黑曲霉发酵产木糖苷酶工艺优化

奥鹏网院作业

黑曲霉发酵产木糖苷酶工艺优化黑曲霉发酵产木糖苷酶工艺优化

汤 勇，丁泓皓，蔡 俊*

（湖北工业大学 发酵工程教育部重点实验室，工业微生物湖北省重点实验室，工业发酵湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430068）

摘 要：为充分再利用玉米芯粉这种农副产品资源，以黑曲霉为菌种，进行黑曲霉液态发酵玉米芯粉产木糖苷酶的研究。首先采用单因素试验，以黑曲霉发酵过程中产生的木糖苷酶活力为响应值，考察发酵周期、发酵温度、接种量、初始发酵pH值、装液量和摇瓶转速对木糖苷酶活力的影响。结果表明：发酵时间144 h、发酵温度34 ℃、接种量7%、初始发酵pH 3.0、摇瓶转速180 r/min、装液量110 mL/300 mL为该菌产木糖苷酶的最佳发酵条件。然后在上述最佳发酵条件的基础上，结合Plackett-Burman试验、最低添加量试验、最陡爬坡试验和响应面中心组合试验确定了最佳产酶培养基组分为：玉米芯粉31.55 g/L，酵母粉8.00 g/L，蛋白胨5.48 g/L，硫酸镁0.70 g/L，氯化钠1.00 g/L，氯化钙1.50 g/L。利用软件构建二次式模型，模型决定系数R2为0.991 0，调整决定系数R2为0.982 9。回归方程的方差分析结果表明，模型显著有效，失拟项P值大于0.05，适用于产酶的理论预测。经过上述优化后菌株产木糖苷酶活力是优化前的8.89 倍。

关键词： 黑曲霉；木糖苷酶；发酵；响应面法

黑曲霉是曲霉属真菌的一个常见种，是广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中的丝状子囊真菌[1]。黑曲霉是重要的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等[2-3]。除此之外，黑曲霉具有强大的聚合物降解酶系，已有黑曲霉作为木聚糖降解酶系的强大生产者，可以在各种廉价的培养基，比如玉米粉、玉米芯粉、麸皮等上快速生长和发酵产酶[4-7]的相关报道。

我国是农业大国，每年都会产生大量可回收再利用的农业废弃物和农业副产品。据统计，我国收获玉米后的副产物——玉米芯量超过2 000万 t。如何更好地利用该宝贵的可再生资源已受到世界各国的高度重视。目前国内外采用微生物菌种液态发酵玉米芯粉的报道较少，且主要用于生产蛋白饲料，很少有关于产酶的报道[8-10]。玉米芯粉含有丰富的纤维素、半纤维素、木质素等，是一种优质的微生物发酵培养基碳源[11]。

女警官道：“举报者说，被绑架的，还有两个人。一个是盗墓者，我们很难找到了；另一位是省城的，叫什么名字，他讲不出来。”

木质纤维素由3 个主要组分组成：纤维素（30%～50%干质量）、半纤维素（20%～40%）、木质素（15%～25%）和灰分及其他成分（3%～10%）。虽然纤维素和半纤维素都可以水解成单个糖分子，但半纤维素的链短、分支少和非结晶性质使其比纤维素更适合水解[12]。硬木和许多农作物，如玉米芯粉的主要半纤维素是木聚糖，伴随少量阿拉伯聚糖、半乳聚糖和甘露聚糖，是木聚糖降解酶系的诱导碳源。木聚糖的完全降解需要木聚糖酶和木糖苷酶2 种关键酶，其中木聚糖酶破坏木聚糖骨架成更短的可溶性低聚木糖；木糖苷酶水解可溶性低聚木糖和木二糖的非还原末端释放木糖[13-14]。木糖苷酶在自然界中比较常见于丝状真菌[15-16]，如曲霉菌属（Aspergillus）、青霉菌属（Penicillium）、木霉菌属（Trichoderma）等。其中黑曲霉[17]是比较常见的可以利用玉米芯粉发酵产木糖苷酶的微生物。木糖苷酶在新能源、化学制药、食品和饮料、纤维饲料、造纸工业等方面都有非常重要的用途[18-22]，尤其是食品领域，比如木糖苷酶可以降低啤酒和果汁的黏度和浑浊度，提高产品质量[23-24]；木糖苷酶可以用于烘烤，不仅改善面团体积还可以延长其保质期[25]；木聚糖经过木糖苷酶处理后得到的木糖可用于生产木糖醇，作为食品甜味剂[26-28]，得到的低聚木糖作为益生元可以选择性促进益生菌生长，从而缓解便秘、促进消化[29-30]，所以提高微生物发酵产木糖苷酶的能力非常有必要。

微生物所产木糖苷酶可以将丰富、廉价、可再生资源生物转化为重要经济产品，其在食品领域具有较高的商业价值和市场潜力。但是自然界中野生型微生物产木糖苷酶的酶量低、成本高等问题极大限制了木糖苷酶的广泛应用，因此本研究拟通过单因素试验、Plackett-Burman试验设计、中心组合试验设计优化野生型菌株黑曲霉CAN产木糖苷酶的发酵工艺和发酵培养基，以期为木糖苷酶的工业化生产和应用提供重要的参考依据。

1 材料与方法1.1 材料与试剂

玉米芯粉 武汉新华扬股份有限公司；黑曲霉CAN保藏于湖北工业大学教育部重点实验室工业发酵湖北省协同创新中心A610实验室。

蔗糖、木糖、淀粉、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、酵母膏、硝酸钾、硝酸钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸镁、碳酸钠、柠檬酸、柠檬酸三钠、对硝基苯酚 国药集团化学试剂有限公司；对硝基苯基吡喃木糖苷 上海源叶生物科技有限公司。

而白葡萄品种主要是歌蕾拉（Glera）和卡尔卡耐卡。歌蕾拉这一品种还可以用来酿造意大利最出名的起泡酒之一：普塞克。普塞克这种起泡酒的名称很特别：在过去歌蕾拉也被称为“普塞克”，它是为数不多以葡萄品种命名的葡萄酒，同时，普塞克还是意大利的一个法定产区名。这种起泡酒通常散发着花朵、桃子、梨子和苹果的芳香，还有些许香草的气息，口感清新淡雅，酒精度较低，风格平易近人，价格也十分亲民接地气，比香槟便宜得多。很适合聚餐时搭配火腿、油炸食品、下午茶等，是小清新的首选。

菌种种子培养采用土豆培养基，配制过程：称取土豆200 g，去皮切成丁，加适量蒸馏水，充分煮沸，用4 层纱布过滤，滤液加入20 g葡萄糖，补足水至1 000 mL，高压灭菌，备用。活化时于以活化的黑曲霉斜面接种，28 ℃、180 r/min振荡培养40 h。

左小龙暗自想到，这个泥巴真是的，自己就是因为没钱才想让这车修慢点，恨不能这发动机是自己发动一下然后从广东一路走过来的，现在直接空运过来，发动机费用不说，空运费又是一笔。

焦作市商务局相关负责人表示，通过开展此次专项整治，严肃查处并曝光违法违规案件，进一步加大商务执法领域事中事后监管力度，为消费扩大和升级营造良好的市场环境。

1.2 仪器与设备

Sorvall LYNK 6000超速离心机 美国Thermo公司；立式压力蒸汽灭菌锅 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-1D型单人净化工作台 苏州净化设备有限公司；ZSD-12全自动生化培养箱 上海智城分析仪器有限公司；ZQZY-CF8系列三层恒温培养振荡器 上海知楚仪器有限公司；SYNERGY2酶标仪 基因有限公司。

1.3 方法

1.3.1 木糖苷酶活力的测定

取0.1 mL稀释适当倍数后的发酵上清液加入0.9 mL 0.5 mg/mL的对硝基苯基吡喃木糖苷溶液（pH 4.5），在70 ℃水浴中以应30 min后，立即加入0.5 mL 2 mol/L碳酸钠溶液终止以应，混和均匀后在410 nm波长处测溶液的吸光度。通过测定在410 nm波长处释放出的对硝基苯酚吸光度计算酶活力。1 个木糖苷酶的酶活力单位（U/mL）定义为每分钟生成1 μmol对硝基苯酚所需的酶量[31]。

1.3.2 黑曲霉CAN产木糖苷酶发酵条件的优化

采用单因素法研究发酵周期、发酵温度、接种量、初始pH值、装液量、摇瓶转速对CAN发酵产木糖苷酶的影响。产木糖苷酶初始发酵培养基：玉米芯粉20 g/L，硝酸钠2.5 g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸氢二钾1.0 g/L，氯化钙2.5 g/L；初始发酵条件：接种量5%，装液量100 mL/300 mL，温度28 ℃，摇瓶转速160 r/min，pH值自然。

心肌梗死是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌发生不可逆转坏死而形成的病理过程，心肌出现缺血性的坏死后可引起心脏的收缩功能和(或)舒张功能发生障碍，出现心力衰竭[1]。心力衰竭多伴恐惧或焦虑的心理反应，因而在急救的过程中除了提高急诊的效率以缩短患者接受治疗的时间，同时还不可忽视患者的心理反应[2]。舒适护理是1995年由Kolcaba提出的，其更注重患者的舒适感和满意感[3]。2016年6月～2018年2月，我们对45例心肌梗死致心力衰竭患者在临床护理路径基础上给予舒适护理，取得满意效果。现报告如下。

发酵时间：在上述初始发酵培养基和培养条件下进行黑曲霉发酵产酶实验，每隔12 h测定一次发酵液中木糖苷酶活力；发酵温度：以上述实验最佳结果为前提，分别在25、28、31、34、37、40、43 ℃条件下发酵培养后测定木糖苷酶活力；摇瓶接种量：以上述实验最佳结果为前提，改变接种量分别为1%、3%、5%、7%、9%（V/V），发酵培养后测定木糖苷酶活力；发酵初始pH值：以上述实验最佳结果为前提，调整初始pH值分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，发酵培养后测定木糖苷酶活力；摇瓶装液量：以上述实验最佳结果为前提，采用300 mL摇瓶装液，摇瓶装液量分别为30、50、70、90、110 mL，发酵培养后测定木糖苷酶活力；摇瓶转速：以上述实验最佳结果为前提，摇瓶转速分别为120、140、160、180、200、220 r/min，发酵培养后测定木糖苷酶活力。

1.3.3 黑曲霉CAN产木糖苷酶发酵培养基的优化

研究对象选自2015年12月至2017年12月本院诊治的急性糜烂出血性胃炎大出血患者100例,随机对其进行分组,分成50例研究组和50例对照组,所有患者均知情同意参与本次研究。其中研究组50例患者中男性患者34例,女性患者16例;年龄在52-80岁,平均年龄(69.81±11.2)岁;主要临床表现为呕血和便血。对照组50例患者中男性患者33例,女性患者17例;年龄在51-79岁,平均年龄(68.34±10.93)岁;主要临床表现为呕血和便血。研究组与对照组在性别、年龄以及主要临床表现等方面对比无明显差异,P>0.05,无统计学意义。

1.3.3.1 发酵培养基碳源的优选及添加量的优化

发酵培养基碳源选择蔗糖、麸皮、木糖、淀粉、玉米粉、玉米芯粉、低聚木糖、葡萄糖，碳源添加量为20 g/L，培养基其他成分保持不变，发酵条件为1.3.2节优化后条件，发酵培养后测定木糖苷酶活力。

选择酶活力最高的碳源为最佳碳源，改变其添加量分别为5、10、15、20、25、30、35、40 g/L，培养基其他成分保持不变，发酵条件为1.3.2节优化后条件，发酵培养后测定木糖苷酶活力。

(3)通过前面的分析，综合指标的主观权重Wi主(层次总排序权重)和客观权重Wi客，就可以得到指标权重Wi。虽然是由不同方法得出的不同权重，但是它们所反映的却是同一个问题。因此，Wi主和Wi客应该尽可能的接近。根据最小相对信息熵原理有[18]

1.3.3.2 发酵培养基氮源的优选及添加量的优化

以上述实验最佳结果为前提，发酵培养基氮源选择硫酸铵、玉米浆、氯化铵、硝酸钾、酵母膏、硝酸钠、大豆粉、麸皮、尿素、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉，氮源添加量为10 g/L，培养基其他成分保持不变，发酵条件为1.3.2节优化后条件，发酵培养后测定木糖苷酶活力。

选取较优的几种氮源做复合氮源实验，培养基其他成分保持不变，发酵条件为1.3.2节优化后条件，发酵培养后测定木糖苷酶活力。以最优复合氮源为研究对象，培养基其他成分保持不变，总添加量分别为5、10、15、20、25、30 g/L，发酵条件为1.3.2节优化后条件，发酵培养后测定木糖苷酶活力。

1.3.3.3 发酵培养基无机盐的优化

以上述实验最佳结果为前提，发酵培养基中无机盐只添加磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸镁和氯化钙中的一种，其添加量为0.5 g/L，发酵条件为1.3.2节优化后条件，发酵培养后测定木糖苷酶活力。

1.3.3.4 Plackett-Burman设计

在工艺优化中，采用Plackett-Burman设计可以通过较少的试验次数从众多因素中快速筛选出对目的指标影响最大的显著性因素，以供进一步研究[32]。根据上述实验结果，用Design-Expert软件进行Plackett-Burman设计，筛选出对菌株产木糖苷酶影响比较显著的因素。发酵条件为1.3.2节优化后条件，发酵培养后测定木糖苷酶活力。

1.3.3.5 最低添加量试验

以Plackett-Burman试验筛选出的不显著性因素为基础，以培养基最经济为目的，研究对黑曲霉CAN产木糖苷酶影响不显著因素的最低添加量。发酵条件为1.3.2节优化后条件，发酵培养后测定木糖苷酶活力。

1.3.3.6 最陡爬坡试验

以Plackett-Burman试验筛选出的显著性因素为基础，为进一步确定最佳培养基组成，通过最陡爬坡试验确定这些显著因素的最佳区域。依据显著性因素正负效应，设计合理的步长，增加试验的密集度，逼近效果最好的区域[33]。发酵条件为1.3.2节优化后条件，发酵培养后测定木糖苷酶活力。

1.3.3.7 中心组合试验设计

响应面试验通过合理地选取试验点和迭代策略，克服了传统方法的缺点，在对微生物培养条件和培养基成分选择的优化中均取得了显著的成效。根据上述试验结果，采用Design-Expert软件设计，对试验结果进行方差分析，依据回归方程绘制响应面三维立体分析图，并预测发酵培养基的最佳组成。发酵条件为1.3.2节优化后条件，发酵培养后测定木糖苷酶活力。

1.4 数据统计分析

应用Design-Expert 8.0.6进行数据处理和分析，包括回归分析、二次多项式回归方程、方差分析和响应面图。所有实验重复3 次，数据表示为±s。

近年来，我国经济高速发展，土地使用制度也在不断的改革和创新，城镇地籍管理作为我国土地管理的核心工作，已由传统的人工管理模式逐渐向信息化模式转变，由此，加强建立动态、现势性强的空间和属性数据一体化的城镇地籍数据库以及管理信息系统势在必行。城镇地籍数据库中的数据关系复杂、种类繁多，采用常规建库手段已难以满足现代业务的需求。如何对海量数据进行管理，实现地籍图的快速更新和生成以及满足地籍信息的公开查询与共享，从而建成集影像、图形、地类、面积和权属于一体的国家、省、市、县四级城镇地籍调查数据库和管理信息系统，这都需要应用良好的空间数据建库系统来维护和管理。

恩布拉科亚太区市场经理刘美华在会上阐述了全球家用压缩机市场概括，从零部件层面剖析了冰箱技术的升级发展情况。

2 结果与分析2.1 黑曲霉CAN产木糖苷酶发酵条件的优化   
     

图1 发酵条件对CAN产木糖苷酶的影响
Fig. 1 Effect of fermentation conditions on xylosidase activity of A. niger

由图1A可知，在发酵前期培养基中的营养物质主要用于菌株的生长繁殖。随着发酵时间的延长，产酶量逐步增加，当发酵时间到达144 h时酶活力达到最高。当发酵时间继续延长，随着发酵培养基中营养物质的消耗和有毒物质的积累导致发酵液中酶活力有所下降，故选择发酵周期为144 h[34]。

由图1B可知，当温度在25～34 ℃之间时，随着温度的升高，菌株产木糖苷酶活力随着升高，在温度34 ℃时，酶活力最高，当温度高于40 ℃时，木糖苷酶活力开始降低。由于微生物的生长和产物的合成需要在适宜的温度下进行，一般温度升高，生长代谢加快，但温度过高，会导致菌体提前衰老，产酶减少。同时温度还会影响微生物合成产物的方向。故选择发酵温度为34 ℃。

由图1C可知，当接种量从1%增加到7%时，发酵液中木糖苷酶活力最高，当接种量继续增大时，木糖苷酶活力开始下降。因为较大的接种量导致菌株生长过快，培养基黏度增加，溶氧不足，不利于菌株发酵产木糖苷酶，故选择最佳接种量为7%。

由图1D可知，当发酵液初始pH值为3.0，木糖苷酶活力最高。因为pH值会影响各种酶活力、菌对基质的利用速率和细胞的结构，从而影响菌的生长和产物的合成，同时已知大多数木糖苷酶在酸性条件下较稳定[27]，故选择发酵液初始pH值为3.0。

由图1E可知，当装液量为110 mL（300 mL三角瓶）时，木糖苷酶活力最高，此时的发酵液中的溶氧量最适合菌株发酵产木糖苷酶，故选择装液量为110 mL。

由图1F可知，当转速为180 r/min时，木糖苷酶活力最高，随着转速的增大，产生的剪切力会影响菌丝体的生长，导致菌株产木糖苷酶能力降低，故选择最适转速为180 r/min。

学校在进行设计和规划时，并没有根据校园内行车的需要对道路尽心规划，使得道路较窄。比如，多数校园道路的设计局限于疏散人流的单一功能，并且人为地限制了车辆的同行。这使得学校内虽然有大量的道路，但是多为狭窄的销路，并且拐弯很多，一旦有大量的车辆进入校园，就很难有足够的空间行车，再加上路窄无法掉头，因此很容易造成交通拥堵。

2.2 黑曲霉CAN产木糖苷酶发酵培养基的优化

2.2.1 发酵培养基碳源及碳源添加量的优选

     

图2 碳源种类（A）及碳源添加量（B）对CAN产木糖苷酶的影响
Fig. 2 Effect of the type (A) and concentration (B) of carbon source on xylosidase activity of A. niger

由图2A可知，当发酵培养基碳源为玉米芯粉时，产木糖苷酶活力最高，麸皮次之。玉米芯粉和麸皮中木聚糖含量较高，能够诱导菌株产木糖苷酶[35]。其他可以被直接利用的碳源不能诱导菌株产酶或者对菌株产酶具有抑制作用[36-37]，故选择玉米芯粉为最佳碳源。

由图2B可知，当碳源添加量为25 g/L时，木糖苷酶活力最高，当碳源添加量过低时，营养物质供应不足，造成木糖苷酶活力较低。当碳源添加量过高时，培养基黏度增大，发酵过程中的传质和溶氧会受到影响，导致木糖苷酶活力较低，故选择碳源添加量为25 g/L。

2.2.2 发酵培养基氮源及氮源添加量的优选

     

图3 氮源种类（A）和氮源总添加量（B）对CAN产木糖苷酶的影响
Fig. 3 Effect of the type (A) and concentration (B) of nitrogen source on xylosidase activity of A. niger

表1 复合氮源对CAN产木糖苷酶的影响
Fig. 1 Effect of combinations of nitrogen sources on xylosidase activity of A. niger

     

氮源种类 比例 木糖苷酶活力/（U/mL）蛋白胨-牛肉膏 1∶1 4.367蛋白胨-牛肉膏 1∶2 2.509蛋白胨-牛肉膏 2∶1 2.330蛋白胨-酵母粉 1∶1 8.617蛋白胨-酵母粉 1∶2 8.964蛋白胨-酵母粉 2∶1 6.621牛肉膏-酵母粉 1∶1 4.627牛肉膏-酵母粉 1∶2 7.981牛肉膏-酵母粉 2∶1 1.275

细菌、霉菌和酵母都要利用氮元素合成酶，因此氮源的选择和添加量对微生物产酶至关重要。由图3A可知，菌株利用不同氮源产木糖苷酶活力差别较大，一般情况下，有机氮源比无机氮源对微生物内酶的合成与分泌具有更明显的促进作用[26,38]。因此选择蛋白胨、牛肉膏、酵母粉和硝酸钾做复合氮源实验。由表1可知，利用几种较优的单一氮源复合后，菌株产酶能力大都有所提高。因此选择最优的复合有机氮源配比，即蛋白胨-酵母粉1∶2。

由图3B可知，随着氮源总添加量的逐渐增加，菌株利用氮源合成木糖苷酶的量逐渐增加，氮源总添加量在10 g/L时，木糖苷酶活力最高，氮源总添加量超过10 g/L时，酶活力开始逐渐降低，故选择氮源添加量为10 g/L。

2.2.3 发酵培养基无机盐的优选试验

     

图4 无机盐种类对CAN产木糖苷酶的影响
Fig. 4 Effect of different inorganic salts on xylosidase activity of A. niger

由图4可知，单一无机盐对菌株产酶的影响中，磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸镁、氯化钙、磷酸二氢钾较优，故选择磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸镁、氯化钙进行后续Plackett-Burman试验。

经验教训:本例主要是对生殖道畸形认识不足而导致误诊,另外也暴露了对子宫及盆腔脓肿的基本理论掌握不扎实,未能分辨出两者超声的区别,故需要提高B超诊断水平;以后也应加强对病史的采集,对有疑问的专科检查应做出更全面的考虑,切不可草率定论;本例庆幸的是对患者术后再次复查B超,做出了双子宫、双宫颈的考虑,如若不然,患者日后仍有再次腹痛、包块复发的必然性,饱受疾病的折磨,希望本病例能引起同行的重视,减少对患者的误诊误治。

2.2.4 Plackett-Burman试验结果

通过对单因素试验结果进行分析，可以基本确定Plackett-Burman设计所需的培养基组分，然后通过Plackett-Burman试验筛选得到培养基对菌株产酶有显著性影响的组分，以便对培养基的组分进行进一步优化。按照Design-Expert软件设计，次数20 次，每组3 个平行，试验设计与结果见表2。

表2 Plackett-Burman试验设计与结果
Table 2 Plackett-Burman design with experimental results

     

试验号玉米芯粉 蛋白胨 酵母粉 磷酸氢二钾磷酸二氢钾 氯化钠 硫酸镁 氯化钙 木糖苷酶活力/（U/mL）1 1 1 -1 -1 -1 -1 1 -1 9.034 2 1 -1 -1 1 1 -1 1 1 7.806 3 1 -1 -1 -1 -1 1 -1 1 8.225 4 1 -1 1 1 -1 -1 -1 -1 8.066 5 1 1 1 1 -1 -1 1 1 9.988 6 -1 -1 1 1 -1 1 1 -1 6.722 7 -1 -1 -1 -1 1 -1 1 -1 5.927 8 -1 1 1 1 1 -1 -1 1 7.300 9 -1 1 1 -1 1 1 -1 -1 7.791 10 1 1 -1 -1 1 1 -1 1 8.658 11 1 -1 1 1 1 1 -1 -1 8.601 12 -1 1 1 -1 -1 -1 -1 1 7.748 13 1 1 1 -1 -1 1 1 -1 9.193 14 -1 -1 1 -1 1 -1 1 1 5.392 15 1 1 -1 1 1 -1 -1 -1 11.477 16 1 -1 1 -1 1 1 1 1 7.936 17 -1 -1 -1 1 -1 1 -1 1 7.026 18 -1 1 -1 1 -1 1 1 1 7.213 19 -1 1 -1 1 1 1 1 -1 7.286 20 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 6.953

由表3可知，回归模型的P值小于0.05，表明该模型显著。玉米芯粉、蛋白胨、硫酸镁的P值在95%的置信区间内小于0.05，即说明玉米芯粉、蛋白胨、硫酸镁这3 种培养基组成成分是影响CAN菌株产木糖苷酶的显著性因素，其中玉米芯粉、蛋白胨为正效应，硫酸镁为负效应。由方差分析可知，决定系数R2为0.873 1，表明87.31%的数据都能用此模型解释。

四肢骨折为外科常见病,手术是临床上治疗该病的常用方式,但因该病发病较为突然,疼痛感较强,且易造成行为受限,因此,极易给患者的生理及心理造成极大影响。做好对患者护理干预的重视,改善患者生活质量就显得尤为重要。网络健康管理属于新型医学服务模式的一种,为探讨该护理模式在四肢骨折患者中的作用,本研究对收治的118例患者进行了分析,详细报告如下。

表3 Plackett-Burman设计回归模型方差及主效应分析
Table 3 ANOVA of the mathematical model established based on Plackett-Burman design and significance test

     

来源 效应 系数 标准 T值 P值常量 15.518 0.235 66.10 0.000玉米芯粉 3.847 1.923 0.235 8.19 0.001蛋白胨 2.555 1.277 0.235 5.44 0.002酵母粉 -0.691 -0.346 0.235 -1.47 0.169磷酸氢二钾 0.385 0.193 0.235 0.82 0.429磷酸二氢钾 0.131 0.065 0.235 0.28 0.786氯化钠 0.317 0.159 0.235 0.68 0.513硫酸镁 -1.569 -0.785 0.235 -3.34 0.007氯化钙 -0.736 -0.368 0.235 -1.57 0.145来源 自由度 偏差平方和 均方差 F值 P值主效应 8 120.059 15.007 4 9.46 0.001残差误差 11 17.442 1.585 7合计 19 137.502 R2=0.873 1

2.2.5 最低添加量试验结果

根据Plackett-Burman设计试验得到的影响菌株产木糖苷酶的不显著因素，即酵母粉、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钙，做最低添加量试验，结果见表4。

表4 不显著因素的最低添加量试验
Table 4 Results of lowest addition experiments on medium ingredients without significant influence on xylosidase activity of A. niger

     

因素 添加量/（g/L） 木糖苷酶活力/（U/mL）10.682 0.5 9.624 1.0 9.456 1.5 9.359 2.0 9.136 0磷酸氢二钾11.730 0.5 9.662 1.0 8.861 1.5 8.614 2.0 8.444 0磷酸二氢钾8.189 0.5 9.719 1.0 10.767 1.5 9.011 2.0 8.983 0氯化钠8.813 0.5 9.323 1.0 9.691 1.5 10.739 2.0 8.189 0氯化钙酵母粉2.0 6.037 4.0 8.133 6.0 8.841 8.0 10.314 10.0 9.861

由表4可知，本着降低生产成本和简化培养基组分的原则，选择各因素下酶活力达到峰值时所对应的添加量为其最低添加量，即磷酸氢二钾0 g/L、磷酸二氢钾0 g/L、氯化钠1.0 g/L、氯化钙1.5 g/L、酵母粉8.0 g/L。

2.2.6 最陡爬坡试验结果

在离开中南海时，卫士长阎长林派警卫战士金武森送他们去前门东火车站坐火车，并交代金武森说：“记住，为他们买好回湖南的火车票。”

根据Plackett-Burman设计回归分析和方差分析，显著性因素中玉米芯粉和蛋白胨为正效应，硫酸镁为负效应，按照各因素的正负效应设定最陡爬坡试验。其他成分为酵母粉8.00 g/L、氯化钠 1.00 g/L、氯化钙1.50 g/L。

表5 最陡爬坡试验设计与结果
Table 5 Steepest ascent design with experimental results

     

试验号 玉米芯粉添加量/（g/L）蛋白胨添加量/（g/L）硫酸镁添加量/（g/L）木糖苷酶活力/（U/mL）1 25 3 1 12.651 2 30 4 0.8 14.379 3 35 5 0.6 11.039 4 40 6 0.4 10.869 5 45 7 0.2 10.303 6 50 8 0.0 9.878

由表5可知，当玉米芯粉、蛋白胨和硫酸镁添加量分别为30、4.0 g/L和0.8 g/L时，菌株产木糖苷酶活力最高，将其作为中心组合试验的中心点，进一步优化组分的添加量。

2.2.7 中心组合试验设计

表6 响应面二次式模型的方差分析
Table 6 ANOVA of response surface quadratic model

     

变异来源 平方和 自由度 均方 F值 P值模型 52.00 9 5.78 122.64 ＜0.000 1 A玉米芯粉添加量 17.48 1 17.48 370.99 ＜0.000 1 B蛋白胨添加量 12.20 1 12.20 258.88 ＜0.000 1 C硫酸镁添加量 5.88 1 5.88 124.91 ＜0.000 1 AB 1.87 1 1.87 39.73 ＜0.000 1 AC 3.80 1 3.80 80.55 ＜0.000 1 BC 0.12 1 0.12 2.50 0.145 0 A2 7.07 1 7.07 150.11 ＜0.000 1 B2 3.51 1 3.51 74.56 ＜0.000 1 C2 1.92 1 1.92 40.67 ＜0.000 1残差 0.47 10 0.047失拟项 0.22 5 0.044 0.88 0.555 3纯误差 0.25 5 0.005总离差 52.48 19 R2=0.991 0 R2（调整）=0.982 9 R2（预测）=0.960 8

通过最陡爬坡试验得到的玉米芯粉30.00 g/L、蛋白胨4.00 g/L、硫酸镁0.80 g/L为中心点，以木糖苷酶活力为响应值进行3因素5水平中心组合设计试验，其他发酵培养基成分为：酵母粉8.00 g/L、氯化钠1.00 g/L、氯化钙1.50 g/L。以酶活力作为响应值，利用软件构建二次式模型，模型方程为Ŷ=14.35+1.13A+0.95B-0.66C-0.48AB+0.69AC+0.12BC-0.70A2-0.49B2-0.36C2。由响应面二次式模型的方差分析可知，方程中A、B、C、AB、AC、A2、B2、C2各项的P值均小于0.05，说明以上各项对产酶有显著性影响。同时失拟项检验P值大于0.05，则说明模型能与数据准确拟合。经回归方程方差分析结果验证表明，模型的P值小于0.05，方程具有统计学上的显著性，说明该模型与实验值拟合较好，适用于产酶的理论预测。

由表6可知，玉米芯粉和蛋白胨、玉米芯粉和硫酸镁之间存在着显著的交互作用，通过软件对回归方程中的AB、AC交互项绘制响应面分析图，如图5所示。

     

图5 玉米芯粉分别和蛋白胨添加量（a）、硫酸镁添加量（b）的交互作用对CAN产木糖苷酶的影响响应面图
Fig. 5 Response surface plots showing the effects of interactions between corncob and peptone (a) as well as MgSO4 (b) on xylosidase activity of A. niger

由模型和软件分析可知得到极大值点所对应的各因素的编码值分别为0.31、0.74、-0.48，换算成实际值，分别是玉米芯粉31.55 g/L、蛋白胨5.48 g/L、硫酸镁0.70 g/L。在此预测最优培养基组分下木糖苷酶活力可以达到15.04 U/mL。用得到最佳培养基组成玉米芯粉31.55 g/L、酵母粉8.00 g/L、蛋白胨5.48 g/L、硫酸镁0.70 g/L、氯化钠1.00 g/L、氯化钙1.50 g/L，3 次重复实验平均酶活力为14.87 U/mL。实测值与回归方程预测值（15.04 U/mL）吻合良好。

3 结 论

采用单因素试验，确定黑曲霉发酵产木糖苷酶的最适发酵时间、发酵温度、接种量、初始pH值、装液量和摇瓶转速。然后在上述最佳发酵条件的基础上，结合Plackett-Burman、最低添加量、最陡爬坡试验和响应面法中心组合方法建立了黑曲霉发酵玉米芯粉产木糖苷酶工艺中木糖苷酶活力响应模型。经回归方程的方差分析表明，模型的P值小于0.05，方程具有统计学上的显著性，说明该模型与实验值拟合较好，适用于产酶的理论预测。用上述模型得到的最佳培养基组成为玉米芯粉31.55 g/L、酵母粉8.00 g/L、蛋白胨5.48 g/L、硫酸镁0.70 g/L、氯化钠1.00 g/L、氯化钙1.50 g/L，做3 次重复验证实验，平均酶活力为14.87 U/mL。实测值与回归方程预测值（15.04 U/mL）吻合良好。经过上述优化后菌株产木糖苷酶的活力是优化前的8.89 倍。

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Optimization of Fermentation Conditions for Xylosidase Production by Aspergillus niger

TANG Yong, DING Honghao, CAI Jun*
(Key Laboratory of Fermentation Engineering, Ministry of Education, Hubei Key Laboratory of Industrial Microbiology,Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China)

Abstract: In order to fully utilize corn cob powder as an agricultural by-product, the submerged fermentation of Aspergillus niger using corn cob powder as a substrate was optimized for enhanced xylosidase activity. Firstly, one-factor-at-atime method was used to investigate the effects of fermentation period, temperature, inoculum size, initial fermentation pH, medium volume and shaker speed on xylosidase activity. The results showed that a fermentation period of 144 h, a temperature of 34 ℃, an inoculum size of 7%, an initial fermentation pH of 3.0, a shaking speed of 180 r/min, and a medium volume of 110 mL in 300-mL shake fl asks were found to be the best conditions. Further, using the Plackett-Burman design,lowest addition experiments, the steepest ascent method, and response surface methodology with central composite design,the optimal levels for medium components were determined as follows: corn kernel powder 31.55 g/L, yeast powder 8.00 g/L, peptone 5.48 g/L, magnesium sulfate 0.70 g/L, sodium chloride 1.00 g/L, and calcium chloride 1.50 g/L.A quadratic polynomial model was developed with a determination coefficient R2 of 0.991 0, and an adjustment coefficient R2 of 0.982 9. The analysis of variance (ANOVA) showed that the model was significant with a P value greater than 0.05 for lack-of-fit, supporting its use for the theoretical prediction of enzyme production. Under the optimized conditions, an 8.89-fold increase was observed in xylosidase activity of Aspergillus niger.

Keywords: Aspergillus niger; xylosidase; fermentation; response surface methodology

收稿日期：2019-03-14

第一作者简介：汤勇（1992—）（ORCID: 0000-0002-9512-9047），男，硕士，研究方向为新型酶制剂发酵技术和生物再生资源的微生物转化。E-mail: 13971240128@163.com

*通信作者简介：蔡俊（1968—）（ORCID: 0000-0003-1488-9915），男，教授，博士，研究方向为发酵过程的优化与放大、生物再生资源的微生物转化和农副产品加工。E-mail: caijun@mail.hbut.edu.cn

DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190314-184

中图分类号：Q815

文献标志码：A

文章编号：1002-6630（2020）10-0172-08

引文格式：

汤勇, 丁鸿皓, 蔡俊. 黑曲霉发酵产木糖苷酶工艺优化[J]. 食品科学, 2020, 41(10): 172-179. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190314-184. http://www.spkx.net.cn

TANG Yong, DING Honghao, CAI Jun. Optimization of fermentation conditions for xylosidase production by Aspergillus niger[J]. Food Science, 2020, 41(10): 172-179. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190314-184. http://www.spkx.net.cn