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高通量测序分析大头菜发酵过程中真菌的多样性高通量测序分析大头菜发酵过程中真菌的多样性 吴进菊，曾瑞萍，张俊毅，张一舟，余海忠，于 博 （湖北文理学院食品科学技术学院·化学工程学院，湖北 襄阳 441053） 摘 要：为全面揭示大头菜发酵过程中真菌群落结构动态变化，采用Illumina MiSeq高通量测序技术对不同发酵时期工厂生产的大头菜发酵液进行真菌多样性研究。经可操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）分析，24 份样品中共发现4 个门、19 个纲、56 个目、106 个科、190 个属、303 个种、516 个OTU。通过聚类分析和主成分分析发现，24 个样品可根据真菌群落结构特征划分为3 个聚类，将发酵的整个过程分为发酵前期、中期和后期，3 个发酵阶段共有OTU数为124 个。去除未分类的真菌后，所有样品中的优势菌门均为子囊菌门，相对丰度达到74.2%～99.8%，其次为担子菌门。目水平上，发酵前期炭角菌目为优势菌目，相对丰度为45.7%～60.2%，后续发酵过程中，酵母目取代炭角菌目，占据了绝对优势，相对丰度达到63.6%～99.5%。属水平上，发酵前期明梭孢属（Monographella）为优势菌属，发酵中期和后期德巴利氏酵母属（Debaryomyces）和接合酵母属（Zygosaccharomyces）为优势菌属。 关键词： 大头菜；发酵；真菌多样性；高通量测序 传统发酵食品制作和食用历史悠久，发酵系统开放，其中蕴藏了丰富的微生物资源[1]。近年来随着分子生物学和生物信息学的不断发展，高通量测序技术广泛地用于发酵食品微生物多样性的研究，如酸鱼[2]、意大利香肠[3]、食醋[4-5]、甜面酱[6]、发酵酒[7-10]、发酵蔬菜[11-14]、发酵豆制品[15-19]、发酵乳[20-22]等。 湖北襄阳大头菜是我国四大名腌菜之一，是襄阳市地理标志产品，具有2 000多年种植史，相传是三国时期被诸葛亮发现并引入军中广泛食用，故又名诸葛菜。襄阳大头菜需经历长达数月的发酵过程才能成熟。襄阳大头菜的制作采用“三腌、五卤、六晒”的传统工艺，在发酵过程中逐步加入食盐，大头菜成熟时发酵液中的食盐含量几乎达到饱和状态。目前，对传统发酵大头菜中微生物群落结构、种群多样性的研究相对较少，早期的研究基本是建立在传统纯培养技术方法上[23-25]，近年来有研究人员采用聚合酶链式以应（polymerase chain reaction，PCR）-变性梯度凝胶电泳技术和高通量测序技术对襄阳大头菜腌制液膜醭进行了多样性分析[26-28]，主要针对襄阳大头菜正常发酵腌制液和长膜腌制液中细菌和真菌多样性进行比较研究，找出引起发酵液长膜的主要微生物，为后续控制大头菜的品质提供一定的帮助。 本实验采用Illumina MiSeq高通量测序技术对不同发酵时期传统发酵大头菜的真菌多样性和菌群结构进行分析，从基因水平全面揭示传统发酵大头菜发酵过程中真菌的多样性和群落结构的动态变化，以期为今后传统发酵大头菜的工业化、标准化生产提供理论支持。 1 材料与方法1.1 材料与试剂大头菜发酵液样本 湖北孔明菜食品有限公司；FastPfu polymerase 北京全式金生物技术有限公司；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒 美国Axygen公司；QuantiFluor™-ST蓝色荧光定量系统 Promega公司；DL2000 DNA Marker 宝生物工程（大连）有限公司；土壤基因组提取试剂盒 美国MP Biomedicals公司。 1.2 仪器与设备9700型PCR仪 美国ABI公司；MiSeq高通量测序平台 美国Illumina公司；台式冷冻离心机 德国Eppendorf公司；NanoDrop 2000紫外-可见分光光度计赛默飞世尔科技（中国）有限公司。 1.3 方法1.3.1 样品采集 大头菜发酵液样本由湖北孔明菜食品有限公司提供，采用“三腌、五卤、六晒”的传统工艺进行加工，按照加工工序的特点，在每一道腌制和卤制工序完成后采集样本，分别编号为1_1～1_8，每个发酵时期平行取3 个样本，分别编号为a、b和c。样本采集后低温运送至实验室，置于-80 ℃冰箱保存备用。 1.3.2 样本总DNA的提取和PCR 将大头菜发酵液样本送至上海美吉生物医药科技有限公司，采用土壤基因组提取试剂盒提取总DNA。以样本中微生物总DNA为模板，以ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）和ITS2R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）为上下游引物扩增真菌的ITS基因序列[29]。PCR采用20 μL（下同）以应体系：总DNA 10 ng，5×FastPfu buffer 4 μL，dNTP mixture（各2.5 mmol/L）2 μL，上下游引物（各5 μmol/L）0.8 μL，FastPfu polymerase 0.4 μL，牛血清白蛋白0.2 μL，添加双蒸水补充至20 μL。PCR条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30 个循环；72 ℃延伸10 min。 1.3.3 Illumina MiSeq测序和数据分析 夏国忠让战士们检查武器装备，负伤的做好简单包扎治疗，派几个人严密监视敌人的动向，其它人好好休息一下，为最后的战斗做好准备。 将PCR产物纯化和荧光定量后，构建MiSeq文库并进行双端测序，测序读长300 bp。MiSeq测序得到的PE reads首先根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，得到优化序列。采用上海美吉生物医药科技有限公司I-Sanger云平台进行在线数据分析。采用Usearch进行可操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）聚类分析，对于相似性水平大于等于97%的OTU进行生物信息统计，其中每个OTU代表一个物种[30]。采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，在各个分类水平统计样本群落的组成。利用Mothur软件计算样本的α多样性，包括Chao 1指数、ACE指数、Shannon指数、Simpson指数和Coverage值，以表征真菌群落的丰富度和多样性。采用Qiime软件计算样本β多样性距离矩阵，使用非加权组平均法（unweighted pair-group method with arithmetic mean，UPGMA）算法构建树状结构。 来自各级硫冷凝器的液硫随重力自流至液硫池(S-301)，在液硫池中通过Black&Veatch的专利技术MAG○R脱气工艺可将液硫中的硫化氢质量分数脱除至15×10-6以下[2]。MAG○R液硫脱气工艺无需采用任何化学添加剂，其工艺原理为:液硫在液硫池的不同分区中循环流动，并通过一、二级喷射器(EJ-302/303)进行机械搅动，溶解在液硫中的硫化氢释放到气相中并由蒸汽抽空器(EJ-301A/B)送入尾气焚烧炉焚烧[3]。 1.3.4 样本序列的提交及序列号 2 结果与分析2.1 测序结果和α多样性分析通过Illumina MiSeq高通量测序，24 份大头菜发酵液样品共获得1 299 970 条优化序列，平均长度234.4～313.5 bp（表1）。去除无重复的单序列和嵌合体后，共获得1 272 007 条有效序列。经OTU分析，这些序列归属于4 个门、19 个纲、56 个目、106 个科、190 个属、303 个种、516 个OTU。为保证样本测序序列的均一性，对所有样品有效序列按最小样本序列数进行抽平（每个样本30 774 条有效序列）。抽平后，所有样品序列归属于4 个门、18 个纲、50 个目、99 个科、175 个属、284 个种、483 个OTU，每个样品的OTU分类信息见表1。 表1 样品信息
Table 1 Fungal community composition and OTUs identified in samples  样品名称优化序列/条平均长度/bp有效序列/条 门/个 属/个 OTU/个1_1a 41 751 234.4 41 594 4 72 128 1_1b 40 352 235.1 40 170 4 79 151 1_1c 44 672 235.9 44 480 4 96 183 1_2a 66 252 246.4 65 689 4 82 171 1_2b 66 352 246.5 65 689 4 84 184 1_2c 60 770 250.0 59 952 4 86 173 1_3a 54 186 279.4 54 079 4 48 91 1_3b 60 584 271.6 60 406 4 61 108 1_3c 57 055 281.7 56 934 4 52 91 1_4a 52 278 276.0 52 085 4 65 110 1_4b 50 758 285.2 50 583 4 51 87 1_4c 45 758 293.1 45 708 3 40 63 1_5a 48 149 293.6 48 097 4 37 65 1_5b 50 667 293.1 50 600 4 36 61 1_5c 43 964 293.2 43 928 4 43 70 1_6a 54 992 291.6 54 853 4 43 76 1_6b 48 774 293.8 48 589 4 39 63 1_6c 58 666 258.9 58 492 4 40 80 1_7a 61 683 310.4 60 912 4 30 44 1_7b 31 793 308.6 30 774 4 34 56 1_7c 46 764 313.5 45 239 4 37 56 1_8a 58 405 276.3 58 151 4 53 103 1_8b 68 998 257.3 68 620 4 58 133 1_8c 66 547 253.6 66 383 4 49 96
Chao 1指数和ACE指数以映群落的丰富度，Shannon指数、Simpson指数和Coverage值以映群落多样性。每个样品的Coverage值均为0.998以上，表明测序深度良好，覆盖率高，可以真实展示样品中的绝大多数真菌（表2）。在样品1_1和1_2中，Chao 1指数和ACE指数较高，表明样品中群落的丰富度较高。而随着发酵的进行，Chao 1指数和ACE指数明显下降，而在1_8中又有所提高。分析Shannon指数和Simpson指数在各样品中的变化可知，群落多样性也呈现出相似的趋势。这可能是由于发酵前期加入的食盐相对较少，所以样品中真菌群落的丰富度和多样性较高，而随着发酵的进行，食盐的添加量逐渐提高，导致不耐盐的真菌逐渐消失，所以真菌群落的丰富度和多样性有所下降。而在发酵的最后时期，真菌群落的丰富度和多样性又有所提高，推测可能是有些真菌逐渐适应了高盐的环境，所以提高了真菌群落的丰富度和多样性。 表2 α多样性指数分析
Table 2 α Diversity indices  样品 Shannon指数 Simpson指数 ACE指数 Chao 1指数 Coverage值1_1 1.73 0.38 231.92 197.68 0.998 1_2 2.20 0.24 244.19 239.82 0.998 1_3 1.32 0.45 176.13 154.95 0.999 1_4 1.46 0.50 90.16 91.37 1.000 1_5 0.25 0.93 78.16 76.40 0.999 1_6 1.06 0.53 106.69 90.83 0.999 1_7 0.86 0.53 102.96 81.21 0.999 1_8 1.58 0.32 167.58 148.89 0.999
2.2 不同发酵时期大头菜发酵液样本真菌群落结构分析在对大头菜发酵液中不同分类学水平真菌菌群相对丰度进行分析的基础上，进一步采用样本层级聚类分析和主成分分析（principal component analysis，PCA）研究不同样本真菌群落结构的相似性和差异关系。在OTU分类水平上，采用bray-curtis距离算法，根据β多样性距离矩阵进行层级聚类分析，使用UPGMA算法构建树状结构，结果如图1所示。24 个大头菜发酵液样品可聚为3 类，其中1_1和1_2的6 个样品聚为一类，1_3、1_4、1_5的9 个样品和1_6a聚为一类，1_7、1_8的6 个样品和1_6b、1_6c聚为一类。由此也可将整个发酵过程大致分为3 个阶段，发酵前期、中期和后期。在发酵的相同阶段，真菌群落组成结构相似。  图1 OTU水平上样本真菌群落聚类分析
Fig. 1 Cluster analysis of fungal communities of the samples at the OTU level
进一步PCA可知，不同样本真菌群落结构信息主要集中在前3 个主成分，其累计方差贡献率为93.14%，其中PC1的贡献率为53.01%，PC2的贡献率为26.6%。如图2所示，样本之间的距离代表真菌群落结构的差异程度。24 个大头菜发酵液样本呈现出明显的聚类趋势，除1_6a与II类有交叉外，1_1和1_2聚为I类，1_3、1_4和1_5聚为II类，1_6、1_7和1_8聚为III类，这与UPGMA聚类分析结果一致。 通过对10个高新技术企业的实证研究发现，得出的指标体系及指标权重对指导高新技术企业信息共享建设具有重要的现实意义。通过实证分析得出的整体效率评价结果看，“信息系统研发成本”对高新技术企业供应链信息共享程度的影响最大，其次是“硬件投资”和“系统安全维护”。因此，应加强对信息系统的投资和应用程度、加大力度维护信息系统的安全性，确保信息的安全性、及时性以及准确性。根据以上分析，为提升高新技术企业间供应链信息共享水平提出以下几点建议。  图2 OTU水平上样本真菌群落PCA
Fig. 2 Principal component analysis of fungal communities at the OTU level
2.3 门水平真菌群落组成分析如图3所示，去除未分类的真菌后，样品中真菌群落包含3 个门，分别为子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）和接合菌门（Zygomycota）。其中子囊菌门为优势菌门，相对丰度为74.2%～99.8%。其次为担子菌门，相对丰度为0.25%～25.7%。担子菌门在前期和后期相对丰度较高，在中期较低。在所有样品中接合菌门相对丰度最低，在0.2%以下。 基于木结构建筑施工中传统施工技术无法发挥出有效作用，同时难以满足施工发展需求。在这种情况下建筑施工企业应将先进施工技术运用到工程施工总，利用自动化机器来施工。通过机械化工作方式可促进施工效率的提升，同时为工程施工质量提供保障，据此在建设房屋工作中，先进的技术推广工作人员一定要重视起来。通过先进的技术和设备，把房屋建设工作的质量工作做到最好。此外，设备使用之后，应展开相应的运维工作，使因设备故障导致的质量问题得到有效预防。  图3 门水平上真菌群落组成分析
Fig. 3 Fungal community composition at the phylum level
2.4 目水平真菌群落组成分析不同发酵时期大头菜样品在目水平的真菌群落组成如图4所示，主要归属于11 个菌目，包括酵母目（Saccharomycetales）、炭角菌目（Xylariales）、散囊菌目（Eurotiales）、肉座菌目（Hypocreales）、格孢菌目（Pleosporales）、煤炱目（Capnodiales）、银耳目（Tremellales）、Cystofilobasidiales、节担菌目、norank_c__Sordariomycetes和伞型束梗孢菌目（Agaricostilbales），其他菌目相对丰度均为1%以下。 在1_1和1_2中，炭角菌目为优势菌目，相对丰度分别为60.2%和45.7%（平均值，下同），酵母目相对丰度仅为0.00%和0.07%。而在后续发酵过程中，酵母目取代炭角菌目，占据绝对优势，相对丰度达到了63.6%～99.5%。在1_1中，银耳目相对丰度较高，为17.0%，而在1_2～1_4中降为3%以下，在1_5～1_8中降至1%以下。在整个发酵过程中，Cystofilobasidiales在1_1中相对丰度最高，为8.4%，其次为1_4中（2.1%），在其他6 个发酵时期相对丰度均在1%以下。  图4 目水平上真菌群落组成分析
Fig. 4 Fungal community composition at the order level
2.5 属水平真菌群落组成分析对属水平总丰度排在前30的物种进行层级聚类，采用平均聚类方式，得到如图5所示的群落组成热图。图5表明了襄阳大头菜不同发酵时期样本间不同真菌菌属的相对丰度以及真菌组成的差异性和和样品间的相似性。在1_1和1_2中，明梭孢属（Monographella）为优势菌属，相对丰度分别为60.1%和45.6%。在1_3～1_5中，德巴利氏酵母属（Debaryomyces）占据了绝对的优势，相对丰度达到63.5%～96.3%。而在1_6～1_8中，接合酵母属（Zygosaccharomyces）相对丰度大大提高，发展为优势菌属，德巴利氏酵母属相对丰度有较大幅度的下降，在1_7中接合酵母属相对丰度超过德巴利氏酵母属，成为相对丰度最高的菌属（86.5%）。 包括用户管理和权限设置两种功能。用户可以管理三种类型的用户：考生，教师和管理人员(只能由管理员管理，教师没有这样的管理权限)。用户信息可被编辑，批量删除，查询等操作，还可以添加一个新的角色给用户。此外，如果用户(学生或教师)忘记密码，管理员可以重置六个数字用户密码。用户角色分类是考生，教师和管理人员，通过权限设置来设置角色，这取决于使用权限。 业内有多种冻雨积冰数学模型，其中认可度最高的是Jones模型[14]，诸多学者都对Jones模型进行了实验验证[15-16]。这里也基于Jones提出的冻雨积冰数学模型来进行研究，如式(1)所示。 由图5可知，整个发酵过程样品可聚为3 类，1_1和1_2在属水平真菌群落结构比较接近，归为一类，1_3、1_4和1_5归为一类，1_6、1_7和1_8归为一类，分别对应于发酵的前期、中期和后期，这与聚类分析和PCA结果一致。总丰度排在前30的菌属可聚为5 类，接合酵母属和德巴利氏酵母属聚为一类，在发酵前期丰度较低，而在发酵中后期丰度较高；赤霉菌属（Gibberella）、unclassified_f__Trichocomaceae、链格孢属（Alternaria）、Cystofilobasidium、Hannaella、Dioszegia、隐球菌属（Cryptococcus）和镰刀菌属（Fusarium）聚为一类，在发酵前期和中期相对丰度较高，而在发酵后期相对丰度较低。  图5 属水平上真菌群落组成热图
Fig. 5 Heatmap of fungal communities at the genus level
2.6 不同发酵阶段OTU Venn图分析 图6 3 个发酵阶段真菌群落OTU水平的Venn图
Fig. 6 Venn diagram analysis of fungal communities at the OTU level in the samples from three fermentation stages
利用Venn图统计多个样本中共有的和独有的OTU的数量，可以直观地显示出不同分类水平样本的组成相似性和重叠程度。24 个大头菜发酵液样本中共检出483 个OTU，发酵前期OTU数量最多，达到329 个，其次为发酵中期（266 个），发酵后期样本中OTU数量最少，为246 个。随着发酵的进行，OTU数量有所降低，这可能是由于在发酵过程中逐步加入了大量的食盐，抑制了不耐盐真菌的生长。从图6可以看出，3 个发酵阶段共有OTU数为124 个，发酵前期、中期和后期特有OTU数分别为118、58 个和73 个，分别占各发酵阶段总OTU数的35.87%、21.80%和29.67%。 3 结 论采用Illumina MiSeq高通量测序技术对发酵过程中传统发酵大头菜的真菌多样性和菌群结构进行分析，经OTU分类学分析，24 份样本中共发现4 个门、19 个纲、56 个目、106 个科、190 个属、303 个种、516 个OTU。α多样性分析表明，在整个发酵过程中，前期真菌群落的丰富度和多样性更高。通过聚类分析和PCA发现，24 个样品可根据微生物群落结构特征划分为3 个聚类，将发酵的整个过程分为发酵前期、中期和后期，3 个发酵阶段共有OTU数为124 个。去除未分类的真菌后，子囊菌门为优势菌门，相对丰度为74.2%～99.8%。目水平上，发酵前期炭角菌目为优势菌目，相对丰度为45.7%～60.2%，后续发酵过程中，酵母目取代炭角菌目，占据绝对优势，相对丰度达到63.6%～99.5%。属水平上，发酵前期明梭孢属为优势菌属，相对丰度为45.6%～60.1%。发酵中期，德巴利氏酵母属占据了绝对的优势，相对丰度达到63.5%～96.3%。而在发酵后期，接合酵母属相对丰度大大提高，发展为优势菌属，甚至超过德巴利氏酵母属。本研究全面揭示了传统发酵大头菜发酵过程中真菌群落结构及其动态变化，可为后续大头菜发酵剂的制备提供一定理论基础，对今后传统发酵大头菜的工业化、标准化生产具有极其重要的意义。 今年是国土资源系统实施“七五”法制宣传教育工作的中期阶段，嘉兴市国土资源局始终紧紧围绕浙江省自然资源厅要求的“法治国土”和市委、市政府要求的“法治嘉兴”两个法制建设要求，不断加强领导、强化措施、联系实际、突出重点、创新形式，积极通过多种形式开展法制宣传教育活动，扎实推进依法行政和普法工作。今年以来，嘉兴市国土资源局在市局机关开展“文化颂法治”活动，在局机关干部职工中广泛征集以法治宣传为内容的书法、绘画作品，在市局机关走廊内建立法治国土文化宣传栏，通过机关文化进行法治宣传，不断提高单位干部职工和广大人民群众国土资源保护意识和法制观念。 参考文献： [1] 吴进菊, 胡佳琪, 于博, 等. 传统发酵食品中微生物多样性和群落结构动态变化研究进展[J]. 中国酿造, 2016, 35(9): 20-23.DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.005. 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Fungal Diversity of Pickled Kohlrabi during Fermentation Analyzed by High-throughput Sequencing WU Jinju, ZENG Ruiping, ZHANG Junyi, ZHANG Yizhou, YU Haizhong, YU Bo
(College of Food Science and Technology and Chemical Engineering,Hubei University of Arts and Science, Xiangyang 441053, China) Abstract: In order to fully reveal the dynamic change of fungal community structure in Xiangyang pickled kohlrabi during its fermentation process, Illumina MiSeq high-throughput sequencing technology was used to investigate the fungal community diversity in pickle juice samples at different fermentation times during its industrial production. A total of 303 species in 190 genera in 106 families in 56 orders in 19 classes in 4 phyla with 516 operational taxonomic units (OTUs) were identified in 24 samples. Collectively, cluster analysis and principal component analysis showed that the 24 samples could be divided into three clusters based on the structural characteristics of fungal community, i.e. early, middle and late stages of fermentation. The total number of OTUs common to the three fermentation stages was 124. Except for unclassified fungi, the dominant phylum in all samples was Ascomycota, with a relative abundance of 74.2% to 99.8%, followed by Basidiomycota.At the level of order, Xylariales was the dominant fungus at the early fermentation stage, with a relative abundance of 45.7%to 60.2%. Subsequently, Saccharomycetales became absolutely dominant instead of Xylariales, with a relative abundance of 63.6% to 99.5%. At the level of genus, Monographella was the dominant fungus at the early fermentation stage while Debaryomyces and Zygosaccharomyces were the dominant fungi at the middle and late stages. Keywords: kohlrabi; fermentation; fungal diversity; high-throughput sequencing
收稿日期：2019-04-25 基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（31501456）；湖北省高等学校优秀中青年科技创新团队计划项目（T201616）；湖北省普通本科高校“荆楚卓越人才”协同育人计划项目；襄阳市科学研究开发课题（食品加工高新技术平台建设项目）；湖北文理学院食品新型工业化学科群建设项目 第一作者简介：吴进菊（1983—）（ORCID: 0000-0002-8996-1603），女，副教授，博士，研究方向为食品加工高新技术和食品生物技术。E-mail: wujinju302@163.comDOI:10.7506/spkx1002-6630-20190425-327 中图分类号：TS201.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2020）10-0075-06 引文格式： 吴进菊, 曾瑞萍, 张俊毅, 等. 高通量测序分析大头菜发酵过程中真菌的多样性[J]. 食品科学, 2020, 41(10): 75-80.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190425-327. http://www.spkx.net.cnWU Jinju, ZENG Ruiping, ZHANG Junyi, et al. Fungal diversity of pickled kohlrabi during fermentation analyzed by highthroughput sequencing[J]. Food Science, 2020, 41(10): 75-80. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190425-327. http://www.spkx.net.cn
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发表于 2021-2-10 10:43:25
