鸡肉中金刚烷胺间接竞争ELISA检测方法的建立

奥鹏网院作业

鸡肉中金刚烷胺间接竞争ELISA检测方法的建立鸡肉中金刚烷胺间接竞争ELISA检测方法的建立

谭 庶1，杨金易1，许吉华2，沈玉栋1，曾道平3，苏晓娜3，钟翠丽3，许小炫1，孙远明1,*

（1.华南农业大学食品学院，广东省食品安全重点实验室，广东 广州 510642；2.吉安市公安局刑科所，江西 吉安 343000；3.温氏食品集团股份有限公司，广东 云浮 527499）

摘 要：建立检测鸡肉中金刚烷胺的间接竞争酶联免疫吸附分析（indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay，ic-ELISA）法。利用N-(1-金刚烷胺基)肼甲酰胺与乙醛酸合成新式金刚烷胺半抗原，采用活泼酯法将金刚烷胺半抗原分别与血蓝蛋白、牛血清白蛋白偶联合成免疫原和包被原，将所制备的人工抗原免疫BALB/c小鼠，并制备特异性识别金刚烷胺的单克隆抗体。ic-ELISA法经系统优化后，最佳包被原稀释倍数为80 000，抗体工作质量浓度为122.50 μg/L，对金刚烷胺的IC50为0.69 μg/L，检出限为0.21 μg/L，在0.07～6.15 μg/L之间线性良好，鸡肉样品中添加回收率为101.69%～108.71%，变异系数均低于15%，且实际样品检测结果与高效液相色谱-质谱联用测定结果相关性良好（R2=0.97），表明建立的ic-ELISA具有良好的准确度和可靠性。利用该特异性抗体建立的方法适用于实际鸡肉样品中金刚烷胺的快速检测。

关键词： 鸡肉；金刚烷胺；间接竞争酶联免疫吸附分析；单克隆抗体

兽药残留是影响食品安全的一个重要因素，其中抗病毒药物残留问题尤为突出[1]。金刚烷胺是常用于动物治疗的一种抗病毒药物[2]，在动物饲养过程中主要用于治疗和预防禽流感和猪的传染性胃肠炎。然而金刚烷类抗病毒药物在动物养殖过程中违禁使用的现象普遍发生，在生物机体内以原药形式蓄积的金刚烷胺可通过食物链进入人体，产生神经毒性等毒副作用[3-5]。其滥用还间接导致全世界范围内流感病毒的耐药性日益严重[6-8]。2000—2012年间的流行病学调查表明，我国流感病毒对金刚烷胺的耐药性由13.16%激增至80.00%，严重威胁人类健康和社会经济发展[9]。因此，2005年农业部560号公告规定禁止将金刚烷胺类药物应用于动物的病毒性疾病的防治以及相关的生产、销售等。2006年美国食品药品监督管理局也禁止在家禽养殖中使用金刚烷胺和金刚乙胺等人类抗病毒药物[10]。

鸡肉是中国主要食用肉类之一，因其高蛋白、低脂肪和低胆固醇的特点而广受欢迎。作为世界第三大鸡肉生产国，2017年我国鸡肉产量达1 160万 t[11]。然而在肉鸡饲养过程中，金刚烷胺的违规使用依然屡禁不止。2012年“速成鸡”事件[12]再次让金刚烷胺的滥用成为了民众舆论的焦点。2013年日本厚生劳动省医药食品局食品安全部发布通知，在进口食品监控计划中加入对中国产鸡肉中金刚烷胺的检查[13]。现阶段，我国尚未建立有关食品中金刚烷胺检测的国家标准和行业标准，只有山东省和江苏省分别建立了鸡肉和鸡肝中金刚烷胺残留量的液相色谱-串联质谱检测法。随着我国鸡肉生产和消费量增大，为保障消费者健康安全和鸡肉出口贸易的顺利进行，对鸡肉及其相关产品中的金刚烷胺残留量监测十分必要。

橡胶圈外观质量应符合以下要求：颜色均匀，表面不应有游离硫；材质致密，无肉眼可见的杂质、气孔、裂缝及其他有碍使用的缺陷；单个橡胶圈上凹凸不超过1 mm，面积不超过6 mm2，且不多于3处；飞边须除净，其厚度不应超过0.4 mm，剪损宽度应不超过0.8 mm；无平面扭曲现象，带接头的橡胶圈，接头处应平顺无分离迹象，接头处错位不应超过0.5 mm；每个橡胶圈只容许有1个接头。

目前已报道的检测鸡肉组织中金刚烷胺残留的方法主要包括：高效液相色谱[14]、高效液相色谱-质谱联用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）[15-17]、亲水相互作用色谱-串联质谱[13]、生物识别材料亲和检测[18]等。虽然这些方法可靠且准确，但通常采用复杂的样品前处理和精密仪器并需要专业人员操作，检测成本高，不适合大量样品的快速检测。近年来基于抗原-抗体特异性识别的基础上发展的免疫检测方法有酶联免疫吸附滴定[19-23]、免疫传感器[24]、免疫层析试纸条[21-22]、免疫磁珠[25]、免疫比色分析[26-27]等。其中酶联免疫吸附测定方法具有操作简单、成本低廉且高检测通量，是当前快速检测的主要方法。在构建免疫检测方法时，半抗原的设计与合成是关键步骤，直接决定了制备的抗体质量的优劣[28-30]。报道[20-21]显示半抗原的复杂空间结构和分子极性可能是产生高特异性抗体的关键，氨基的保留与否可能不影响抗体特异性，但大多数抗体表现出低亲和力或对个别药物具有高选择性。

Human colon cancer cell lines SW480 were seeded in 96-well plates, and cell proliferation was measured 24, 48,72, 96, and 120 h later using the CellTiter96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS assay; Promega,Madison, WI, United States) according to manufacturer’s instructions.

本研究通过分析现有的金刚烷胺半抗原及其抗体，设计并制备一种针对金刚烷胺分子特点的新型半抗原，利用产生的金刚烷胺特异性单克隆抗体，拟建立一种与现有检测方法相比更为灵敏、适用性强的间接竞争酶联免疫吸附分析（indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay，ic-ELISA）法，为进一步研制鸡肉中金刚烷胺残留免疫检测试剂盒提供理论依据。

1 材料与方法1.1 材料与试剂

鸡肉样品 市售；金刚烷胺、金刚乙胺、利巴韦林等标准品 国药集团化学试剂有限公司上海分公司；N-(1-金刚烷基)肼甲酰胺（N-(1-adamantyl)hydrazine carboxamide)，ADHZ） 美国Matrix Scientific公司；乙醛酸（glyoxylic acid，GA） 上海麦克林生化科技有限公司；3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）由实验室制备并保存；N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxy succinimide，NHS）、碳化二亚胺盐酸盐（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide，EDC）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、钥孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）等生化试剂美国Sigma公司；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG（HRP-IgG） 碧云天生物技术研究所；96 孔微孔测定板 深圳金灿华实业有限公司；4 周龄SPF级Balb/c小鼠 广东省医学实验动物中心；SP2/0小鼠骨髓瘤细胞由广东省食品安全重点实验室保存。

包被液：碳酸盐缓冲液；底物显色液：TMB显色液；洗液：Na2HPO4·12H2O 3.0 g、NaCl 8.5 g、吐温-20 0.5 mL，用蒸馏水定容至1 L；磷酸缓冲液（phosphate buffer，PB）；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）；B液：Na2B4O7·10H2O 4.92 g、H3BO3 3.09 g、蔗糖100 g、鱼明胶4 g、酪蛋白5 g，用蒸馏水定容至1 L；P液：Na2HPO4·12H2O 6.2 g、NaH2PO4·2H2O 0.8 g、蔗糖100 g、鱼明胶4 g、酪蛋白5 g，用蒸馏水定容至1 L；T液：三羟甲基氨基甲烷14.6 g、浓盐酸8.8 mL、蔗糖80 g、鱼明胶4 g、酪蛋白5 g，用蒸馏水定容至1 L。

1.2 仪器与设备

JZ-II型均质器 莆田市南荣贸易有限公司；超低温高速离心机 美国Eppenndorf公司；Multiskan MK3酶标仪 美国Thermo公司；氮吹仪 康宁科技有限公司；QP50质谱仪 日本岛津公司；1200系列液相色谱仪 美国Agilent公司；ZHJH-1122超净工作台上海新苗医疗器械公司。

1.3 方法

1.3.1 金刚烷胺半抗原的制备与鉴定

半抗原ADHZ-GA合成路线如图1所示。称取ADHZ 10.00 mg、GA 4.00 mg、甲醇250 μL放入圆底烧瓶中，滴加几滴冰乙酸，再置于磁力搅拌器上，室温搅拌以应48 h，会有沉淀析出。将以应后的混合液在4 500 r/min离心15 min，弃去上清液，将沉淀于50 ℃真空干燥，最终得到白色固体粉末即为金刚烷胺半抗原，将半抗原溶解于合适有机溶剂，进行质谱鉴定。

妊娠期高血压疾病是常见的妊娠期合并症，国外研究显示，妊娠期高血压疾病在世界范围内的发病率在7%～12%之间，在我国发病率约为9.4%～10.4%。本病严重威胁母婴生命健康，是孕产妇和围生儿死亡的主要原因之一，目前研究表明，初产妇、年轻孕产妇(≤20岁)或高龄孕产妇(≥35岁)、肥胖、高血压病家族史等是影响妊娠期高血压疾病的主要因素。本县属于少数民族地区，妇女多有早婚早育的现象，初产妇低龄化及二胎全面放开后的经产妇高龄化，使得我们基层医院面临更多的挑战。因而，如何对该病进行有效的预防和治疗，成为我们临床医务人员广为关注的问题。

     

图1 金刚烷胺半抗原合成路线
Fig. 1 Synthesis of hapten for amantadine detection

1.3.2 人工抗原的制备

参考史晓亚[31]的方法，采用活化酯法将金刚烷胺半抗原与BSA和KLH分别偶联，作为包被原和免疫原。称取ADHZ-GA 6.6 mg（25 μmol），EDC 4.8 mg（25 μmol），NHS 2.9 mg（20 μmol）溶到1 mL DMF中，室温下避光以应18 h，定为A液；称量BSA 16.7 mg（0.25 μmol）或KLH 75.0 mg（0.025 μmol）溶于1 mL PBS，定为B液；把A液和B液混合，室温搅拌以应3 h，再把此混合液倒入透析袋，并放入缓冲液中于4 ℃透析3 d，每隔8 h换1 次透析液，且透析液需提前置于4 ℃冰箱中。透析结束后移取透析袋中的上清液，并于4 ℃保存。

1.3.3 动物免疫与特异性单克隆抗体的制备

参考Peng Dapeng等[19]的方法，选取6～8 周龄的雌性Balb/c小鼠，将上述免疫原免疫3 只小鼠。先将KLH-抗原肽偶联物免疫原时用生理盐水稀释成1 mg/mL，按每只小鼠注射100 mL的剂量，共免疫4 次。首次免疫加完全弗氏佐剂，皮下多点注射；2 周后免疫原加不完全弗氏佐剂，同样皮下多点注射进行加强免疫。此后每2 周加强免疫1 次，在第4次免疫后1 周对小鼠进行剪尾收集血清，并使用ic-ELISA测定抗血清滴度。在细胞融合前3 d对产生最高滴度抗血清的小鼠加强免疫，直接腹腔注射0.5 mL相应抗原（不加佐剂）。以10∶1的比例将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，并在37 ℃、5% CO2条件下的HAT培养基中培养。在融合约7 d后，用ic-ELISA选择和标记效价高、抑制率高的阳性杂交瘤细胞。阳性细胞经有限稀释法亚克隆3 次均为100%的阳性后，建立细胞株并冻存。并将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔，制备腹水，使用Protein G亲和层析法纯化单抗备用。

心肌损伤后释放CK-MB、cTnI等特异性酶。室壁张力负荷较大时心肌能量代谢障碍，使大量CK-MB、cTnI通过受损的细胞膜向细胞间质内弥散。因此，血清CK-MB、cTnI水平的高低可灵敏反映心肌损伤的严重程度［17］。本研究中并发恶性心律失常患者的血清CK-MB、cTnI水平高于未并发恶性心律失常患者。这一结果提示，并发恶性心律失常的AMI患者心肌损伤更为严重，这可能与受损心肌细胞的传导及收缩能力下降有关。

1.3.4 特异性单克隆抗体免疫学特性的鉴定

1.3.4.1 抗体腹水效价及亲和力鉴定

用紫外分光光度法测定纯化后的单克隆抗体蛋白浓度，采用ic-ELISA法测定抗体腹水的效价及抗体亲和力，用亲和常数Ka表示亲和力的大小。

一是重视过程性评价和开放性测试。小测试、综合写作、阅读笔记、角色表演和发言时的表现、提问和解答问题的时体现的思维品质等，都是教师评价学生学习成绩的依据。笔者见到一堂历史考试中有两道论述题，每题都含两到三个观点，全是开放性的、需要学生发表独立观点的思辨性问题。

1.3.4.2 特异性测定

选择与金刚烷胺具有类似结构或功能的8 种药物金刚乙胺、利巴韦林、吗啡胍、诺氟沙星、氟苯尼考、喹乙醇代谢物、氯霉素进行ic-ELISA测定，通过各种药物的标准曲线分别得到其IC50，交叉以应率计算公式如下：

   

1.3.5 ic-ELISA基本步骤

包被：用包被液将包被抗原稀释至相应的最适浓度，包被96 孔酶标板，每孔100 μL，4 ℃过夜孵育；封闭：经每孔300 μL洗液洗涤2 次后，每孔加入120 μL封闭液，37 ℃孵育3 h，甩干孔中的液体，置于37 ℃烘箱中2 h备用；竞争以应：加入金刚烷胺标准品或样品溶液（50 μL/孔），再加入50 μL稀释好的抗体工作液，25 ℃以应一定时间；加酶标二抗：洗涤5 次，每孔加入100 μL用P液稀释好的酶标二抗25 ℃以应20 min；显色：洗涤5 次，每孔加入显色液100 μL，25 ℃显色10 min。

终止以应：每孔加入50 μL终止液（10% H2SO4），酶标仪测定OD值。以金刚烷胺标准品质量浓度的对数值为横坐标（X），以抑制率为纵坐标（Y），应用Origin 8.5软件中的四参数拟合竞争标准曲线。

②互相融通，优势互补。厅直水电站分别拥有不同类型的机组，有各种不同类型的技术人才，可以相互交流，互相融通，形成优势互补，容易承揽业务，扩大优势。

1.3.6 ic-ELISA法优化

[68] 林民旺、朱立群：《国际规范的国内化：国内结构的影响及传播机制》，《当代亚太》2011年第1期，第140页。

1.3.6.1 包被原及单克隆抗体的稀释倍数组合

利用方阵滴定对包被抗原、抗体的最适工作浓度进行优化，将包被用偶联抗原用包被缓冲液分别按1∶2 500、1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000、1∶40 000、1∶80 000稀释，抗体分别按1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000 和1∶40 000稀释，按照1.3.5节的步骤操作，测定0 μg/L和48.6 μg/L的金刚烷胺标准品在450 nm波长处的吸光度。

1.3.6.2 优化药物稀释液、抗体稀释液、二抗稀释倍数、竞争时间

秀容月明、乔瞧就这样好上了。这事传到秀容月明母亲那里去了。秀容母亲年纪轻轻就守了寡，这个家由她一手操持，虽是妇道人家，但不论做什么事，都让人说不出话来。她觉得儿子在婚姻大事上不该瞒着自己，儿子娶谁，得由她说了算。

选择去离子水、PBST、PBS和PB作药物稀释液配制标准品，选择T液、P液和B液作抗体稀释液配制抗体溶液，分别用P液稀释酶标二抗不同倍数，选择竞争时间为20、25、30 min和40 min，按照1.3.5节步骤操作，以Amax、IC50及Amax/IC50作为评价各影响因素的标准。选择Amax在1.5～2.0之间，Amax/IC50最高，IC50最低时的条件为ic-ELISA的最佳以应条件。

1.3.7 样品前处理

将鸡胸肉去除脂肪并匀浆化，准确称取2.00 g样品于50 mL离心管中，加入6 mL乙腈，100 μL 0.1 mol/L盐酸，剧烈振荡2 min，室温4 000 r/min离心5 min；取4 mL上清液于离心管中，于60 ℃氮气或空气吹干；加入0.5 mL 0.05 mol/L磷酸盐缓冲液，充分涡动30 s；取50 μL进行ic-ELISA分析。

向空白鸡肉样品中分别添加高、中、低3 个质量浓度的金刚烷胺标准品，经前处理后用同一批次包被酶标板对同批样品进行检测，每个样品设4 个重复，计算批内变异；用不同批次包被酶标板对同批样品进行检测，每个样品设4 个重复，计算批间变异。

1.3.8 仪器方法确证

联合国教科文组织提出未来教育是让学生“学会认知”“学会做事”“学会共同生活”“学生生存”。各国都在不断地进行教育改革，探索新的教育方法。以学生为主体，让学生在“做中学”的教学方式越来越得到推崇，这其中“做中学”的做，即是参与活动，动手操作，亲自感知的意思。

鸡肉中金刚烷胺含量的仪器方法测定参照DB 21/2394—2014《鸡肝和鸡肉中金刚烷胺、金刚乙胺的检测 超高效液相色谱串联质谱法》进行。

1.4 数据统计及图表分析

根据样品A450 nm值，由标准曲线查出相应的质量浓度，乘以稀释倍数，即为样品的实际质量浓度，使用Origin 8.5软件绘制相关ic-ELISA图表。数据统计使用SAS 6.12软件计算完成。

2 结果与分析2.1 半抗原合成的鉴定

比较其他文献中的金刚烷胺半抗原（表1）可知，这些半抗原的共同结构由金刚烷组成，表明金刚烷在动物免疫系统以应中可能比氨基更重要。Wu Songsong等[22]直接采用戊二醛的醛基与金刚烷胺和载体蛋白氨基缩合成Schiff碱而进行共价交联合成金刚烷胺全抗原，其抗体灵敏度较低，IC50为11.93 μg/L；Peng Dapeng等[19]研究表明加入丁二酸酐与金刚烷胺氨基结合生成酰胺作为金刚烷胺半抗原，IC50为15.8 μg/L，这可能因为用来产生抗体的半抗原具有相对低的分子极性，这对产生高亲和力的抗体无益。Wang Zhaopeng等[20]将4-(氯磺酰基)苯甲酸与金刚烷胺在4-二甲氨基吡啶催化下磺酰化合成金刚烷胺半抗原，其IC50为0.84 μg/L；Xu Liguang等[21]研究表明加入二碳酸二叔丁酯保护氨基，然后加入6-溴己酸乙酯偶联，水解酯键得到金刚烷胺半抗原，其IC50为1.92 μg/L；但是这两者半抗原合成路线复杂且与金刚乙胺交叉较大，不利于实际检测。说明半抗原连接臂的结构选择和长度与抗体特异性有关。

基于金刚烷是抗原决定簇的假设，而且ADHZ与金刚烷胺结构类似，直接设计了半抗原ADHZ-GA（图1），为了在人工抗原表面突显出半抗原的特征结构，以利于产生具有高特异性的抗体[31]，半抗原引入席夫碱结构、羧基暴露分子结构，增加了特异性抗体产生的免疫原性。本研究所制备半抗原经层析初步鉴定纯度后，再经质谱手段进行结构的鉴定。结果显示成功制得目标半抗原。

表1 金刚烷胺半抗原对比
Table 1 Comparison of haptens used for determination of AMA

     

半抗原名称 半抗原结构 IC50/（μg/L）线性检测范围/（μg/L） 文献O O N ADHZ-GA HN NH OH 0.69 0.07～6.15 本实验AMA-HS H O N OH 15.8 5～80 [19]O AMA-CSBA NH O S O OH O 0.84 未给出 [20]OH AMA-正戊酸H2N O 1.92 0.62～5.89 [21]NH2 AMA 11.93 2.5～100 [22]

2.2 杂交瘤细胞株的建立

研究结果表明，融合细胞经3 次克隆后阳性率达100%，分离得到稳定分泌抗金刚烷胺抗体的杂交瘤细胞，命名为3E7。

2.3 抗金刚烷胺抗体的鉴定

2.3.1 腹水效价及单抗质量浓度

采用间接ELISA法检测纯化后抗体腹水效价，结果表明，效价在1.60×106以上。用紫外分光光度法测定纯化后单抗蛋白质量浓度为4.9 mg/mL。

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2.3.2 亲和力鉴定

本研究利用竞争性ELISA测定单克隆抗体亲和力，根据公式计算单克隆抗体3E7的亲和常数为4.92×107 L/mol，一般认为亲和力高的抗体亲和常数在107～1012 L/mol之间，亲和力较好。

2.3.3 特异性鉴定

表2 金刚烷胺单克隆抗体ic-ELISA交叉反应率
Table 2 Cross-reactivity of monoclonal antibody determined by ic-ELISA

     

氟苯药物名称 金刚烷胺金刚乙胺 韦林 吗啉胍 诺氟沙星利巴尼考 氯霉素 喹乙醇代谢物交叉以应率/% 100.00 29.89 ≤0.01 ≤0.01 ≤0.01 ≤0.01 ≤0.01 ≤0.01

由表2可知，制备的金刚烷胺抗体特异性好，但是金刚烷胺与金刚乙胺其交叉以应率为29.89%，这是因为该物质为金刚烷胺一结构类似物，其结构极其类似，仅比金刚烷胺多出一个亚甲基，所以存在少量交叉，但在实际检测中，金刚乙胺较少使用在禽病的预防与治疗。除金刚乙胺以外，与结构类似物和功能类似物的交叉以应率均小于0.01%，受其他化合物的影响小，不易出现假阳性、错检等现象。

2.4 抗体、抗原最适工作质量浓度的确定

依据实际ic-ELISA检测的经验，为后续绘制标准曲线时，当0 μg/L的标准液A450 nm值为1.6～2.2，最高质量浓度标准溶液（48.6 μg/L）的A450 nm值在0.1～0.3之间时，绘制标准曲线的梯度和线性关系较好。

表3 包被抗原稀释倍数及抗体稀释倍数的确定（n=2）
Table 3 Determination of optimal dilution of coating antigen and monoclonal antibody (n= 2)

     

抗体稀释倍数包被抗原稀释倍数2 500 5 000 10 000 20 000 40 000 80 000 5 000 0 3.811 4.271 4.181 4.043 3.848 3.740 48.6 3.399 3.525 2.961 2.197 1.255 0.621 10 000 0 3.953 3.736 3.540 3.662 3.323 2.431 48.6 3.315 2.732 1.822 2.053 0.926 0.376 20 000 0 3.728 3.308 2.774 3.428 2.906 1.846 48.6 2.330 1.905 1.037 1.415 0.588 0.248 40 000 0 2.720 2.631 2.182 2.592 2.147 1.476 48.6 1.504 1.170 0.818 0.868 0.509 0.232标准溶液质量浓度/（μg/L）

由表3可以看出，当包被抗原稀释80 000 倍，单抗稀释20 000 倍时阴性标准液和质量浓度为48.6 μg/L的标准液的A450 nm值分别为1.846和0.248，阴阳对照品的A450 nm值之比最大。因此最佳包被原稀释倍数为80 000，抗体工作质量浓度为122.5 μg/L。

2.5 优化药物稀释液、抗体稀释液、二抗稀释倍数、竞争时间

抗体和药物在不同缓冲体系里分散能力不同，所以需要选择抗体和药物最适合的溶剂；以应时间长短决定抗原抗体是否充分结合，所以要优化竞争以应时间达到最佳以应程度。蛋白质性质不同，抗原抗体以应所需最佳质量浓度、缓冲体系、离子浓度、以应时间等参数也有所差异。不同药物稀释液条件下Amax、IC50和Amax/IC50的比较如图2所示，选择PB作为药物稀释液时，其IC50较低，同时Amax/IC50最高，故选择PB作为药物稀释液；不同抗体稀释液、二抗稀释倍数和竞争时间条件下Amax、IC50和Amax/IC50的比较如图3～5所示，同理可得出抗体稀释液为P液，酶标二抗稀释倍数为8 000，竞争时间30 min为最佳以应条件。

     

图2 金刚烷胺标准品稀释液的优化
Fig. 2 Optimization of dilution of amantadine standard

     

图3 抗体稀释液的优化
Fig. 3 Optimization of dilution solution for monoclonal antibody

     

图4 酶标二抗稀释倍数的优化
Fig. 4 Optimization of dilution degree of enzyme-labelled antibody

     

图5 竞争时间的优化
Fig. 5 Optimization of competition time

2.6 标准曲线的建立

按照上述ELISA条件优化结果，得到金刚烷胺间接竞争ELISA法的最佳以应条件，即包被抗原与单抗最佳工作质量浓度分别为12.5 μg/L和122.5 μg/L，标准品稀释液为PB缓冲液，抗体稀释液为P液，酶标二抗稀释倍数为8 000，最佳竞争时间为30 min。在此最佳以应条件下绘制标准曲线，其曲线的回归方程为：Y=-28.914X+42.313，相关系数R2为0.994 6，IC50为0.69 μg/L，线性检测范围（IC20～IC80）为0.07～6.15 μg/L。

2.7 实际样品检测结果

ic-ELISA法准确度以回收率表示，选择高、中、低3 个添加水平进行金刚烷胺添加回收实验，结果如表4所示。其中所测样品中金刚烷胺平均回收率在101.69%～108.71%之间，且批间和批内变异系数低于15%。方法准确度能达到检测要求，适用于实际样品中金刚烷胺的检测。

大孔树脂是一种人工合成的具有多孔立体结构的聚合物，对一些芳香族化合物有很强的吸附能力，已广泛应用于很多活性成分如黄酮、内酯、生物碱等大分子化合物的提取分离[8]。对于红薯叶黄酮的研究大多集中在有机溶剂提取法[1]、超声波辅助提取法[7]、酶提取法等[5]方面，有关大孔吸附树脂对于红薯叶黄酮的吸附分离研究报道较少，尤其是缺乏其吸附、解吸特性的研究，因此，本试验研究了大孔树脂对红薯叶中总黄酮的吸附与解吸特性，优选出适合红薯叶总黄酮提取的树脂材料并确定了最佳吸附及解吸参数，以期为红薯叶的综合开发利用提供科学依据，为红薯叶黄酮的工业化生产提供理论参考。

表4 金刚烷胺的实际鸡肉样品回收率和变异系数（n=4）
Table 4 Recoveries and coefficients of variation for AMA in chicken samples (n= 4)

     

添加量/（μg/kg）平均回收率/%±s/（μg/kg）变异系数/%批内 批间0.5 0.51±0.03 101.69 6.35～10.57 9.28 1 1.09±0.07 108.71 6.80～10.31 10.33 5 5.18±0.07 103.66 1.35～9.55 8.36

2.8 精密度实验结果

批内变异测定：每一标准品质量浓度作6 次重复，以其批内变异系数表示批内误差；批间变异测定：按照上述优化条件分别作标准曲线，取不同批次包被的酶标板，每个标准品质量浓度每天作一次分析，连续进行6 d测定，综合6 d测得质量浓度进行分析，以其批间变异系数表示批间误差。如表5所示，当金刚烷胺质量浓度为0.2、0.6 μg/L时，变异较大，当质量浓度在1.8～16.2 μg/L范围内，变异系数均小于10%，表明该方法重复性较好。通过在同一个实验室内，在适当长的时间间隔内（每天）和实验所确立的条件下，不同时间内建立的标准曲线，如表6所示，IC50、Amax的变异系数均小于15%，表明在不同时间内进行检测，试剂盒的性能（IC50、Amax）比较稳定，实验室内重复性较好。

表5 样品测定批内变异（n=6）
Table 5 Intra-assay coef fi cients of variation of the standard curve (n= 6)

     

质量浓度/（μg/L） ±s/（μg/L） 变异系数/%0.2 0.22±0.03 12.08 0.6 0.53±0.07 14.00 1.8 2.13±0.15 7.23 5.4 5.83±0.51 8.69 16.2 14.15±1.12 7.93

表6 样品测定批间变异（n=6）
Table 6 Inter-assay coef fi cients of variation of the standard curve (n= 6)

     

检测时间/d IC50/（μg/L） Amax 1 1.19 1.84 2 1.02 1.87 3 1.46 1.74 4 1.22 1.86 5 1.51 1.81 6 1.39 1.89±s 1.30±0.19 1.84±0.05变异系数/% 14.29 2.88

2.9 仪器方法对比

从市场购得的100 只肉鸡，收集鸡胸肉并均质化，-20 ℃保存。按照实验建立的ic-ELISA法检测所有鸡肉样品中金刚烷胺，以DB 21/2394—2014的检出限（0.5 μg/kg）作为阴阳性判定值，其中检出9 份样品为阳性，91 份样品为阴性，将可疑样品和9 份阴性样品分别再用ic-ELISA法和HPLC-MS法检测，进行统计学分析比较测定结果。以HPLC-MS所测得的金刚烷胺含量为Y轴，以ic-ELISA测得的金刚烷胺含量为X轴，绘制散点图。对2 种方法的测定结果进行线性回归分析，如图6所示。回归方程为：Y=0.81X-0.03，R2=0.970 2，说明建立的ic-ELISA法的测定结果准确可靠。

     

图6 ic-ELISA与HPLC-MS方法对比
Fig. 6 Comparison between ic-ELISA and HPLC-MS

3 结 论

本实验通过设计并合成一种新型的金刚烷胺半抗原，制备特异性的金刚烷胺特异性单克隆抗体，通过优化ic-ELISA以应条件，建立检测鸡肉中金刚烷胺残留的ic-ELISA法。该方法的IC50为0.69 μg/L，线性检测范围为0.07～6.15 μg/L，检出限为0.21 μg/L；除金刚乙胺外，与其余结构及功能类似物均无交叉以应，方法特异性好；鸡肉中金刚烷胺的添加回收率为101.69%～108.71%，批间和批内变异系数均小于15%；实际样品检测中，ic-ELISA与HPLC-MS方法检测结果符合，整个检测以应时间需60 min左右。这些数据表明本实验建立金刚烷胺残留检测方法的准确度、精密度、灵敏度较高，可用于鸡肉中金刚烷胺残留的快速定量检测。

优化预备役部队功能结构，是新一轮国防和军队改革的重要任务之一。根据中央军委决策部署，目前预备役部队已经全部归属相应军兵种系统领导管理，迈出了调整改革的重要一步。但从整体看，转隶领导关系仅仅是预备役部队改革的开端，由于我军预备役部队始建于上世纪80年代初期，受当时战争威胁和“冷战”环境影响，主要是着眼机械化战争形态下以陆军为主、以直接参战为主、以地面防卫作战为主进行定位的，虽然后经几次调整改革，仍没有根除“大陆军”“作战型”的历史痕迹，与支援保障打赢信息化战争的职能任务存在较大差距。因此，必须下大力优化预备役部队的功能结构。

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Development of an Indirect Competitive Enzyme Linked Immunoassay for the Analysis of Amantadine in Chicken Muscle

TAN Shu1, YANG Jinyi1, XU Jihua2, SHEN Yudong1, ZENG Daoping3, SU Xiaona3, ZHONG Cuili3, XU Xiaoxuan1, SUN Yuanming1,*
(1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Food Quality and Safety, College of Food Science,South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 2. Forensic Science Institute of Ji’an Municipal Bureau of Public Security, Ji’an 343000, China; 3. Wens Food Group Co. Ltd., Yunfu 527499, China)

Abstract: An indirect competitive enzyme linked immunoassay (ic-ELISA) for the detection of amantadine residue in chicken muscle was developed in this paper. The hapten was synthesized via the reaction of N-(1-adamantylamino)carbamide with glyoxylic acid, and then conjugated to the carrier proteins keyhole limpet hemocyanin (KLH) and bovine serum albumin (BSA) by the active ester method to generate an immunogen and a coating antigen, respectively. BALB/c mice were immunized with the immunoantigen for antibody generation. Subsequently, a specific monoclonal antibody against amantadine was obtained. The optimal dilution of coating antigen and antibody concentration were 80 000 and 122.50 μg/L, respectively. Under the optimized experimental conditions, the ic-ELISA showed an IC50 of 0.69 μg/L with a limit of detection (LOD) of 0.21 μg/L. The linear range was 0.07-6.15 μg/L, and the recoveries for spiked chicken muscle were in the range from 101.69% to 108.71% with coefficients of variation less than 15%. Furthermore, the results of ic-ELISA were highly correlated with those of high performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS) (R2 =0.97), which demonstrated that the established ic-ELISA is of high accuracy and good reliability. Therefore, the ic-ELISA proved to be a suitable method for the rapid detection of amantadine in real chicken samples.

Keywords: chicken muscle; amantadine; indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay; monoclonal antibody

收稿日期：2019-01-23

基金项目：“十三五”国家重点研发计划重点专项（2018YFC1602904）；广东省自然科学基金项目（2018B030314005）；国家自然科学基金面上项目（31871887）；广州市科技计划项目（201704020082）

第一作者简介：谭庶（1995—）（ORCID: 0000-0001-6011-3814），男，硕士研究生，研究方向为食品科学与工程。E-mail: 496872152@qq.com

*通信作者简介：孙远明（1956—）（ORCID: 0000-0003-3651-5316），男，教授，博士，研究方向为食品科学。E-mail: ymsun@scau.edu.cn

DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190123-293

中图分类号：TS207.3

文献标志码：A

文章编号：1002-6630（2020）10-0304-07

引文格式：

谭庶, 杨金易, 许吉华, 等. 鸡肉中金刚烷胺间接竞争ELISA检测方法的建立[J]. 食品科学, 2020, 41(10): 304-310.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190123-293. http://www.spkx.net.cn

TAN Shu, YANG Jinyi, XU Jihua, et al. Development of an indirect competitive enzyme linked immunoassay for the analysis of amantadine in chicken muscle[J]. Food Science, 2020, 41(10): 304-310. (in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190123-293. http://www.spkx.net.cn

二维码刷码购票的方式对设备硬件改动较大，采用TVM设备与第三方支付系统直连模式，对车站网络要求较高。二维码扫码购票可减少TVM设备硬件投入，只需通过软件优化就可实现互联网购票。云购票机和扫码购票的方式，系统接入第三方支付系统调试的工作量较大，聚合码扫码购票的方式只需接入一家聚合码支付平台，地铁只需与一家结算平台结算票款。总体而言，云购票机、扫码购票、聚合码购票的方式，通过实体票进出站，不能减少车站TVM设备的配置数量，不能降低单程票采购、制作、管理、流失的运营成本。