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乳酸菌代谢物中二肽基肽酶-4抑制剂的分离纯化及鉴定乳酸菌代谢物中二肽基肽酶-4抑制剂的分离纯化及鉴定 董 杰1，刘 鹭2，甲承立3，朱俊玲1,*，吕加平3,* （1.山西农业大学食品科学与工程学院，山西 晋中 030800；2.北京市营养源研究所系统营养工程技术研究中心，北京 100069；3.中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193） 摘 要：筛选出具有抑制二肽基肽酶-4（dipeptidyl peptidase-4，DPP-4）活性的植物乳杆菌BLP12，将其代谢物通过有机溶剂萃取、超滤膜、凝胶色谱和高效液相色谱等一系列方法进行分离纯化，利用底物N-甘氨酰脯氨酰-对硝基苯胺盐酸盐与DPP-4在波长405 nm左右强烈的光吸收测定DPP-4活性，选择抑制活性强的部分用液相色谱-质谱联用仪鉴定样品中的物质，质谱共鉴定出61 种物质，其中十二烷基硫酸盐是已有报道的DPP-4抑制剂。 关键词：乳酸菌；代谢物；二肽基肽酶-4；抑制活性 糖尿病是一种由多种原因引起的代谢紊乱性疾病，主要是由于体内的胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗导致血糖过高或过低，其显著特点是长期高血糖[1]。长期高血糖容易造成大血管、微血管的损害，进而使脑、肾、心、眼、神经等多个器官受损，最终可能导致患者失明，引起尿毒症、脑中风、心肌梗塞等并发症，甚至危及生命[2]。2017年底，国际糖尿病联盟公布了第八版全球糖尿病地图，结果显示，全球糖尿病患者从2000年的1.51亿到2017年的4.25亿，增加了近2 倍，平均每11 个人中就有1 位患病者。其中，中国患病人数达1.14亿，是全球糖尿病患病人数最多的国家[3]。 随着现代教育技术的发展，教学实践中使用电教器材设备和电教教材进行相关教学活动，在体育教学中已经越来越常见，有时也称之为“视听教学”、“机器教学”、“多媒体教学”、“CAI辅助教学”。但是由于常规的体育课程教学，尤其是体育专项课教学，大都在体育场馆进行技术技能的实践演练，因此运用相对较少。电化教学如今更多地采用多媒体的方式进行，通过幻灯、电影、录音、电视、录像、电子计算机等终端设备，在训练计划、游泳模拟、动态展示等课程内容上，可以多角度、多方位地向学生展示游进中的身体姿态，相比传统语言讲解与示范，具有更为形象、直观、动态等多种优势。 现已有几类降糖药可用于治疗糖尿病，包括磺酰脲类、甲格列奈类、噻唑烷二酮类、双胍类、α-葡萄糖苷酶抑制剂等。但它们具有共同的副作用，即体重增加和低血糖，这使得长期治疗无法控制最佳血糖[4]。因此，为改善治疗效果，降低副作用，出现了治疗II型糖尿病的新方法。其中，二肽基肽酶-4（dipeptidyl peptidase-4，DPP-4）抑制剂是目前比较新颖且有前途的抗糖尿病药物。 DPP-4又称T细胞表面抗原CD26，是广泛存在于细胞膜上的一类具有潜在的调节免疫、内分泌以及神经系统等功能的膜结合丝氨酸蛋白酶，其存在于多种器官中且家族成员众多[5]，在肠道中高表达，于肝脏、胰腺、胎盘、胸腺等处也有表达，部分以可溶形式存在于循环血液中[6]。凡是N端第2位存在脯氨酸（Pro）或丙氨酸（Ala）的多肽均是该类酶的底物，其可以从肽链的N端将这两个氨基酸残基水解使该活性多肽失活[7]。如胃肠道激素、神经肽、细胞因子等都是DPP的底物，但在人体中DPP-4的底物只有葡萄糖依赖性促胰岛素释放多肽（glucose-dependent insulinotropic peptide，GIP）和胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）[8-9]。生成GLP-1的肠道L细胞主要位于回肠下段，所有存贮在L细胞微粒中的GLP-1都是有活性的，但DPP-4使GLP-1快速失活且不可逆，因而GLP-1在体内的半衰期极短，其中大约75%的GLP-1离开肠道前已经被降解为无活性的代谢产物，此后40%～50%的门静脉血GLP-1在肝脏中降解，因此，仅10%～15%有活性的GLP-1能到达体循环[10-11]。DPP-4抑制剂竞争性结合GLP-1和GIP中与DPP-4作用部分，从而延缓GLP-1和GIP在体内的降解，增强其促胰岛素分泌和葡萄糖调节活性。此外，在某些情况下，抑制DPP-4同时可以降低糖尿病患者的心血管危险因素，降低血压，改善餐后高血糖，减少炎症标志物、氧化应激、血小板聚集以及改善内皮功能等[12]。目前市场上DPP-4抑制剂类药物多为列汀类，但是据一些药物上市后的检测结果显示，西格列汀可引起严重的过敏反应以及出血性或坏死性急性胰腺炎；维格列汀有肝毒性报道。因此，列汀类DPP-4抑制剂的长期安全性仍然需要更多的临床研究来评价[13]。寻找天然来源的DPP-4抑制剂被提上日程。 乳酸菌作为定居肠道中的有益菌群具有多种生理功能，如缓解乳糖不耐受症、改善便秘和腹泻、维持肠道微生态平衡和肠管机能、增强免疫功能和抗肿瘤、影响心血管疾病的发展、缓解过敏反应等[14-15]。近年来，一些研究报道乳酸菌还具有抑制DPP-4和α-葡萄糖苷酶的作用，因而已经成为控制糖尿病、缓解高血糖和增加胰岛素敏感性的潜在新型和天然治疗药物。本研究的目的是筛选出1 株对DPP-4有良好抑制作用的乳酸菌，并用多种方法对乳酸菌的代谢物进行分离纯化，最终鉴定出乳酸菌代谢物中抑制DPP-4的主要物质，为以后实施代谢调控提供理论基础和参考。 1 材料与方法1.1 材料与试剂实验所用菌株均由中国农业科学院农产品加工研究所乳品实验室保藏。 2) 区域隔离。为保证各联合控制室控制系统的相对独立，在高级应用网与部分联合控制室之间部署工业防火墙进行装置间控制系统隔离，阻止病毒、木马的入侵和扩散等，即使一个装置控制系统出现问题，也不会影响到其他装置控制系统，将危险源控制在有效范围。 重组人源DPP-4（D4943）、N-甘氨酰脯氨酰-对硝基苯胺盐酸盐（N-glycyl-prolyl-p-nitroanilide hydrochloride，Gly-Pro-pNA，0513-100MG） 美国Sigma公司；抑二肽素A 英国Abcam公司；西格列汀杭州默沙东制药有限公司；MRS肉汤培养基、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠 北京广达恒益科技有限公司；甲醛、丙酮、石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂均为分析纯。 如江西省陶瓷技能大师刘嘉鸿的作品。他的工笔花鸟画画风十分严谨，可以看到清晰，有序的线条和恰到好处的色彩填充。如他笔下的牡丹，花朵硕大而娇艳十足，花瓣重重叠叠，互相映衬;色彩瑰丽夺目、色色相融，仿若洁白的瓷板上真实地放置了几株牡丹花；还有他画的荷花茎高且直，独傲不俗、亭亭玉立在万绿丛中，风姿卓绝且仪态万方；他所绘制的小鸟灵动活泼、形神兼备，栩栩如生。工笔花鸟画在画面形式的讲究上也成就了它更为专业，生动的作品风格。 1.2 仪器与设备Spark 20M全波长酶标仪 瑞士TECAN公司；3K15离心机 美国Sigma公司；MB-102高通量组织恒温金属浴 杭州博日科技有限公司；DHP-9082电热恒温培养箱 上海一恒科技有限公司；LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；JY92-IIN超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；DL-CJ-1N超净工作台 北京东联哈尔仪器制造有限公司；RE-52A旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；蛋白分离纯化系统 美国GE公司；半制备液相色谱仪 美国安捷伦公司；超高效液相色谱-串联飞行时间质谱系统美国AB SCIEX 公司。 1.3 方法1.3.1 菌种活化 将实验室保藏的植物乳杆菌BLP12和1.6970分别接入无菌的MRS肉汤培养基中，于37 ℃恒温静置培养16 h，活化3 代后用于后续实验。 将活化好的菌株以4%（V/V）接种量接入MRS肉汤培养基中，于37 ℃静置培养16 h，收集菌液，根据GB 4789.2—2010《食品微生物学检验 菌落总数测定》进行菌株菌落总数的测定，将菌液浓度调节为1×109 CFU/mL。 1.3.2 样品的制备 1.3.2.1 无细胞发酵上清液（cell-free excretory supernatant，CFS）的制备[16] 将保藏的益生菌菌种活化3 代后，按4%的接种量接种于MRS培养基中，于恒温培养箱中37 ℃培养24 h后取出，以4 ℃、10 000 r/min离心15 min，倒掉培养基收集菌体。将收集到的菌体用无菌0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 6.8）洗涤3 次，再重悬于PBS中，调节菌液浓度至1×109 CFU/mL，涡旋混匀。接着于37 ℃恒温培养箱中静置培养16 h，以同样的条件离心15 min，收集上清液，用0.22 μm水系微滤膜过滤得到CFS，-80 ℃保存以备使用。 1.3.2.2 无细胞胞内提取物（cell-free intracellular extract，CFE）的制备[17] 将所用的益生菌菌种活化3 代后，按4%的接种量接种于MRS培养基中，恒温培养箱37 ℃培养24 h后取出，以4 ℃、10 000 r/min离心15 min，倒掉培养基收集菌体。将收集到的菌体用无菌0.1 mol/L PBS（pH 6.8）洗涤3 次，再重悬于PBS中，调节菌液浓度至1×109 CFU/mL，涡旋混匀，用超声波细胞破碎仪破碎细胞。超声破碎的条件为：在冰浴的条件下，功率200 W，以3～5 s（工作3 s，停5 s）的脉冲破碎12 min。将超声后得到的液体于4 ℃、10 000 r/min离心15 min，收集上清液，以0.22 μm水系微滤膜过滤得到CFE，-80 ℃保存以备使用。 1.3.2.3 猪小肠中DPP-4的制备[18] 将新鲜猪小肠的内容物杂质清理干净，用冷藏过的pH 6.8的PBS冲洗。在冰浴环境下切开，用干净的载玻片分别刮取十二指肠、空肠、回肠黏膜及其表面黏液。将刮取下的黏膜及黏液加入等体积的pH 6.8 PBS，低温下匀浆，然后将混合物在 4 ℃、12 000 r/min离心20 min收集上清液，冻存于-20 ℃以备用。 将猪小肠黏膜液的上清液用pH 6.8 PBS稀释90 倍，作为DPP-4使用。 1.3.3 DPP-4抑制率的测定 底物Gly-Pro-pNA在DPP-4的作用下发生降解，生成的对硝基苯胺在405 nm波长下具有强烈光吸收，因此可依据单位时间内吸光度的改变程度表示酶促反应速率[19]。 取96 孔板，用微量移液器在反应孔中加入25 μL 1.6 mmol/L的底物Gly，接着加入25 μL待测样品（对照加入0.1 mol/L PBS（pH 8），37 ℃反应10 min，加入DPP-4（猪小肠）50 μL，金属浴37 ℃反应1 h，加入100 μL的0.1 mol/L的Na2CO3终止反应，用酶标仪在405 nm波长处测样品的吸光度，每组3 个平行。抑制率的计算公式如下[20]： 
式中：A为Gly＋样品＋酶＋Na2CO3；B为Gly＋样品＋PBS＋Na2CO3；C为Gly＋PBS＋酶＋Na2CO3；D为Gly＋PBS＋PBS＋Na2CO3。 1.3.4 样品的分离纯化 他首先想到了感激，感激这样的相遇相识，让他单调得无趣无味的空中骤然升腾出绚丽的云彩，他甚至幻想有那么一天云彩下出现了他和伍亦苒的身影。这幻想每日叠加，成为夜晚的依赖梦中的期待。 1.3.4.1 超滤 取适量样品加入到50 mL的超滤管中，依次用10、5、3 kDa的超滤管进行逐步分离，按不同的分子质量范围对样品进行收集：＜3 kDa，3～5 kDa，5～10 kDa，＞10 kDa。测定各个部分的DPP-4抑制活性。选择活性强的一部分进行下一步分离纯化。 1.3.4.2 有机溶剂提取 其次，早期的区块链应用记录的是源于母体的数字货币，区块链自产自销的是原生虚拟资产。这是一个封闭的数字价值世界，不需要与物理世界打交道就可以运转，匿名也是完全可行的。但到了区块链的2.0时代（具备智能合约和平台化等），区块链上记录和交易的不再来自区块链，而是来自物理世界的股权、版权和产权等。如果区块链上所映射的是匿名资产，从法律意义上就是无效合同。 取100 mL发酵上清液置于分液漏斗，分别用甲醇、丙酮、石油醚、乙酸乙酯有机溶剂进行萃取。萃取体积按照1∶1进行，萃取后分别收集水相部分和有机相部分，对收集到的样品用旋转蒸发仪蒸发浓缩至干，接着用5 mL超纯水反复洗脱壁上的残留物质，将收集到的洗脱液进行活性测定[21]。 1.3.4.3 凝胶色谱柱分离 四是要有好身体。自驾游比跟团游更考验人的体能。吃饭不及时、休息不及时、睡觉不及时，都是常事。有时前不着村、后不着店，只能咬牙坚持。我们此次所去的地方，一连好几天，都在海拔3500-4000米左右的地方活动，如果有高原反应，对身体会造成一定影响。在阿克塞县城，遇到一伙刚从西藏下来的游客。他们都穿着棉衣，但其中有一女的却一身背心短裤，精神抖擞。据说在西藏，此人毫无不适之感。而另有一个人高原反应十分厉害，头疼欲裂，氧气吸了一大袋，差点死在那里。 选择抑制活性强的部分进一步用AKTA蛋白分离纯化系统按不同分子质量对样品进行分离，流动相使用0.5 mmol/L的PBS，收集出峰，并对每个收集到的峰进行活性检测。使用Superdex peptide柱进行分离，分离分子质量范围0.1～7 kDa，进样量1 mL，流速2 mL/min，检测波长214 nm。 1.3.4.4 半制备高效液相色谱进一步纯化 选出活性较高的部分，用半制备高效液相色谱进一步分离纯化活性物质，检测使用Innoval C18柱（21.2 mm×250 mm），进样量1.5 mL，流速5 mL/min，检测波长为214 nm，流动相A为超纯水溶液，流动相B为乙腈溶液，梯度条件如表1所示。收集每一个出峰部分，对收集到的峰物质进行活性检测。 表 1 半制备高效液相色谱流动相洗脱梯度
Table 1 Mobile phase gradient elution program of semi-preparative high performance liquid chromatography  时间/min 流动相A/% 流动相B/%
1.3.5 超高效液相色谱-串联飞行时间质谱分析 先假定一个−值，然后由以上2个方程分别计算，若两者之差不超过值的±2%，则计算结果有效。即进行炉膛燃烧室热力校核计算时，各受热面的传热系数K及平均温差Δt均与炉膛出口烟温−有关，因此，计算时必须采取逐次逼近法。经过迭代，得到炉膛热力并计算各个参量值。 1.3.5.1 色谱条件 色谱柱：BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 µm）；载气（He）流速：0.40 mL/min，进样量20 μL，柱温45 ℃；流动相A为水（含0.1%甲酸），流动相B为乙腈（含0.1%甲酸）。 1.3.5.2 质谱条件 资本市场是建立在投机的心理机制之上的，也正因为这种投机心理，资本市场存在一些通过牺牲别人而获利的现象，因此该领域比其他领域更容易发生道德风险，也就更有强调伦理性的必要。相比诚信的缺失、正义的伦理缺失更隐蔽，危害后果更大。因此，我们不仅要对资本市场诚信缺失进行规制，更要加强对正义缺失的规制，加强资本市场伦理与道德建设，为资本市场体系寻找支撑点或基石。 电喷雾离子源，正负离子扫描模式，进样电压和碰撞电压分别为10 000、40 V和6 eV。离子源温度和去溶剂温度分别为120 ℃和500 ℃，载气流量900 L/h，质谱扫描范围m/z 50～1 000，扫描时间和间隔时间分别为：0.1 s和0.02 s。 1.4 数据分析数据预处理在进行模式识别之前，原始数据经代谢组学处理软件QI（Waters，Milford，USA）进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐和归一化，最终得到一个保留时间、质荷比和峰强度的数据矩阵，并与Metlin、HMDB、本地库等谱库进行对比，对物质进行定性。 随着科学技术的进步，我们身边的电子产品越来越智能化了，基于国家近来科学技术的发展，我们进行无线充电自动小车的设计，率先实现远距离充电。本研究以线圈为基础，通过线圈在通电时产生电磁感应现象，将能量传递给次级线圈，进一步给法拉电容充电，充电时间通过单片机控制，预设的充电时间一到，法拉电容放电，驱动小车前进。该系统变得更加智能化，不需要人为干预，减少人力、财力。 所有数据用 ±s的形式表示，采用SPSS 17.0进行统计分析，Excel进行绘图分析。 2 结果与分析2.1 CFS和CFE对DPP-4的抑制力表 2 益生菌对DPP-4的抑制率
Table 2 DPP-4 inhibitory rates of probiotics  菌株 DPP-4抑制率/%CFE CFS 0.001 mol/L西格列汀（阳性对照） 32.33±0.009 7 1.6970 -4.21±3.593 1.66±3.260 ST-2 6.73±1.936 20.78±1.977 ZNJ05 5.10±2.085 5.80±1.383 1.1881 9.55±1.364 10.58±2.197 GS-3 0.25±0.694 7.75±1.086 BLP12 3.05±1.646 27.09±0.009 1
由表2可以看出，阳性对照组对DPP-4的抑制率最高，为32.33%；除菌株1.6970外，其余菌株的CFE均对DPP-4有较弱的抑制作用，抑制活性最强的为菌株1.1881，但抑制活性仅为9.5%左右。6 株菌株的CFS对DPP-4均具有抑制活性，而且除菌株1.6970外其余菌株的CFS抑制率都比其CFE的抑制率高；其中植物乳杆菌BLP12的抑制率最高，抑制率为27%左右，其次是ST-2；对于菌株1.6970不论是CFS还是CFE其抑制率都是最低的，所以选择其作为抑制活性最高菌株BLP12的对照菌株。Panwar等[12]从婴儿粪便中分离出15 株乳酸菌，并对比了乳酸菌、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌对DPP-4的抑制率，研究结果发现从婴儿粪便中分离的乳酸菌对DPP-4的抑制力最高，抑制率达25%，而对照菌株对DPP-4的抑制率均很弱，有些甚至有促进作用。本实验所选菌株的CFS中具有良好的DPP-4抑制能力；而CFE中不含或含有极少的该类抑制物，所以选取BLP12的CFS做下一步的研究。 2.2 不同萃取溶剂CFS萃取物对DPP-4抑制活性的影响 图 1 不同有机溶剂CFS萃取物对DPP-4的抑制率
Fig. 1 DPP-4 inhibition rates of extracts obtained with different organic solvents
经有机溶剂萃取后，甲醇和丙酮与水互溶形成的萃取液不分层，石油醚和乙酸乙酯与水不溶或部分溶解，所以形成的萃取液分为上下两层，上层为有机相部分，下层为水相部分。从图1可以看出，对于植物乳杆菌1.6970，本实验所选用的有机溶剂的萃取液对DPP-4均有抑制活性，其中甲醇、丙酮、乙酸乙酯萃取液水相部分对DPP-4的抑制活性较高，而且均高于原液；石油醚萃取液水相部分和有机相部分、乙酸乙酯萃取液有机相部分的抑制活性低于原液，石油醚萃取液水相部分对DPP-4的抑制活性最弱，抑制率仅有3%左右；对于植物乳杆菌BLP12，除石油醚外其他有机溶剂的萃取液对DPP-4均有抑制作用，其中乙酸乙酯萃取液水相部分对DPP-4的抑制活性最高，显著高于原液，抑制率高达50%左右；其次是丙酮萃取液，抑制率为27%左右；甲醇、乙酸乙酯萃取液有机相部分的抑制活性均低于原液；石油醚萃取液对DPP-4没有抑制作用，反而有促进作用。 通过图1可以看出，植物乳杆菌BLP12的乙酸乙酯萃取液水相部分对DPP-4的抑制活性最高，所以最终选择乙酸乙酯作为萃取剂。 2.3 CFS萃取液的分级分离及其分离组分的DPP-4抑制活性 图 2 CFS萃取液不同分子质量组分对DPP-4的抑制率
Fig. 2 DPP-4 Inhibition rates of fractions with different molecular masses
如图2所示，样品经过不同分子质量的分级后，所得部分的抑制率均有所下降。植物乳杆菌1.6970不同分子质量大小的CFS对DPP-4均具有抑制活性，其中分子质量小于5 kDa的样品抑制活性最强，分子质量大于10 kDa和5～10 kDa的样品的抑制活性较弱，因此推测具有DPP-4抑制作用的物质分子质量小于5 kDa。植物乳杆菌BLP12不同分子质量大小的CFS对DPP-4均具有抑制活性，而且均比1.6970的抑制活性高；分子质量小于5 kDa的CFS的抑制活性远大于分子质量5～10 kDa，因此，推测植物乳杆菌BLP12的CFS中抑制DPP-4的活性物质主要为小于5 kDa的物质。这与Huang等[22]研究结果一致，其发现在猪皮明胶的水解产物中分子质量在1～1.25 kDa之间的物质对DPP-4的抑制率最高，达35%。分析降糖物质可能大多数为小分子物质。  图 3 植物乳杆菌1.6970（a）和BLP12（b）凝胶色谱柱分离图
Fig. 3 Chromatographic separation profiles of metabolites of Lactobacillus plantarum 1.6970 (a) and BLP12 (b) on Superdex peptide column
将超滤后分子质量小于5 kDa的溶液进行收集，并利用Superdex peptide层析柱对样品进行进一步分离纯化。从图3可以看出，植物乳杆菌1.6970分出9 个组分，BLP12分出10 个组分，对每个组分进行收集，并标记1.6970的9 个组分为A-1～A-9，BLP12的10 个组分为B-1～B-10。测定各个组分的DPP-4抑制活性。  图 4 柱层析各个组分对DPP-4的抑制率
Fig. 4 DPP-4 inhibition rates of fractions separated by column chromatography
如图4所示，植物乳杆菌1.6970的所有组分对DPP-4均具有抑制活性，但抑制活性都较弱，其中抑制活性较高的有A-4，经过2 次柱子的稀释后仍具有14%抑制率。对于BLP12菌株，收集到的10 个组分均具有抑制活性，且每个组分的抑制活性都较高，其中组分B-5的抑制活性最高，抑制率高达46%，比原液的抑制率高19%；其次是组分B-9，抑制率为37%。所以最终选择植物乳杆菌BLP12的组分B-5和组分B-9进行下一步的分离纯化。  图 5 B-9（a）和B-5（b）半制备液相色谱分离图
Fig. 5 Semi-preparative liquid chromatograms of B-9 (a) and B-5 (b)
将样品B-5和B-9用半制备高效液相色谱进行进一步分分离纯化，如图5所示，B-5分离出4 个组分，分别记为B-5-1、B-5-2、B-5-3、B-5-4；B-9分离出2 个组分，分别记为B-9-1和B-9-2。对分离得到各个组分进行收集并测定对DPP-4的抑制率，以便选择最终进行质谱鉴定的样品。 在网络语言实际运用的过程中，青少年成为十分重要的主体，也是受到影响比较大的一类人群。因此，学校要做出相应的努力，为汉语言文学的发展提供有力保障。学校应该加强汉语言文学教育，让学生拥有较强的汉语言素养。学校在实际教学中可以购进关于汉语言文学的书籍，供学生在课余时间进行阅读。另外，还应该组建教师研讨会，针对现阶段的汉语言文学发展状况进行分析和研究，为制订出良好的教学计划而做准备。教师在进行教学的过程中，要为学生提供更多的机会，让学生发表自己的看法，展现出较强的表达能力。通过多种活动形式，开展诗歌朗诵、作文竞赛和演讲活动等，让学生参与课堂的积极性和主动性得到提升，引导学生合理运用网络语言。  图 6 半制备液相各组分对DPP-4的抑制率
Fig. 6 DPP-4 inhibition rate of subfractions separated from B-9 and B-5
从图6可以看出，组分B-9-1的抑制活性很低，组分B-9-2没有抑制活性；B-5经分离得到的4 个组分除B-5-4外，其余组分都有较弱的抑制活性，B-5-3的抑制活性最高，抑制率为8%左右。尽管组分B-5-3的抑制活性最高，但是由于样品经过多次分离纯化，已经被稀释很多倍，样品中可以抑制DPP-4的活性物质含量已十分稀少，所以在进行下一步的质谱鉴定前，将样品用冷冻浓缩机进行浓缩。 2.4 质谱鉴定结果表 3 质谱鉴定的物质
Table 3 Metabolites of strain BLP12 identified by LC-MS-MS  序号 名称 相对分子质量1 3,5-二-叔丁基-4-羟基苯甲醛 234.161 98 2反式-3-吲哚丙烯酸 187.063 33 3鸟嘌呤 151.049 41 4腺嘌呤 135.054 5 5邻苯二甲酸二丁酯 278.151 81 6次黄嘌呤 136.038 51 7烟酸 123.032 03 8胞嘧啶 111.043 26 9甜菜碱 117.078 98 10 吲哚-3-丙烯酸 187.063 33 11 乙酰胆碱 145.110 28 12 缬草脯氨酸 214.131 74 13 鸟苷一磷酸 363.058 14 聚乙二醇 458.272 71 15 2,5-二叔丁基对苯二酚 222.161 98 16 亮氨酸脯氨酸 228.147 39 17 腺苷 267.096 75 18 腺苷3’5’-环一磷酸 329.052 52 19 吲哚-3-乳酸 205.073 89 20 邻苯三酚 414.204 24 21 三苯基膦氧化物 278.086 05 22 邻苯二甲酸二异丁酯 278.151 81 23 3,4-二羟基苯基丙酸 182.057 91 24 肉豆蔻基硫酸盐 294.186 48 25 L-焦谷氨酸 129.042 59 26 别嘌呤醇 136.038 51 27 2,6-二-叔丁基-1,4-苯醌 220.146 33 28 4-香豆酸 164.047 34 29 N,N’-二环己基脲 224.188 86 30 DL-赖氨酸 146.105 53 31 吡啶甲酸 123.032 03 32 D-(＋) - 焦谷氨酸 129.042 59 33 L-谷氨酸 147.053 16 34 2-羟基肉桂酸 164.047 34 35 16-羟基十六烷酸 272.235 14 36 亮氨酸 131.094 63 37 4-十二烷基苯磺酸 326.191 57 38 L-苯丙氨酸 165.078 98 39 脯氨酸 115.063 33 40 L-正亮氨酸 131.094 63 41 异亮氨酸 131.094 63 42 腺苷5’-一磷酸 347.063 08 43 十二甲基环己烷 444.112 75 44 DL-色氨酸 204.089 88 45 十二烷基硫酸盐 266.155 18 46 邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯 278.151 81 47 (15Z)-9,12,13-三羟基-15-十八碳烯酸 330.240 62 48 二苯甲酮 182.073 16 49 柠檬酸 192.027 50 L-赖氨酸 146.105 53 51 DL-正亮氨酸 131.094 63 52 腺苷二磷酸 427.029 41 53 芥酸酰胺 337.334 47 54 油酸酰胺 281.271 86 55 十二烷二酸 230.151 81 56 环(苯丙氨酸-脯氨酸) 244.121 18 57 2,4-二甲基苯甲醛 134.073 16 58 9(Z),11(E),13(E) - 十八碳三烯酸甲酯 292.240 23 59 尿嘧啶 112.027 28 60 (15Z)-9,12,13-三羟基-15-十八碳烯酸 330.240 62 61 曲酸 142.026 61
植物乳杆菌BLP12的细胞代谢物经分离纯化后用高效液相色谱-质谱联用仪鉴定代谢物中的物质种类，共鉴定出61 种物质，表3为鉴定出的物质名称以及相对分子质量。 2014年，按照党的十八届三中全会精神，注重发挥市场在配置资源的决定性作用，进一步完善局属国有资产管理体制，按照股权清晰、运行规范、风险可控的原则，启动实施产业发展三次改革，做实“新华控股”；按照促进经济、业务高度融合的要求，做好“国泰实业”；按照现代企业制度要求，完善法人治理结构，做优“新华发电”、做强“中国水务”、做活“万家寨公司”；充分发挥现有水利投融资平台的积极作用，深化落实2011年中央1号文件精神，全面提升服务水利投融资体制机制建设的能力和水平。 3 讨论与结论本研究测定6 株益生菌的细胞代谢物和细胞内容物的DPP-4抑制作用，结果显示植物乳杆菌BLP12的细胞代谢物对DPP-4的抑制效果最为显著，将BLP12的代谢物进行分离纯化并用高效液相色谱-质谱联用仪检测样品中物质种类，最终得到61 种物质，经查证其中11 种物质与治疗糖尿病相关，其中有4 种DPP-4抑制剂，其余7 种与治疗糖尿病相关物质。这11 种物质分别是十二烷基硫酸盐、烟酸、环(苯丙氨酸-脯氨酸)、亮氨酸脯氨酸、十二烷二酸、吡啶羧酸、十八碳三烯酸、别嘌呤醇、鸟嘌呤、邻苯三酚、曲酸。 早在2006年，Ellison等[23]发现(2R)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[l,2,4]三唑[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-l-(2,4,5-三氟苯基)丁胺的十二烷基硫酸盐是DPP-4的有效抑制剂，可用于治疗II型糖尿病；Miyamoto等[24]在烟酸的衍生物中发现了DPP-4抑制剂；Garg等[25]在1990年就发现烟酸可以治疗二型糖尿病的血脂异常；同时烟酸类药物还可以通过升高高密度脂蛋白、降低血浆甘油三酯和低密度脂蛋白等作用来调节糖尿病人的血脂异常情况[26]；有研究表明，具有xaa-pro序列（xaa代表氨基酸）的二肽可以作为DPP-4抑制剂；所以环(苯丙氨酸-脯氨酸)和亮氨酸脯氨酸是可能的DPP-4抑制剂。 十二烷二酸可以降低机体对葡萄糖摄取和氧化，改善糖尿病患者的代谢不灵活。Mingrone等[27]发现十二烷二酸可以通过底物竞争机制降低胰岛素诱导的葡萄糖摄取和氧化，从而节省葡萄糖利用和增加糖原贮存；同时Salinari等[28]发现十二烷二酸在促进脂肪氧化的同时不刺激胰岛素分泌，这意味着对于II型糖尿病患者，可以减少胰岛素诱导的葡萄糖摄取和氧化，从而节省葡萄糖的利用和增加糖原的贮存。吡啶羧酸与麦芽酚、L-苏氨酸的复合物具有降血糖的作用。Kojima[29]每日向小鼠腹腔注射麦芽酚、L-苏氨酸和吡啶酸锌（II）复合物，14 d后测定其口服葡萄糖耐量和HbA1c水平，发现糖尿病情况有所改善。十八碳三烯酸可以激活脂肪细胞过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR）γ[30]。已知过氧化物酶体增殖剂激活受体活化剂具有有效的抗高血糖活性，用于治疗糖尿病相关的胰岛素抵抗。因此，许多天然和合成的PPARγ激动剂被用于治疗葡萄糖疾病。别嘌呤醇具有降低II型糖尿病患者蛋白尿的作用，Momeni等[31]通过向实验者给予别嘌呤醇（100 mg/d），发现在接受药物治疗4 个月后，受试者的血清尿酸水平尿蛋白水平显著降低，因此，别嘌呤醇可作为糖尿病肾病患者经济有效的辅助治疗。邻苯三酚可以抑制α-葡萄糖苷酶，Zheng Li等[32]通过动力学模拟实验发现邻苯三酚可以竞争性的与α-葡萄糖苷酶的活性位点相连接来抑制α-葡萄糖苷酶的活性。 前面是一堵光秃秃的围墙，围墙下有一棵大榕树。在榕树前左拐，再往前走几步，就是另一条繁华大街，街上人来人往，要再跟踪一个人，恐怕不容易。雪萤快步走去，却见墨镜男突然从树后冒出来，堵住了她的去路。那人迅速侵上来，把雪萤拽上了一辆黑色轿车。 从植物乳杆菌BLP12的代谢物中分离出的这些物质充分说明，植物乳杆菌不仅具有抑制DPP-4的作用，还可以通过其他多种方式改善糖尿病的症状。 参考文献： [1] 曹国颖, 李晓翠, 赵楠, 等. 二肽基肽酶Ⅳ抑制剂在治疗2型糖尿病的临床研究进展[J]. 中国新药杂志, 2011(6): 497-502. 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Isolation, Purification and Identification of Dipeptidyl Peptidase-4 Inhibitor from Lactic Acid Bacterial Metabolite DONG Jie1, LIU Lu2, JIA Chengli3, ZHU Junling1,*, LÜ Jiaping3,*
(1. College of Food Science and Engineering, Shanxi Agriculture University, Jinzhong 030800, China;2. Engineering Research Centre of System-Nutrition, Beijing Institute of Nutrition Resources, Beijing 100069, China;3. Institute of Food Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China) Abstract: In this study, the metabolites of Lactobacillus plantarum BLP12 with inhibitory activity against dipeptidyl peptidase-4 (DPP-4) were separated and purified by organic solvent extraction, ultrafiltration membrane, gel chromatography and high performance liquid chromatography. The substrate N-glycyl-prolyl-p-nitroanilide hydrochloride (Gly-Pro-pNA) was applied to determine DPP-4 activity based on the strong absorption at around 405 nm of the degradation product of Gly-PropNA. The fraction with strong inhibitory activity was selected for chemical composition analysis by liquid chromatography tandem mass spectrometry. A total of 61 substances were identified including dodecyl sulfate, which has been reported as a DPP-4 inhibitor. Keywords: lactic acid bacteria; metabolite; dipeptidyl peptidase-4; inhibition activity
收稿日期：2019-04-11 基金项目：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项 （S2016JC01） *通信作者简介： 朱俊玲（1978—）（ORCID: 0000-0003-0796-6783），女，副教授，硕士，研究方向为功能化杂粮食品的研发。E-mail: pheobe78@163.comDOI:10.7506/spkx1002-6630-20190411-138 中图分类号：TS252.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2020）08-0116-07 引文格式： 董杰, 刘鹭, 甲承立, 等. 乳酸菌代谢物中二肽基肽酶-4抑制剂的分离纯化及鉴定[J]. 食品科学, 2020, 41(8): 116-122.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190411-138. http://www.spkx.net.cnDONG Jie, LIU Lu, JIA Chengli, et al. Isolation, purification and identification of dipeptidyl peptidase-4 inhibitor from lactic acid bacterial metabolite[J]. Food Science, 2020, 41(8): 116-122. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190411-138. http://www.spkx.net.cn2.3.1 蕹菜产量 从图2看出，处理1、处理2的蕹菜总产量比CK高，增幅分别为19.95%和14.95%。处理1各次采收产量均高于CK，处理2除第1次采收产量显著低于CK外，其余均高于CK，可能是秸秆加量覆盖并且前期快速腐解消耗了过量N从而抑制蕹菜生长，也有可能是加量的秸秆前期腐解速度较快产生过多养分导致了肥害。水稻秸秆覆盖处理的产量从第3次采收起均显著高于CK，可能是秸秆腐解中后期养分开始缓慢释放所致。第1次采收处理2的蕹菜产量显著低于处理1，其余采收次数间差异不显著，但第6次、第7次处理2的产量均高于处理1，说明随着覆盖量的增加秸秆腐解释放养分更持久。
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