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超声复合碱处理对Oleosin蛋 白结构及功能特性的影响超声复合碱处理对Oleosin蛋 白结构及功能特性的影响 孙禹凡1，齐宝坤1,2,3，钟明明1，刘 曌1，杨树昌1，李 杨1,2,3,* （1.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.哈尔滨市食品产业研究院，黑龙江 哈尔滨 150000；3.国家大豆工程技术研究中心，黑龙江 哈尔滨 150000） 摘 要：为了改善蛋白质的功能特性，分析碱处理、超声处理、超声复合碱处理3 种处理方式对Oleosin蛋白的结构及溶解性和乳化特性的影响，并深入探讨不同处理条件下蛋白聚集体的结构变化机理。采用原子力显微镜、动态激光散射、荧光光谱和圆二色光谱研究不同处理条件改性Oleosin蛋白的微观结构、 流体动力学半径、内部结构特性和改性Oleosin蛋白空间结构的变化。结果表明：超声作用可以明显促进Ole osin蛋白的不溶性聚集体向可溶性聚集体转变，单独超声及超声复合碱处理使Oleosin蛋白溶解度相对于对照分别增加了124%和162%（P＜0.05）；圆 二色光谱和荧光光谱结果表明，超声和碱作用均有助于蛋白质结构展开，从而促进更多的酪氨酸、色氨酸等疏水性 基团暴露，与对照组相比，超声复合碱处理使Oleosin蛋白的α-螺旋相对含量增加17.7%，β-折叠相对含量减少9.2%；同时超声复合碱处理可降低Oleosin蛋白的颗粒粒径（286.0 nm）、提高乳化性（乳化稳定性指数575.0 g/m2、乳化活性指数605.4 min）。本研究可为后期形成不同功能的改性Oleosin蛋白提供参考。 关键词：Oleosin；功能特性；超声；蛋白结构 Oleosin蛋白是存在于油体中的一类碱性小分子蛋白质（24 kDa），等电点在9.0～9.5之间，且普遍存在于植物蛋白中（如大豆、花生、菜籽等）[1]。Oleosin蛋白分子含有3 个区域，即一个两亲性的N-末端，大概含有50～70 个氨基酸残基；一个中央疏水区，大概含有70 个氨基酸残基；一个两亲性C-末端，其长度可变。其中中央疏水区是两列反向排列的β-折叠氨基酸残基，其插入油相中，从而形成发卡状构型[2]，由于这种特殊结构使得Oleosin蛋白能够稳定油体和阻止油体融合[3]。 除此之外，Nik iforidis等[4]研究发现Oleosin 蛋白还是一种良好的乳化剂，可在节省原料的基础上作为乳化剂形成稳定乳液。但Oleosin蛋白含有较长的疏水肽段，其在水中倾向于聚集而不能直接溶解在水中，限制了Oleosin蛋白的进一步应用，改性Oleosin蛋白达到提高其功能特性的目标也成为国内外学者的研究热点。 酸碱诱导、超声技术等食品加工技术可以提高蛋白质的功能性质，酸碱诱导主要利用了在等电点条件下，蛋白中的亚基之间发生静电斥力作用，引起分子结构展开，使得原来包埋在蛋白质分子内部的基团随着其空间结构展开得以暴露，引起球蛋白二级、三级结构变化[5]。据O’Sullivan等[6]报道超声技术不能改变蛋白的一级结构，但其二级结构会 有微小的变化；此外，超声还可以展开部分蛋白的三级结构，将巯基和疏水基团暴露于蛋白表面，提高蛋白质的溶解度。但单一的食品加工技术对蛋白质功能性质的提升效果不理想。近年来，采用复合方法改性蛋白质的研究越来越多，Jiang Shanshan等[7]利用超声和酸碱联合处理有效地改善了豌豆蛋白功能特性。Hu Hao等[8]利用超声和转氨酶联合处理可以增强大豆蛋白的凝胶特性。Li Suyun等[9]研究发现通过超声与碱性蛋白联合作用可以有效地改善了大米蛋白的微观结构，并且粒径发生了显著降低。但目前超声复合碱处理对Oleosin蛋白结构及功能性的影响并鲜见报道。因此，本实验旨在研究超声复合碱处理对Oleosin蛋白分子结构及功能特性的影响，并深入探究超声复合碱处理对Oleosin蛋白溶解度、粒径、乳化性以及二、三级结构的变化，以期为O leosin蛋白的进一步改性提供理论和方法指导。 1 材料与方法1.1 材料与试剂大豆（‘东农36号’） 东北农业大学大豆研究所。 三羟 甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl） 北京百奥莱博科技有限公司；蔗糖 天津科密欧化学试剂有限公司；异辛烷 天津市富宇精细化工有限公司；异丙醇、丁醇、甲醇、氯仿、丙酮、硫氰酸铵、氯化钡、硫酸亚铁、氯化钠、氢氧化钠 天津市天力化学试剂有限公司；尼罗红、尼罗蓝 美国Sigma公司；其他试剂均为分析纯。 生活在狼群里，就应该去做狼，这句话是你说的，他们骗了你，你就应该去骗他们。像你这样的窝囊废，就该戴一百顶绿帽子。还想让我跟你回去，做梦去吧。你这个大骗子。 1.2 仪器与设备KC-701超微粉碎机 北京开创同和科技发展有限公司；超声波细胞破碎仪 宁波新芝生物科技股份有限公司；UV-2600/2700紫外-可见分光光度计 岛津企业管理（中 国）有限公司；F-4500型荧光分光光度计日本日立高新技术公司；Nano-ZS90粒度分析仪 英国马尔文公司；PHSJ-4A型实验室pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；分析天平（0.000 1 g） 北京赛多利斯仪器系统有限公司；FD5-3型冷冻干燥机 美国SIM公司；J-810圆二色光谱仪 日本JASCO公司；Multimode 8型原子力显微镜 德国布鲁克公司。 国内外学者对水资源系统综合评价做了大量研究，包括水资源可持续利用评价、水资源安全评价、水资源风险评价等，取得了许多有价值的研究成果。但现阶段引配水的研究大多数以水量、水质或者调水工程本身为研究对象，较少地综合考虑引配水工程以及周边环境所组成的社会、经济和环境系统。本文从系统论的角度出发，以杭州市运河引配水系统为研究对象，综合考虑其社会子系统、经济子系统和自然生态子系统三方面效益，对改善水质为目的的城市引配水系统的效益进行综合评价，为科学地调配水资源、改善城市水环境提供技术支持。 1.3 方法1.3.1 Oleosin蛋白的提取 根据Deleu等[10]报道的方法提取Oleosin蛋白，并作适当修改。将大豆和水以料液比1∶5浸泡在蒸馏水中，在4～6 ℃条件下放置18～20 h。用组织捣碎机以18 000 r/min磨浆90 s，用4 层脱脂纱布过滤除去豆渣，并收集滤液。将滤液中加入质量分数4%氯化钠，冰水浴搅拌15 min，转移到离心管中，在4 ℃条件下，19 000 r/min离心30 min，收集上层乳状物，并重复此步骤两次，最后用去离子水清洗；将处理后的上层乳状液用0.22 μm的滤膜过滤，将处理后的乳状液与3 倍体积的乙醚混合后，以5 000×g离心15 min除去中性脂质，该过程重复3 次。将获得的残渣再用氯仿/甲醇/去离子水（4∶2∶1，V/V）混合后，以5 000×g离心15 min，收集中间白色胶体；并与3 倍体积的冰丙酮混合，以5 000×g离心15 min，收集沉淀即为Oleosin蛋白。最后将Oleosin蛋白置于氮气下以除去剩余的有机溶剂，冷冻干燥后，以获得冻干的Oleosin蛋白用于进一步分析。 1.3.2 Oleosin蛋白的碱处理和超声处理 Oleosin蛋白的处理方法参照Li Suyun[9]和Huang Liurong[11]等报道的方法进行，具体方法如下。对照：称取Oleosin蛋白1.0 g，加入蒸馏水90 mL，25 ℃搅拌1 h，搅拌过程中利用0.1 mol/L NaOH溶液维持pH值为7.0，蒸馏水定容到100 mL，5 000 r/min离心15 min得上清液。碱处理：称取Oleosin蛋白1.0 g，加入90 mL 0.001 mol/L NaOH溶液，25 ℃搅拌1 h，搅拌过程中利用0.1 mol/L NaOH溶液维持pH值为9.0，然后利用0.001 mol/L NaOH溶液定容到100 mL，5 000 r/min离心15 min得上清液。超声处理：称取Oleosin蛋白1.0 g，加入蒸馏水90 mL，25 ℃搅拌1 h，搅拌过程中利用0.1 mol/L NaOH溶液维持pH 7.0，然后200 W超声处理6 min（工作、间歇时间比为2 s∶1 s），蒸馏水定容到100 mL，5 000 r/min离心15 min得上清液。超声复合碱处理：称取Oleosin蛋白1.0 g，加入90 mL浓度为0.001 mol/L NaOH溶液，25 ℃搅拌1 h且维持pH值为9.0，然后200 W超声处理6 min（工作、间歇时间比为2 s∶1 s），加入0.001 mol/L NaOH溶液定容到100 mL，5 000 r/min离心15 min得上清液。 1.3.3 内源荧光光谱的测定 近年来本校各专业的生物化学实验均采取实验理论与操作并重的考核方式。实验成绩评估是考核学生在实验原理、方法、操作及实验过程中的注意事项、原始数据记录和结果分析等各方面的综合水平，以此全面客观评价学生成绩。 应用F-4500荧光分光光度计测定样品的荧光光谱[12]。将处理后的样品稀释，使其达到0.15 mg/mL。光谱测定条件设置为：激发波长290 nm，扫描波长为300～500 nm，激发狭缝为5 nm，同样发射狭缝宽也为5 nm。重复扫描3 次。 1.3.4 圆二色光谱的测定 采用远紫外区域圆二色光谱研究超声和碱处理后Oleosin蛋白的二级结构，准确称取一定量处理后的蛋白在pH 7.0、0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液中配制成质量浓度为0.4 mg/mL的溶液。圆二色光谱扫描波长范围为240～200 nm，25 ℃条件下，扫描速率为100 nm/min，样品池光程为0.1 nm，灵敏度为100 mdeg/cm，以扫描5 次结果的平均值为最后得到的圆二色光谱。采用CD Pro曲线拟合软件包计算蛋白质二级结构相对含量[13]。 1.3.5 粒径的测定 参照Lee等[14]的方法，稍作修改，将样品稀释至蛋白质量浓度1 mg/mL以下，放入台式离心机中以5 000 r/min离心15 min。利用激光粒度仪进行测定，蛋白溶液的平均粒径采用体积平均直径（D4,3）来表示。设置蛋白折射率为1.46，吸收参数为1.33。所有的测试均在25 ℃条件下进行，平行测定3 次。 1.3.6 溶解性的测定 Analysis on distribution characteristics of secondary geo-hazards before and after Jiuzhaigou 精确称取 10 mg左右样品，溶解于10 mL的去离子水中，室 温下磁力搅拌溶解1 h，3 000 r/min离心 15 min，上清液经适度稀释，采用Lowry法[15]测定蛋白质量浓度，以牛血清白蛋白为标准物绘制标准曲线。蛋白质的溶解度以上清液蛋白质量浓度占总蛋白质量浓度的百分比表示。 高中物理必修知识是整个高中阶段物理知识学习的重点和难点，只有做好这一阶段的学习才能为选修课的学习打下基础.教师在课程完成后，首先回顾教学过程，分组讨论阶段学生是否充分发挥主观能动性，积极思考动手实践，其次思考课程时间分配上，有没有留白过多实践而造成效率低下，最后总结打点计时器的实验过程有没有达到引出加速度概念的目的.通过课后作业的回收情况综合判断本节课的学习成果. 1.3.7 乳化性及乳化稳定性的测定 乳化性的测定参考Schröder等[16]的方法。取9 mL 0.2 g/100 mL蛋白液（0.05 mol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液），向其中加入3 mL葵花籽油，在25 ℃条件下采用组织分散机20 000 r/min分散1 min后，从底部取样50 μL，分别于0、30 min后测定吸光度，再 将获得的乳液用质量分数0.1%十二烷基硫酸钠溶液稀释到确定倍数，在500 nm波长处用紫外-可见分光光度计测定吸光度，按公式（1）计算乳化活性指数（emulsification activity index，EAI）。静置30 min后测定吸光度，按公式（2）计算乳化稳定性指数（emulsification stability index，ESI）。 本文结合教学实践归纳了课堂教学有效性的三个要素，在对课堂教学有效性研究和剖析的过程中，我将课堂教学有效性的理论与实践相结合，将自身的教学经验融入其中。在分析课堂教学有效性的方式方法时，结合了一些课堂实践颇有成效的教学技巧，为进一步对课堂教学有效性的研究提供了参考。 
式中：N为稀释倍 数（100）；ρ为乳化液形成前蛋白质水溶液中蛋白质量浓度/（g/mL）；φ为乳化液中油相体积分数/%；A0为0 min时的吸光度；A30为30 min时的吸光度；t30―t0为时间差30 min。 1.3.8 原子力显微镜观察 样品的扫描采用“轻敲”模式进行，驱动频率320 kHz，扫描速率1.0 Hz。探针典型谐振频率为290 kHz。将超声处理前后的蛋白分散液用20 mmol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液稀释成10 μg/mL，然后取大约2 μL滴在干净云母片上，室温下挥发20 min后进行观察。 1.4 数据统计分析所有的实验进行3 次，结果表示为平均值±标准差，利用SPSS 22.0软件的方差分析法对数据进行差异显著性分析，P＜0.05为差异显著。采用Origin 9.1软件进行图表处理及图谱分析处理。 2 结果与分析2.1 荧光光谱分析结果 图1 超声和碱处理后Oleosin蛋白荧光光谱的变化
Fig. 1 Fluorescence spectra of oleosin after alkali and/or ultrasonic treatments
在激发波长为290 nm的条件下，对蛋白中含芳香族氨基酸，例如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸残基的蛋白产生荧光，即内源性荧光，内源性荧光光谱是一种能反映蛋白质三级结构构象变化的有效方法[17]。由图1可知，与对照组相比，超声处理后Oleosin蛋白的内源性荧光光谱的峰位并没有发生明显的红移或者蓝移现象。而荧光强度增加。这是由于超声产生的空穴效应作用于Oleosin蛋白，使蛋白结构松散，Oleosin蛋白分子伸展暴露出芳香族氨基酸，特别是色氨酸残基的暴露使荧光强度增大[18]。但Oleosin蛋白经碱处理后最大发射波长增加了2.0 nm，红移表明Oleosin在碱性诱导的条件下，蛋白分子展开使发色基团暴露[19]。然而碱处理Oleosin蛋白的溶解度低于对照组，表明荧光强度和最大发射波长的增加取决于可溶性聚集体的结构变化。超声复合碱处理与单独超声或碱处理相比，荧光强度明显增加，说明超声和碱结合处理可以使蛋白分子结构发生解折叠，从而破坏疏水相互作用，发色基团暴露使荧光强度增加。 2.2 圆二色光谱分析结果表1 超声和碱处理后Oleosin蛋白二级结构的变化
Table 1 Secondary structures of oleosin after alkali and or ultrasonic treatment  注：同列肩标小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。 无规卷曲相对含量/%对照 19.2±0.1d 31.4±0.2a 18.6±0.1a 30.8±0.1a碱 20.7±0.1c 30.2±0.0b 18.4±0.1b 30.7±0.1a超声 21.8±0.0b 29.3±0.1c 17.8±0.0c 31.1±0.1a超声复合碱 22.6±0.2a 28.5±0.2d 17.4±0.1d 31.5±0.1a处理方式 α-螺旋相对含量/%β-折叠相对含量/%β-转角相对含量/%
超声和碱处理后Oleosin蛋白二级结构的变化情况如表1所示。结果表明经过不同的处理方式Oleosin蛋白的二级结构发生了改变。与对照组相比，碱处理能使Oleosin蛋白的α-螺 旋相对含量显著增加（P＜0.05），β-折叠和β-转角相对含量显著减少（P＜0.05），而无规卷曲的相对含量变化不显著（P＞0.05）。Liu Ru等[20]通过研究发现经过碱处理可以使乳清分离蛋白的α-螺旋相对含量增加，β-折叠相对含量减少，这与本研究的结果一致。而超声和超声复合碱处理使Oleosin蛋白α-螺旋相对含量增加，β-折叠相对含量减少。这是因为超声处理使蛋白质分子内的氢键断裂，改变了蛋白质刚性 结构，增加 了蛋白质分子的柔性结构[21]。其中超声复合碱 预处理Oleosin时，α-螺旋相对含量最多，为22.6%，β-折叠相对含量最少，为28.5%。表明碱处理和超声处理具有协同作用，这是由于碱诱导改变了电荷间的排斥作用，辅以超声处理产生的空化作用，更易改变Oleosin蛋白的二级结构。Lee等[14]研发现α-螺旋含量的减少及β-折叠含量的增加会使蛋白聚集，导致蛋白空间结构伸展，导致乳液粒径的增加，这一现象从侧面证明超声复合碱处理造成的二级结构改变趋势更有利于减少蛋白聚集，与本研究溶解度及粒径分析结 果一致。 在全面深化改革新时期，改革进入“深水区”和“攻坚期”，留下的都是难啃的硬骨头，单纯地“摸着石头过河”已经不再适应时代要求。虽然全面深化改革是在走前人未走过的路，“摸着石头过河”仍有合理性，但必须将“摸着石头过河”和“顶层设计”结合起来，坚持趋利避害，让“顶层设计”缓冲“摸着石头过河”的风险。 2.3 粒径分析结果 图2 超声和碱处理后Oleosin蛋白平均 粒径（A）和粒径分布（B）的变化
Fig. 2 Average particle size (A) and particle size distribution (B) of oleosin after alkali and/or ultrasonic treatment
粒径是用来衡量溶液理化特性和功能特性的重要参数之一。样品经不同处理后，液滴的破碎和重新聚集同时发生，因此需用体积平均粒径表示不同粒径所占有的体积分布，同时表征蛋白质聚集、解聚等行为。超声和碱处理后Oleosin蛋白粒径变化如图2所示。总地来说，所有样品均呈现出双峰的粒径分布，但峰值及峰宽均有所不同。与对照组相比，Oleosin蛋白经过碱处理后粒径逐渐向大粒径的方向移动，且分布变宽，平均粒径显著增加（P＜0.05）。结合荧光光谱的分析得出，在碱性条件时接近Oleosin蛋白的等电点，由于静电斥力的减弱和蛋白结构的展开，使得Oleosin蛋白易于形成聚集体[22]。而经过超声处理后，Oleosin蛋白粒径逐渐向小粒径的方向移动，且分布变窄，与对照组相比，超声处理和超声复合碱处理，Ole osin蛋白平均粒径由661.3 nm分别减少至360.4、286.0 nm，这可能是由于Oleosin蛋白在 碱诱导下产生的静电斥力作用，使蛋白结构展开、亚基发生解离，结合超声作用产生的机械剪切和空穴效应又减弱了蛋白分子间的非共价相互作用，阻碍了蛋白的聚集，从而进一步降低了Oleosin蛋白粒径[23-24]。 2.4 溶解性分析结果溶解度是蛋白质的重要指标之一，会影响其他功能特性，如乳化性、表面疏水性和流变性等。Oleosin蛋白的溶解度曲线在不同pH值下呈现“U”型分布，在等电点（pH 9.0～9.5）附近时溶解度最低[10,25]。经过超声和碱处理的Oleosin蛋白的溶解度如图3所示，在pH 7.0的对照组中，Oleosin蛋白的溶解度为21.09%，而经碱、超声及超声复合碱处理后的溶解度分别为18.88%、47.45%和55.26%。数据显示，碱处理Oleosin蛋白与对照组相比溶解度降低了11.7%（P＜0.05），这是由于碱性处理条件下Oleosin蛋白溶液的pH值接近蛋白等电点，酸碱诱导使可溶性聚集体向不溶性聚集体转化，此时蛋白质颗粒之间无电荷间的相互作用，蛋白质内部疏水基团的暴露导致了蛋白的溶解度降低[26]。而单独超声与超声复合碱处理对Oleosin蛋白的溶解度影响较大，与对照相比分别提高124%、162%，原因可能是碱诱导作用促使蛋白分子亚基解离和结构的展开[26]，同时超声作用产生的声波具有波动属性和能量属性，可以改变蛋白的分子结构，破坏蛋白质分子内化学键，使肽链变得疏松，同水分子结合能力增强，提高蛋白质的溶解性[27]。说明超声复合碱处理可以提高Oleosin蛋白的溶解性，比单一的超声处理更有优势。  图3 超声和碱处理后Oleosin蛋白溶解度的变化
Fig. 3 Solubility of oleosin after alkali and/or ultrasonic treatment
2.5 乳化性分析结果表2 超声和碱处理后Oleosin蛋白悬浮液和乳液粒径的变化
Table 2 Particle sizes of suspensions and emulsions of oleosin after alkalii aanndd/or ultrasonic treatment  处理方式 EAI/（m2/g） ESI/min对照 78.6±6.1b 18.0±8.4b碱55.4±20.6a 12.0±10. 1a超声 427.4±9.2c 321.0±25.1c超声复合碱 575.0±15.7d 605.4±17.8d
乳化活性及乳化稳定性是表征乳状液乳化特性及稳定状态的最重要指标之一。其中EAI反映重组油体乳液形成油-水界面的能力，ESI反映乳状液形成小液滴的稳定能力[28]。由表2可知，当使用碱处理Oleosin蛋白时，由于接近其等电点，改变了Oleosin蛋白质分子之间的静电相互作用，从而在油-水乳液中产生不均匀的蛋白聚集体[29]，粒径增大，乳化性低于对照组。超声处理后Oleosin蛋白的ESI和EAI显著增加（P＜0.05），但超声复合碱处理表现出最高的EAI（575.0 g/m 2）和ESI（605.4 min），与对照组相比，分别提高7.31 倍和33.63 倍，这可能是由于碱处理产生静电斥力可使Oleosin蛋白内部疏水基团暴露，辅以超声处理，机械力作用使蛋白结 构由无序变得有序，同时超声产生的空化效应使蛋白有序结构相互结合形成胶束，胶束的形成有利于乳化性提升。 头孢菌素类是临床另一类广泛使用的抗菌药物。本研究中，无论是ICU还是普通病房，大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对头孢菌素均存在不同程度的耐药。但两种病房中，肺炎克雷伯菌对头孢曲松的耐药率均低于文献[10]报道，可能与本研究中碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌所占比例较低有关。本研究中，大肠埃希菌ESBLs在两种病房的检出率约为60%，与王启等[12]研究一致。ESBLs阳性可导致大肠埃希菌对所有青霉素类和头孢菌素均耐药，而酶抑制剂合剂如头孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦对阴性杆菌均有较好的敏感性，可作为产ESBLs肠杆菌科细菌感染的经验用药[13]。 2.6 原子力显微镜分析结果 图4 超声和碱处理后Oleosin蛋白的原子力显微结构图
Fig. 4 Atomic force microscopic images of oleo sin after alkali and/or ultrasonic treatment
将超声处理前后Ole osin蛋白分散液 沉积在云母片上后，采用原子力显微镜可以更加直观地观察Oleosin蛋白的絮凝状态，结果如图4所示，样 品未处理前，由于较强的疏水性，Oleosin蛋白呈现出无序的聚集状态。当样品经过超声处理后，Oleosin蛋白分子逐渐开始由无序聚集状态转变为均匀的球形颗粒，其形状规整、尺寸均一，并形成较小、较为分散的聚集体，这个结果与二级结构的结果相一致。利用Nanoscope analysis软件对样品三维结构进行分析，当超声复合碱处理Oleosin蛋白时平均表面粗糙度（arithmetical mean roughness，Ra）最小为2.04 nm，与未经超声处理的样品（Ra 69.7 nm）相比明显降低，Ra作为统计学的基本参数，能够反映样品表面粗糙程度，即聚集程度，Ra的减小说明单独的超声处理和碱处理可以使蛋白空间结构展开，功能基团（如疏水基团）暴露，蛋白发生了某种程度的自组装，形成蛋白质聚集体。结合荧光光谱的变化可知，超声复合碱处理可以使Oleosin蛋白的疏水性基团暴露，促进蛋白 解离，大大降低了Oleosin蛋白颗粒的尺寸，与粒径结果一致。 3 结 论碱诱导作用促使蛋白分子结构展开，同时超声产生的机械作用和空化作用可改变不溶性分子间作用力及分子结构，促进蛋白质溶解度的增加，比单一处理更有优势。超声复合碱处理Oleosin蛋白使最大发射波长发生红移，且荧光强度增加，说明超声和碱处理对蛋白结构的展开具有协同作用。同时，蛋白质的二级结构的相对含量也发生了明显的变化。超声和超声复合碱处理均可以显著降低Oleosin蛋白粒径、乳化性显著提高，其中超声复合碱处理的效果最佳。在超声复合碱处理时，一方面碱处理产生静电斥力使Oleosin蛋白内部疏水基团暴露；另一方面，超声处理使蛋白结构由无序变为有序，从而降低粒径，提升乳化活性。 参考文献： [1] CAO Y, ZHAO L, YING Y, et al. The characterization of soybean oil body integral oleosin isoforms and the effects of alkaline pH on them[J]. Food Chemistry, 2015, 177: 288-294. DOI:10.1016/j.foodchem.2015.01.052. [2] TZEN J, CAO Y, LAURENT P, et al. Lipids, proteins, and structure of seed oil bodies from diverse species[J]. Plant Physiology, 1993,101(1): 267-276. DOI:10.1104/pp.101.1.259. [3] HUANG A H . Oleosins and oil bodies in seeds and other organs[J].Plant Physiology, 1996, 110(4): 1055-1061. DOI:10.1104/pp.110.4.1055. [4] NIKIFORIDIS C V, AMPATZIDIS C, LALOU S, et al. Purified oleosins at air-water interfaces[J]. Soft Matter, 2012, 9(4): 1354-1363.DOI:10.1039/C2SM27118D. [5] LI R, WU Z, WANGB Y, et al. Role of pH-induced structural change in protein aggregation in foam fractionation of bovine serum albumin[J]. Biotechnology Reports, 2016, 9: 46-52. DOI:10.1016/j.btre.2016.01.002. [6] O’SULLIVAN J, PARK M, BEEVERS J. The effect of ultrasound upon the physicochemical and emulsify ing properties of wheat and soy protein isolates[J]. Journal of Cereal Science, 2016, 69: 77-84.DOI:10.1016/j.jcs.2016.02.013. [7] JIANG Shanshan, DING Junzhou, ANDRADE J, et al. Modifying the physicochemical proper ties of pea protein by pH-shifting and ultrasound combined treatments[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2017,38: 835-842. DOI:10.1016/j.ultsonch.2017.03.046. [8] HU Hao, ZHU Xinrong, HU Tan, et al. Effect of ultrasound pretreatment on formation of transglutaminase-catalysed soy protein hydrogel as a riboflavin vehicle for functional foods[J]. Journal of Functional Foods, 2015, 19: 182-193. DOI:10.1016/j.jff.2015.09.023. [9] LI Suyun, YANG Xue, ZHANG Yanyan, et al. Effects of ultrasound and ultrasound assisted alkaline pretreatments on the enzymolysis and structural characteristics of rice protein[J]. Ultrasonics Sonochemistry,2016, 31: 20-28. DOI:10.1016/j.ultsonch.2015.11.019. [1 0] DELEU M, VACA-MEDINA G, FABRE J F, et al. Interfacial properties of oleosins and phospholipids from rapeseed for the stability of oil bodies in aqueous medium[J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2010, 80(2): 125-132. DOI:10.1016/j.colsurfb.2010.05.036. [11] HUANG Liurong, DING Xiaona, DAI Chunhua, et al. Changes in the structure and dissociation of soybean protein isolate induced by ultrasound-assisted acid pretreatment[J]. Food Chemistry, 2017, 232:727-73 2. DOI:10.1016/j.foodchem.2017.04.077. [12] FRANCESCO B, GIUSEPPE M, MARIA AMBROGINA P, et al.Probing structural features of water-insoluble proteins by front-face fluorescence[J]. Analytical Biochemistry, 2004, 329(1): 104-111.DOI:10.1016/j.ab.2004.02.016. [13] SR EERAMA N, WOODY R W. Estimation of protein secondary structure from circular dichroism spectra: comparison of CONTIN,SELCON, and CDSSTR methods with an expanded reference set[J].Analytical Biochemistry, 2000, 287(2): 252-260. DOI:10.1006/abio.2000.4880. [14] LEE Y J, YOON W B. Effects of particle size and heating time on thiobarbituric acid (TBA) test of soybean powder[J]. Food Chemistry,2013, 138(2/3): 841-850. DOI:10.1016/j.foodchem.2012.11.113. [15] FRYER H J L, DAVIS G E, MANTHORPE M, et al. Lowry protein assay using an automatic microtiter plate spectrophotometer[J].Analytical Biochemistry, 1986, 153(2): 262-266. DOI:10.1016/0003-2697(86)90090-4. [16] SCHRÖDER A, BERTON-CARABIN C, VENEMA P, et al. Interfacial properties of whey protein and whey protein hydro lysates and their influence on O/W emulsion stability[J]. Food Hydrocolloids, 2017, 73:129-140. DOI:10.1016/j.foodhyd.2017.06.001. [17] SHEN L, TANG C H. Microfluidization as a potential technique to modify surface prope rties of soy protein isolate[J]. Food Research International, 2012, 48(1): 108-118. DOI:10.1016/j.foodres.2012.03.006. [18] OMAR S B, SCHLEICH T. Assessment of the exposure and environments of tryptophanyl residues in ribosomal protein S1 by fluorescence quenchin g[J]. Biochemistry, 1981, 20(22): 6371-6378.DOI:10.1021/bi00525a014. [19] ULUKO H, ZHANG S, LU L, et al. Effects of microwave and ultrasound pretreatment on enzymolysis of milk protein concentrate[J].International Journal of Food Science & Technology, 2013, 48(11):2250-2257. [20] LIU Ru, ZHAO Siming, XIONG Shanbai, et al. Role of secondary structures in the gelation of porcine myosin at different pH va lues[J]. Meat Science, 2008, 80(3): 632-639. DOI:10.1016/j.meatsci.2008.02.014. [21] GAO H, MA L, LI T, et al. Impact of ultrasonic power on the structure and emulsifying properties of whey protein isolate under various pH conditions[J]. Process Biochemistry, 2019, 81: 113-122. DOI:10.1016/j.procbio.2019.03.012. [22] MAO X Y, TONG P S, GUALCO S, et al. Effect of NaCl addition during diafiltration on the solubility, hydrophobicity, and disulfide bonds of 80% milk protein concentrate powder[J]. Journal of Dairy Science, 2012, 95(7): 3481-3488. DOI:10.3168/jds.2011-4691. [23] SUI X, BI S, QI B, et al. Impact of ultrasonic treatment on an emulsion system stabilize d with soybean protein isolate and lecithin: its emulsifying property and emulsion stability[J]. Food Hydrocolloids,2017, 63: 727-734. DOI:10.1016/j.foodhyd.2016.10.024. [24] HUANG L, DING X, LI Y, et al. The aggregation, structures and emulsifying properties of soybean protein isolate induced by ultrasound and acid[J]. Food Chemistry, 2019, 279: 114-119.DOI:10.1016/j.foodchem.2018.11.147. [25] VESNA K, GANESH KU MAR A, MARTIN H, et al. Protein and lipid composition analysis of oil bodies from two Brassica napus cultivars[J]. Proteomics, 2010, 6(16): 4586-4598. DOI:10.1002/pmic.200600020. [26] TANG C H, TEN Z, WANG X S, et al. Physicochemical and functional properties of hemp (Cannabis sativa L.) protein isolate[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54(23): 8945-8950.DOI:10.1021/jf0619176. [27] ARZENI C, MARTÍNEZ K, ZEMA P, et al. Comparative study of high intensity ultrasound effec ts on food proteins functionality[J].Journal of Food Engineering, 2012, 108(3): 463-472. DOI:10.1016/j.jfoodeng.2011.08.018. [28] ZHU X, LI L, LI S, et al. L-Arginine/L-lysine improves emulsion stability of chicken sausage by increasing electrostatic repulsion of emulsion droplet and decreasing the interfacial tension of soybean oil-water[J]. Food Hydrocolloids, 2019, 89 492-502. DOI:10.1016/j.foodhyd.2018.11.021. [29] CHEUNG L, WANASUNDARA J, NICKERSON M T. Effect of pH and NaCl o n the emulsifying properties of a napin protein isolate[J].Food Biophysics, 2015, 10(1): 1-9. DOI:10.1007/s11483-014-9350-7.
Functional Characteristics of Oleosin Affected by Ultrasound-Assisted Alkali Treatment SUN Yufan1, QI Baokun1,2,3, ZHONG Mingming1, LIU Zhao1, YANG Shuchang1, LI Yang1,2,3,*
(1. School of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China;2. Harbin Food Industry Research Institute, Harbin 150000, China;3. National Research Center of Soybean Engineering and Technology, Harbin 150000, China) Abstract: In order to improve the functional properties of oleosin, the effects of alkali and ultrasonic treatments alone and in combination on the structure, solubility and emulsifying properties of oleosin were studied. The mechanism of structural changes of protein aggregates under different treatment conditions was also discussed. The microstructure, hydrodynamic radius, internal structure and spatial structure of modified oleosin were studied by atomic force microscopy, dynamic laser scattering, fl uorescence spectroscopy and circular dichroism microscopy. The results showed that ultrasonic treatment could promote the transformation of oleosin from insoluble aggregates to soluble ones, and the solubility of oleosin subjected to ultrasonic treatment alone or in combined with alkali treatment increased by 124% and 162% compared to the control,respectively (P ＜ 0.05). Circular dichroism and fl uorescence spectroscopy showed that both ultrasonic and alkali treatments could promote the unfolding of protein structure, thus promoting the ex posure of more hydrophobic groups such as tyrosine and tryptophan. Compared with the control group, the α-helix content of oleosin increased by 17.7% and the β-folding content decreased by 9.2% after the combined treatment. At the same time, the particle size decreased (286.0 nm) and the emulsifying properties improved (emulsion stabili ty index of 575.0 g/m2, and emulsifying activity index of 605.4 min). This study provides a reference for improved functions of oleosin. Keywords: oleosin; functional properties; ultrasonic; protein structure
收稿日期：2019-04-08 基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（31801579）；中国博士后科学基金面上项目（2018M631902） 第一作者简介：孙禹凡（1992—）（ORCID: 0000-0001-7172-8451），男，硕士研究生，研究方向为粮食、油脂及植物蛋白工程。E-mail: sunyufan4399@163.comDOI:10.7506/spkx1002-6 630-20190408-075 中图分类号：TS214.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2020）07-0079-07 引文格式：孙禹凡, 齐宝坤, 钟明明, 等. 超声复合碱处理对Oleosin蛋白结构及功能特性的影响[J]. 食品科学, 2020, 41(7): 79-85.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190408-075. http://www.spkx.net.cnSUN Yufan, QI Baokun, ZHONG Mingming, et al. Functional characteristics of oleosin affected by ultrasound-assisted alkali treatment[J]. Food Science, 2020, 41(7): 79-85. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190408-075. http://www.spkx.net.cn
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发表于 2021-2-2 17:14:37
