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γ-kokumi肽及其合成酶γ-谷氨酰转肽酶的研究进展γ-kokumi肽及其合成酶γ-谷氨酰转肽酶的研究进展 伍圆明1，伍伦杰1，王 莉1，林 璐1，刘 义1，孙伟峰2，丁文武1,* （1.西华大学食品与生物工程学院，四川 成都 610039；2.衡阳师范学院生命科学与环境学院，湖南 衡阳 421008） 摘 要：Kokumi是第6种基本味觉候选之一，添加到食物中能增强味道的浓厚感、饱满感、持续性及协调性，其相关增味产品具有巨大的开发价值和市场前景。Kokumi物质中重要的一类是具有kokumi味的γ-谷氨酰肽，称为γ-kokumi肽，由γ-谷氨酰基及氨基酸/多肽两部分组成，可通过具有转肽活性的γ-谷氨酰转肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，GGT）合成。因此，本文对γ-kokumi肽结构特征、食物来源、呈味评价方法、制备方法、GGT结构特征、催化机理及合成γ-kokumi肽的生产应用等方面进行了综述，以期为γ-kokumi肽相关增味产品的开发以及GGT酶法合成提供一定的参考。 关键词：γ-kokumi肽；结构特征；γ-谷氨酰转肽酶；酶法合成 随着生活质量水平的提高和个体饮食习惯的差异化发展，食品的味道和质量受到了越来越多的关注，人们对食物味道的需求不再局限于单一的基本味觉体验，还更多地追求丰富的味觉体验及幸福愉悦的味道，而使人感到回味无穷、浓郁持久和极富层次感的浓厚味（kokumi）能极大程度地满足这一需求。因此，在食品调味品领域中，kokumi已然成为了一个研究热点。 Kokumi是继五大基本味觉酸、甜、苦、咸、鲜之后新提出的第6种基本味觉候选之一[1]，主要代表食物味道的浓厚感（thickness）、饱满感（mouthfulness）、持续性（continuity）及协调性（harmony of taste）[2]。kokumi物质的特点是，当添加到基本的味道溶液或食物中时，它们会提升5 种基本口味的协调性和呈味强度（特别是鲜味）。目前已报道的kokumi物质多数为短肽类[3]，而在多项关于kokumi肽鉴定的研究中发现，发酵食物中浓厚味的主要贡献者为γ-谷氨酰多肽（γ-kokumi肽）[4-11]并且与其他呈味分子，如寡糖、核苷酸等组合使用还能增强浓厚味、延长回味或提升鲜味强度，具有极大的开发价值和市场前景，因此，其生产应受到更多的关注。 有关中小型水利工程管理方面的规章制度还不完善，导致很多项目工程启动之后出现了一系列不规范但是又无法用法律强制规范的行为。而且在招标过程中随机性很大，不可预控，很多中标的单位并不一定会认真履约合同上的要求，甚至还出现工程分包等情况，严重影响到监理的正常发展。 γ-谷氨酰转肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，GGT，EC 2.3.2.2）具有将γ-谷氨酰基转移至受体分子上的特异性催化功能[12]，可直接催化合成γ-谷氨酰肽而受相关食品工业领域的广泛重视，并且GGT已经成功应用于L-茶氨酸等重要γ-谷氨酰类化合物的生产中[13-16]，为γ-kokumi肽的酶法生产提供了有力的参考。 综上所述，在初中学生解决函数“动点问题”期间，由于受到教师与学生等客观因素影响，致使其解题困难性相对较强。因此教师可结合实际情况通过利用旧知识引入新知识、自主学习以及仔细观察发现问题等方法提高学生函数动点问题解题能力，并在一定程度上为学生的发展创建良好的条件。 因此，本文对γ-kokumi肽结构特征、食物来源、呈味评价方法、制备方法及食品中的应用，以及GGT结构特征、转肽反应催化机理及合成γ-kokumi肽的生产应用等方面进行了综述，加深对γ-kokumi肽结构与呈味的关系、GGT结构与转肽活性的关系以及GGT合成γ-kokumi肽的现状等科学和工程问题的认识，以期为新型γ-kokumi肽的设计、γ-kokumi肽大规模生产和相关肽类增味产品的开发提供一定的参考。 1 γ-kokumi肽概况1.1 γ-kokumi肽的结构及特征γ-kokumi肽是具有kokumi特征的γ-谷氨酰肽，多为二肽或三肽。γ-谷氨酰肽分子结构如图1a所示，谷氨酸在α-C和γ-C上都连接有—COO-基团，当谷氨酸的γ-COO-与γ-谷氨酰基受体（R基团）的NH3+脱水缩合形成γ位肽键时，即产生了γ-谷氨酰肽，其中R基团可以为多肽或者游离氨基酸。例如最常见的γ-kokumi肽为谷胱甘肽（γ-Glu-Cys-Gly，GSH），其结构由γ-谷氨酰基与二肽-Cys-Gly组成（图1b）。 γ-kokumi肽的结构与其浓厚味强度密切相关。γ-kokumi肽N末端的γ-谷氨酰基是其呈浓厚味的关键基团，Yusuke等[18]筛选二肽库发现大多数γ-谷氨酰基二肽（γ-Glu-X）具有浓厚味活性，而α-Glu-X几乎都无浓厚味活性，三肽中也有类似的结论。γ-kokumi肽中间残基和C-末端同样对其浓厚味具有重要影响，当中间残基为中等大小的不带电、非极性脂肪族残基时（如Val、Leu等），表现出更高的浓厚味强度；C-末端残基的结构对其呈味影响相对较小，但其优选为无侧链的Gly时，可进一步提升γ-kokumi肽浓厚味[18-19]。此外，残基的侧链中有含硫基团也有助于提升γ-kokumi肽浓厚味强度[19]。这些关于肽结构与呈味的关系的结论将为新型γ-kokumi肽的设计提供新的思路。  图 1 γ-谷氨酰肽（a）及谷胱甘肽（b）[17]分子结构式
Fig. 1 Molecular structures of γ-glutamyl peptides (a) and glutathione (b)[17]
1.2 γ-kokumi肽的来源目前，大多数的γ-kokumi肽都是从常见的发酵食品、调味品或海鲜产品中分离鉴定获得（表1）。1990年，Ueda等[20]从大蒜中分离获得赋予浓厚味的物质，鉴定结果表明大蒜中浓厚味的主要贡献者为γ-谷氨酰肽，包括GSH和γ-谷氨酰基-S-烯丙基-L-半胱氨酸（γ-Glu-S-allyl-Cys）等。随后，Ueda等[21]又从洋葱中分离鉴定出新的浓厚味物质γ-谷氨酰基-S-(1-丙烯基)-半胱氨酸亚砜。近年来，对菜豆[4]、Gouda干酪[22]等存在kokumi味道的成分分析发现，γ-kokumi肽物质是其主要的味道提供者。Kuroda[6,23-24]和Miyamura[7,25-26]等陆续在商业鱼酱、加工扇贝、酱油、酿造酒精饮料等食品中检测鉴定获得一种典型的γ-kokumi肽——γ-Glu-Val-Gly，并指出该肽对发酵食品感官品质具有显著影响[27]；后续的食品增味实验结果也表明，γ-Glu-Val-Gly添加到低脂食品或鸡肉清汤中能明显提升其味道的饱满感和持续性[9,27]。Zhao等[28]也在发酵的酸面团中鉴定出6 种γ-kokumi肽（表1），这些肽是面团浓厚感味的关键成分。最近，研究人员逐渐开始关注γ-kokumi肽的酶法合成，Yang Juan等[29-30]通过生物酶催化方法合成了多种系列的γ-kokumi肽，分别有γ-[Glu](n=1,2,3,4,5)-Phe、γ-[Glu](n=2,3,4)-Val和γ-[Glu](n=2,3,4)-Met，这些γ-kokumi肽都展现出浓厚的味道，并且能有效增强酱油的鲜味和连续性，以及鸡肉清汤的浓厚感和饱满感。 越来越多的γ-kokumi肽从不同的风味食物中被鉴定获得，并陆续地被验证能赋予食物浓厚感、饱满感、持续性等口感特性，展现出非常强的增味能力；因此，γ-kokumi肽具有进一步开发成相关肽类食品风味增强剂的巨大潜力。 表 1 γ-kokumi肽的序列及来源
Table 1 Sequences and sources of γ-kokumi peptides  γ-kokumi肽 来源 参考文献γ-Glu-Cys-Gly（GSH） 大蒜、洋葱、酵母提取物 Ueda等[20-21]γ-Glu-S-allyl-Cys 大蒜、酶合成 Ueda[20]、Speranza[31]等γ-Glu-S-(1-propenyl)-cysteine sulfoxide 洋葱 Ueda等[21]γ-Glu-Val 菜豆、化学合成、发酵面团、酶合成Dunkel[4]、Toelstede[22]、Zhao[28]、Lee[34]等γ-Glu-Cys-β-Ala 菜豆 Dunkel等[4]γ-Glu-Glu 奶酪、发酵面团 Toelstede[22]、Zhao[28]等γ-Glu-Gly 奶酪 Toelstede等[22]γ-Glu-Gln 奶酪 Toelstede等[22]γ-Glu-Met 奶酪、化学合成、发酵面团、酶合成Dunkel[4]、Ohsu[32]、Zhao[28]、Suzuki[33]等γ-Glu-Leu 菜豆、奶酪、发酵面团、酶合成Kuroda[6,23-24]、Miyamura[7,25]、Speranza[31]、Suzuki[35]等γ-[Glu](n=1,2,3,4,5)-Phe 酶合成 Yang Juan等[29]γ-[Glu](n=2,3,4)-Val 酶合成 Yang Juan等[30]γ-[Glu](n=2,3,4)-Met 酶合成 Yang Juan等[30]Toelstede[22]、Ohsu[32]、Zhao[28]、Speranza[31]等γ-Glu-His 奶酪 Toelstede等[22]γ-Glu-Ile 发酵面团 Zhao等[28]γ-Glu-Tyr 大豆 Shibata等[11]γ-Glu-Phe 大豆、发酵面团、酶合成 Shibata[11]、Zhao[28]、Suzuki[35]等γ-Glu-Ala 化学合成 Ohsu等[32]γ-Glu-Cys 化学合成 Ohsu等[32]γ-Glu-Abu-Gly 化学合成 Ohsu等[32]γ-Glu-Cys-Gly 化学合成 Ohsu等[32]γ-Glu-Val-Gly 奶酪、鱼酱、扇贝、酱油、啤酒、清酒、化学合成
1.3 γ-kokumi肽的呈味评价方法目前对γ-kokumi肽的呈味评价方法通常为感官评价法和钙敏感受体（calcium-sensing receptor，CaSR）活性检测法。 感官评价法因简便、迅速、准确分析样品的优点，被广泛用作于呈味肽呈味效果的测定[36]。γ-kokumi肽的感官评价测定不同于基本味觉酸、甜、苦、咸、鲜肽的测定方式，原因在于自身的水溶液基本上不存在味道或者呈味效果较低，但是只需要少量添加至鲜味物质（如谷氨酸钠）中，即可显著降低其鲜味阈值并提升鲜味溶液的连续性和口感。因此在采用感官评价法评价γ-kokumi肽的阈值时，将实验品按照一定浓度梯度稀释添加到基本的酸、甜、苦、咸、鲜的感官标准的单一溶液或者是混合液，按照一定标准进行打分，再根据统计学分析得出最终的感官评价结果。但是由于kokumi味物质的呈味的复杂性，使用感官评价法难以满足定量准确的检测，因此需要寻找更精确的检测方式。 教育部于2000年发布了《高等学校仪器设备管理办法》的通知，在第二章第九条中界定了贵重仪器设备的判定标准，以购置金额为主要判断标准，即单价在人民币10万元(含)以上的仪器即为贵重仪器设备。 近年来，CaSR活性检测法作为一种新型γ-kokumi肽的检测方法逐渐受到学者的关注[37-38]。CaSR作为人体感知kokumi物质受体，与基本味觉的受体有味觉信号功能偶联性。Brennan等[39]对kokumi类物质的信号传递做出以下猜想：CaSR在接收到kokumi物质受体时，接收刺激释放Ca2+增加胞内浓度，产生一系列的味觉信号传导，如增加ATP释放加强接收鲜味物质的信号，从而达到降低鲜味物质阈值的效果。Ohsu等[38]合成一系列γ-谷氨酰肽，采用CaSR结合感官评价检测法检测kokumi呈味效果，结果表明经过感官验证确定的γ-kokumi肽均能激活CaSR，且呈味阈值的高低与激活CaSR的激活力密切相关。后来，Yusuke[18]和Kuroda[40]等进一步研究了CaSR的感应机制，检测了一系列人工合成的γ-kokumi肽，结合感官评价验证，发现γ-kokumi肽的阈值越低，刺激CaSR释放Ca2+的能力越强。由此表明CaSR活性检测法可作为一种新型γ-kokumi肽的检测方式。但是CaSR方法检测存在一定局限性，因为CaSR易受到某些阳离子、碱性肽类和多胺类物质的刺激释放Ca2+导致检测结果的不准确性[41-42]。因此CaSR活性检测法通常是与感官评价法共同使用对kokumi物质进行检测。 1.4 γ-kokumi肽的制备尽管γ-kokumi肽具有非常强的增味功能，但是市场上γ-kokumi肽类食物增味剂非常少，仅有GSH或富含GSH的酵母提取物成功商业化并用于增强食物的浓厚味[43-45]，其中最重要的一个原因是γ-kokumi肽的大规模生产能力较低。目前制备γ-kokumi肽方法主要有化学合成、微生物发酵和酶法合成。 Hold住萌 坑爹 给力 围观 你懂的 肿么了 有爱 神马浮云 吐槽 蛋疼 达芬奇的眼泪 啥都有 円族 有木有 云电视 伤不起 我勒个去 谣盐 你妹 腐女 普通青年 文艺青年 2B青年 隐蔽青年 SKI族 妥妥的 虎妈 高压锅族 驴友 微电影 加名税 尼玛 小清新 此处省略一万字 闪玩 求干货 拇指消费 地沟油 癌症性格 冻脸效应 悲催Peak people Cyberflaneur Linsanity NC AFK Eurogeddon Drynuary 化学合成法以简单底物作为原料进行合成γ-kokumi肽，例如Yusuke等[18]通过N-α-苄氧羰基保护γ-谷氨酰基并逐个地将Glu、Val、Gly残基缩合到主链制备γ-Glu-Val-Gly，最终得率为54%，但化学合成由于反应途径长、基团修饰操作复杂、成本高、化学物毒性等问题，不适用于γ-kokumi肽的工业化水平大规模生产。由于当前大部分γ-kokumi肽来源于发酵风味食品，传统的微生物发酵也是获得γ-kokumi肽浓厚味物质有效选择之一。然而目前常见的发酵风味食品都是传统的固态发酵，存在时间长、产量低、纯化难，工业化难度较高等问题，仅有少许γ-kokumi肽，如GSH通过液态发酵实现了大规模生产，且优化发酵工艺提高了其产量[46]，但产物分离纯化难等问题亟待解决。酶法合成是通过生物酶催化合成γ-kokumi肽。文献中已报道的酶主要有两种：1）谷氨酰胺酶（EC 3.5.1.2）。该酶具有一定的γ-谷氨酰基转移活性[47-48]，有少数学者通过谷氨酰胺酶合成γ-kokumi肽，用于提升食物风味[29-30,49]。但谷氨酰胺酶受体的底物特异性较差，γ-谷氨酰基转移活性较低，难以用于γ-kokumi肽的工业化生产。2）GGT。GGT属于转移酶而不是合成酶，它不需要ATP等能量来源，并且酶活力较高，具有大规模生产γ-kokumi肽的应用前景。关于GGT转肽催化生产重要γ-谷氨酰类化合物如：L-茶氨酸、γ-谷氨酰-多巴等[13-15]的研究已经比较成熟，为GGT催化生产γ-kokumi肽提供了强有力的参考。 综上所述，在γ-kokumi肽的制备中，由于化学合成的步骤复杂、成本高以及传统发酵法的产量低、纯度低等缺点，酶法合成被视为一种有效的、低成本的生产手段。其中，GGT因具有较强的转肽活性而在γ-谷氨酰类化合物的合成中备受重视，使用GGT生产γ-kokumi肽将有效促进γ-kokumi肽的生产及在食品调味中的应用。 2 γ-kokumi肽合成酶GGT2.1 GGT的来源及结构分析GGT也称“谷氨酰基转移酶”或“谷酰转肽酶”，从20世纪中叶开始，人们从细菌、植物、动物中相继发现GGT，如奇异变形杆菌（Proteus mirabilis，Pm）GGT[50]、大肠杆菌（Escherichia coli，Ec）GGT[51]、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，Bs）GGT[52]、幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori，HpGGT）[53]、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis，Bl）GGT[54]和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens，Ba）GGT [55]、洋葱和老鼠、牛、马、人（human GGT，HGGT）的肝、肾、胰提取物等[50,56]。GGT在原核生物和真核生物的分布情况具有一定的差异性，真核生物中GGT定位于细胞膜，原核生物中则分布在周质空间或者被分泌到细胞外[57-58]。正是由于这种分布的差异性，原核生物来源的GGT更便于提取和纯化，因此在工业生产中主要采用原核来源的GGT进行生产γ-谷氨酰基化合物，如采用EcGGT酶法合成γ-谷氨酰类化合物茶氨酸[51,59]，或将BsGGT添加到“moromi”半固态发酵发酵液中可提升成品的醇厚滋味感[60]。 随着科学技术的发展，蛋白质结晶技术得到了全新的突破，蛋白质结构解析的分辨率越来越高，有助于深入理解蛋白结构和功能之间的关系。近年来，多个研究团队解析了不同来源的GGT晶体结构，以期从接近原子水平的精密结构解释其生化特性存在的差异性。对蛋白质结构数据库中的GGT序列比对（图2）和结构比对（图3）分析发现，根据活性中心区域空间构象的不同可以分成两类。 第一类为带有“活性开关装置”活性中心的GGT，如HGGT（PDB：4Z9O）[61]、HpGGT（PDB：2QM6）[62]、EcGGT（PDB：2DBU）[63]等。以EcGGT活性中心结构为例（图3a），其活性中心是一个有“封口的口袋”，该结构的形成是由于：GGT自裂解催化过程中，位于活性中心的EcGGT的大亚基C端末尾氨基酸（第375～390位）围绕Ile378发生偏转，并远离小亚基N端Thr 30Å以上。空出来的区域形成一个能够接受γ-谷氨酰化合物的活性口袋，并且活性口袋的上方存在大部分真核细胞中才会存在的“盖子-突环”结构（lid-loop）[64]，该loop结构柔性较大，形成一个活性开关装置，控制着底物和产物进出的速率。第二类为“开放式”活性中心GGT，如BsGGT（PDB：3A75）[64]和BlGGT（PDB：4OTT）（图3b）[65]等。与第一类GGT活性中心区别在于，这类GGT在自在酶自成熟的过程中大亚基的C端末尾在成熟前后没有发生偏移构象的改变，位于小亚基的N端附近，并且在活性中心上方不存在lid-loop结构，从而形成开放式的活性中心结构。  图 2 不同来源GGT序列比对[50-55,61]
Fig. 2 Alignment of GGT sequences from different sources[50-55,61]
 图 3 EcGGT（a）[63]和BlGGT（b）[65]的三维结构差异
Fig. 3 Three-dimensional structural differences between EcGGT (a) and BlGGT (b)
对GGT活性中心及周边区域分析发现，存在活性中心上方的lid-loop结构起着隔离活性中心和外部环境的作用，在酶催化反应过程中作为底物和产物进出的开关[62]。而控制lid-loop结构灵活的关键性氨基酸为盖环顶点处的芳香族氨基酸[62,66]。原核生物以EcGGT为例（图4a），lid-loop上保守的Tyr444上的酚羟基与保守的Asn411的侧链酰胺官能团形成氢键保持lid-loop的空间位置，从而起到保护活性中心的功能[67]。而HGGT的酶活力高于原核生物来源的GGT，原因在于lid-loop中心处EcGGT Tyr444所对应的氨基酸残基为Phe433，该残基不存在酚羟基，因此不能形成氢键（图4b），这样增加了lid-loop的灵活性，有利于底物的进入和产物的释放[68]。Terzyan等[61]对HGGT进行结晶进一步证明HGGT不含上述可以固定lid-loop结构的氢键（图4b），从而导致HGGT的lid-loop柔性较高，具有有高迁移率。Calvio等[69]也对lid-loop结构的作用进行进一步探究，将EcGGT上的lid-loop结构通过基因设计到BsGGT中，在突变体BsGGT催化反应过程中，lid-loop结构展现出优先允许小分子γ-谷氨酰底物进入酶的活性中心而大分子后进入的调控功能，并且突变过后BsGGT的酶活力和稳定性比原酶显著提升，酶稳定性增高的原因可能是lid-loop结构对活性中心有一定的保护作用。以上的研究发现有助于选择用于生产γ-kokumi肽及其他γ-谷氨酰化合物为目的产物的GGT，还为设计具有高酶活力的突变体GGT提供一定参考意见。 在教学“平行四边形面积”的内容时，需要注重内容的内在逻辑性，要有利于学生的学习。通过个人数一数方格数、与同桌切割一下平行四边形，拼一拼图形等合作交流来探索“平行四边形面积”计算方法，对提升学生数学交流能力有着很大的作用，同时还利于发展学生的空间观念。  图 4 EcGGT（a）[63]和HGGT（b）[61]的lid-loop结构差异
Fig. 4 Lid-loop structural differences between EcGGT (a)[63]and HGGT (b)[61]
2.2 GGT的成熟机制 图 5 EcGGT自催化剪切过程[63]
Fig. 5 Autocatalytic cleavage process of EcGGT[63]
GGT属于N末端亲核水解酶家族的成员之一，这类酶家族成员的共同特点是：转录翻译生成的前体蛋白没有酶活力，需要激活N端的Ser或者是Thr进行自催化裂解后才能产相应生酶活力，称为自催化裂解成熟机制[63,70-71]。在GGT的自催化裂解过程中，其关键氨基酸为小亚基N端高度保守的Thr[63,72]。Okada等[63,73]使用Ala将EcGGT小亚基N端Thr取代，获得的突变体T391A在形成二聚体过后没有酶活力，Pica[74]、Murty[75]、Kristin[76]等采用类似的方法对BlGGT、BsGGT等不同来源的GGT进行突变验证，也得到相同的结果。以上研究表明小亚基N端的Thr对GGT自催化裂解反应起着关键性的作用。GGT自催化裂解具体过程如图5所示，GGT基因首先通过转录翻译形成前体蛋白，小亚基N端的Thr作为亲核试剂进攻大亚基C端的羰基形成过渡状态的四面体中间体，Thr上的氨基通过质子化裂解C—N形成酯中间体，最后细胞基质中的水作为活性剂进攻中间体的羰基，前体蛋白裂解成为二聚体。二聚体的大亚基分子质量通常为38～72 kDa，小亚基的分子质量为20～66 kDa。 “Paid in full with one glass of milk. Dr.Howard Kelly.” 2.3 GGT的催化机理小亚基N端高度保守的Thr不仅是GGT前体蛋白自催化裂解成熟的关键氨基酸，也是GGT催化反应中进攻底物的关键催化位点。GGT在催化反应属于乒乓反应机制，分为酰化反应和去酰反应两个步骤（图6）[72,77-79]。酰化反应：首先是γ-谷氨酰底物进入GGT的活性中心，GGT小亚基N端上的Thr羟基氧原子亲核进攻底物上γ-谷氨酰的羰基肽，形成γ-谷氨酰基-GGT中间体[80]；去酰化反应[12]：水、氨基酸或者多肽类（一般为二肽或者三肽）等作为亲核试剂物质进入GGT活性中心进攻γ-谷氨酰基-GGT四面体中间体的羰基，中间体键断裂从而生成新的γ-谷氨酰基化合物。根据去酰化亲和试剂的种类不同分为水解反应、转肽反应和自转肽反应。GGT反应类型与所处环境的pH值密切相关相关，水解反应在酸性或者中性条件下进行，而转肽反应在碱性条件下进行。 到了晚上，杨力生回到家，老两口如实向他述说吴玉梅登门说媒的事，并且反复问杨力生，是否真的已与杨秋香谈过恋爱。杨力生见瞒不住，只得承认。不料，父亲一听说这情况，当即便骂起来：“呸！你这个没有骨气的东西，我多年搞养殖业，辛辛苦苦地攒钱让你做买卖，一心指望你找那门当户对的姑娘成个家，难道你就想给家里找这么个饿皮虱子？！”  图 6 GGT的催化机理及反应类型[63]
Fig. 6 Catalytic mechanism and reaction type of GGT[63]
2.4 GGT转肽反应的应用目前已有报道表明，使用GGT可成功催化生产多种γ-谷氨酰类化合物，如：L-茶氨酸、γ-谷氨酰-多巴等[13-15]，但是GGT在碱性条件下极易发生不可逆的变性失活，限制其在实际生产中的应用。彭清等[15]发现GGT在高pH值下容易失活的原因是亚基解聚导致活性中心构象发生改变[81]，为稳定GGT的亚基结构，在远离酶活性中心的亚基表面选择合适的位点进行改造，增强亚基的疏水性能，最终得到稳定性较强的突变酶Y280V比原酶在高pH值下活力提高至58%以上。Keillor[12]及Carlo[82]等发现GGT在碱性条下进行转肽反应时，自转肽反应也存在，这导致得到的产物产量和纯度较低。因此，在GGT工程化方面，如何降低自转肽反应的发生以及提高转肽反应效率从而提高产物量是当前亟待解决的重要问题。 最近，Lin Longliu[65]、Lin Minguan[83]等发现来源于地衣芽孢杆菌的BlGGT转肽酶活力较高，对其活性口袋中的关键位点和周围的氨基酸空间结构进行分析（图7），发现BlGGT活性中心结构由周围残基形成的氢键网络所固定，其中，构成氢键网络的保守残基Asn450对活性中心的稳定具有重要影响，对该点活性改造设计得到的突变体N450D不仅明显提高转肽反应的催化能力，还将转肽反应/水解反应比例从3.5最高提升到18。Bindal等[84]对Arg109的定点突变研究发现，其带正电荷的侧链基团对底物的结合和自转肽催化至关重要，突变体R109K自转肽反应的活性降低，转肽反应合成茶氨酸效率得到了明显的提高。Pica[74]、Nakajima[85]和Chi Mengchun[86]等则对Arg109在BlGGT活性中心的具体作用进行了研究，改造与活性中心Arg109侧链相互作用的Gly482和Gly482，酶的整体构象几乎没有发生改变，但是活性中心的Arg109空间位置发生较大偏移从而导致对酶活性产生了影响。由于GGT催化的相似性，其他来源的GGT可参考上述结果进行酶工程改造以提高转肽活性和降低自转肽反应活性，为生产γ-kokumi肽提供良好的酶催化剂。  图 7 BlGGT活性中心的关键残基[65,74,83-84,86]
Fig. 7 Key residues in the active center of BlGGT[65,74,83-84,86]
3 GGT合成γ-kokumi肽的应用3.1 GGT合成γ-kokumi肽的优势GGT具有独特转肽催化特性，对于γ-谷氨酰类化合物特别是γ-kokumi肽的工业化生产非常有意义。相较于其他合成方法，使用GGT作为生物酶催化剂生产γ-kokumi肽具有多方面的优势[87]：1）和化学合成法相比，GGT催化合成无需对氨基酸或其他活性基团进行基团保护和去保护操作，酶仅同γ-谷氨酰基供体和受体相互作用，反应过程简单；2）GGT属于转移酶而不是合成酶，进行催化时不需要ATP、金属阳离子等能量物质或辅助因子；3）GGT对γ-谷氨酰基受体的底物特异性非常广泛，添加不同的受体即可生成相应的γ-谷氨酰类化合物；4）细菌来源的GGT以未糖基化修饰的可溶性蛋白形式存在于细胞的周质空间或胞外，因此细菌来源的GGT比较容易获得；5）不同于哺乳动物来源的GGT，细菌来源的GGT转肽催化时能使用较廉价的γ-谷氨酰基供体，如谷氨酰胺等，可有效地降低生产成本。 3.2 GGT合成γ-kokumi肽实际应用在21世纪之前，γ-谷氨酰肽的kokumi味性质未被广泛了解，GGT曾作为一种风味改善酶进行研究，证实该酶可改善食物的整体风味并能减弱苦味氨基酸的苦味[35,88-89]。近10 年来，对于GGT合成γ-kokumi肽并改善食品风味的可行性研究报道逐渐增多。2009年，Toelstede等[5]研究证明青霉菌（Penicillium roqueforti）来源的GGT直接参与了蓝色脉纹奶酪中γ-kokumi肽的合成，对奶酪的浓厚味具有重要的贡献作用。Hillmann等[10]也证实牛奶原料中的GGT是帕玛森芝士成熟过程中浓厚味物质——γ-kokumi二肽形成的关键因素。类似地，van Ho等[60]在日本发酵豆酱中添加BsGGT合成γ-kokumi肽以提升豆酱的浓厚感味，结果表明γ-Glu-Val和γ-Glu-Val-Gly两种γ-kokumi肽浓度分别提高到70 µmol/L和16 µmol/L，同时提升了产品的鲜味，增强了豆酱的风味。 GGT催化合成γ-kokumi肽的能力得到验证后，研究人员逐步开始通过添加特异性γ-谷氨酰基受体的方式用GGT催化合成特定的γ-kokumi肽。Suzuki等[35]以细菌来源的GGT为生物催化剂合成γ-Glu-Phe，在Gln和Phe浓度200 mmol/L、酶活力0.5 U/mL、pH 10.4及温度37 ℃的条件下反应1.5 h，最终γ-Glu-Phe的产率为70%，远高于化学合成；随后，Suzuki等[33]按照同样的方法，优化反应条件后，GGT催化合成γ-Glu-Val的产率高达88%。2012年，Speranza等[31]通过添加不同受体的方式成功合成了γ-Glu-S-allyl-Cys和γ-Glu-Met及其衍生物，但γ-kokumi肽的产率较低，可能的原因是该实验中GGT来源于马肾，转肽反应活性较低。近些年，Lee[34]、Chi Mengchun[86]、Chen Yiyu[90]等使用BlGGT逐步合成了γ-Glu-S-allyl-Cys、γ-Glu-Phe和γ-Glu-Leu 3 种γ-kokumi肽，并通过条件优化提高这些肽的产量；值得注意的是，该团队还研究了BlGGT的固定化催化应用[91]，通过共价键或非共价键的方式将BlGGT固定在氧化石墨烯纳米片上催化合成γ-Glu-Phe和γ-Glu-Leu，最终产物收率都超过31%，其中共价固定的GGT在30 d的储存期间具有与游离酶相当的酶稳定性，可以循环催化9 次，9 次使用后其酶活力约为初始酶活力的45.3%。另外，Suzuki等[92]创新性地将谷氨酰胺酶和GGT组成双酶合成系统，添加到麦麸和大豆蛋白后高效进行γ-谷氨酰物水解反应和转肽反应，最终生产获得浓厚味较强的增味剂。总地来说，由于GGT具有以上诸多优点，利用GGT催化是合成γ-kokumi肽的一种有效的、低成本的生产手段，并且结合酶工程改造、酶固定化催化及双酶合成系统等工程化策略能有效提高GGT生产能力，并降低生产成本，有助于酶法合成γ-kokumi肽的工业化生产。 4 结 语前期关于γ-kokumi肽结构特征、调味应用及酶法合成的研究取得了很大的进步，但仍然有许多科学及工程等各方面的问题值得进一步研究。1）γ-kokumi肽的稳定性和安全性。由于γ-kokumi肽的目标是开发相关肽类增味剂，在产品贮藏、消费以及食用过程中其稳定性和安全性应得到高度重视，相配套的食品准入门槛和定性、定量分析检测标准也需同步进行探索和研究。2）γ-kokumi肽的三维构象特征。关于γ-kokumi肽二级结构与呈味的关系研究已经取得了较大的进展，但更为重要的三维构象特征未被清楚认识，而γ-kokumi肽正是因为特殊的三维构象才能激活kokumi受体并传递信号，产生浓厚味；因此，应加强基于kokumi受体的γ-kokumi肽三维结构特征分析，从分子层面理解γ-kokumi肽呈味机制，也为新型γ-kokumi肽的设计和挖掘提供参考。3）GGT合成γ-kokumi肽的效率和产量还有待提高。目前文献已报道的GGT催化合成γ-kokumi肽几乎都处于实验室级生产水平，还未找到同时满足高转化率、高产量、高强度的GGT，后续的研究可以通过筛选高活性的GGT和GGT酶工程改造，或结合液态发酵、固定化酶等工程化策略提高γ-kokumi肽的合成效率和强度，同时加强生产工艺的研究提高其产量，为γ-kokumi肽低成本、高产量的工业化生产提供基础。 最后，要有爱心、耐心和高度责任心，树立终身学习意识，提高自身的师德修养，增强服务意识，不断开拓创新。留学生辅导员要具有良好的修养和师德，做好中国文化的代言人，要用自身的人格魅力和道德修养去感化学生。同时，也要不断丰富和完善自我，关注国际时政新闻，把握留学生心理动向，及时做好各种突发事件的预防和处理工作，更好地完成留学生教育管理与服务工作。 虽然国内对于γ-kokumi肽的研究起步较晚，但也有多个优秀的研究团队在开展相关工作，随着多方面问题的深入研究，会有更多的浓厚味增味剂出现在餐桌上，为我们创造更绿色、健康、美味的幸福生活。 参考文献： [1] 佚名. 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Recent Advances in γ-Kokumi Peptide and Its Synthetase γ-Glutamyl Transpeptidase WU Yuanming1, WU Lunjie1, WANG Li1, LIN Lu1, LIU Yi1, SUN Weifeng2, DING Wenwu1,*
(1. School of Food and Biotechnology, Xihua University, Chengdu 610039, China;2. College of Life Science and Environment, Hengyang Normal University, Hengyang 421008, China) Abstract: Kokumi is one of the sixth basic taste candidates, whose addition to food can enhance the thickness, mouthfulness,continuity and harmony of taste. As a result, kokumi-related flavor products have a great potential to be developed and marketed. γ-Glutamyl peptides with kokumi flavor are an important class of kokumi substances, also called γ-kokumi peptides, composed of γ-glutamyl and amino acid/polypeptide, which could be synthesized by γ-glutamyl transpeptidase(GGT). In this paper, the structural characteristics and food sources of γ-kokumi peptides and the methods used for their taste evaluation and preparation, as well as the structural characteristics, catalytic mechanism and application for the synthesis of γ-kokumi peptides of GGT are reviewed, which will provide a basis for the development of γ-kokumi peptide-related flavor products and their enzymatic synthesis with GGT. Keywords: γ-kokumi peptides; structural characteristics; γ-glutamyl transpeptidase; enzymatic synthesis
收稿日期：2019-01-27 基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（31601418）；四川省科技厅应用基础项目（2019YJ0390）；衡阳师范学院人才引进项目（18D14）；四川省教育厅项目（15ZB0126） 第一作者简介：伍圆明（1994—）（ORCID: 0000-0001-9765-0381），男，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail: 905291021@qq.comDOI:10.7506/spkx1002-6630-20190127-352 中图分类号：TS201.4 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2020）05-0256-10 引文格式： 伍圆明, 伍伦杰, 王莉, 等. γ-kokumi肽及其合成酶γ-谷氨酰转肽酶的研究进展[J]. 食品科学, 2020, 41(5): 256-265.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190127-352. http://www.spkx.net.cnWU Yuanming, WU Lunjie, WANG Li, et al. Recent advances in γ-kokumi peptide and its synthetase γ-glutamyl transpeptidase[J]. Food Science, 2020, 41(5): 256-265. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190127-352. http://www.spkx.net.cn
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发表于 2021-2-1 21:04:40
