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黑斑病对新疆红枣营养成分的影响黑斑病对新疆红枣营养成分的影响 范盈盈1,2，胡东强3，张锐利4，李晓龙5，何伟忠1,2，华震宇1,2，李 静1,2，武爱波3，王 成2,6,* （1.新疆农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，新疆 乌鲁木齐 830091；2.农业农村部农产品质量安全风险评估实验室（乌鲁木齐），新疆农产品质量安全重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830091；3.中国科学院营养代谢与食品安全重点实验室，中国科学院上海营养与健康研究所，中国科学院上海生命科学研究院，中国科学院大学，上海 200031；4.塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300；5.昌吉州农产品质量安全中心，新疆 昌吉 831100；6.新疆农业科学院科研管理处，新疆 乌鲁木齐 830091） 摘 要：为研究红枣感染黑斑病后营养成分的变化情况，针对南疆7 个不同地区枣园中采集的14 个健康红枣和黑斑病红枣样品，分析其中31 种营养指标（糖类、氨基酸、总酸、总糖、还原糖、蛋白质和矿物质元素）及4 种主要有毒代谢产物（链格孢毒素）的含量变化。结果发现：相比于健康红枣，黑斑病枣中检测的7 种矿物质元素下降显著；所检测的17 种氨基酸中，有8 种苦味氨基酸（Val、Iie、Leu、Tyr、Phe、His、Lys、Arg）均升高，1 种甜味氨基酸（Pro）显著降低；果糖、蔗糖、还原糖、总糖、总酸、水溶性蛋白质含量明显降低，葡萄糖含量升高；毒性最强的细交链孢菌酮酸（tenuazonic acid，TeA）在所有样品中均检出，其在健康枣中检出含量显著低于黑斑病枣。另外，通过偏最小二乘-判别分析发现链格孢酚、天冬氨酸、蛋氨酸、TeA和赖氨酸这5 项指标可作为判别健康红枣和病枣的主要判别因子，为后续开展红枣感染黑斑病后的代谢组学研究提供思路。 关键词：黑斑病；红枣；营养成分；链格孢毒素；代谢组学 红枣（Ziziphus jujuba Mill.）富含果糖、葡萄糖、蔗糖等可溶性糖，以及钾、磷、钙、锰、酚类、黄酮类、三萜酸、氨基酸等营养物质，是一种广受国内外消费者欢迎的药食同源的果品[1]。中国是世界上最大的红枣生产国和消费国，而新疆红枣年产量300多万 t[2]，占全国的30%以上，居全国首位[3]。新疆红枣的品种按产量分主要有骏枣、灰枣和哈密大枣，其中骏枣呈椭圆形，个大，皮薄，口感偏酸，主要种植在南疆环塔里木盆地的阿克苏、喀什、和田等地州；灰枣个小，果肉密实，味甜，主要种植在南疆巴音郭楞蒙古自治州的若羌、库车等地；哈密大枣呈圆形，大小介于骏枣和灰枣之间，主要种植在东疆的哈密地区。目前，红枣产业是新疆经济发展的重要支柱产业之一，也是最具资源优势和发展潜力的产业[4]。然而，自2010年以来，“黑斑病”已成为危害新疆红枣最大的病害，造成平均产量损失超过30%，严重时超过50%[5-6]。 孕妈妈要保证均衡营养的膳食，避免摄入过多碳水化合物和热量，而应补充丰富的维生素、矿物质以及富含蛋白质的食物，如黑木耳、银耳等，但不要一下子吃太多。此外，孕妈妈也要多吃含有维生素C的水果，以促进胶原蛋白的生成，使肌肤更有活力。 黑斑病不仅给新疆的支柱产业带来产量损失，而且给采后果品的营养和品质造成了巨大影响。正常红枣果肉的颜色在生长期是从青色到暗红色，而黑斑病红枣感病部位的果肉颜色则是从淡红色到黑色。红枣感病部位肉质坚硬、腐烂、有涩味，不同于正常红枣的软和甜味。许瑛等[7]发现，与健康枣果相比，发病‘骏枣’鲜果在硬度、质量、含水量、亮度、色差等外观品质明显下降；VC、蛋白质、含糖量、可滴定酸等内在品质均明显下降。 黑斑病的主要致病菌为链格孢霉菌，侵染红枣后可产生链格孢毒素。链格孢毒素具有致畸、致癌、致突变作用，主要包括腾毒素（tentoxin，TEN）、细交链孢菌酮酸（tenuazonic acid，TeA）、链格孢酚（alternariol，AOH）、链格孢酚甲基醚（alternariol monomethyl ether，AME）等，其中TeA毒性最强，AOH和AME具有急性毒性且可显示协同效应[8]。 目前，仅有国内学者对新疆枣果黑斑病有研究，主要集中在黑斑病的危害分布[9-10]、病原鉴定[11-12]、发生规律[13-14]以及防治[15-16]等方面，而红枣感染黑斑病后的品质变化、毒素产生情况、食用安全性方面的研究则很少。本研究以南疆不同地区枣园中采集的健康红枣和黑斑病红枣为研究对象，通过对其内在品质指标，如糖类、氨基酸、总酸、总糖、还原糖、蛋白质、矿物质元素及主要链格孢毒素进行检测分析，最终找到病害枣果变化显著的代谢物因子，以期为全面研究黑斑病对南疆红枣的代谢组学研究提供基础。 1 材料与方法1.1 材料与试剂2016年红枣成熟期分别在阿克苏、喀什、和田等地区的7 个县市枣园的不同方位随机采集100 粒黑斑病骏枣（至少含有1 个黑斑病斑）和100 粒健康骏枣（无病斑），分别去核混匀后，加入液氮，用刀式研磨仪打碎，-20 ℃冷冻保存，用于后续枣果营养成分和链格孢毒素的含量测定，每个实验重复3 次，结果取平均值。 果糖、葡萄糖、蔗糖标准品 美国Sigma-Aldrich试剂公司；铜、钾、锌、铁、锰、镁、锌、钙标准品 国家标准物质中心；17 种氨基酸混合标准溶液 德国赛卡姆公司；4 种链格孢毒素标准品 奥地利Romer公司；乙酸钠、乙酸钾、乙酸（均为分析纯） 北京北化精细化学品有限责任公司；茚三酮 上海三爱思公司；苯酚、盐酸（均为分析纯） 广东光华化学有限公司；硝酸、过氧化氢（均为优级纯） 德国Merk试剂公司；甲醇、乙腈、甲酸（均为色谱级） 美国Fisher试剂公司。 食醋可由固态发酵酿制也可由液态发酵酿制。固态发酵工艺又可分为全固态发酵和前液后固发酵，而液态发酵工艺主要采用深层半连续发酵[3,4]。对于食醋发酵工艺的应用，中国与欧美国家存在明显差异：中国传统食醋酿造所用的原料主要有米、小麦、麸皮等，大部分采用固态发酵工艺生产；而欧洲食醋主要以酒、苹果、果汁、麦芽、蜂蜜等为原料[5]，最广泛的发酵方式是使用FRINGS醋酸发酵罐进行液态深层发酵[6]。液态深层发酵工艺流程为[7,8]：(1)对种子罐、发酵罐、各阀门及管道进行灭菌；(2)对醋酸菌种进行种子培养；(3)进行醋酸发酵，培养70 h后开始分割取醋；(4)压滤；(5)配兑和灭菌。 1.2 仪器与设备HM100型刀式研磨仪 北京格瑞德曼仪器设备有限公司；8400型全自动凯氏定氮仪 丹麦FOSS公司；BSA223S型电子天平 德国赛多利斯公司；Mars型微波消解仪 美国CEM公司；900F型原子吸收分光光度计美国PE公司；AFS0820型原子荧光分光光度计 北京吉天仪器有限公司；LS-5型荧光分光光度计、UPLCTQD型超高效液相色谱-串联质谱仪 美国Waters公司；1260 INFINITY型高效液相色谱仪 美国安捷伦公司；S-433D型氨基酸分析仪 德国SYLM公司；TYE-100型真空干燥浓缩仪 东京理化器械株式会社；WX-2型真空泵台州市枫江创新电机厂。 1.3 方法枣果葡萄糖、果糖和蔗糖含量测定：参考GB/T 22221—2008《食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定 高效液相色谱法》；还原糖含量测定：参考GB/T 5009.7—2008《食品中还原糖的测定》，采用直接滴定法；17 种氨基酸含量测定：参考GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的测定》，采用氨基酸全自动分析仪测定；总酸含量测定：参考GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》，采用酸碱中和滴定法；蛋白质含量测定：参考GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》，采用凯氏定氮法；矿物质元素Fe、Mg、Mn、Ca含量测定：参考GB/T 5009.90—2003《食品中铁、镁、锰的测定》和GB/T 5009.92—2003《食品中钙的测定》，采用原子吸收分光光度法；Cu含量测定：参考GB/T 5009.13—2003《食品中铜的测定》，采用火焰原子吸收光谱法；K含量测定：参考GB/T 5009.91—2003《食品中钾、钠的测定》，采用火焰发生光谱法。 链格孢毒素（AOH、AME、TEN、TeA）的检测方法参考文献[17]。 1.4 数据处理采用Excel建立数据系统，用SPSS软件进行显著性差异分析，用SIMCA-P软件进行主成分分析和营养分析评价。 财务会计的信息能否保证不被泄露也是现今所面临的巨大挑战之一，更何况是在这个网络高度发达的时代，如果不能够保障信息的安全，一旦遭到病毒攻击，企业将承受巨大的损失。另一方面在计算机运行的过程中也可能会有突发状况发生，如停电或机器出现了故障，这将导致数据流失且不可挽回。 2 结果与分析2.1 黑斑病对红枣中矿物质元素的影响 图 1 病枣样品相比与健康红枣中不同种类矿物质元素含量变化率
Fig. 1 Changes in contents of mineral elements in infected jujubes as compared with healthy ones
如图1所示，通过检测来自7 个枣园中的健康红枣和黑斑病枣中的7 种矿物质元素，发现同一个枣园黑斑病红枣中的矿物质元素含量相比于健康红枣中的含量分别减少了2.4%～28.7%（Ca）、3.1%～43.0%（Cu）、3.97%～12.73%（Fe）、1.1%～21.9%（K）、2.4%～27.3%（Mg）、1.5%～38.2%（Mn）、7.9%～66.9%（Zn），而且通过配对样本t检验分析，黑斑病红枣和健康红枣中这7 种矿物质在95%的置信区间内变化显著（P值为0.017～0.046，均小于0.05）。其中，K、Ca、Mg为红枣中含量较高的矿物质元素（＞100 mg/kg）[18]，其在黑斑病枣中的流失情况低于Zn、Mn、Cu等微量元素（＜10 mg/kg）。 2.2 黑斑病对红枣中氨基酸含量的影响 图 2 病枣样品相比与健康红枣中不同种类氨基酸含量变化率
Fig. 2 Changes in contents of amino acids in infected jujubes as compared with healthy ones
如图2所示，通过检测健康红枣和黑斑病红枣中17 种氨基酸的含量发现，相比于健康红枣，黑斑病枣中的脯氨酸和天冬氨酸含量显著降低（配对检验P值为0.003～0.008，小于0.05），谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸含量显著升高（配对检验P值为0.001～0.033，小于0.05），胱氨酸含量降低不显著（配对检验P值为0.322，大于0.05），亮氨酸、丝氨酸、组氨酸、酪氨酸、蛋氨酸含量升高但不显著（配对检验P值为0.092～0.304，大于0.05）。其中苦味氨基酸（Leu、Lys、Arg、Val、His、Phe、Iie、Tyr）含量均升高含量，而含量最高的氨基酸（Pro）为甜味氨基酸，其在病枣中的含量显著降低，这与红枣在发病过程中果肉变质发苦有很大关系[19]。 2.3 黑斑病对红枣中其他营养成分含量的影响如图3所示，同一个枣园黑斑病红枣中的其他营养成分含量相比于健康红枣中的含量分别减少7.4%～38.9%（总糖）、4.6%～51.4%（还原糖）、8.8%～35.7%（果糖）、47.5%～100%（蔗糖）、5.6%～47.5%（水溶性蛋白质）、3.1%～46.6%（总酸），然而葡萄糖含量升高了10.0%～81.8%，根据配对检验结果（P值为0.004～0.034，小于0.05）发现这7 项营养指标均为显著性变化。这是由于骏枣感染病害后，呼吸作用增强，增加了贮藏物质的糖消耗，尤其是二元糖——蔗糖的消耗（在部分黑斑病枣中未检测到蔗糖），因而可能造成葡萄糖含量升高、总糖含量降低[20]。  图 3 病枣样品相比与健康红枣中不同种类营养成分含量变化率
Fig. 3 Changes in contents of nutritional components in infected jujubes as compared with healthy ones
2.4 黑斑病对红枣中链格孢毒素含量的影响表 1 不同枣园中健康红枣和黑斑病枣样品中链格孢毒素的含量Table 1 Contents of Alternaria toxins in infected and healthy jujubes from different orchards
mg/kg  注：LOQ.定量限。 采样地点编号TeA AOH AME TEN健康红枣 黑斑病枣 健康红枣 黑斑病枣 健康红枣 黑斑病枣 健康红枣 黑斑病枣A1 3.839 7 80.148 8 未检出 0.071 7 未检出 0.343 9 ＜LOQ 0.001 5 A2 0.865 5 19.259 6 未检出 0.102 7 ＜LOQ 0.021 3 0.004 6 0.002 1 A3 1.262 5 3.105 0 未检出 0.020 2 ＜LOQ ＜LOQ ＜LOQ 0.001 8 A4 3.445 6 109.671 8 未检出 0.040 0 0.001 2 1.551 7 ＜LOQ 0.005 0 A5 0.168 7 4.208 0 0.044 0 0.063 0 未检出 ＜LOQ 未检出 ＜LOQ A6 0.161 2 4.086 4 未检出 0.019 6 ＜LOQ ＜LOQ ＜LOQ 0.001 7 A7 0.370 7 1.966 6 0.039 1 0.058 2 未检出 ＜LOQ 0.001 8 0.029 1
从表1可以看出，TeA在所有样品中均检出，而且检出含量随着黑斑病感染程度而变化：健康枣（0.161 2～3.839 7 mg/kg）＜病枣（3.105 0～109.671 8 mg/kg）。AOH、AME和TEN在大部分的健康红枣中都未检出或者低于LOQ，病枣中的检出含量范围分别为0.019 6～0.102 7 mg/kg、＜LOQ～1.551 7 mg/kg和＜LOQ～0.029 1 mg/kg。健康枣在运输、保存、处理过程中可能受到病枣污染，因此有少量链格孢毒素检出。何丽等[21]在不同病级发病枣果中也均检出TeA、AME和AOH，其中TeA检出含量最高，可达3 102.27 mg/kg。 2.1.2.1 提高护士业务能力 每个月组织病房小讲课，护理查房，科内业务学习，及不定期的医师授课，并定期进行考核。通过开展各类业务学习、培训，不断丰富专科知识，更新护理理念，调动和激发护士的积极性与创造性，提高护士业务能力。 2.5 黑斑病对红枣中营养成分的整体影响同一枣园中的健康红枣和黑斑病枣的营养品质具有一定的差异性，利用测定的营养品质参数，尝试构建判别模型，判别红枣是否已感染黑斑病。将测定的来自7 个不同枣园中的健康红枣和黑斑病枣的31 个营养指标和4 个链格孢毒素构成为14×35的数据矩阵。利用偏最小二乘法-判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）方法[22-23]，挖掘差异特征信息，提取特征因子，构建红枣感病判别模型。如图4a所示，7 个健康红枣和7 个黑斑病枣在前2 个潜变量空间的投影可以明显区分。如图4b所示，AOH、ASP、TeA对第1个潜变量具有较大贡献，而蛋白质、Mg、Ser对第2潜变量具有较大贡献。如图4c所示，AOH、Asp、Met、TeA、Lys等是红枣PLS-DA发病判别模型最主要的特征变量（VIP值＞1）。 由表2可知，实验前，实验组总体凝聚力及各维度均略低于对照组总体凝聚力及相应维度，并且实验组和对照组总体凝聚力及各个维度均没有存在显著性差异(P>0.05)。两组在各个方面相差都不大，基本处于同一水平，说明实验组和对照组凝聚力水平相同或相近。  图 4 基于PLS-DA的健康红枣和黑斑病枣的判别模型
Fig. 4 PLS-DA based identification model for infected versus healthy jujubes
3 讨论与结论由于骏枣皮薄、肉质疏松，并且矮化密植、恶劣天气等因素，特别容易受到链格孢霉菌侵染，从而易得黑斑病[24]。白剑宇等[25]以3 种不同栽培模式的不同黑斑病发病程度的骏枣为研究对象，检测10 种主要营养成分，发现总糖、还原糖、蔗糖、黄酮、VC、Ca、P、Fe、Zn等营养成分的含量与枣黑斑病危害级别呈负相关。许瑛等[7]对不同黑斑病发病程度的骏枣和灰枣进行外观及内在品质指标测定，发现2 种病枣中的VC、蛋白质、含糖量、可滴定酸等含量均明显下降，而且在2 种病枣中均检测到TeA、AME和AOH这3 种链格孢毒素。本课题组[26]曾对3 种红枣（哈密大枣、和田骏枣和若羌灰枣）接种黑斑病病原菌——链格孢菌（Alternaria alternata）和细极链格孢菌（A. tenuissima），用超高效液相色谱-离子阱轨道-高分辨质谱进行代谢物筛查，发现感染了病原菌的枣果中有4 种皂苷、3 种有机酸、3 种生物碱含量显著下降，链格孢毒素TeA和AOH显著升高。 本研究采集的红枣主要来自阿克苏、和田两地兵团的7 个连队枣园的矮化密植的骏枣。经过检测健康红枣和黑斑病枣中的7 种矿物质元素、17 种氨基酸、3 种糖类、总酸、总糖、蛋白质、还原糖等31 项指标发现：1）病枣中所检测的7 种矿物质元素含量显著下降，说明果实在病变过程中矿物质元素均有不同程度的流失[27]，且K、Ca、Mg等红枣中含量较高的矿物质元素在黑斑病枣中的流失情况低于Zn、Mn、Cu等微量元素。相关文献报道[28]枣果中的Ca含量与裂果密切相关，而裂果也是红枣黑斑病的诱因之一。2）相比于健康红枣，黑斑病枣中的一些苦味氨基酸含量（Val、Iie、Leu、Tyr、Phe、His、Lys、Arg）均升高，甜味氨基酸含量（Pro）显著降低，这与红枣在发病过程中果肉变质发苦有关。3）红枣感染黑斑病后，果糖、葡萄糖、蔗糖、还原糖、总糖、总酸、水溶性蛋白质等明显降低，这是由于骏枣感染病害后，呼吸作用增强，增加了贮藏物质的糖消耗，因而糖含量降低。4）毒性最强的TeA在所有的样品中均检出，且含量最高，其在健康枣中检出含量（0.161 2～3.839 7 mg/kg）显著低于黑斑病枣（3.105～109.671 8 mg/kg）。AOH、AME和TEN在所有的健康红枣中都未检出或者低于定量限，在病枣中的检出量较低。5）通过主成分分析发现AOH、Asp、Met、TeA和Lys为主要判别健康红枣和病枣的区分因子。由此可以猜测黑斑病中链格孢毒素AOH和TeA的生物合成[29-30]可能与氨基酸Asp、Met和Lys有关。 综上所述，新疆红枣感染黑斑病后，多种营养成分发生显著变化，并主要产生有毒代谢产物——链格孢毒素，其中健康红枣和黑斑病枣的5 个主要区分因子中，AOH和TeA为有毒代谢产物，Asp、Met和Lys为主要营养成分，推测这5 个因子可能存在一定的代谢关系，具体代谢途径还有待于后期的实验验证。本研究结果可为阐释新疆红枣黑斑病变过程中链格孢毒素的产生机理提供理论依据。 参考文献： [1] FANG S, WANG Z, HU X, et al. 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Effects of Black Spot Disease on Nutritional Composition of Red Jujubes Grown in Xinjiang FAN Yingying1,2, HU Dongqiang3, ZHANG Ruili4, LI Xiaolong5, HE Weizhong1,2, HUA Zhenyu1,2, LI Jing1,2, WU Aibo3, WANG Cheng2,6,*
(1. Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agro-products, Xinjiang Academy of Agricultural Sciences, Ürümqi 830091, China; 2. Key Laboratory of Agro-products Quality and Safety of Xinjiang, Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agro-products (Ürümqi), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Ürümqi 830091, China;3. Key Laboratory of Nutrition, Metabolism and Food Safety of CAS, Shanghai Institute of Nutrition and Health of CAS, Shanghai Institutes for Biological Sciences of CAS, University of Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China;4. College of Life Sciences, Tarim University, Alar 843300, China;5. Center for Quality and Safety of Agricultural Products, Changji Hui Autonomous Prefecture, Changji 831100, China;6. Management of Scientific Research, Xinjiang Academy of Agricultural Sciences, Ürümqi 830091, China) Abstract: In order to study the changes of the nutrients in red jujubes after being infected with black spot disease, we analyzed 14 infected and healthy jujube samples collected from 7 jujube orchards in South Xinjiang for 31 nutritional components (sugars, amino acids, total acid, total sugar, reducing sugars, proteins and mineral elements) and four main toxic metabolites (Alternaria toxins). Results showed that the contents of 7 mineral elements were decreased significantly in infected jujubes as compared with healthy ones. Among the 17 amino acids detected, the contents of 8 bitter amino acids(Val, Iie, Leu, Tyr, Phe, His, Lys, and Arg) were all increased while one sweet amino acid, Pro, was significantly decreased.The contents of fructose, sucrose, reducing sugar, total sugar, total acid and water-soluble protein were significantly reduced,whereas glucose content was increased. Tenuazonic acid (TeA), the most toxic among the four metabolites, was detected in all samples, at a significantly lower level in health jujubes than in infected ones. In addition, by partial least squares discriminant analysis we found that alternariol (AOH), aspartic acid, methionine, TeA and lysine could act as main indicators to distinguish between healthy and infected jujubes. This research provides novel ideas for future metabolomics research of red jujubes infected with black spot disease. Keywords: black spot; red jujubes; nutritional components; Alternaria toxins; metabonomics
收稿日期：2019-06-10 基金项目：NSFC-新疆联合基金重点支持项目（U1703234）；乌鲁木齐市科技计划项目（P161210005）；新疆维吾尔自治区自然科学基金青年基金项目（2017D01B25） 第一作者简介：范盈盈（1987—）（ORCID: 0000-0002-1693-1702），女，助理研究员，硕士，研究方向为农产品质量安全。E-mail: fyyxaas@sina.comDOI:10.7506/spkx1002-6630-20190610-095 中图分类号：TS255.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2020）08-0303-05 引文格式： 范盈盈, 胡东强, 张锐利, 等. 黑斑病对新疆红枣营养成分的影响[J]. 食品科学, 2020, 41(8): 303-307. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190610-095. http://www.spkx.net.cn原句：Suddenly,in the middle of the night,she went berserk and hell broke out. FAN Yingying, HU Dongqiang, ZHANG Ruili, et al. Effects of black spot disease on nutritional composition of red jujubes grown in Xinjiang[J]. Food Science, 2020, 41(8): 303-307. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190610-095. http://www.spkx.net.cn
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发表于 2021-2-3 22:07:56
