研究WP的纳米直径分布、电位值和载药性能变化，确定C3G与WP的最优结合体积比为1∶80。TEM和FTIR研究结果表明WP与C3G结合后，其纳米颗粒大小和蛋白二级结构都会发生改变。体外模拟消化研究表明，C3G与WP结合后，C3G在肠消化环境中，其降解速率明显降低，由于WP易被人体消化吸收，不仅能够实现C3G胃肠道靶向释放，还可以提高C3G在人体内的消化利用率。在贮藏性能方面，WP-C3G在贮藏时的损失率较低，C3G的降解速率缩短，货架期延长。研究表明，WP可以降低C3G在食品加工、运输和消化吸收中降解和损失，是一种极具潜力的新型纳米材料。 严重影响云南省宣威市龙场镇水稻品质及产量的病虫害主要有稻瘟病、纹枯病、白叶枯病及稻曲病等。要提高重视、加强防治，保证水稻增产增收。 参考文献： [1] CORTEZ R, LUNA-VITAL D A, MARGULIS D, et al. Natural pigments: stabilization methods of anthocyanins for food applications[J]. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2017, 16(1): 180-198. DOI:10.1111/1541-4337.12244. [2] NOZZOLILLO C. The site and chemical nature of red pigmentation in seedlings[J]. Canadian Journal of Botany, 2011, 50(1): 29-34.DOI:10.1139/b72-005. [3] CASANOVA F, CHAPEAU A L, HAMON P, et al. pH- and ionic strength-dependent interaction between cyanidin-3-O-glucoside and sodium caseinate[J]. Food Chemistry, 2018, 267: 52. DOI:10.1016/j.foodchem.2017.06.081. [4] SUN C D, ZHENG Y X, CHEN Q J, et al. Purification and antitumour activity of cyanidin-3-O-glucoside from Chinese bayberry fruit[J]. Food Chemistry, 2012, 131(4): 1287-1294. DOI:10.1016/j.foodchem.2011.09.121. [5] FRATANTONIO D, CIMINO F, MOLONIA M S, et al. Cyanidin-3-O-glucoside ameliorates palmitate-induced insulin resistance by modulating IRS-1 phosphorylation and release of endothelial derived vasoactive factors[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids, 2017, 1862(3): 351-357. DOI:10.1016/j.bbalip.2016.12.008. [6] BELLOCCO E, BARRECA D, LAGANÀ G, et al. Cyanidin-3-O-galactoside in ripe pistachio (Pistachia vera L. variety Bronte) hulls:identification and evaluation of its antioxidant and cytoprotective activities[J]. Journal of Functional Foods, 2016, 27: 376-385.DOI:10.1016/j.jff.2016.09.016. [7] OANCEA A M, ONOFREI C, TURTURICĂ M, et al. The kinetics of thermal degradation of polyphenolic compounds from elderberry(Sambucus nigra L.) extract[J]. Food Science and Technology International, 2018, 24(4): 361-369. DOI:10.1177/1082013218756139. [8] SAH B N P, MCAINCH A J, VASILJEVIC T. Modulation of bovine whey protein digestion in gastrointestinal tract: a comprehensive review[J]. International Dairy Journal, 2016, 62: 10-18. DOI:10.1016/j.idairyj.2016.07.003. [9] NESSE K O, NAGALAKSHMI A P, MARIMUTHU P, et al. Efficacy of a fish protein hydrolysate in malnourished children[J]. Indian Journal of Clinical Biochemistry, 2011, 26(4): 360-365. DOI:10.1007/s12291-011-0145-z. [10] DICKINSON E. Food emulsions and foams: stabilization by particles[J]. Current Opinion in Colloid & Interface Science, 2010,15(1/2): 40-49. DOI:10.1016/j.cocis.2009.11.001. [11] GASPAR A L C, DE GÓES-FAVONI S P. Action of microbial transglutaminase (MTGase) in the modification of food proteins:a review[J]. Food Chemistry, 2015, 171: 315-322. DOI:10.1016/j.foodchem.2014.09.019. [12] ALI M, HOMANN T, KHALIL M, et al. Milk whey protein modification by coffee-specific phenolics: effect on structural and functional properties[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2013, 61(28): 6911-6920. DOI:10.1021/jf402221m. [13] SCHONG E, FAMELART M H. Dry heating of whey proteins leads to formation of microspheres with useful functional properties[J].Food Research International, 2018, 113: 210-220. DOI:10.1016/j.foodres.2018.07.004. [14] ARROYO-MAYA I J, MCCLEMENTS D J. Biopolymer nanoparticles as potential delivery systems for anthocyanins:fabrication and properties[J]. Food Research International, 2015, 69:1-8. DOI:10.1016/j.foodres.2014.12.005. [15] HU Y, KOU G N, CHEN Q Y, et al. Protection and delivery of mandarin (Citrus reticulata Blanco) peel extracts by encapsulation of whey protein concentrate nanoparticles[J]. LWT, 2019, 99: 24-33.DOI:10.1016/j.lwt.2018.09.044. [16] CHEN L, GNANARAJ C, ARULSELVAN P, et al. A review on advanced microencapsulation technology to enhance bioavailability of phenolic compounds: based on its activity in the treatment of type 2 diabetes[J]. Trends in Food Science & Technology, 2019, 85: 149-162.DOI:10.1016/j.tifs.2018.11.026. [17] GIROUX H J, HOUDE J , BRITTEN M. Preparation of nanoparticles from denatured whey protein by pH-cycling treatment[J]. Food Hydrocolloids,2010, 24(4): 341-346. DOI:10.1016/j.foodhyd.2009.10.013. [18] CHEN L, LIN X J, XU X W, et al. Self-nano-emulsifying formulation of Sonchus oleraceus Linn for improved stability: implications for phenolics degradation under in vitro gastro-intestinal digestion:food grade drug delivery system for crude extract but not single compound[J]. Journal of Functional Foods, 2019, 53: 28-35.DOI:10.1016/j.jff.2018.12.009. [19] 薛瑾. 茶多酚: 蛋白纳米复合物的研究[D]. 无锡: 江南大学, 2014:24-25. [20] WU N D, LIU X G, ZHAO C Y, et al. Effects of particle size on the magnetic and microwave absorption properties of carbon-coated nickel nanocapsules[J]. Journal of Alloys and Compounds, 2016, 656: 628-634. DOI:10.1016/j.jallcom.2015.10.027. [21] JELVEHGARI M, BARAR J, VALIZADEH H, et al. Formulation,characterization and in vitro evaluation of theophylline-loaded Eudragit RS 100 microspheres prepared by an emulsion-solvent diffusion/evaporation technique[J]. Pharmaceutical Development and Technology,2011, 16(6): 637-644. DOI:10.3109/10837450.2010.508075. [22] PENG X, WANG X C, QI W, et al. Deciphering the binding patterns and conformation changes upon the bovine serum albuminrosmarinic acid complex[J]. Food & Function, 2015, 6(8): 2712-2726.DOI:10.1039/c5fo00597c. [23] ZHANG Y, WRIGHT E, ZHONG Q X. Effects of pH on the molecular binding between β-lactoglobulin and bixin[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61(4): 947-954. DOI:10.1021/jf303844w. [24] HE Z Y, ZHU H D, XU M Z, et al. Complexation of bovine β-lactoglobulin with malvidin-3-O-glucoside and its effect on the stability of grape skin anthocyanin extracts[J]. Food Chemistry, 2016,209: 234-240. DOI:10.1016/j.foodchem.2016.04.048. [25] 李杨, 王中江, 王瑞, 等. 不同热处理条件下大豆分离蛋白的红外光谱分析[J]. 食品工业科技, 2016, 37(8): 104-109. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.013. [26] DELBONI L A, DA SILVA F L B. On the complexation of whey proteins[J]. Food Hydrocolloids, 2016, 55: 89-99. DOI:10.1016/j.foodhyd.2015.11.010. [27] BALLERINI G, ORTEGA M, GIORDANENG V. Effects of enzymatic hydrolysis on the foaming properties of whey proteins[J].Journal of the Science of Food and Agriculture, 2016, 4: 64-78. [28] ZHAO D, LE T T, NIELSEN S D, et al. Effect of storage on lactase-treated β-casein and β-lactoglobulin with respect to bitter peptide formation and subsequent in vitro digestibility[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2017, 65(38): 8409-8417.DOI:10.1021/acs.jafc.7b02985. [29] OLIVAS-AGUIRRE F J, RODRIGO-GARCÍA J, MARTÍNEZ-RUIZ N R, et al. Cyanidin-3-O-glucoside: physical-chemistry, foodomics and health effects[J]. Molecules, 2016, 21(9): 1264. DOI:10.3390/molecules21091264. [30] FLORES F P, SINGH R K, KERR W L, et al. In vitro release properties of encapsulated blueberry (Vaccinium ashei)extracts[J]. Food Chemistry, 2015, 168: 225-232. DOI:10.1016/j.foodchem.2014.07.059. [31] SHANBHAG B K, LIU C, HARITOS V S, et al. Understanding the interplay between self-assembling peptides and solution ions for tunable protein nanoparticle formation[J]. ACS Nano, 2018, 12(7):6956-6967. DOI:10.1021/acsnano.8b02381.
Fabrication and Study of Whey Protein/Cyanidin-3-O-Glucoside Nanoparticles QIAN Liu, MI Yani, CHEN Lei, TENG Hui*
(College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China) Abstract: The microstructure of whey protein (WP)/cyanidin-3-O-glucoside (C3G) nanoparticles was studied by a nanometer particle size analyzer, transmission electron microscopy and Fourier transform infrared spectrometry, and the digestion stability in vitro and storage stability were analyzed as well. Nanoparticles with an average diameter of (275.51 ± 3.15) nm, PdI of(0.28 ± 0.01), zeta potential of (-16.92 ± 1.04) mV, encapsulation efficiency of (97.09 ± 2.39)% and loading efficiency of (2.43 ± 0.05)% were prepared successfully under the following conditions: heating WP in a water bath at 80 ℃ for 30 min, homogenously mixing it with C3G: WP at a volume ratio of 1:80 after pH adjustment to 7, and finally adding 8 mmol/L CaCl2. Transmission electron microscopy showed that after encapsulating C3G, the nanoparticles changed from hollow nanospheres to typical “core-shell” structures. The results of infrared spectroscopy showed that the secondary structure of whey protein was changed after binding with C3G; the contents of α-helix and β-turn were reduced, while the contents of β-sheet and random coil were increased. After in vitro digestion, the release rate of C3G from the WP-C3G nanoparticles was (87.25 ± 3.72)%, and the degradation rate of C3G decreased by (51.34 ± 0.52)% as compared with free C3G. After being stored for 20 days in the dark, the retention rate of free and encapsulated C3G were(42.62 ± 2.33)% and (64.14 ± 1.70)%, respectively. The results showed that the gastrointestinal digestion stability and storage stability of C3G can be effectively improved after being encapsulated with whey protein. Keywords: whey protein; cyanidin-3-O-glucoside; nanoparticles; in vitro digestion
收稿日期：2019-11-04 基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（31801459；31701520）；中国博士后面上项目 （2018M642551）；福建省科技厅面上项目（2019J01393）；福建农林大学“校杰青”项目（kxjq17012） 第一作者简介：钱柳（1996—）（ORCID: 0000-0001-5312-4128），女，硕士研究生，研究方向为农产品加工及贮藏工程。E-mail: qian_liu1@163.comDOI:10.7506/spkx1002-6630-20191104-034 中图分类号：TS201.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2020）10-0014-07 引文格式： 钱柳, 米亚妮, 陈雷, 等. 乳清蛋白/矢车菊素-3-O-葡萄糖苷纳米粒的制备[J]. 食品科学, 2020, 41(10): 14-20.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20191104-034. http://www.spkx.net.cnQIAN Liu, MI Yani, CHEN Lei, et al. Fabrication and study of whey protein/cyanidin-3-O-glucoside nanoparticles[J]. Food Science,2020, 41(10): 14-20. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20191104-034. http://www.spkx.net.cn现采用三维反求技术进行建模并结合3D打印技术研制待修复复杂曲面，其原理如图1所示。首先对待修复的复杂曲面通过数据采集运算单元进行高精度提取，其次通过优化算法计算曲面边缘不宜测量的数据，从而得到完整零件的原始曲面模型数据以及不规则的待修复曲面模型数据，最终将此提取表面输入到3D打印机中，直接打印成型预修复零件的破损部位。然后通过精密抛光或光整加工将3D打印所取得的零件曲面进行后处理，得到超精密曲面，最后通过粘结技术将该修复曲面粘结到缺损零件的缺损部位中。
| 
|Archiver|手机版|小黑屋|www.openhelp100.com
( 冀ICP备19026749号-1 )
发表于 2021-2-10 11:17:28
