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白酒中两种萜烯类化合物的细胞内抗氧化活性白酒中两种萜烯类化合物的细胞内抗氧化活性 张 倩1，朱婷婷2，黄明泉1，魏金旺2,*，吴继红1，霍嘉颖1 （1.食品质量与安全北京实验室，北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京市食品风味化学重点实验室，北京工商大学，北京 100048;2.北京顺鑫农业股份有限公司牛栏山酒厂，北京 101301） 摘要：利用顶空固相微萃取结合气相色谱质谱联用技术对13 种牛栏山二锅头原酒及3 种商品酒中的萜烯化合物进行定性定量分析，经质谱、外标物比对共定性出5 种萜烯化合物，其中香叶基丙酮（geranylacetone，GAT）在二锅头酒中为首次发现;同时，利用2,2’-偶氮双(2-甲基丙脒)二盐酸盐诱导的HepG2细胞氧化损伤模型探究GAT和β-石竹烯（β-caryophllene，BCP）的抗氧化活性。研究发现，GAT和BCP在牛栏山二锅头白酒中的剂量水平下，对氧化损伤细胞内的活性氧具有清除作用，主要通过增强细胞内抗氧化酶（超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶）的活性，提高机体内非酶系统抗氧化剂谷胱甘肽的浓度来实现，同时还可以防止脂质过氧化终产物丙二醛含量的增加，从而提高细胞的抗氧化能力，其抗氧化能力呈浓度依赖性增加。本研究可为白酒的健康功效和白酒行业健康发展提供数据。 关键词：牛栏山二锅头白酒;香叶基丙酮;β-石竹烯;顶空固相微萃取;抗氧化活性 白酒作为中国的国酒，具有悠久的历史，在中国传统文化中占有独特的地位[1]。白酒中的风味成分仅占总质量的2%～3%[2]，但种类繁多，目前在白酒中检测到的微量化合物已超过2 000 种[3]。这些微量化合物是构成白酒独特风味的物质基础，其中很多是功能性组分[4-8]。结合中外对饮酒与健康的研究，适量饮用白酒对人体健康有益。当前党中央和国务院制定了“健康中国”的发展战略，向健康白酒发展是中国白酒发展的新趋势[9]，但白酒中功能性组分对人体健康作用机制仍需要进一步研究。 活性氧（reactive oxygen species，ROS）是机体正常代谢产物[10]，ROS浓度过高会导致机体发生氧化应激，机体内累积过多的ROS会造成多种疾病。正常情况下，机体细胞内存在着抗氧化防御系统，另外，膳食补充抗氧化活性物质对清除机体内过多的ROS、维持细胞内氧化还原平衡具有重要意义，尤其是机体内发生氧化应激时，补充外源性抗氧化剂尤其重要[11-13]。萜烯类化合物是一类广泛存在于植物、动物体内的碳氢化合物[14]。随着检测技术的发展，越来越多的萜烯类化合物在白酒中不断检测出，清香型与酱香型白酒中共检测到69 种，包括萜烯醚、萜烯醇、萜烯酮、萜烯醛和萜烯酯[15-16]，在浓香型白酒中检测到30 种[17]、药香型白酒中检测到52 种[18]，其中药香型董酒中萜烯含量较高，主要原因是董酒的特殊百草入曲酿制工艺[19]。另外在酱香型、浓香型和清香型原酒、酒醅及大曲中也均检测到萜烯类化合物[15,17-18]。目前越来越多的证据表明，萜烯具有抗氧化活性。2012年Bourgou等[20]从精油中分离出4 种萜类化合物，通过氧自由基吸收能力测试证明其体外抗氧化活性。2019年Wang等[21]对葡萄酒中7 种主要萜类化合物进行研究，发现0.4～8.0 mg/mL质量浓度范围的萜类化合物具有抗菌活性，6.25～50.00 mg/mL萜类化合物具有抗氧化活性，认为其可作为食品工业天然抗菌剂和抗氧化剂的新潜在来源。萜烯化合物中的双环倍半萜类β-石竹烯（β-caryophllene alcohol，BCP）具有重要的功能作用，如2018年Ames-Sibin等[22]证明215 mg/L和430 mg/L BCP可抑制氧化应激及炎症反应;2019年Aguilar-Ávila等[23]的研究表明10 mg/kg BCP可减弱神经性疼痛。无环萜类香叶基丙酮（geranylacetone，GAT）也具有功能活性，2019年Schepetkin等[24]发现植物精油中含有的GAT可调节人体嗜中性粒细胞的反应。虽然已有研究表明BCP和GAT具有功能活性，但所研究的剂量水平都远高于白酒中的水平，目前为止鲜有对白酒中、低质量浓度下BCP和GAT抗氧化作用的研究。 作为我国北方清香型的代表白酒之一，牛栏山二锅头酒以清香纯正、入口醇甜爽净、酒体协调、尾净香长的特点深受消费者喜爱[25]。本研究利用顶空固相微萃取结合气相色谱质谱联用技术（head space solid-phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）对13 种牛栏山二锅头原酒中的微量萜烯化合物进行定性定量分析，同时按酒中剂量范围，利用2,2’-偶氮双(2-甲基丙脒)二盐酸盐（2,2’-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride，AAPH）诱导的HepG2细胞氧化损伤模型探究其细胞内抗氧化活性，以期为健康白酒的进一步研究与发展提供一定参考。 1 材料与方法1.1 材料与试剂13 种牛栏山二锅头原酒，3 种商品酒（十五年珍品二锅头（52度）、百年二锅头（45度）、百年红牛栏山（52度）由北京顺鑫农业股份有限公司牛栏山酒厂提供，于4 ℃保存。 BCP、GAT、L-乙酸薄荷酯（色谱纯，纯度＞98.0%）北京百灵威科技有限公司;NaCl、浓盐酸（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司;HepG2细胞 中国疾病预防控制中心;Dulbecco’s modified Eagle medium（DMEM）培养基 美国Corning公司;0.25%胰蛋白酶 美国Gibco公司;磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS） 上海源叶生物科技有限公司;细胞计数试剂盒CCK-8 日本Dojindo公司;胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、AAPH、抗生素、2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）、乙醇（高效液相色谱级） 美国Sigma-Aldrich公司;RIPA细胞溶解缓冲液 北京康为世纪生物科技有限公司;过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、微量丙二醛（malondialdehyde，MDA）和总蛋白检测试剂盒 南京建成生物技术研究所;ROS、谷胱甘肽（glutathione，GSH）测定试剂盒 碧云天生物技术研究所;无菌去离子水 北京索莱宝科技有限公司。 1.2 仪器与设备Milli-Q超纯水仪 美国Millipore公司;BL-2200H电子分析天平 岛津国际贸易（上海）有限公司;精密酒精计 河间市黎民居玻璃仪表厂;MPS 2XL固相微萃取自动进样器 德国Gerstel公司;50/30 μm（DVB/CAR/PDMS）自动固相微萃取头美国Supelco公司;7890B-5977A GC-MS联用仪、DB-FFAP毛细管色谱柱 美国Agilent公司;PSHJ-5雷磁pH计上海仪电科学仪器股份有限公司;CCL-170B-8细胞培养箱 新加坡ESCO科技有限公司;Costar 96 孔板美国Corning公司;SpectraMax M2e多功能酶标仪美国Molecular Devices公司;TGL-20B-C高速台式离心机上海安亭科学仪器厂。 1.3 方法1.3.1 HS-SPME萃取样品 根据以上分析，本文基于存储库数据挖掘方法，给出了一种能够方便评价开源软件成功度的量化度量方法.该方法基于开源社区存储库的实时数据，完全客观地描述了一个开源软件的质量、用户参与度、团队活性和软件规模等关键成功要素，使开源软件团队能够方便地了解所开发软件的成功程度和水平.在未来的研究工作中，我们将对影响开源软件成功的具体因素进行分析，为开源软件项目开发提供故障诊断和最佳实践推荐；同时，可以对开源软件进行分类，并基于本文提供的成功度度量方法获取开源软件的分类成功度排名，实现面向不同分类的智能项目推荐. 样品处理：用饱和氯化钠溶液稀释酒样至乙醇体积分数10%，取8.0 mL于20 mL顶空瓶中，并加入10.0 μL内标（L-乙酸薄荷酯，终质量浓度5.02 μg/L），混匀后进行自动HS-SPME结合GC-MS分析。 1.3.2 GC-MS条件 GC条件：进样口温度250 ℃;载气氦气流速：1.5 mL/min;不分流进样;色谱柱DB-FFAP（60 m×0.25 mm，0.25 μm）。 MS条件：电子电离源（electron ionization，EI），电子轰击能量70 eV;离子源温度为230 ℃;四极杆温度150 ℃;传输线温度与最终柱温箱的温度保持一致;全扫描模式，质量范围m/z 35～450。 综合以上两方面数据不难看出，农村地区的老年人群是健康素养水平最低的人群。我国农村老龄化问题严峻，老年健康贫困风险更大。健康扶贫可以克服精准扶贫中扶贫要求难以实行的缺点，通过合理的政策设计和策略选择，有针对性地提升贫困者的脱贫能力，实现贫困者健康能力提升与农村整体健康帮扶的有机结合是目前健康扶贫优选之策。 1.3.3 SPME分析条件 参考范文来等[18]的方法，分析条件为：固相萃取头涂层DVB/CAR/PDMS，膜厚度50/30 μm;样品在50 ℃下预热5 min后，将SPME纤维头插入酒样上方，50 ℃下吸附萃取45 min。萃取后，将SPME纤维头迅速插入GC-MS进样口中，于250 ℃解吸5 min，采用全扫描模式。 1.3.4 定性定量分析 众所周知，当输送容量没有变化的时候，电流和电压成反比，相应地提高运行电压，提高力率，可以达到降损的目标。这在高电压大电网中是成立的。因为在35kV 及以上电网中。变压器的铜损占整个电网电能损耗的80% 以上，铜损与运行电压的平方成反比。其相应的运行电压越高。铜损越小，因而总的电能损耗也越小。而在配电网中，情况有时恰恰相反。配电变压器的铁损约占整个配电网总损耗的40% ～80%，它与配电网运行电压平方成正比。特别是配电变压器在深夜运行时。因负荷低，所以运行电压较高。电压越高。造成空载损耗越大。所以，对于10kV 配电网在所有情况下都片面的强调提高运行电压是不合理的。 萜烯类化合物的定性主要结合质谱、标准物比对定性。 皖河流域自然条件优越，资源丰富，但深受水患困扰，制约了经济发展。水环境问题主要表现在洪、涝、旱和水土流失诸方面，洪水是主导因素。以治水为中心，推动皖河流域绿色经济转型有必要性和可行性。 通过建立标准曲线来定量：先用饱和氯化钠溶液稀释无水乙醇至体积分数为10%，再用稀盐酸溶液调节pH值，使之与酒样稀释后的pH值一致，作为模拟酒样。将标准化合物BCP和GAT溶解于模拟酒样以制备已知质量浓度的混合标准储备液，然后梯度稀释成一系列质量浓度的混合标准溶液。取8.0 mL于20 mL顶空瓶中，并加入20.0 μL终质量浓度为5.02 μg/L的内标物（L-乙酸薄荷酯），依次对各梯度混合标准溶液进行顶空固相微萃取，采用选择离子法扫描进行测定。最后，以待测物与相应内标物质的峰面积比为横坐标，质量浓度比为纵坐标，建立内标标准曲线。 1.3.5 体外细胞模型法评价萜烯类化合物的抗氧化活性 “国脉西凤，酒中凤凰”，为了把西凤酒这一中华老字号带上新的发展高度，他从中华传统文化入手，传承发扬工匠精神，并以文化和品质为纽带，加速中国白酒向世界的传播，引领了白酒行业的发展。 1.3.5.1 细胞培养 综上所述，在小学美术教学中培养学生的色彩感知能力，对提高学生的审美能力，健全学生的发展具有重要意义。因此，在具体的教学过程中，教师要结合小学生的实际情况，从生活和学生喜爱的游戏入手，引导学生在学习和游戏中善于发现色彩、体验色彩和感知色彩。同时，教师也要多组织听、看、练等活动，让学生获得更多体验色彩的经验，不断提高学生的色彩感知能力，促进学生的健康全面发展。 用含有质量分数2.5%血清、50 μg/mL抗生素的DMEM培养液于5% CO2、37 ℃的湿润培养箱中培养HepG2细胞，该细胞属于单层贴壁生长细胞，待细胞贴壁达到90%时，使用体积分数0.25%胰酶进行消化传代，每2～3 d进行一次传代。取对数期的HepG2细胞，当细胞密度为1×105 个/mL时用于后续实验。 1.3.5.2 萜烯化合物对HepG2细胞存活率的影响 当今社会，互联网发展势头迅猛，怀远石榴可以利用互联网进行宣传和销售。可以通过网络电商平台进行销售易保存的石榴，扩大销路，并且通过互联网进行宣传。因为“怀远石榴”成为了地理商标，怀远县可以通过制作广告投放互联网宣传商标，也就宣传了当地特色。并且可以现在最热门的直播平台，直播石榴生长，石榴丰收的画面，也可以通过直播普及挑选石榴的小知识，借此宣传怀远县的石榴。并可以通过直播平台直接接受石榴预定，在平台进行销售，拓宽石榴销路。 为避免萜烯化合物对细胞的毒性作用，确定后续实验的样品浓度，先将细胞接种到Costar 96 孔板中，每孔加入100 μL细胞悬液，于培养箱中进行贴壁培养24 h。培养结束后弃去培养基，用PBS清洗细胞3 次，样品组加入100 μL不同质量浓度的萜烯化合物，对照组加入相同体积的无FBS培养液，每组设置4 个平行，放入细胞培养箱继续培养24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，于培养箱中培养4 h后，用酶标仪检测450 nm波长处的吸光度，按照下式计算细胞存活率。 
式中：As、Ab、Ac分别为样品组、对照组、CCK-8对照组吸光度。 1.3.5.3 萜烯化合物对AAPH诱导的氧化损伤细胞中ROS的影响 将细胞接种到Costar 96 孔板中，每孔加入100 μL细胞悬液，于培养箱中进行贴壁培养24 h。实验设为4 组，分别为空白组、样品组、AAPH组、阳性对照组，每组设4 个平行。清洗细胞后，每孔加入100 μL 10 μmol/L DCFH-DA溶液，在培养箱中孵育20 min后，用无FBS培养液清洗细胞，以除去未进入细胞的DCFH-DA，之后样品组加入100 μL不同质量浓度GAT和BCP，AAPH组和空白组加入100 μL无血清培养液，培养20 min后取出，弃去培养基，用无血清培养基清洗细胞3 次后，将100 μL 200 μmol/L AAPH溶液加入样品组和AAPH组，同时向空白组加入100 μL无血清培养基，放入细胞培养箱中继续培养3 h后取出，利用荧光酶标仪在激发波长488 nm、发射波长525 nm处测定吸光度[26]。阳性对照组处理较为简单，加入10 μmol/L DCFH-DA溶液培养并清洗细胞后，加入100 μL 1∶1 000稀释的Rosup，于培养箱中孵育0.5 h后测定荧光吸光度，其中Rosup为ROS检测试剂盒中的ROS阳性对照试剂，Rosup是一种混合物，在较短时间内刺激细胞可显著提高ROS水平。 1.3.5.4 萜烯化合物对氧化损伤细胞内MDA含量和抗氧化酶活性的影响 将细胞接种到Costar 24 孔板中，每孔加入1.0 mL细胞悬液，于培养箱中进行贴壁培养24 h。实验分为3 组，分别为空白组、样品组和AAPH组（此评价指标的抗氧化实验未设置其他阳性对照组，AAPH组即为阳性对照组：细胞经过AAPH诱导后，产生强烈氧化应激，使细胞受到较大的氧化损伤，后同）。弃去培养液后，样品组每孔加入600 μL不同质量浓度GAT和BCP，空白组和AAPH组加入等体积的无血清培养液，孵育2 h后，弃去培养液并用PBS清洗3 次，样品组和AAPH组每孔加入600 μL 200 μmol/L AAPH溶液以引发氧化应激损伤，空白组加入等体积的无血清培养液，继续孵育3 h，弃去培养液并用PBS清洗3 次后，每孔加入150 μL 1.0 mmol/L PMSF的RIPA裂解液，在4 ℃下裂解20 min，将裂解后的细胞在10 000×g条件下离心10 min，取上清液按照各试剂盒说明书测定脂质氧化产物MDA和抗氧化酶（CAT、GSH-Px、SOD）活力。采用BCA试剂盒对细胞内蛋白质量浓度进行测定。 1.3.5.5 萜烯化合物对氧化损伤细胞中GSH浓度的影响 将细胞接种到Costar 24 孔板中，每孔加入1.0 mL细胞悬液，于培养箱中进行贴壁培养24 h。实验设为3 组，分别为空白组、样品组和AAPH组。按照1.3.5.4节处理细胞，加入200 μmol/L AAPH溶液孵育清洗后，每孔加入质量分数0.25%胰蛋白酶，在细胞培养箱中消化5 min 后，加入含血清培养基以终止消化，弃去上清液，收集孔板底部细胞碎片转移至离心管，将试剂盒中的蛋白去除剂加入离心管，在-80 ℃和37 ℃条件下，迅速反复冻融3 次，以更好去除细胞内蛋白。静置5 min后，在10 000×g条件下离心10 min，取上清液按照试剂盒说明书测定GSH浓度。 1.4 数据统计分析1.3.5节实验均进行4 次平行实验，结果以平均值±相对标准偏差表示。采用SPSS 17.0软件中最小显著性差异法进行显著性差异分析，柱形图用Origin 8.5软件绘制。通过Masshunter B.07.00软件对质谱数据进行分析。 2 结果与分析2.1 牛栏山二锅头酒中萜烯类化合物的确定应用HS-SPME-GC-MS法对13 种牛栏山二锅头原酒和3 种商品酒中的萜烯类化合物进行测定，对GAT和BCP两种化合物通过内标物标准曲线准确定量，该方法能够满足白酒中痕量萜烯类化合物定量分析要求（表1）。由于β-大马酮、β-杜松烯和反式-橙花叔醇无标准品，单个化合物的相对含量采用其与内标物响应值的比进行半定量分析，各萜烯类化合物的质量浓度见表2、3。 表 1 牛栏山二锅头原酒中萜烯类化合物的定量参数
Table 1 Quantitative parameters for terpenoids in Niulanshan Erguotou base Baijiu  注：R2.标准曲线的相关系数;n.标准曲线所取点数。 化合物 定量离子 斜率 截距 R2 n 检测限/（μg/L）定量限/（μg/L）回收率/%线性范围/（μg/L）GAT 69 2.145 0.007 0.995 5 0.06 0.23 93.65 0.1～1.6 BCP 133 17.11-0.013 0.999 5 0.03 0.12 105.19 0.1～5.4 β-大马酮 半定量β-杜松烯 半定量反式-橙花叔醇 半定量
与之前研究[27]相比，本实验准确定性定量的微量萜烯化合物有：GAT、BCP、β-大马酮、β-杜松烯和反式-橙花叔醇，其中GAT为二锅头酒中首次检出。从单个萜烯来看，牛栏山原酒及商品酒中的质量浓度一般为一微克每升到几百微克每升，这5 种萜烯类化合物中，原酒中GAT、BCP、β-大马酮、β-杜松烯、反式-橙花叔醇平均质量浓度分别为0.006 3、0.107 5、0.048 7、0.008 8、0.001 6 mg/L，商品酒中GAT、BCP及反式-橙花叔醇平均质量浓度为0.006 8、0.117 5、0.001 9 mg/L。部分萜烯类化合物可能对清香型牛栏山二锅头风味有贡献。香气活力值（odor activity value，OAV）可以表征化合物对酒体香气的贡献，OAV的计算方式是香气化合物的浓度与该化合物阈值之比，当某化合物的OAV≥1时，认为该化合物对酒样香气有重要贡献，且OAV越大，表明该化合物对酒体香气的贡献越大。β-大马酮在体积分数46%乙醇水溶液中的阈值仅有0.12 μg/L[27]，经计算，13 种牛栏山原酒中β-大马酮的平均OAV为406.25;BCP在纯水中的阈值为64.00 μg/L[28]，其平均OAV为1.68，其余3 种萜烯化合物OAV均小于1，β-大马酮呈蜂蜜味，BCP呈苔藓味，这两种萜烯化合物可能是牛栏山二锅头原酒中重要的香气化合物。 胡去和胡来两个人是音乐老师最头疼的，他们虽然统称“二胡”，但完全没有音乐细胞。音乐老师也不喜欢我，因为我不喜欢唱歌。音乐老师惋惜地说：等你们到了陆地上，连音乐都不会，拿什么来慰藉啊。胡椒是我们这里唱歌最好的，她不是胡来和胡去的姐妹，也不是辣妹。她只是一个唱歌好听的女孩。我们这个岛上基本由两个大姓组成，一个是胡，一个是何。我也姓胡。当年我爸爸妈妈都是这个岛上的新潮青年，是第一个把胎教带到这个岛上来的，再加上爷爷是传下来的岛长，他们生我的时候一点都没有马虎。我的爸爸为了我受精的这一天禁欲健身，我的妈妈在怀上我后一直听着音乐，他们为我的诞生做了精心的准备。我的名字叫胡生。 表 2 牛栏山二锅头原酒中萜烯类化合物定量结果（n＝ 3）
Table 2 Quantification of terpenoids in Niulanshan Erguotou base Baijiu (n= 3)mg/L  注：MS.化合物由质谱鉴定;S.化合物由标准品鉴定。表3同。 化合物 鉴定方法 酒样1 酒样2 酒样3 酒样4 酒样5 酒样6 酒样7 酒样8 酒样9 酒样10 酒样11 酒样12 酒样13 GAT MS、S 0.005 5±0.036 00.004 9±0.080 00.007 1±0.032 00.006 8±0.054 00.005 1±0.068 00.005 7±0.048 0 0.006 4±0.032 0 0.009 6±0.037 0 0.005 4±0.004 0 0.005 2±0.059 00.007 8±0.046 00.007 2±0.010 00.005 7±0.036 0 BCP MS、S 0.123 6±0.024 00.115 0±0.059 00.121 0±0.031 00.127 2±0.046 00.064 1±0.029 00.050 5±0.034 00.090 2±0.044 00.055 2±0.025 00.240 1±0.016 00.061 6±0.032 00.123 1±0.040 00.054 7±0.043 00.170 6±0.034 0 β-大马酮 MS 0.015 6±0.015 00.021 3±0.065 00.020 8±0.038 00.030 2±0.035 0 0.028 8±0.045 0 0.053 4±0.051 00.061 3±0.032 0 0.080 7±0.036 0 0.100 3±0.017 0 0.071 3±0.048 0 0.051 3±0.039 00.049 5±0.015 00.056 2±0.046 0 β-杜松烯 MS 0.005 4±0.007 00.009 0±0.026 00.006 2±0.046 00.006 4±0.035 00.005 6±0.057 00.007 6±0.042 0 0.012 1±0.039 0 0.012 0±0.036 0 0.015 4±0.020 0 0.007 8±0.024 00.007 1±0.051 00.008 5±0.037 0 0.011 1±0.035 0反式-橙花叔醇 MS 0.001 0±0.011 0 0.001 1±0.032 00.001 5±0.014 00.001 5±0.027 00.001 3±0.032 0 0.001 2±0.036 0 0.001 9±0.036 0 0.001 5±0.041 0 0.001 7±0.023 00.002 9±0.037 00.001 7±0.038 00.001 6±0.038 00.001 8±0.047 0
表 3 牛栏山二锅头商品酒中萜烯类化合物定量结果
Table 3 Quantification of terpenoids in Niulanshan Erguotou commercial Baijiu
mg/L  注：nd.未检测到。 化合物 鉴定方法 十五年珍品 百年二锅头 百年红GAT MS、S 0.004 3±0.026 00.006 5±0.015 00.009 5±0.032 0 BCP MS、S 0.155 5±0.030 00.154 7±0.025 00.042 3±0.016 0 β-大马酮 MS nd nd nd β-杜松烯 MS nd nd nd反式-橙花叔醇 MS 0.002 0±0.018 0 0.002 2±0.021 0 0.001 4±0.025 0
2.2 体外细胞模型法评价萜烯类化合物的抗氧化活性分析结果2.2.1 萜烯化合物对HepG2细胞存活率的影响  图 1 GAT质量浓度对HepG2细胞存活率的影响
Fig. 1 Effect of GAT concentration on viability of HepG2 cells
由图1可以看出，随着GAT质量浓度的升高，细胞存活率整体呈下降趋势。当GAT质量浓度达到0.5 mg/L时，细胞存活率较空白组有显著性降低（P＜0.05），但此时细胞存活率高于80%，可视为细胞正常存活[29]。当质量浓度不小于5 mg/L时，细胞存活率明显降低，HepG2细胞在此质量浓度下已经受到较大损伤，不可进行后续实验。综合考虑酒样中GAT质量浓度以及为了探究不同质量浓度GAT的抗氧化作用，最终选择0.005、0.025、0.05、0.5 mg/L进行后续实验。  图 2 BCP质量浓度对HepG2细胞存活率的影响
Fig. 2 Effect of BCP concentration on viability of HepG2 cells
由图2可以看出，随着BCP质量浓度的升高，细胞存活率整体呈下降趋势，直到BCP质量浓度达到0.5、5 mg/L时，细胞存活率较空白组显著降低（P＜0.05），但此时细胞存活率高于80%，可视为正常细胞[29]。当BCP质量浓度不小于50 mg/L时，细胞存活率显著降低，HepG2细胞在此质量浓度下已受到较大损伤。考虑到酒样中BCP质量浓度以及高质量浓度BCP可以更准确探究其抗氧化作用，最终选择0.05、0.5、5 mg/L进行后续实验研究。 2.2.2 萜烯化合物对AAPH诱导的氧化损伤细胞中ROS的影响 舍弗勒集团是全球领先的汽车零部件供应商和轴承制造商，其汽车事业部是世界上少数几个能为汽车整套动力系统提供各类子系统和零部件的专业部门。该集团在全球拥有大约65 000名员工和超过180个分支机构，舍弗勒集团旗下拥有LuK、INA和FAG三大知名品牌。 AAPH是一种水溶性偶氮化合物，可以自发稳定产生自由基[30]，其产生的自由基可诱导细胞脂质氧化损伤。细胞膜脂质的氧化损伤，会导致其完整性受损，同时破坏细胞膜传输机制，增加细胞膜的通透性，使得AAPH可以轻易通过细胞膜进入到细胞内部，从而引起细胞内ROS的产生。因此可通过AAPH诱导细胞氧化应激，由细胞内ROS水平来反映其氧化损伤程度。针对细胞内ROS含量，本研究选用细胞内ROS荧光探针DCFH-DA法进行测定。DCFH-DA本身没有荧光，可自由通过细胞膜，在细胞内酯酶的作用下转化为无荧光的DCFH，DCFH不能透过细胞膜，可被细胞内的ROS进一步氧化为具有荧光特性的DCF，荧光强度与细胞内ROS水平成正比[27]。最后采用荧光酶标仪在指定波长（激发波长488 nm、发射波长525 nm）处测定吸光度，通过各组荧光强度来确定影响效果。 高教强国“中国模式”是立足中国高等教育实际的自主发展历程，有着区别于西方高等教育的独特发展逻辑，其主要特征是中国特色与全球视野的融合，体现出高教强国“中国模式”的中国和国际两个维度的时代价值。  图 3 GAT对AAPH氧化应激HepG2细胞内ROS的影响
Fig. 3 Effect of GAT on reactive oxygen species in HepG2 cells with AAPH-induced oxidative damage
 图 4 BCP对AAPH氧化应激HepG2细胞内ROS的影响
Fig. 4 Effect of BCP on reactive oxygen species in HepG2 cells with AAPH-induced oxidative damage
如图3、4所示，空白组未添加AAPH及样品，细胞产生较低的ROS，经过AAPH处理后细胞发生氧化损伤，产生大量的ROS，荧光强度较空白组增加63.64%，经不同质量浓度GAT预处理后，细胞内ROS荧光强度分别降低36.28%、53.03%、67.62%、72.80%，经低、中、高质量浓度BCP处理后，ROS荧光强度分别降低62.90%、74.75%、86.91%。结果表明，经不同质量浓度GAT和BCP处理后细胞内ROS荧光强度显著下降（P＜0.05），与空白组相比也有显著性差异（P＜0.05），且呈浓度依赖性，样品组细胞中ROS的荧光强度甚至低于空白组，这表明这两种萜烯化合物具有直接清除细胞内ROS、防止细胞氧化损伤的作用。 2.2.3 萜烯化合物对氧化损伤细胞内MDA含量的影响ROS过剩时会攻击细胞膜脂质，通过与多不饱和脂肪酸的双键反应，引起脂质过氧化并导致脂质过氧化终产物MDA的积累。MDA在细胞内的含量过高会破坏细胞膜结构影响其功能，进而引起细胞代谢紊乱及功能障碍最终可能导致细胞凋亡[31]，因此MDA含量可以反映机体细胞氧化损伤程度。 自动驾驶在早些年前开始便得到了人们空前的关注，也能够在今日得以空前发展。它带给社会的不只是技术，也不仅是资金，更是全球性人工智能的发展，更是人们价值观的一种提升，更是道德沦理的一种上升。所以技术是工程师提供，技术背后的一切体验都将赋予于人们，这从某种程度上讲，这场技术性的革命是人类历史发展历程上一次跨纪元的成功。  图 5 GAT对AAPH氧化应激HepG2细胞内MDA含量的影响
Fig. 5 Effect of GAT on MDA content in HepG2 cells with AAPH-induced oxidative damage
 图 6 BCP对AAPH氧化应激HepG2细胞内MDA含量的影响
Fig. 6 Effect of BCP on MDA content in HepG2 cells with AAPH-induced oxidative damage
如图5、6所示，与空白组相比，AAPH组细胞内MDA含量显著增加（P＜0.05）。样品组与AAPH组相比显著降低（P＜0.05），GAT质量浓度由低到高各组对MDA抑制率分别为70.11%、90.75%、95.37%、97.72%;BCP质量浓度由低到高各组对MDA抑制率分别为95.14%、96.89%、98.44%。对于低质量浓度的GAT（0.005、0.025 mg/L）对细胞进行处理后，细胞内MDA水平较空白组仍显著升高，可能是由于GAT质量浓度较低，无法将氧化损伤细胞内MDA含量降至正常水平。曹光秀等[32]采用线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞模型，发现BCP在较高剂量（102、306 mg/kg）作用下，皮质中MDA含量降低，由此推断出可能是由于BCP的抗氧化性对脑缺血再灌注大鼠具有保护作用。本实验中经过低质量浓度GAT和BCP处理后细胞内MDA含量都有所下降，表明这两种萜烯化合物对AAPH氧化应激HepG2细胞具有保护作用，能够维持细胞正常代谢。 2.2.4 萜烯化合物对氧化损伤细胞内抗氧化酶的影响 细胞内酶抗氧化系统包含SOD、GSH-Px、CAT等，用以清除外源进入或细胞内产生的各种ROS分子和自由基，从而维持机体的氧化还原动态平衡。当机体受到各种有害刺激时，自由基会大量产生，超出了抗氧化系统的清除能力就会导致机体处于氧化应激状态，造成氧化损伤[33]。SOD可催化超氧阴离子自由基生成过氧化氢和氧，生成的过氧化氢继续被CAT和GSH-Px两种抗氧化酶催化生成水和氧[34]，从而降低机体氧化应激水平，防止自由基对机体造成损伤[35]。 表 4 萜烯对AAPH氧化应激HepG2细胞内抗氧化酶的影响
Table 4 Effect of terpenoids on antioxidant enzyme activities in HepG2 cells with AAPH-induced oxidative damage  组别 SOD活力/（U/mg）GSH-Px活力/（U/mg）CAT活力/（U/mg）空白组 12.01±0.20# 280.45±5.76# 3.09±0.24#AAPH组 6.50±0.43* 120.89±14.11* 1.02±0.14*GAT组0.005 mg/L 11.99±0.44# 275.64±9.98# 3.08±0.24#0.025 mg/L 14.36±2.25*# 300.53±7.02*# 3.53±1.02*#0.05 mg/L 16.36±0.73*# 320.57±7.04*# 4.02±1.30*#0.5 mg/L 20.31±6.36*# 350.57±6.99*# 6.05±5.80*#BCP组0.05 mg/L 14.30±0.96*# 270.85±7.05*# 3.24±0.19*#0.5 mg/L 20.36±0.71*# 340.68±7.04*# 5.82±0.28*#5 mg/L 27.36±0.73*# 420.59±9.87*# 7.93±0.95*#
如表4所示，与空白组相比，AAPH组3 种抗氧化酶的活力均显著性降低，SOD、GSH-Px、CAT活力分别降低45.88%、56.89%、66.99%，表明经AAPH处理后，细胞产生氧化损伤，激发了HepG2细胞内酶氧化应激。样品组与AAPH组相比3 种酶活力有显著性增加，不同质量浓度GAT给药组SOD活力增加84.46%～212.46%，GSH-Px活力增加128.01%～189.99%，CAT活力增加201.47%～490.20%。值得注意的是，添加0.005 mg/L GAT后，样品组中3 种酶活力与空白组相比无显著性差异（P＜0.05），本次研究中13 种牛栏山二锅头原酒、3 种商品酒中GAT的平均质量浓度分别为0.006 34 mg/L和0.006 8 mg/L，结果表明酒中该化合物的剂量可以使氧化损伤细胞内抗氧化酶活性恢复到正常水平。经不同质量浓度组BCP处理后，SOD活力增加120.00%～320.92%，GSH-Px活力增加124.05%～247.91%，CAT活力增加217.65%～677.45%。牛栏山二锅头原酒及商品酒中BCP平均质量浓度分别为0.107 5、0.117 5 mg/L，该质量浓度可以显著升高氧化损伤细胞内抗氧化活力。本实验的研究结果表明GAT和BCP这两种萜烯化合物对AAPH诱导的HepG2细胞氧化损伤具有一定的防护作用，除了通过直接清除ROS自由基而发挥抗氧化作用，还通过影响细胞内抗氧化活力而发挥作用。这一点在很多文献中亦有分析，黄娜娜[35]研究了柑橘精油对过氧化氢诱导的人皮肤成纤维细胞模型的氧化损伤恢复作用，认为柑橘精油及活性成分能够使GSH-Px、SOD、CAT的活力明显提升，揭示了其可能通过增强细胞内源性抗氧化酶活力而发挥保护作用。 2.2.5 萜烯化合物对氧化损伤细胞中GSH浓度的影响 GSH作为细胞内重要的非酶系统抗氧化剂，可用作自由基清除剂，通过维持细胞生长的氧化还原稳态而在氧化应激中起关键作用[36]，当机体受到氧化应激时，GSH会被氧化成GSSH，因此GSH的浓度变化可用以评估细胞氧化损伤情况[37]。  图 7 GAT对AAPH氧化应激HepG2细胞内GSH浓度的影响
Fig. 7 Effect of GAT on glutathione concentration in HepG2 cells with AAPH-induced oxidative damage
 图 8 BCP对AAPH氧化应激HepG2细胞内GSH浓度的影响
Fig. 8 Effect of BCP on GSH concentration in HepG2 cells with AAPH-induced oxidative damage
细胞在正常状态下，GSH浓度较高，未加样品进行保护，只加AAPH损伤处理的HepG2细胞，与空白组相比显著下降（P＜0.05），下降率达49.86%，经萜烯类化合物预处理后，细胞内GSH的浓度显著增加，且呈浓度依赖性。GAT低质量浓度组至高质量浓度组GSH浓度增加率分别为22.59%、43.67%、66.50%、83.22%，经高质量浓度组GAT（0.5 mg/L）处理后的细胞中GSH浓度与空白组仍有显著性差异，说明此时细胞的氧化损伤并未完全消除。BCP低质量浓度组至高质量浓度组GSH浓度增加率分别为66.52%、87.08%、99.92%，经高质量浓度BCP（5 mg/L）处理后的细胞中GSH浓度与空白组无显著性差异，此时细胞的氧化损伤得到抑制甚至消除。以上结果表明，经GAT和BCP处理后的细胞能够阻止细胞内GSH水平下降，保护细胞免受AAPH诱导的氧化损伤。相似的结论在其他文献中也有得出，Ojha等[38]将鱼藤酮诱导的帕金森病大鼠模型经BCP处理后，不仅能减少促炎性细胞因子和炎性介质，还能恢复谷胱甘肽的消耗，这说明BCP因其强大的抗氧化性和抗炎活性能对由鱼藤酮诱导的帕金森病提供神经保护的作用。目前有研究表明，高质量浓度下的BCP和GAT具有一定的抗氧化作用，例如：25 mg/kg BCP可以使多柔比星诱导的慢性心脏毒性大鼠体内MDA水平降低，抗氧化酶（SOD、CAT）及GSH活性升高[23]、60 μmol/L GAT具有较强的自由基清除能力[39]。另外，BCP对氧化应激细胞的抗氧化作用可能依赖于大麻素受体2型[40]，GAT在极性溶剂中清除自由基的机制归因于顺序质子损失电子转移，与羰基官能团附近的烯丙基和烷基氢的存在有关[39]。与之前研究不同，本实验选择与白酒中BCP、GAT的实际质量浓度相似的范围，综合多种抗氧化作用指标证明了BCP和GAT在白酒剂量水平（低质量浓度）下也发挥着较强的抗氧化作用，为中国白酒的健康发展提供了理论参考。 3 结 论本研究利用HS-SPME-GC-MS技术对13 种牛栏山二锅头酒中的GAT和BCP进行测定，其中GAT在二锅头酒中为首次发现。按酒中剂量范围利用AAPH诱导的HepG2细胞氧化损伤模型探究抗氧化性，研究发现GAT和BCP能够清除氧化损伤细胞内ROS、提高机体内非酶系统抗氧化剂GSH的浓度，通过提高SOD、GSH-Px、CAT的活性增强细胞内酶抗氧化系统，同时还可以防止脂质过氧化终产物MDA含量的增加，提高细胞的抗氧化能力，其抗氧化能力呈浓度依赖性增加。这一结果可为中国白酒的健康特性提供基础数据。 本研究发现GAT和BCP在牛栏山二锅头酒中的剂量下，可发挥抗氧化作用，而且此剂量水平未超过美国香料生产者协会的香料限制标准，符合食品安全法规，是一种有效的白酒抗氧化剂。白酒是中国人的日常饮品，GAT和BCP可能具有协同抗氧化作用。今后，明晰其来源及代谢途径，借助微生物调控的途径有效提高GAT和BCP在白酒中的含量，可能会更好地发挥其抗氧化性。本研究仅表明在与白酒含量相同的剂量范围内GAT和BCP单体具有抗氧化作用，但白酒这一复杂混合体系的生理活性及作用剂量还需进一步研究。 双相不锈钢(duplex stainless steel,DSS)是指铁素体相与奥氏体相各占约一半,一般较少相也需达到30%的不锈钢.由于两相组织的特点,通过适当控制化学成分和热处理工艺,可使双相不锈钢兼有铁素体不锈钢的较高强度、耐氯化物应力腐蚀性能和奥氏体不锈钢的优良韧性、焊接性的优点[1].正是这些优越的性能使双相不锈钢作为一种重要的可焊耐蚀结构材料,日益受到人们的重视,具有广阔的应用前景,并已广泛应用于石油化工和造船工程等领域[2-3]. 参考文献： [1] LIU H, SUN B. 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Intracellular Antioxidant Activity of Two Terpenoids in Baijiu ZHANG Qian1, ZHU Tingting2, HUANG Mingquan1, WEI Jinwang2,*, WU Jihong1, HUO Jiaying1
(1. Beijing Laboratory of Food Quality and Safety, Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health,Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China;2. Beijing Shunxin Agriculture Co. Ltd. Niulanshan Distillery, Beijing 101301, China) Abstract: Headspace solid phase microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry was applied for the qualification and quantification of terpenoids in 13 base Baijius and 3 commercial Baijius of Niulanshan “Erguotou”. Totally 5 terpenoids were identified by the external standard method, including β-caryophllene (BCP) and geranylacetone (GAT),which was first discovered in Erguotou Baijiu. The protective effects of GAT and BCP on oxidative damage induced by 2,2’-azobis(2-methylpropanimidamidine)dihydrochloride (AAPH) in HepG2 cells were investigated. The results showed that at the same concentration as in Erguotou, both GAT and BCP had a potent scavenging effect against intracellular reactive oxygen species by increasing the activity of intracellular antioxidant enzymes including catalase, superoxide dismutase and glutathione peroxidase and the level of non-enzymatic antioxidants such as glutathione (GSH).In addition, they could decrease the level of malondialdehyde (MDA), thereby enhancing cellular antioxidant defense capacity in a dose-dependent manner. This study provides fundamental data supporting the health benefits of Baijiu and the healthy development of the Baijiu industry. Keywords: Niulanshan Erguotou Baijiu; geranylacetone; β-caryophllene; headspace-solid phase microextraction; antioxidant activity
DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190412-176 中图分类号：TS261.9 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2020）09-0066-08 引文格式： 张倩, 朱婷婷, 黄明泉, 等. 白酒中两种萜烯类化合物的细胞内抗氧化活性[J]. 食品科学, 2020, 41(9): 66-73.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190412-176. http://www.spkx.net.cn收稿日期：2019-04-12 基金项目：国家自然科学基金面上项目（31871749）;2019年研究生科研能力提升计划项目; 酒类风味品质与安全科研创新团队项目（PXM2019-014213-000007） 第一作者简介：张倩（1994—）（ORCID: 0000-0002-6717-4940），女，硕士研究生，研究方向为食品风味分析。E-mail: zqkristy94@163.comZHANG Qian, ZHU Tingting, HUANG Mingquan, et al. Intracellular antioxidant activity of two terpenoids in Baijiu[J].Food Science, 2020, 41(9): 66-73. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190412-176. http://www.spkx.net.cn
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发表于 2021-2-4 16:11:46
