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太平洋牡蛎壳制备L-天冬氨酸螯合钙的工艺优化及表征太平洋牡蛎壳制备L-天冬氨酸螯合钙的工艺优化及表征 王 真，姜岁岁，张 帆，王润芳，冯 雪，汪 瑞，李诗洋，赵元晖* （中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003） 摘 要：以太平洋牡蛎壳为钙源，利用电感耦合等离子体质谱测定牡蛎壳中重金属元素含量，采用不同处理方式制备L-天冬氨酸螯合钙，以螯合率和得率为衡量指标进行综合评价，选出最佳处理方式，并进一步分级操作，通过单因素试验从pH值、温度、时间、物质的量比4 个方面对螯合工艺进行综合评分，利用正交试验优化制备条件，且通过能谱分析对产物进行表征研究。结果表明，在煅烧、直接过筛和球磨3 种处理方式下，直接过筛的壳粉与L-天冬氨酸的螯合率显著高于煅烧和球磨处理。对过筛壳粉进一步分级发现，300～200 目筛的壳粉与L-天冬氨酸的螯合率较高。根据单因素试验得到螯合钙的最佳工艺参数为pH 4.5、以应温度50 ℃、以应时间100 min、L-天冬氨酸与Ca2+物质的量比2∶1，此条件下的螯合率高达98.5%。通过扫描电子显微镜、比表面积表征可知，煅烧、直接过筛和球磨3 种处理方式壳粉的微观形态差异较大，且比表面积逐次升高，与各自螯合率的大小相对应。螯合物能谱图结果显示钙元素成功螯合到L-天冬氨酸上。研究结果为废弃牡蛎壳的高值化利用及L-天冬氨酸螯合钙的生产工艺提供理论基础和新的思路。 关键词： 牡蛎壳；处理方式；L-天冬氨酸螯合钙；工艺优化 牡蛎作为我国四大养殖贝类之首，盛产于整个沿海地区，素有“海中牛奶”的美誉，已被我国卫生部门批准为第一批既是药材又是食品的海洋资源。然而，每消耗1 kg太平洋牡蛎，约产生370～700 g副产物，几乎全部都是壳[1]。在我国，每年处理约1 000万 t壳体废物[2]，这些废弃物通常被丢弃在垃圾填埋场，或加工成饲料，或者用作钙肥等，因此迫切需要新技术手段进行再生资源的利用。由于牡蛎壳中含有95%左右的碳酸钙，以牡蛎壳为原料制备生物钙逐渐引起人们的重视[3]。 钙是人体必需的矿质元素之一，在骨骼组成、肌肉收缩、细胞吞噬以及酶的激活等多种生命活动中具有重要作用[4]。人体中的钙主要来自食物，然而我国城乡居民膳食钙日摄入量较低，不及营养学推荐摄入量的一半[5]，且钙易与食物中的植酸、草酸、饱和脂肪酸、膳食纤维等物质结合形成难溶物，导致钙的吸收利用率较低，缺钙导致乏力抽筋、腰酸背痛、骨质疏松等症状居高不下。由此，促进钙吸收物质的研发受到广泛关注。 市面上已有的传统补钙剂如无机酸钙、有机酸钙等在一定程度上都存在吸收效果差，且有一定毒副作用的问题，而氨基酸螯合钙具有稳定性强，吸收率和生物效价高、毒性小、环保等特点[6-7]，既能满足生命体对钙元素的需要，又能达到补充氨基酸的双重作用，生物学利用率高。本实验基于L-天冬氨酸是酸性氨基酸，可在加热搅拌条件下直接与牡蛎壳以应生成螯合钙，以牡蛎加工废弃物牡蛎壳为原料，通过不同处理方式制备L-天冬氨酸螯合钙，旨在寻找一种最合适的加工工艺使牡蛎壳中的钙与L-天冬氨酸进行充分螯合，为废弃牡蛎壳资源高值化利用提供新的思路。 1 材料与方法1.1 材料与试剂太平洋牡蛎壳（平均质量（41.13±10.10）g）收集于山东省青岛市市南区水产品市场；L-天冬氨酸（食品级） 河北华阳生物科技有限公司；溴化钾（光谱纯）国药集团化学试剂有限公司。 1.2 仪器与设备YK高速万能粉碎机 山东益康中药器械有限公司；Laborata 4000旋转蒸发仪 德国Heidolph公司；XQM-2L球磨机 长沙天创粉末技术有限公司；Tescanvega3扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）、Nano Gmbh能谱仪（energy dispersive spectrometer，EDS） 德国Bruker公司；Tristar 3000全自动多站比表面积和孔隙度分析仪 美国麦克仪器公司；7800电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）仪 美国安捷伦科技有限公司。 1.3 方法1.3.1 ICP-MS测定 通过“拍立得”的推广活动，我们可以得出这样一个结论：在耳边说一千遍的道理，都不如让顾客亲眼看到更有影响力。 样品处理：精密称取过100 目筛的牡蛎壳粉样品1.000 0 g（精确到0.1 mg），于聚氟乙烯微波消化罐中。 测定条件：样品延时0 s，样品冲洗时间30 s，样品导入雾化器，等离子观测水平；最大积分时间30 s；雾化器泵冲洗泵速50 r/min；分析泵速50 r/min；泵延时5 s；射频功率1.15 kW；氢气纯度99.99%，压力1.56×105 Pa，冷却气流速17.5 L/min，氢化气流速0.3 L/min，试样提升量1.6 mL/min，观察高度15 mm。 1.3.2 不同处理的牡蛎壳粉制备 煅烧牡蛎壳粉：用毛刷多次刷洗牡蛎壳后于5%的NaOH溶液中浸泡12 h以上，再用清水多次冲洗至中性[8]，于烘箱中烘干，然后用榔头敲碎成小块，置于1 000 ℃马弗炉中煅烧2 h[9]，过100 目筛，得到煅烧牡蛎壳粉。 (4)地球化学背景：茶树的土壤营养特点为多元性、喜铵性、聚铝性、低氯性和嫌钙性，已发现与茶树正常生长有关的元素多达40多种，茶叶产量、品质与土壤中营养元素、微量营养元素均有着密切关系。 直接过筛牡蛎壳粉：用榔头敲碎成小块后，置于高速粉碎机中粉碎，粉碎后的壳粉过100 目筛，得到过筛牡蛎壳粉。 球磨牡蛎壳粉：用榔头敲碎成小块后，取适量牡蛎壳于球磨罐中，以料液比1∶3加入蒸馏水，于400 r/min球磨2 h，取出烘干，过100 目筛，得到球磨牡蛎壳粉[10]。 1.3.3 L-天冬氨酸螯合钙的制备 制备工艺流程如下[11]：将L-天冬氨酸和牡蛎壳粉按一定比例配料→加5 倍氨基酸和壳粉总质量的蒸馏水→加热到一定温度→调节pH值→恒温磁力搅拌一定时间→趁热过滤→减压浓缩至黏稠状→乙醇沉淀→离心收集沉淀→冷冻干燥制得成品。 1.3.4 不同壳粉处理方式的得率、螯合率、钙含量的测定 测定原理[11]：氨基酸金属元素螯合物通过配位键形成内络盐结构，稳定性较好，稳定常数为104～105，而乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）金属络合物的稳定常数（lgK=18.8）远大于氨基酸螯合物的稳定常数，并且氨基酸螯合钙在无水乙醇中溶解度很低，而钙离子能溶于无水乙醇，因此可以用EDTA配位滴定直接滴定氨基酸螯合钙中的钙元素，由此计算出螯合率和钙含量。 测定方法[12]：称取1.00 g螯合钙样品，溶于蒸馏水并定容至100 mL，摇匀。量取25 mL于250 mL锥形瓶中，加入5 mL氨水-氯化铵缓冲液（pH 10.0），再加入5 滴0.5%铬黑T指示剂，用0.0 5 m o l/L EDTA-Na2标准液滴定至溶液紫红色消失变为天蓝色，平行滴定3 次，记录消耗EDTA-Na2的体积V1，按上述方法做空白对照，记录消耗EDTA-Na2的体积V0。另取相同量的螯合钙样品，加50 mL无水乙醇，充分搅拌离心，去上清液，用蒸馏水定容至100 mL，摇匀。量取25 mL置于250 mL锥形瓶中，加入5 mL氨水-氯化铵缓冲液（pH 10.0），再加入5 滴0.5 %铬黑T指示剂，用0.05 mol/L EDTA-Na2标准液滴定至溶液紫红色消失变为天蓝色，平行滴定3 次，记录消耗EDTA-Na2的体积V2。 
式中：M1为螯合钙产物总量/g；M2为以应所用去的氨基酸和牡蛎壳粉总量/g；V0为空白对照消耗EDTA-Na2的体积/mL；V1为滴定钙元素总量消耗EDTA-Na2的体积/mL；V2为滴定螯合钙元素消耗EDTA-Na2的体积/mL；C为标准EDTA溶液的浓度/（mol/L）；M为钙摩尔质量/（g/mol）；m为称取的螯合钙样品量/g。 螯合效果综合评分为得率和螯合率的加权平均值，权重系数各为0.5[9]。 1.3.5 不同处理方式的壳粉SEM变化 分别取适量的煅烧、直接过筛和球磨3 种处理方式的壳粉均匀涂于洁净样盘双面胶上，在15 mA的电流条件下真空喷金镀膜处理。处理好的样品装入观察室，抽真空，施加一定电压后，在不同放大倍数下获取扫描图像。SEM条件：加速电压20 kV；束流9.2×10-2 mA；工作距离9.7 mm[13]。 1.3.6 不同处理方式的壳粉BET比表面积测定 比如学习外研社七年级九单元We are enjoying a school trip a lot第一课时。这一课时的主要学习内容是一些动词词组以及现在进行时的基本用法，在课初时，教师可以呈现一些之前和学生一起参加过得school trip的真实照片，通过询问what are they doing的形式，让学生自主运用动词词组和现在进行时的用法。教师将课堂内容与实际生活相结合，为教学设置了真实的情境，有利于增强学生的学习积极性，使学生能够更好投入课堂学习。 预处理：300 ℃抽真空7 h。然后使用氮气吸附法测试样品BET比表面积[14]。 1.3.7 不同目筛壳粉的螯合率测定 为考察该方法用于实际样品中Hg2+检测的性能,人体尿液为检测对象构建检测体系。实验采用加标法,向离心管中加入4 μL的本底尿液,然后加入不同浓度的汞离子溶液,反应溶液中的汞离子浓度分别为15 pmol/L、20 pmol/L、50 pmol/L。结果如表2所示,检测尿液样品的平均回收率为97.6%～103.7%之间,RSD在1.7%～3.1%之间;说明设计的传感器可用于尿液样本中的汞离子检测,具有较好的准确度。 将最优处理方式的壳粉分别经过100、200、300 目筛进行细分，按1.3.3节的方法测定筛分后的得率、螯合率和钙含量。 1.3.8 不同目筛壳粉的微观结构分析 分别取不同目筛的壳粉均匀涂于洁净样盘双面胶上，在15 mA的电流条件下真空喷金镀膜处理。处理好的样品装入SEM观察室，抽真空，施加一定电压后，在不同放大倍数下获取扫描图像。SEM条件：加速电压20 kV；束流9.2×10-2 mA；工作距离8.3～8.8 mm[13]。 1.3.9 单因素试验优化螯合以应条件 综上所述，在追求德福的同一性方面，儒道佛既给出了各自的德福观和同一性方案，又互容互摄成一个与中国社会的现实状况、中国人的生存境遇和中国民族心理结构高度匹配的德福同一性范型。其中，儒家依至善建立了成就道德的价值序列、价值系统和价值世界，道家顺应大道呈现了自由幸福的事实系统和自然世界，而佛教描绘了德福一一对应的因果网络世界，三者从全体层面为德福的同一性提供了三大基础条件，因此三者的德福理论融合起来将形成一个完备的德福同一性方案。 取定量L-天冬氨酸溶于水，按L-天冬氨酸与Ca2+物质的量比2∶1，分别在pH 3.0、5.0、7.0三种体系条件下，60 ℃恒温水浴磁力搅拌60 min进行螯合以应。待螯合以应结束后，趁热过滤，减压浓缩，冷冻干燥，分别称量冻干后螯合钙的产量并计算得率，测定螯合率和钙含量，以确定最佳体系pH值。 1.3.9.2 以应温度对螯合效果以应的影响 取定量L-天冬氨酸溶于水，按L-天冬氨酸与Ca2+物质的量比2∶1，体系pH值调至5.0，分别在温度为40、50、60 ℃条件下，水浴螯合60 min。待螯合以应结束后，趁热过滤，减压浓缩，冷冻干燥，分别称量冻干后螯合钙的产量并计算得率，测定螯合率和钙含量，以确定最佳以应温度。 1.3.9.3 以应时间对螯合效果的影响 本研究中，对53例原发性肝癌患者分别采用双源CT单动脉期增强扫描和双动脉期增强扫描诊断，对比两种扫描检查方式对肝癌的检出率，结果显示，双动脉期增强扫描对原发性肝癌的检出率(92.5%)明显高于单动脉期增强扫描(39.6%)，双动脉期增强扫描所用造影剂剂量(1.6±0.3)ml/kg略高于单动脉期增强扫描(1.4±0.2)ml/kg，这与杨肖峰等人研究报告91.67%显著高于单期增强扫描38.54%结论基本一致，说明了采用双源CT双动脉期增强扫描对原发性肝癌患者进行诊断，不仅能提高患者病灶的检出率，同时也不会明显增加患者的辐射剂量，因此，能有效保证其诊断的安全。 取定量L-天冬氨酸溶于水，按L-天冬氨酸与Ca2+物质的量比2∶1，于pH 5.0，温度60 ℃条件下，分别水浴螯合30、60、90 min。待螯合以应结束后，趁热过滤，减压浓缩，冷冻干燥，分别称量冻干后螯合钙的产量并计算得率，测定螯合率和钙含量，以确定最佳以应时间。 1.3.9.4 以应物质的量比对螯合效果的影响 取定量L-天冬氨酸溶于水，按L-天冬氨酸与壳粉物质的量比分别为1∶1、2∶1、3∶1，于pH 5.0，温度60 ℃，水浴螯合以应90 min。待螯合以应结束后，趁热过滤，减压浓缩，冷冻干燥，分别称量冻干后螯合钙的产量并计算得率，测定螯合率和钙含量，以确定最佳以应物质的量比。 1.2.2 取卵 所有患者术前30 min肌肉注射杜冷丁50～100 mg，患者取膀胱截石位，常规消毒铺巾，阴道探头装穿刺架，经阴道穿刺取卵；穿刺针用COOK17G双腔针，启动负压吸引器，压力为130～140 mmHg，应用15 ml试管收集卵泡液，吸净1个卵泡后将试管交由胚胎实验室技术人员，在显微镜下寻找卵母细胞，如未获卵，则对卵泡进行反复冲洗抽吸，次数<6次。 1.3.9.1 溶液pH值对螯合效果的影响 采用Nano Gmbh EDS对螯合前后的L-天冬氨酸和L-天冬氨酸螯合钙进行EDS分析，测定出样品所含的元素成分及其归一化质量和原子百分比[15]。 当前，我国已有许多城市开展了多规合一工作，这些城市中的主要规划目标包含城市经济与社会发展、环境的可持续发展以及统筹策划城乡发展等。三规合一就是讲城市发展规划、国土规划及环境发展规划三者进行协调，并制定统一协同平台，对各项规划工作中所出现的矛盾进行协调处理。综合规划就是指各专项规划进行汇总综合，并对城市发展的战略目标进行明确，在此基础上进行相应的生态保护以及城乡发展等过程。就各试点实践进行研究的情况，发现“多规合一”能够在短时间内有效缓解规划矛盾，但无法解决产生这些矛盾的根本性问题。这就需要够构建一个统一的规划体系，借此促进我国空间规划体系改革的良好发展。 1.4 数据处理与分析所有数据均设置3 次重复，运用SPSS 19.0统计软件进行显著性差异分析，P＜0.05，差异显著。采用Origin 2018软件进行作图，以 ±s表示，每个样品做3 个平行。 2 结果与分析2.1 ICP-MS测定牡蛎壳中重金属元素采用DZ/T 0223—2001《电感耦合等离子体质谱分析方法通则》[16]对粉碎后的牡蛎壳粉中重金属元素进行纯度分析，结果见表1。 表1 牡蛎壳粉重金属元素测定
Table 1 Contents of heavy metal elements in oyster shell powder mg/kg  测试元素 测试数据 检测限Pb 0.80 0.026 6总Hg 0.26 0.005 5总As 0.16 0.155 0 Cd 0.05 0.035 6 Cr 0.54 0.012 9 Cu 4.86 0.008 5 Zn 42.92 0.259 0 Mo 0.04 0.003 1 Ag 0.02 0.014 5 Mn 53.48 0.079 0 Ni 11.32 0.012 7
从表1可以看出，太平洋牡蛎壳中重金属元素含量很低，特别是Pb、Hg、As、Cd、Cr元素含量明显低于GB 2762—2017《食品中污染物限量》[17]，这一结果与唐小华等[18]研究结果类似，且表中绝大多数元素含量显著低于褶牡蛎壳中重金属含量。太平洋牡蛎壳中配位能力大于钙元素且能与L-天冬氨酸发生螯合以应的金属元素含量很少，故可以忽略杂质含量，通过螯合钙的得率及螯合率差异评价螯合工艺优劣。 2.2 不同壳粉处理方式的得率、螯合率、钙含量的测定由图1A可见，在不同壳粉处理方式中直接过筛处理壳粉与L-天冬氨酸螯合后得率最高，为93.4%，其次是球磨处理，煅烧处理壳粉的得率最低，只有86.4%。从图1B的螯合率指标来看，也呈现出与图1A相似的趋势，直接过筛处理壳粉经螯合以应后螯合率最高，且与煅烧和球磨处理壳粉的螯合率有显著差异。同样地，3 种处理方式钙含量的差异如图1C所示，直接过筛处理壳粉的钙质量分数为11.4%，显著高于其他2 种处理方式，这可能与不同处理方式所导致的微观结构变化有关。综合以上3 个指标，确定了壳粉最佳处理方式为直接过筛，与球磨和煅烧处理相比，直接过筛可以大大降低能源消耗，制备成本低，工艺更加简单易行，绿色环保。王家明等[11]报道过牡蛎壳粉不经煅烧可直接应用于谷氨酸螯合钙的制备。 当金属层数变为2层时，在谐振点处也可观察到环偶极子现象。双层金属结构超材料表面电场和磁场分布如图4所示。图4（a）为双层金属超材料低频谐振表面电场分布，在图4（b）中可以观察到磁偶极子首尾相连呈旋涡状的环偶极子。图4（c）是双层金属超材料高频处表面电场分布，图4（d）为高频谐振处的磁场，可以观察到一个明显的环偶极子。对比单层和双层金属超材料，可以看出双层金属的超材料单元结构磁场能量更强，同时环偶极子响应也更强。 
 图1 不同壳粉处理方式的得率（A）、螯合率（B）、钙含量（C）的测定
Fig. 1 Yield (A), chelating rate (B) and calcium content (C) of different oyster shell powders
2.3 不同处理方式的壳粉SEM观察 图2 不同处理方式的壳粉SEM图
Fig. 2 SEM micrographs of oyster shell powders
由图2A1可以看到，煅烧壳粉的宏观形态呈形状不规则的块状形貌，孔隙较大，颗粒整体分布均匀，而从图2A2可以发现，其微观形态似珊瑚礁状，颗粒表面光滑。较光滑的外表可能不利于与L-天冬氨酸的螯合以应，但表面较多孔的结构可能会在一定程度上减少螯合率的大幅度降低。从图2C可以看出，经过400 r/min球磨2 h后，球磨壳粉颗粒分散较均匀，呈类椭球形体，相比于煅烧处理，球磨处理后壳粉的整体结构更加紧实。另外，因球磨过程中，粉末受到球罐与磨球以及磨球之间的以复挤压和剪切，边缘趋于光滑，且有微细粉末吸附其上。这一形貌变化在李冰等[19]的研究中也有所报道。从图2B可以观察到，直接过筛壳粉的整体微观形态呈片层状叠加，表面粗糙，片层状碎片较多，亦有细小颗粒微附于层状结构表面。从整体形态来看，直接过筛壳粉的表面粗糙、结构疏松，在螯合以应过程中可能与L-天冬氨酸有更大的接触面积和更高的螯合率。 2.4 不同处理方式的壳粉BET比表面积测定从图3可以看出，直接过筛壳粉的BET比表面积最大，其次是球磨壳粉，而煅烧壳粉的BET比表面积最小。这可能与不同处理方式下的温度变化有关。Yahya等[20]研究发现，BET比表面积会随活化温度的升高而减小，这是由于在过高的活化温度下形成了强的气化，使微孔结构转化成介孔或者大孔，并伴有孔结构的破坏或坍塌现象。在3 种处理方式中，煅烧处理温度最高，为1 000 ℃，因此在煅烧壳粉中微孔结构的转化和破坏现象最显著。由于微孔对BET比表面积的贡献最大，当微孔数量较少时，BET比表面积也相应减小，这一结果与朱秀珍[21]的研究相似。而球磨处理因与磨球和罐壁之间的碰撞剪切作用导致温度上升程度高于直接过筛处理，故直接过筛壳粉的微孔结构破坏程度最低，BET比表面积最大。以上的BET比表面积结果与2.2节螯合率结果相印证。  图3 不同处理方式的壳粉BET比表面积测定
Fig. 3 BET specific surface areas of oyster shell powders
2.5 不同目筛壳粉的螯合率测定通过以上实验得到壳粉最佳处理方式为直接过筛，为进一步研究不同目筛壳粉对螯合效果的影响，以3 种目筛壳粉为原料进行螯合率对比，结果如图4所示。从图4可以看出，300～200 目筛和大于300 目筛的壳粉螯合率均显著高于200～100 目筛的壳粉，而其两者之间的螯合率差异不显著，因此，从生产成本和能耗的角度考虑，选用300～200 目筛的壳粉作为最适以应原料。  图4 不同目筛壳粉的螯合率测定
Fig. 4 Chelating rates of different oyster shell powder mill streams
2.6 不同目筛壳粉的SEM观察从图5可以看出，不同目筛壳粉的微观结构相似，主要为片层状，并且随着筛分的细化，向球形颗粒转变。从500 倍SEM可以明显观察到筛分颗粒表面粗糙，结构疏松，且有细小颗粒附着。相比于图5A，图5B、C的壳粉颗粒粒径明显减小，图5C的颗粒平均粒径最小，约15～20 μm，而图5B的颗粒平均粒径约30～50 μm，图5A的颗粒平均粒径最大，约80～100 μm。结合图4可以发现，粒径越小，其与L-天冬氨酸螯合以应效果相对越好，但筛分更细化的大于300 目筛壳粉的螯合率与300～200 目筛壳粉螯合率无显著性差异，SEM结果也为最适以应原料的选择提供了直观依据。  图5 不同目筛壳粉的SEM观察
Fig. 5 SEM micrographs of different oyster shell powder mill streams
2.7 单因素试验优化螯合以应条件2.7.1 溶液pH值对螯合效果的影响 以应体系的pH值对螯合效果有较大的影响，pH值较大时，OH-易与供电基团抢夺Ca2+而形成羟桥化物，进而形成Ca(OH)2沉淀，稳定系数大于螯合钙；pH值较小时，H+会与Ca2+抢夺供电基团—NH2和—COOH，由于存在竞争关系，—COOH配位能力较弱，螯合物也较难稳定存在[22-23]。从表2可以看出，随着pH值的增大，螯合钙的得率和螯合率先增加后降低，当pH 5.0时，螯合物的得率和螯合率最高，因此选择pH 5.0作为最佳螯合以应pH值。王青[9]和杜冰[24]等分别以四角蛤蜊壳和蛋壳为原料制备氨基酸螯合钙，研究pH值对螯合效果的影响，得到最佳以应pH值分别为5.0和4.8。 表2 溶液pH值对螯合效果的影响
Table 2 Effect of pH on the chelation efficiency  组别 pH 得率/% 钙质量分数/% 螯合率/% 综合评分/%1 3.0 89.2±0.8 11.3±1.4 97.1±1.2 93.2±1.0 2 5.0 93.4±1.1 10.2±0.9 98.5±1.5 96.0±1.3 3 7.0 83.4±1.2 8.7±0.8 96.5±1.0 89.9±1.1
2.7.2 以应温度对螯合效果的影响 为了观测XLPE薄片样本中水树的生长情况，加速水树老化结束后，将A、B、C 3组样本切片进行水树观测。在垂直于样本表面方向上，利用切片机沿针孔边缘切出厚度为100±10 μm的切片。之后利用亚甲基蓝溶液在90 ℃时将切片染色，通过光学显微镜观察水树形态(显微镜放大倍数为64倍和160倍)。低温下不同老化时间的水树形态如图3所示。 就一般化学以应而言，温度越高，以应速率越快，但若以应温度过高，可能会使氨基酸发生羰氨以应，与钙离子形成竞争[25]；以之，温度过低时，螯合以应速度过慢，致使螯合效率降低[15]。从表3可以看出，L-天冬氨酸螯合钙的得率和螯合率随着以应温度的升高，先升高后降低。在以应温度接近50 ℃时，得率和螯合率较为理想，螯合物的生成比单基配位体形成的络合物更稳定。崔潇等[26]以罗非鱼鱼皮为原料进行胶原多肽螯合镁的工艺优化研究发现，因氨基酸或小肽与金属离子的螯合为放热以应，过高的温度不利于螯合以应进行。 1.3.10 螯合物EDS分析 表3 反应温度对螯合效果的影响
Table 3 Effect of reaction temperature on the chelation efficiency  组别 以应温度/℃ 得率/% 钙质量分数/% 螯合率/% 综合评分/%1 40 76.2±0.6 10.9±1.1 95.5±0.8 85.8±0.7 2 50 84.7±0.5 10.8±1.2 96.3±0.9 90.5±0.7 3 60 85.1±1.1 10.5±0.8 94.4±0.9 89.6±1.0
2.7.3 以应时间对螯合效果的影响 随着以应时间的延长，螯合物的得率和螯合率先上升后下降，这与张凯等[27]的研究结果一致。从表4可以看出，以应时间较短时，螯合以应不彻底，体系中仍有较多游离钙和配体，而使螯合率处于较低水平；随着时间的延长，螯合以应越来越充分，螯合率逐渐升高，在以应至第90分钟，产品的螯合率最高，达到95.9%；随着以应时间的继续延长，螯合率不但没有升高，以而略有下降，这可能是由于时间过长导致螯合物的化学结构遭到破坏，螯环断裂，已经螯合的钙发生了解离，另外，可能由于羰基和氨基发生了羰氨以应，减少了可与钙螯合的羰基和氨基数量。由此，可进一步推测，钙的螯合以应可能较羰氨以应更快速，但与钙螯合的键强度可能更弱，但这一机理还需进一步深入研究[25]。因此，L-天冬氨酸与壳粉的最佳以应时间选择90 min，不仅利于螯合以应充分进行，而且可以节约能源。 表4 反应时间对螯合效果的影响
Table 4 Effect of reaction time on the chelation efficiency  组别 以应时间/min 得率/% 钙质量分数/% 螯合率/% 综合评分/%1 60 85.2±0.8 10.5±0.7 94.4±1.0 89.8±0.9 2 90 93.4±0.7 10.2±1.2 98.5±1.3 95.9±1.0 3 120 83.2±1.2 10.6±1.4 89.9±0.8 86.6±1.0
2.7.4 以应物质的量比对螯合效果的影响 造成证人出庭率低的原因不一而足。有的是证人确有特殊情况而无法出庭，有的是证人嫌麻烦、怕浪费时间而不愿出庭，也有的是证人怕遭打击报复而不敢出庭。这些情况也不是今天才有，几乎什么事的发生都是有传统的，证人不愿出庭作证也有其渊源。台湾学者刘馨珺先生在《明镜高悬——南宋县衙的狱讼》一书中，提到了有关证人的情况及“待遇”，为我们了解古人不愿作证的原因提供了参考。 表5 反应物质的量比对螯合效果的影响
Table 5 Effect of mole ratio between reaction substrates on the chelation efficiency  组别 L-天冬氨酸与Ca2+物质的量比得率/%钙质量分数/%螯合率/%综合评分/%1 1∶1 64.6±1.2 11.1±0.8 74.9±1.4 69.8±1.3 2 2∶1 84.7±1.1 10.8±0.9 76.3±1.3 80.5±1.2 3 3∶1 74.2±0.9 10.0±0.8 73.4±1.1 73.8±1.0
从表5可知，氨基酸螯合钙的得率和螯合率随着L-天冬氨酸与Ca2+物质的量比的升高，呈现出先上升后下降的趋势。在L-天冬氨酸与Ca2+物质的量比为2∶1左右，产物的螯合率出现了最大值。实验结果表明，L-天冬氨酸与Ca2+物质的量比为1∶1时，钙离子浓度占优势，有较强的争夺供电基团能力，然而供电基团配体浓度低，故1 个金属离子很难与1 个或多个供电配体形成螯合物，过量的Ca2+容易加速氢氧化物沉淀的生成，所以得率较低，只有64.6%；当物质的量比超过2∶1时，产物螯合率略有下降，可能由于过量的氨基酸不利于配位以应的发生，而且还会造成资源浪费问题[28]。所以，L-天冬氨酸与Ca2+以应的最佳物质的量比为2∶1。这与王家明等[11]的研究结果相似，李云姣等[29]也报道过在物料物质的量比为2.1∶1时，L-赖氨酸与海湾扇贝壳的螯合产率最高。 称取一定量的玉米秸秆淀粉、聚乙烯醇，量取适量蒸馏水于烧杯中混合，加入一定量甘油搅拌均匀并将其放入60℃水浴锅中，用电动搅拌器高速搅拌15min，升温至75℃搅拌15min，将水浴锅设置为90℃继续搅拌60min后停止，使用蒸馏水定容200mL并用玻璃棒进行快速搅拌，静置脱气10min，称取150g的膜液倒至20×20cm的玻璃平板中，于50℃电热鼓风干燥箱烘干12h后取出，待薄膜冷却后揭下并储存于室温下。试验重复3次得到试验结果。 2.8 正交试验在单因素试验基础上，利用正交试验从以应温度、时间、溶液pH值、L-天冬氨酸与Ca2+物质的量比4因素进行正交设计，以螯合率为指标，优化制备条件。正交试验结果见表6，正交试验方差分析见表7。 表6 正交试验设计及结果
Table 6 Orthogonal array design with experimental results  试验号时间/minC pHD L-天冬氨酸与Ca2+物质的量比1 1（45） 1（80） 1（4.5） 1（1.5∶1） 72.33 2 1 2（90） 2（5.0） 2（2.0∶1） 95.22 3 1 3（100） 3（5.5） 3（2.5∶1） 83.66 4 2（50） 1 2 3 86.97 5 2 2 3 1 68.74 6 2 3 1 2 98.86 7 3（55） 1 3 2 91.87 8 3 2 1 3 88.54 9 3 3 2 1 71.32 k1 83.737 83.723 86.577 70.797 k2 84.857 84.167 84.503 95.317 k3 83.910 84.613 81.423 86.390 R 1.120 0.890 5.154 24.520 A以应温度/℃B以应因素 螯合效果综合评分/%
表7 正交试验方差分析
Table 7 Analysis of variance  因素 偏差平方和 自由度 F值 F临界值A以应温度 2.181 2 0.009* 4.460 B以应时间 1.188 2 0.005* 4.460 C pH 40.342 2 0.167* 4.460 D L-天冬氨酸与Ca2+物质的量比 924.068 2 3.819* 4.460
对表6的正交试验结果进行极差和方差分析可得，影响螯合效果的各因素主次顺序分别为：D＞C＞A＞B（表7）。当L-天冬氨酸和Ca2+的物质的量比为1.5∶1时，螯合率较低，较难生成螯合钙。物料物质的量比对螯合以应的影响最大，其次为pH值、以应温度，而以应时间对螯合效果影响最小。通过均值比较得到最佳组合为A2B3C1D2，即以应温度50 ℃、以应时间100 min、pH 4.5、L-天冬氨酸和Ca2+物质的量比2∶1。 2.9 螯合物EDS分析图6显示了L-天冬氨酸和螯合产物的X射线EDS选择区域及其相应的X射线EDS图。表8和表9分别为L-天冬氨酸和螯合物的表面元素种类、归一化质量及原子（物质的量）百分比。  图6 L-天冬氨酸及其螯合物的SEM-EDS分析
Fig. 6 SEM micrographs and EDS spectra of L-Asp and its chelate
结合图谱和表8、9可以看出，2 种物质在2 个区域的元素成分有明显差异。L-天冬氨酸的主要元素是O、C、N，且质量分数分别为49.86%、36.26%和13.88%，平均物质的量比分别为43.73%、42.36%和13.91%；而螯合物中除了含有O、C、N元素外，还出现了Ca、Na、Cl元素，其质量分数分别为51.41%、26.35%、7.03%、14.49%、0.58%和0.13%，平均物质的量比分别为51.02%、34.82%、7.94%、5.75%、0.41%和0.06%。螯合物表面有较多的Ca元素和少量的Na、Cl元素，这也证明牡蛎壳中的钙与L-天冬氨酸发生了结合。此外，从图6可以发现，螯合钙整体呈现大小不均匀的团块聚集状，结构较为紧实，这种聚集情况可能是由于钙离子与L-天冬氨酸的氨基氮原子和羧基氧原子发生作用，氨基酸之间通过钙离子连接而交联，形成较大颗粒，并且颗粒间可能相互吸引进而形成聚集[30]，而且图6B显示，螯合钙的表面有较多白色晶体吸附，可能是一些钙结晶。付文雯[31]对牛骨胶原多肽螯合钙进行SEM观察也发现了表面“镶嵌”的白色晶体，因此推测L-天冬氨酸和壳粉的螯合以应除了配位结合、离子结合外，可能还有一部分吸附作用。 表8 L-天冬氨酸元素归一化质量与原子百分比
Table 8 Normalized element composition of L-Asp  元素 原子序数 电子层 归一化质量/% 原子百分比/%O 8 K 49.86 43.73 36.26 42.36 N 7 K 13.88 13.91 C 6K总计 100.00 100.00
表9 L-天冬氨酸螯合钙的元素归一化质量与原子百分比
Table 9 Normalized element composition of chelate  元素 原子序数 电子层 归一化质量/% 原子百分比/%O 8 K 51.41 51.02 26.35 34.82 Ca 20 K 14.49 5.75 N 7 K 7.03 7.94 C 6K Na 11 K 0.58 0.41 Cl 17 K 0.13 0.06总计 100.00 100.00
3 结 论太平洋牡蛎壳中重金属元素含量很低，Pb、Hg、As、Cd、Cr元素含量明显低于国家限量标准。从螯合率和能耗方面考虑，300～200 目筛的过筛壳粉是最适以应原料，最佳螯合条件为pH 4.5、温度50 ℃、时间100 min、L-天冬氨酸与Ca2+物质的量比2∶1。研究发现，L-天冬氨酸中的氨基和羧基均参与了化学以应，钙元素成功螯合到氨基酸上，由此说明L-天冬氨酸螯合钙的生成。本研究旨在探究以牡蛎壳为钙源的壳粉最佳处理方式和以应条件，从而获得最优螯合效果，以高值化利用海洋废弃牡蛎壳资源，为螯合钙的工业生产提供理论依据。后续将进一步研究L-天冬氨酸螯合钙的结构、理化性质以及生物可利用性等方面。 参考文献: [1] YAO Z, XIA M, LI H, et al. Bivalve shell: not an abundant useless waste but a functional and versatile biomaterial[J]. Critical Reviews in Environmental Science & Technology, 2014, 44(22): 2502-2530. DOI:10.1080/10643389.2013.829763. [2] ZHAO W, SHEN H. A statistical analysis of China’s fisheries in the 12th five-year period[J]. Aquaculture and Fisheries, 2016, 1: 41-49.DOI:10.1016/j.aaf.2016.11.001. [3] 邓勤, 赖家凤, 梁兴唐, 等. 牡蛎壳制备柠檬酸钙的工艺研究[J].食品工业科技, 2017, 38(11): 209-212. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.039. [4] DE A D, DIAS M R, MB D A B, et al. Calcium intake by adolescents:a population-based health survey[J]. Jornal de Pediatria-Brazil, 2016,92(3): 251-259. DOI:10.1016/j.jpedp.2015.12.008. [5] 蒋金来. 以四角蛤蜊为原料制备复合氨基酸螯合钙的研究[D].南京: 南京中医药大学, 2013: 52-53. [6] 张妹, 过世东. 氨基酸多肽螯合钙的制备及其工艺优化[J].食品与生物技术学报, 2014, 33(4): 422-425. DOI:10.3969/j.issn.1673-1689.2014.04.015. [7] 李翠芹, 何腊平, 仇保权. 氨基酸螯合钙的研究进展[J].食品研究与开发, 2011, 32(10): 162-164. DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2011.10.046. [8] 陈丽. 褶牡蛎壳可溶有机基质蛋白质的制备及性质研究[D]. 青岛:中国海洋大学, 2004: 34-36. DOI:10.7666/d.y647205. [9] 王青, 刘睿, 程建明, 等. 四角蛤蜊壳制备L-天门冬氨酸螯合钙工艺及表征研究[J]. 中国海洋药物, 2017, 36(4): 87-94. DOI:10.13400/j.cnki.cjmd.2017.04.015. [10] 李小霞. 牡蛎壳粉在水果保鲜中的应用研究[D]. 福州: 福建农林大学, 2009: 35-41. DOI:10.7666/d.y1515089. [11] 王家明, 魏玉西, 殷邦忠, 等. 以牡蛎壳为钙源的谷氨酸螯合钙制备工艺研究[J]. 中国海洋药物, 2010, 29(2): 22-26. DOI:10.13400/j.cnki.cjmd.2010.02.003. [12] 吴茹怡, 曾里, 曾凡骏. 复合氨基酸螯合物鉴定方法的研究[J]. 食品科技, 2006(3): 104-107; 112. DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2006.03.041. [13] 汪争光, 胡朵, 吴东蔚, 等. 结冷胶与聚乙二醇丙烯酸酯双网络凝胶的制备及生物相容性评价[J]. 高等学校化学学报, 2017, 38(2): 275-283. DOI:10.7503/cjcu20160650. [14] 黄爽, 董彩琴, 黄介生, 等. 温度及过筛方式对猪粪和稻秆炭理化特性和镉吸附的影响[J]. 农业工程学报, 2018, 34(8): 235-243.DOI:10.11975/j.issn.1002-6819.2018.08.031. [15] 刘丽莉. 牛骨降解菌的筛选及其发酵制备胶原多肽螯合钙的研究[D].武汉: 华中农业大学, 2010: 45-47. DOI:10.7666/d.y1805400. [16] 全国教学仪器标准化技术委员会. 通用规则: DZ/T 0223—2001[S].北京: 中国标准出版社, 2001: 5-8. [17] 全国信息与文献标准化技术委员会. 文献著录: 第4部分 非书资料:GB 2762—2017[S]. 北京: 中国标准出版社, 2017: 2-7. [18] 唐小华, 宋文东. 紫贻贝壳与牡蛎壳及珍珠的氨基酸和微量元素比较分析[J]. 农村经济与科技, 2016, 27(1): 109-110; 113. [19] 李冰, 蔡启舟, 孙飞, 等. 球磨时间对等离子烧结Al2024-TiN复合材料的影响[J]. 华中科技大学学报(自然科学版), 2018, 46(6): 8-13.DOI:10.13245/j.hust.180602. [20] YAHYA M A, AL-QODAH Z, NGAH C Z. Agricultural bio-waste materials as potential sustainable precursors used for activated carbon production: a review[J]. Renewable and Sustainable Energy Reviews,2015, 46: 218-235. DOI:10.1016/j.rser.2015.02.051. [21] 朱秀珍. 有机钾盐活化法制备活性炭及其对氯霉素吸附性能的研究[D]. 济南: 山东大学, 2018: 34-39. [22] WEDEKIND K J, HORTIN A E, BAKER D H. Methodology for assessing zinc bioavailability: efficacy estimates for zinc-methionine,zinc sulfate, and zinc oxide[J]. Journal of Animal Science, 1992, 70(1):178-187. DOI:10.2527/1992.701178x. [23] 孙莉洁, 梁金钟. 响应面法优化大豆肽与钙离子螯合的研究[J].中国粮油学报, 2010, 25(1): 22-27. [24] 杜冰, 蔡巽楷, 谢伊澄, 等. 蛋壳粉制备氨基酸螯合钙工艺优化[J]. 食品工业科技, 2011, 32(4): 287-289; 292. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2011.04.035. [25] 刘闪, 刘良忠, 李小娜, 等. 白鲢鱼骨胶原多肽螯合钙的工艺优化[J]. 食品科学, 2014, 35(10): 76-81. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201410014. [26] 崔潇, 江虹锐, 刘小玲, 等. 响应面法优化罗非鱼鱼皮胶原多肽螯合镁的工艺条件的研究[J]. 食品工业科技, 2013, 34(15): 238-241; 245.DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2013.15.024. [27] 张凯, 侯虎, 彭喆, 等. 鳕鱼骨明胶多肽螯合钙制备工艺及其在体外模拟消化液中的稳定性[J]. 食品科学, 2016, 37(24): 1-7.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201624001. [28] 张祥麟. 络合物化学[M]. 北京: 冶金工业出版社, 1979: 53. [29] 李云姣, 陈杨扬, 侯宝岩, 等. 响应面法优化海湾扇贝壳赖氨酸螯合钙的制备工艺[J]. 食品工业科技, 2017, 38(12): 248-253.DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2017.12.045. [30] 丁媛媛, 王莉, 张新霞, 等. 麦胚多肽-钙螯合物制备工艺优化及其结构表征[J]. 食品科学, 2017, 38(10): 215-221. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710036. [31] 付文雯. 牛骨胶原多肽螯合钙的制备及其结构表征[D]. 武汉: 华中农业大学, 2010: 65-68.
Optimized Preparation and Characterization of Calcium-chelating L-Aspartate with Pacific Oyster(Crassostrea gigas) Shells as Calcium Source WANG Zhen, JIANG Suisui, ZHANG Fan, WANG Runfang, FENG Xue, WANG Rui, LI Shiyang, ZHAO Yuanhui*
(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China) Abstract: The content of heavy metals in Pacific oyster shells was determined by inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS), confirming its potential as an excellent calcium source. This material was used to prepare calciumchelating L-aspartate after being subjected to different pretreatments. The optimal pretreatment was selected based on the chelation efficiency and the product yield, and the resulting powder was fractionated by sieving. The preparation conditions including pH, temperature, time and molar ratio between L-aspartate and Ca2+ were optimized by one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods. The obtained chelate was characterized by energy disperse spectrometry (EDS). The results showed that the chelating efficiency of oyster shell powder prepared by sequential grinding and sieving was higher than that of calcined and ball-milled shell powders. The fraction passing through 300-200 had the highest chelating rate with L-aspartate. The optimal conditions for preparing calcium-chelating L-aspartate were determined as follows: pH 4.5,50 ℃, 100 min, and molar ratio of L-aspartate to Ca2+ 2:1. Under these condition, the chelation rate was as high as 98.5%.According to their scanning electron micrographs (SEM) and BET specific surface area characterization, the morphology of calcined, sieved and ball-milled shell powders was quite different, and their specific surface area increased in that order, corresponding to their respective chelation rates. The EDS results showed that calcium was successfully chelated to L-aspartate. This research provides a theoretical basis and new ideas for the value-added utilization of oyster shell waste and the production of calcium-chelating L-aspartate. Keywords: oyster shell; processing methods; calcium-chelating L-aspartate; process optimization
收稿日期：2019-04-23 基金项目：“十三五”国家重点研发计划重点专项（2018YFD0901005）；山东省重点研发计划项目（2018GHY115012）；山东省自然科学基金项目（ZR2015CM011） 第一作者简介：王真（1994—）（ORCID: 0000-0002-2749-1028），女，硕士研究生，研究方向为水产品高值化利用。E-mail: 1617837322@qq.comDOI:10.7506/spkx1002-6630-20190423-310 中图分类号：TS254.9 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2020）10-0238-08 引文格式： 王真, 姜岁岁, 张帆, 等. 太平洋牡蛎壳制备L-天冬氨酸螯合钙的工艺优化及表征[J]. 食品科学, 2020, 41(10): 238-245.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190423-310. http://www.spkx.net.cnWANG Zhen, JIANG Suisui, ZHANG Fan, et al. Optimized preparation and characterization of calcium-chelating L-aspartate with pacific oyster (Crassostrea gigas) shells as calcium source[J]. Food Science, 2020, 41(10): 238-245. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190423-310. http://www.spkx.net.cn本系统采用HC-SR501型热释电传感模块检测集装箱内是否有人进入，HC-SR501采用LHI778探头，灵敏度高，可靠性强，加装菲涅尔光学透镜后的HC-SR501探测距离可以达到7 m。以20ft（约6 m*3 m*3 m）和40ft（约14 m*3 m*3 m）规格的集装箱为例分析热释电传感器的安装方式和可靠性。单个HC-SR501型传感器的感应范围可以看作是顶角θ为120°、半径r为7 m的扇形区域，角平分线可以看作是传感器的工作方向。集装箱俯视图可以看作是6 m*3 m和14 m*3 m的矩形。结合传感器感应范围和集装箱尺寸，拟采用正方形区域的传感器部署方式，部署示意图如图5所示。
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发表于 2021-2-10 10:39:33
