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Streptomyces septatus磷脂酶D在毕赤酵母中的重组表达及酶学性质分析Streptomyces septatus磷脂酶D在毕赤酵母中的重组表达及酶学性质分析 黄 琳，马杰莹，王 爽，王 楠，MORADANA GAMAGE Rasadi Sajeewa Rajakaruna，路福平，刘逸寒* （工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457） 摘 要：以Streptomyces septatus TCCC 21057基因组为模板，扩增得到磷脂酶D（phospholipase D，PLD）基因（pld），经合成获得pld密码子优化基因（pldm），以pPIC9K为表达载体，毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115为宿主菌株，构建获得毕赤酵母重组菌株GS115/pPIC9K-pldm，摇瓶发酵后获得的重组PLD（rPLDM）转酯活力达2.37 U/mL；rPLDM经纯化后进行转酯酶学性质分析，其最适作用温度为60 ℃，最适作用pH值为6.5；在单水相反应体系中，40 ℃、pH 6.5、Ca2＋浓度10 mmol/L、大豆磷脂酰胆碱和L-丝氨酸物质的量比1∶10、rPLDM添加4.0 U/mL，反应6 h后，磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）的产率可达到33%。本研究通过对rPLDM的重组表达、转酯酶学性质及催化合成PS的研究，为进一步实现酶法合成新资源食品PS奠定了基础。 关键词：链霉菌；磷脂酶D；毕赤酵母；表达；酶学性质；磷脂酰丝氨酸 磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）是一种磷脂成分，其可通过直接作用于膜内蛋白质和膜相关蛋白质参与多个代谢过程[1-2]，因此，PS具有多种生理功能，如提高脑细胞活力、改善记忆力、修复大脑损伤、缓解疲劳以及平衡情绪等[3-4]，不仅可以预防和治疗老年痴呆症，同时对脑萎缩、儿童多动症和抑郁症等的治疗也具有显著效果[5-7]，被称为“脑专一性营养物质”[8]。目前，PS已通过了美国食品药品监督管理局的安全认证，也已被我国原卫生部（现国家卫生健康委员会）批准为新资源食品之一[9]。因此，随着我国大健康产业的发展，将具有多种生理功能的PS应用于食品、保健品中市场潜力巨大。当前，PS的制备主要有提取法和生物酶转化法，提取法主要以动物的大脑和肝脏以及大豆为原料，提取工艺复杂、原料利用率及纯度低，且从动物组织中提取的PS也存在着一定的安全隐患[1,10]；而生物酶转化法主要是由磷脂酶D（phospholipase D，PLD）催化天然卵磷脂，即磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）和L-丝氨酸合成PS，具有绿色环保、反应条件温和、规模化生产简单等优点，具有很好的开发应用前景[4,11]。 PLD（EC 3.1.4.4）可催化2 种反应：一是水解反应，水解磷脂分子中的磷酸二酯键生成磷脂酸和羟基化合物；二是转磷脂酰反应（即转酯反应），催化磷脂分子末端极性基团与另一种含羟基化合物发生反应，生成一种新的磷脂[12]。PLD的转酯作用对磷脂的功能改性尤为重要，其可将含量丰富的PC催化合成为其他的稀有磷脂，如PS、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇等[13]。由此可见，利用PLD酶法合成稀有磷脂可解决功能食品开发对高品质磷脂的迫切需求，推动我国食品产业的发展。 西南巴伦支海的麻坑主要集中在 Asterias复合断裂带附近和Hammerfest盆地（图5）两个地带，麻坑平均密度是 100个/km2，呈随机分布或者沿着冰川犁痕排列分布，主要形成于冰川后退期，是冰川作用前期的结果。圆形麻坑的直径在10 ～ 50 m，平均深度为1 ～ 3 m，可划分为“标准麻坑”[19]。更大、且形状不规则的麻坑，直径达到 300 m，深度达到25 m。此外，还可以观察到海底表面深度达到15 m的冰川犁痕（图6）。 PLD广泛存在于植物、动物及微生物中[14]。与动植物来源的PLD相比，微生物来源的PLD易于分离、提取及生产。至今已报道的产PLD的微生物种类主要有链霉菌属（Streptomyces）[15]、棒状杆菌属（Corynebacterium）[16]、假单胞菌属（Pseudomonas）[17]、芽孢杆菌属（Bacillus）[18]、大肠杆菌（Escherichia coli）[19]等。与其他来源PLD相比，链霉菌来源的PLD表现出较强的转酯能力以及更为广谱的底物选择性[13]，因此，国内外对其研究较为广泛。Lee等[20]实现了Streptomyces sp.YU100来源PLD在大肠杆菌中的异源表达，证明其具有转酯活性；Zambonelli等[21]将Streptomyces PMF的PLD在大肠杆菌中表达，发现其水解活性的最适温度为60 ℃、最适pH值为8.0；Nakazawa等[22]分离筛选获得1 株产PLD的Streptomyces racemochromogenes 10-3，经发酵纯化后测定其酶学性质，发现其在温度50 ℃、pH 7.5时水解活力最高；Moon等[23]从土壤中分离得到了1 株产PLD的菌株Streptomyces sp. p821，经发酵纯化后，测定其水解活性最适温度和pH值分别为55 ℃和6.0，其转酯活性最适温度和pH值分别为30 ℃和5.0，表明水解和转酯反应的最适条件并不相同。由此可见，国内外对链霉菌PLD主要集中在基因筛选和水解活性评估的研究中。另外，野生型链霉菌发酵制备PLD周期长且产量低，限制了其在磷脂改性方面的应用。因此，实现对PLD的高效制备则尤为重要，但目前对于链霉菌来源PLD的异源表达主要是在大肠杆菌中进行，获得的重组PLD一般为胞内蛋白，后期分离纯化较为困难，且容易形成包涵体，难以进一步实现PLD的高水平表达。Zhou Wenbin等[24]将Streptomyces mobaraensis来源PLD在大肠杆菌中进行异源表达，经细胞破碎水解活力达到0.5 U/mL；Iwasaki等[25]在大肠杆菌中获得Streptomyces antibioticus来源PLD包涵体，经复性后水解活力达0.2 U/mL。为提高PLD的表达水平，研究者尝试利用其他表达系统进行研究：Hou Haijuan等[26]通过核糖体结合位点、启动子及信号肽的筛选等，实现了Streptomyces sp.来源pld基因在Corynebacterium glutamicum中的异源表达，水解活力达到1.9 U/mL；Ogino等[27]将Streptoverticillium cinnamoneum来源pld基因在Streptomyces lividans中进行表达，水解活力为55 U/mL；Tao Xinyi等[28]进一步利用S. lividans中的诱导/组成型双启动子表达系统，实现Streptomyces halstedii的PLD水解活力达到68.33 U/mL。但是，到目前为止，围绕毕赤酵母表达链霉菌来源PLD的报道仍较少。毕赤酵母作为常用的蛋白表达系统，具有产物表达效率高、生产安全无病原体、启动子强度大、外源基因遗传稳定及外源蛋白可正确翻译后修饰等特点及优势[29-30]，已成功实现了多种蛋白的表达[31]。 因此，本研究利用毕赤酵母表达系统，对实验室保存的Streptomyces septatus TCCC 21057来源的PLD进行异源表达和转酯活性的酶学性质分析，在此基础上，对其在单水相中催化大豆PC和L-丝氨酸合成PS的条件进行优化，以期为酶法安全高效稳定制备PS奠定基础，进一步促进PS在我国食品工业中的应用。 1 材料与方法1.1 材料与试剂S. septatus TCCC 21057、克隆宿主E. coli JM109、表达宿主Pichia pastoris GS115、大肠杆菌-毕赤酵母穿梭质粒pPIC9K（＋）均为本实验室保藏。基于毕赤酵母密码子偏爱性，优化含有S. septatus TCCC 21057来源的PLD基因（pld），所用重组质粒pUC57-pldm由苏州金唯智生物科技有限公司合成。 据统计，2017年我国城镇化率已达58.52%，农业转移到城镇的人口日益成为城市建设的重要参与者，也是培育农业农村发展新动能、推动农业农村现代化的重要探索者。实施乡村振兴战略，加快推进农业农村现代化，不仅能够推动广大农民在共建共享发展中实现更多获得感、幸福感和安全感，而且有利于更好践行“以人民为中心”的发展思想。[3] 1.1.2 试剂 Pyrobest DNA聚合酶、1 kb DNA Marker、限制性内切酶EcoRI和NotI、solution I Kit 宝生物工程（大连）有限公司；细菌基因组试剂盒、质粒小提试剂盒和切胶回收试剂盒 美国Omega BioTek有限公司；氨苄青霉素（ampicillin，Amp） 北京索莱宝科技有限公司；镍亲合树脂（Ni-NTA） 德国Qiagen公司；胰蛋白胨和酵母提取物 美国Thermo Fisher Scientific有限公司；大豆卵磷脂（PC＞90%） 上海源叶生物科技有限公司；L-丝氨酸、胆碱氧化酶、过氧化物酶、PS 美国Sigma-Aldrich股份有限公司；其他试剂均为国产分析纯。 （2）Accordingtothenewmarket research report,the price of sewing machines has gone down since last year.Some countries are actually lowering their price.Under such circumstance,it is impossiblefor ustoaccept your price. 1.1.3 培养基 LB（Luria-Bertani）固态培养基：酵母提取物5.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，琼脂15.0 g/L；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）固态培养基：酵母提取物10.0 g/L，蛋白胨20.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，琼脂20.0 g/L；甘油缓冲复合（buffered glycerol-complex，BMGY）培养基：蛋白胨20.0 g/L，酵母粉10.0 g/L，酵母基础氮源（yeast nitrogen base，YNB）培养基13.4 g/L，生物素0.4 mg/L，甘油10.0 mL/L、磷酸缓冲液100 mmol/L（pH 6.0）；缓冲甲醇复合培养基（buffered methanol-complex，BMMY）培养基：蛋白胨20.0 g/L，酵母粉10.0 g/L，YNB 13.4 g/L，生物素0.04 g/L，甲醇10.0 mL/L（每日补加），磷酸缓冲液100 mmol/L（pH 6.0）；基础葡萄糖（minimal dextrose，MD）培养基：葡萄糖20.0 g/L，琼脂15.0 g/L，YNB 13.4 g/L，生物素0.04 g/L。 总之，作为转型期中国社会的“表征”，中国当代都市电影围绕消费主义语境下人们的精神处境设置矛盾、展开叙事，对人们的身份认同危机进行了饶有意味的表达。 1.2 仪器与设备回旋式恒温调速摇床、恒温培养箱 上海智城分析仪器制造有限公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）基因扩增仪 德国Eppendorf有限公司；全自动凝胶成像仪 英国Syngene有限公司；电转仪、电泳仪和电泳槽 美国Bio-Rad有限公司；冷冻离心机 美国Thermo Fisher Scientific有限公司；1260型高压液相色谱（high pressure liquid chromatography，HPLC）仪 美国Agilent Technologies有限公司。 1.3 方法1.3.1 pld基因的克隆及密码子优化 参考已报道S. septatus来源的pld基因序列信息设计引物，引物序列为：上游引物P1：GATTCCGCCGACGGC；下游引物P2：GCCCTGGCAGAGGCC。 1.1.1 菌株与质粒 以S. septatus TCCC 21057基因组为模板，P1和P2为引物，进行PCR扩增。扩增条件为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min 40 s，30 个循环；72 ℃延伸10 min。将PCR扩增产物进行测序后，获得pld序列，根据毕赤酵母密码子偏爱性优化该基因，获得pld密码子优化基因pldm。 1.3.2 重组质粒pPIC9K-pldm的构建 提取pUC57-pldm和pPIC9K（＋）质粒，使用EcoRI和NotI对两者进行双酶切处理，经凝胶电泳后采用切胶回收试剂盒对目的酶切产物进行回收，使用solution I Kit进行pldm和pPIC9K（＋）的连接反应，并转化感受态E. coli JM109克隆菌株中，利用LB-Amp平板筛选重组子，挑取阳性转化子进行培养，提取质粒进行双酶切验证，验证正确的重组质粒命名为pPIC9K-pldm，将重组菌株-80 ℃甘油保藏备用。 1.3.3 重组质粒转化毕赤酵母GS115 将构建好的重组质粒pPIC9K-pldm经SacI线性化后电转表达宿主毕赤酵母GS115感受态细胞，电转条件1.5 kV、5 ms，然后快速加入1 mL 1 mol/L的预冷山梨醇，于30 ℃、220 r/min培养1.5 h，离心收集菌体，利用100 µL山梨醇重悬菌体，涂布于MD平板，培养2～3 d，待其长出转化子后，再将MD平板上生长的阳性克隆子分别点接种含G418（抗性梯度分别为0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL）的YPD平板上，进行多拷贝重组菌筛选。可在2.0 mg/mL的YPD-G418平板上正常生长的菌落即为高拷贝整合菌株，挑取平板上长出的转化子，接种于含有5 mL YPD培养基的试管，30 ℃培养24 h。收集菌体，利用真菌基因组提取试剂盒提取基因组，经pPIC9K通用引物进行PCR鉴定，验证pldm是否整合到毕赤酵母GS115的染色体上，验证正确的重组菌株即为GS115/pPIC9K-pldm。 1.3.4 重组PLD（rPLDM）在毕赤酵母中的诱导表达 挑取GS115/pPIC9K-pldm单克隆菌落接种于液体YPD培养基中，220 r/min、30 ℃培养24 h。当种子液的OD600 nm达到2.0～6.0，取1.0 mL接种于50 mL的BMGY培养基中，相同条件培养24 h。然后4 ℃、8 000 r/min离心10 min收集菌体，弃去上清液，用无菌水清洗后，转移至50 mL BMMY培养基中，每隔12 h补加250 µL甲醇诱导培养，培养144 h后，收集发酵上清液，即得到rPLDM酶液。在相同条件下，发酵转入空质粒的菌株GS115/pPIC9K作为空白对照。 英格兰校园足球协会主要负责全国、地方性的校园比赛组织工作，在各级校园中推广足球运动。各个校园足球学校需要根据日常上课、踢球情况，与家长商量孩子未来发展之路。 1.3.5 rPLDM的纯化 将发酵上清液使用0.22 µm滤膜过滤后，与Ni2＋琼脂糖树脂在4 ℃进行特异性结合1～2 h，然后转移至经20 mL裂解缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，pH 7.4）平衡的Ni-NTA His层析柱。过柱后，用20 mL裂解缓冲液漂洗镍柱，然后用10 mL的洗涤缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，50 mmol/L咪唑，pH 7.4）洗涤杂蛋白，最后用10 mL洗脱缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，pH 7.4）对目的蛋白进行洗脱，收集滤过液，即为纯化的rPLDM。将纯化后的蛋白进行12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）检测。 1.3.6 rPLDM转酯活力检测 10 mL 0.2 mol/L醋酸钠缓冲液（pH 5.5），1.3 mmol/L PC，3.9 mmol/L L-丝氨酸和10 mmol/L CaCl2，将其装在25 mL的锥形烧瓶中，40 ℃水浴保温10 min，将一定稀释倍数的发酵上清液（1 mL）加入到反应混合液中，40 ℃反应30 min。反应结束后将其加入20 mL的氯仿-甲醇（2∶1，V/V）混合溶液，对PS进行萃取。转酯活力定义：每分钟PLD催化PC生成1 μmol PS所需的酶量为一个酶活力单位。转酯活力计算如式（1）所示： 
式中：mPS为PS产量/μg；n为稀释倍数；t为反应时间/min；MPS为PS摩尔质量（792.081 g/mol）。 除给予适当的镇静治疗外，还要有一个舒适的睡眠环境。不要反复搬动宝宝，避免惊吓，防止因宝宝抵抗力差而继发细菌感染。安置在阳光充足的房间，保持室内整洁，室温保持在18～22℃，湿度50%～60%，空气要新鲜，定时开窗通风换气，使空气流动和清洁，保持房间安静。房间内不放置花草，尽可能避免加重喘息发作。 HPLC检测：萃取10 h后，取下层溶液并用0.22 µm滤膜过膜除杂质。然后用高效液相色谱检测PS，流动相为乙腈-甲醇-磷酸（95∶5∶0.8，V/V），硅胶柱为Venusil XBP Silica（2.1 mm×150 mm，5 μm），柱温为25 ℃，流速为0.3 mL/min，紫外检测波长为205 nm，进样量为10 μL。配制不同质量浓度的PS（0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1 mg/mL）标准品，对不同浓度的PS标准品进行HPLC检测，以PS浓度为横坐标，响应面积为纵坐标，绘制PS浓度标准曲线，并计算出回归方程。最后通过标准曲线计算出PS含量。 如何让员工拥有工作幸福感，是让企业具备持续发展动力的先决条件。理性、科学地提升员工的幸福度，可以发挥有限资源的最大效益。在现阶段，有效提升员工的幸福指数应从以下路径入手： 1.3.7 rPLDM转酯酶学性质分析 rPLDM最适温度测定：将反应液体系分别置于30、40、50、60、70 ℃进行酶活力测定。每组测3 个平行，将最高酶活力作为100%，以相对酶活力作图。 rPLDM最适pH值测定：将rPLDM分别在不同pH值（4.0、5.0、6.0、6.5和7.0）下进行酶活力的测定。每组测3 个平行，将最高酶活力作为100%，以相对酶活力作图。 “实践锻炼法是思想政治教育的主要方法之一，马克思主义认识论和实践观认为，社会实践是人的思想形成发展的源泉和动力，也是检验人的思想是否正确的唯一标准。”并且实践锻炼的方式方法多种多样，应根据受教育者的年龄、职业以及思想状况来确定教育的形式与内容。大学生正处于生理与心理走向成熟的关键时期，这个阶段所形成的认识与习惯会直接影响到其后续的发展。 金属离子：在反应混合液中分别加入终浓度为10 mmol/L的FeCl3、FeSO4、CuCl2、ZnCl2、NaCl、KCl、MnCl2、MgCl2和CaCl2，检测rPLDM酶活力，以无任何金属离子添加的作为空白对照，设置值为100%，以相对酶活力作图。 1.3.8 PS的制备条件优化 为获得理想的rPLDM催化PC和L-丝氨酸高效合成PS的条件，分别对反应体系中底物物质的量比和加酶量的条件进行了优化。200 mL 0.2 mol/L醋酸钠缓冲液（pH 6.5）中，含有不同物质的量比的L-丝氨酸和PC（5∶1、10∶1、15∶1、20∶1和25∶1）、10 mmol/L CaCl2和3.0 U/mL rPLDM，40 ℃水浴，在旋转振动器中200 r/min反应6 h，研究底物物质的量比对催化合成PS的影响，确定最佳反应的底物物质的量比；在最佳底物物质的量比条件下，加入不同酶量（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 U/mL）的rPLDM进行催化反应，研究酶量对合成PS的影响，确定最佳rPLDM用量。最后采用HPLC法分析PS生成量，利用PS的标准曲线计算PS产率，如式（2）所示： 
1.4 数据处理与分析每组实验独立重复3 次，所得数据表示为 ±s。利用SPSS 18.0软件对实验结果进行统计分析（One-way ANOVA），利用邓肯式多重比较对差异显著性进行比较分析，P＜0.05，差异显著。折线图采用Origin 8.0软件进行绘制。 [3]IFTHEYREALLYWANTTOGETTHEYOUTHS’ATTENTION,THENEXTSINGLESHOULDBE“STRAIGHT OUTTA BEIJING”（ibid.） 2 结果与分析2.1 目的基因扩增及密码子优化以S. septatus TCCC 21057基因组为模板，引物P1和P2，通过PCR扩增获得目的基因pld，结果如图1所示，目的条带大小在1 500 bp左右，切胶回收目的基因，经测序后获得pld基因序列，共1 530 个碱基。根据毕赤酵母基因组密码子偏爱性对pld基因进行优化，由苏州金唯智科技有限公司进行合成，获得pldm基因。与pld相比，pldm基因序列有382 个碱基发生改变，并且GC含量由69.0%下降到52.0%。Liu Yihan等[32]实现了经密码子优化的猪胰腺来源磷脂酶A2基因在毕赤酵母中的高效表达；张晓元等[33]对灰色链霉菌来源海藻糖合成酶进行密码子优化，优化后菌株产酶量高，且酶活力比优化前提高了60.3%以上；Wang Jianrong等[34]将密码子优化后的地衣芽孢杆菌来源α-淀粉酶在毕赤酵母中进行表达，发现酶活力可达到优化前的2.62 倍。由此可见，根据宿主细胞的密码子偏好性，对外源基因进行密码子优化，可在一定程度上提升重组蛋白的表达水平。  图 1 PCR扩增结果
Fig. 1 PCR amplification of PLD-encoding sequence
2.2 重组质粒pPIC9K-pldm的构建将分别经EcoRI和NotI处理后pldm与pPIC9K进行连接，转化至大肠杆菌JM109中，挑取转化子提取质粒，利用EcoRI和NotI进行双酶切验证。如图2所示，得到大小约为9 300 bp和1 500 bp的2 条片段，与预期结果一致，说明重组质粒pPIC9K-pldm构建成功。  图 2 重组质粒pPIC9K-pldm的酶切鉴定
Fig. 2 Restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmid pPIC9K-pldm
2.3 重组质粒pPIC9K-pldm整合入毕赤酵母GS115重组质粒pPIC9K-pldm经SacI酶切线性化处理，电转化入毕赤酵母GS115感受后，经MD平板筛选His＋重组转化子，进一步经0.5～2.0 mg/mL的G418筛选后，最终在2.0 mg/mL YPD-G418平板上获得高拷贝重组菌株，提取其基因组，进行PCR验证。结果如图3所示，用pPIC9K通用引物5’AOX1和3’AOX1扩增得到的基因大小约为1 700 bp，表明目的基因pldm成功整合至毕赤酵母GS115基因组中，构建获得重组菌株GS115/pPIC9K-pldm。 1.3.2 清扫表面的堆积物。割台、过桥、粮仓、发动机外部等部位的杂草、秸秆、尘土、油物要清理干净。卸下筛箱内的上筛、下筛及尾筛，清扫清筛室底壳及筛箱内的杂草及尘土，并用自来水冲洗干净，晾干后开进机库。  图 3 重组菌株GS115/pPIC9K-pldm的PCR鉴定
Fig. 3 Identification of recombinant strain GS115/pPIC9K-pldm by PCR
2.4 rPLDM的表达与纯化 图 4 纯化rPLDM的SDS-PAGE分析
Fig. 4 Analysis of purified rPLDM by SDS-PAGE
将构建获得的重组菌株GS115/pPIC9K-pldm接种于YPD培养基中，按照1.3.4节诱导表达rPLDM，收集发酵上清液，测定其转酯活力达2.37 U/mL。经过镍离子亲和柱纯化后获得纯化酶液，纯化产物经SDS-PAGE分析检测结果如图4所示，rPLDM分子质量约为55 kDa，可见一条单一清晰的条带，可用于后续的酶学性质研究，同时，该结果表明rPLDM成功在毕赤酵母GS115中分泌表达。 2.5 转酯酶学性质分析 图 5 rPLDM的酶学性质
Fig. 5 Enzymatic properties of rPLDM
由图5A可知，rPLDM的转酯反应最适温度为60 ℃，在40～70 ℃范围内可保持60%以上酶活力；由图5B所示，在pH 6.5时，rPLDM转酯活力达到最高，且在pH 5.0～7.0范围内酶活力仍可保持在80%以上；由图5C可知，Fe2＋和Fe3＋对rPLDM的酶活力具有强烈的抑制作用，加入Fe3＋时酶活力几乎完全被抑制，Cu2＋和Zn2＋分别对rPLDM的酶活力具有中度和轻度的抑制作用，Na＋和K＋对其酶活力均没有明显的影响，Mn2＋、Mg2＋及Ca2＋对其酶活力均具有促进作用，其中Ca2＋的促进作用最为明显，可将rPLDM的相对酶活力提高至135%。目前，国内外研究者对不同来源PLD的特性分析主要集中在其水解活性上，Zambonelli等[21]将Streptomyces PMF的PLD在大肠杆菌中表达，发现其水解活性的最适温度为60 ℃、最适pH值为8.0；Nakazawa等[22]分离筛选获得1 株 产PLD的S. racemochromogenes 10-3，经发酵纯化后测定其酶学性质，发现其在温度为50 ℃、pH值为7.5时水解活力最高；并且发现同一PLD水解和转酯活性的最适条件并不相同；Moon等[23]从土壤中分离得到了1 株产PLD的菌株Streptomyces sp. p821，经发酵纯化后，测定其水解活性最适温度和pH值分别为和55 ℃和6.0，其转酯活性最适温度和pH值分别为30 ℃和5.0；Simkhada等[35]对S. olivochromogenes来源的PLD进行酶学性质研究，发现其转酯和水解活力最适pH值均为8.0，最适温度分别为75 ℃和50 ℃。因此，对S. septatus PLD进行转酯活性条件的测定，可为其作用PC和丝氨酸合成PS的催化条件研究奠定基础。 2.6 rPLDM单水相催化合成PS工艺优化2.6.1 最适底物物质的量比的确定  图 6 rPLDM单水相催化合成PS的条件优化
Fig. 6 Optimization of conditions for the synthesis of PS by rPLDM in a purely aqueous system
在单水相中利用rPLDM转酯活性催化合成PS的同时，水作为反应介质和竞争性底物会在rPLDM的作用下与PC反应，水解形成PA，从而影响PS的产率。因此，理论上可以通过过量的L-丝氨酸，提升L-丝氨酸与PC物质的量比，使反应平衡向转酯反应进行，从而降低竞争性水解反应。酶量为3.0 U/mL时，分别选择底物L-丝氨酸与PC物质的量比为5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1进行PS合成，反应6 h后测定PS产率。如图6A所示，随着L-丝氨酸与PC物质的量比的提升，PS的产率随之增加，当物质的量比为10∶1时，PS产率达到为23%，随着底物物质的量比的进一步增加，PS产率并没有得到明显提升，考虑催化效率及原料成本的因素，最终确定L-丝氨酸与PC物质的量比10∶1进行后续研究。 Study on the Yellow River Tourism in Shanxi Oriented by the All-For-One Tourism_____________________SANG Ziyu,HU Weixia 1 阿东想了想，记起家里以前有台老式盒带录音机，他曾用它练习过英语听力。便问老巴还在不在。老巴说，应该还在。又说，你姆妈有一阵为了揽客，在店里放音乐，还说话。什么减价呀打折呀。后来不怎么管用，就算了。 2.6.2 最适酶添加量的确定 维普资讯服务方式以 “网络包库”、“镜像”为主。个人付费用户超过1000万；服务方式以“流量”为主。主营业务收入超过亿元。其中不同销售模式的占比分别为：包库为65%、镜像站为30% 、流量计费为5%；广告收入为200万左右。 酶添加量在催化合成反应过程中同样有着重要的影响。为研究rPLDM对PS合成的影响，在L-丝氨酸与PC物质的量比为10∶1的基础上，分别加入1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 U/mL的rPLDM进行反应，反应6 h后测定PS产率，结果如图6B所示，PS产量随着酶量的增加而显著增加，当酶添加量为4.0 U/mL和5.0 U/mL时，PS产率分别达到33%和35%。综合考虑催化效率及酶使用成本的因素，确定rPLDM添加量为4.0 U/mL。 最终，在200 mL单水相反应体系中，40 ℃、pH 6.5（0.2 mol/L醋酸钠缓冲液）条件下，大豆PC和L-丝氨酸物质的量比1∶10，rPLDM添加4.0 U/mL，反应6 h后，PS产率可达到33%。 目前，围绕酶法合成PS的方法主要有：1）构建有机相/水相双相系统；2）在单水相中添加表面活性剂与PC形成混合胶束体系；3）在单水相中使用硫酸钙、二氧化硅和硅藻土作为PC吸附剂[36]。其中，对双相合成PS的研究较多，即采用有机相（PC）和水相（L-丝氨酸和PLD）两相催化体系，以避免PLD水解底物PC和产物PS生成副产物PA，尽管乙醚[37]、乙酸乙酯[38]、氯仿[19]、正己烷[39]、2-甲基四氢呋喃[40]和γ-缬内酯[41]等可实现PS产率达到95%，但有机溶剂的使用难以适用于食品加工及规模生产中。利用表面活性剂，可与PC形成混合胶束，如在水相中添加Triton X-100、脱氧胆酸钠和胆酸钠分别与PC复配形成的混合胶束体系合成PS，PS产率分别达到94.7%、57%和56%[13,36]，但表面活性剂的使用往往会导致产品分离困难，并且大多数具有一定毒性，不适用于食品的生产[36,42]。另外，硫酸钙、二氧化硅和硅藻土可作为PC的吸附载体，在单水相中合成PS，但存在操作较为复杂、需要能耗等问题[36,42-43]。相对水相-有机相双相合成PS法，单水相的研究较少。尽管在PS产率上相较于上述合成方式相对较低，但单水相体系更适合于食品行业及规模生产。本研究为进一步研究单水相PLD催化PC和丝氨酸合成PS的过程中，降低PC的水解率及提高PS的生成率奠定基础，从而进一步促进PS在功能食品领域的应用。 3 结 论本研究利用基因密码子思路及毕赤酵母表达系统，实现了S. septatus TCCC 21057 pld基因在毕赤酵母GS115中的高效分泌表达，摇瓶水平rPLDM酶活力可达2.37 U/mL；对rPLDM的部分酶学性质进行研究，发现其最适作用温度为60 ℃、最适作用pH值为6.5；进一步对rPLDM催化应用性能进行评估，在单水相反应体系中，40 ℃、pH 6.5下，Ca2＋浓度10 mmol/L，大豆PC和L-丝氨酸物质的量比1∶10，rPLDM添加4.0 U/mL，反应6 h后，PS的产率可达到33%。因此，本研究为PLD的高效表达及其应用催化合成新资源食品PS提供了技术基础，在后续研究中将围绕PLD的表达系统进行优化，以进一步提升其表达水平。 参考文献： [1] LIU Y H, ZHANG T, QIAO J, et al. 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Recombinant Expression of Phospholipase D from Streptomyces septatus in Pichia pastoris and Analysis of Its Enzymatic Properties HUANG Lin, MA Jieying, WANG Shuang, WANG Nan, MORADANA GAMAGE Rasadi Sajeewa Rajakaruna, LU Fuping, LIU Yihan*
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology, Ministry of Education, Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology,College of Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China) Abstract: The phospholipase D (PLD) encoding sequence (pld) was amplified from the genomic DNA of Streptomyces septatus TCCC 21057. The optimized pldm sequence was synthesized according to the codon usage bias in Pichia pastoris and then integrated into the expression vector pPIC9K. The resulting recombinant plasmid was then transformed into P. pastoris GS115 competent cells to obtain the recombinant strain GS115/pPIC9K-pldm. The transphosphatidylation activity of recombinant PLD (rPLDM) could reach 2.37 U/mL after shaking flask fermentation. The recombinant enzyme was purified and characterized. Its optimal activity was observed at 60 ℃ and pH 6.5. The yield of phosphatidylserine (PS) could reach 33% after 6 h reaction in a purely aqueous system under the following conditions: molar ratio between the substrates soybean phosphatidylcholine (PC) and L-serine substrate 1:10, rPLDM amount 4.0 U/mL, temperature 40 ℃, pH 6.5, and Ca2+concentration 10 mmol/L. This study lays a foundation for enzymatic synthesis of PS as a novel food ingredient. Keywords: Streptomyces; phospholipase D; Pichia pastoris; expression; enzymatic properties; phosphatidylserine
收稿日期：2019-09-03 基金项目：国家自然科学基金面上项目（31571805）；天津市企业科技特派员项目（19JCTPJC52200）；天津市自然科学基金一般项目（17JCYBJC23700） *通信作者简介：刘逸寒（1982—）（ORCID: 0000-0002-5322-6818），男，教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail: lyh@tust.edu.cnDOI:10.7506/spkx1002-6630-20190903-029 中图分类号：Q814 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2020）08-0100-08 引文格式： 黄琳, 马杰莹, 王爽, 等. Streptomyces septatus磷脂酶D在毕赤酵母中的重组表达及酶学性质分析[J]. 食品科学, 2020,41(8): 100-107. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190903-029. http://www.spkx.net.cnHUANG Lin, MA Jieying, WANG Shuang, et al. Recombinant expression of phospholipase D from Streptomyces septatus in Pichia pastoris and analysis of its enzymatic properties[J]. Food Science, 2020, 41(8): 100-107. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190903-029. http://www.spkx.net.cn
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