酪蛋白糖基化对其胰蛋白酶消化物在免疫低下模型小鼠中...

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酪蛋白糖基化对其胰蛋白酶消化物在免疫低下模型小鼠中免疫活性的影响酪蛋白糖基化对其胰蛋白酶消化物在免疫低下模型小鼠中免疫活性的影响

时 佳1，刘宛宁1，付 余2，赵新淮1,*

（1.东北农业大学 乳品科学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030；2.西南大学食品科学学院，重庆 400715）

摘 要：本研究揭示酪蛋白美拉德糖基化反应对其胰蛋白酶消化物在免疫低下小鼠中免疫活性的影响。通过酪蛋白与乳糖发生美拉德糖基化反应得到糖基化酪蛋白，利用胰蛋白酶消化分别制备酪蛋白消化物和糖基化酪蛋白消化物，并用80 mg/kg mb的环磷酰胺处理小鼠3 d以诱导其出现免疫低下；低（100 mg/kg mb）、中（200 mg/kg mb）和高（400 mg/kg mb）剂量的酪蛋白消化物灌胃小鼠25 d后，测定小鼠免疫器官指数（脾脏指数和胸腺指数）、血清生化指标、血清免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）质量浓度、脾淋巴细胞增殖指数和自然杀伤（natural killer，NK）细胞活力。结果表明，与生理盐水处理的正常组小鼠相比，模型组小鼠的免疫状况低下，其免疫器官指数、血清生化指标、血清中Ig质量浓度、脾淋巴细胞增殖指数和NK细胞活力等指标显著降低（P＜0.05）。与模型组小鼠相比，中、高剂量酪蛋白消化物灌胃小鼠脾脏指数和胸腺指数分别增加35.9%～66.4%和50.5%～62.9%，血清IgM、IgA和IgG质量浓度分别增加21.6%～30.4%、27.1%～41.8%和37.2%～45.1%，脾淋巴细胞增殖指数及NK细胞活力分别增加34.2%～51.1%和32.1%～90.7%；中、高剂量糖基化酪蛋白消化物灌胃小鼠后脾脏指数和胸腺指数分别增加27.7%～51.9%和39.2%～52.6%，血清IgM、IgA和IgG质量浓度分别增加19.1%～29.0%、21.8%～35.3%和30.1%～41.6%，脾淋巴细胞增殖指数及NK细胞活力分别增加32.9%～41.6%和27.3%～81.1%。酪蛋白消化物和糖基化酪蛋白消化物均可明显减轻由环磷酰胺引起的上述免疫指标水平下降，且酪蛋白消化物比糖基化酪蛋白消化物具有更好的免疫指标水平提升作用。酪蛋白的美拉德糖基化反应会降低酪蛋白消化物对小鼠免疫状况的提升作用。

关键词：酪蛋白；美拉德反应；糖基化；小鼠；免疫作用

酪蛋白是含量最多的乳蛋白成分，并且是食品工业广泛应用的蛋白质配料。近20 年来，为进一步提高酪蛋白的应用效果，科研人员通过物理、化学或生物等不同途径修饰酪蛋白结构、改进其功能性质，糖基化是其中修饰技术之一。美拉德反应是蛋白质（提供氨基）和还原糖（提供羰基）之间的反应，可以导致蛋白质发生糖基化。研究发现，利用美拉德反应和蘑菇β-葡聚糖对燕麦分离蛋白进行糖基化修饰，修饰后燕麦分离蛋白的溶解性、乳化性和热稳定性得到改善[1]。葡聚糖和乳清分离蛋白经美拉德反应糖基化后，蛋白质分子间相互作用降低，在较大pH值范围内和较高浓度下有较好的溶解性和热稳定性[2]。利用美拉德反应分别和葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、核糖糖基化得到糖基化β-乳球蛋白，其乳化和起泡性质均得到改善，并且这些性质的改善程度与糖种类有关[3]。蛋白质糖基化反应对蛋白质的某些生物活性也有影响。例如，葡萄糖糖基化的豌豆7S球蛋白有更低的抗体亲和性和较低的Caco-2单层细胞毒性[4]；乳糖糖基化的酪蛋白具有较低的免疫活性[5]。作为重要的营养素之一，蛋白质对动物机体的免疫状况有直接影响，可以促进免疫器官发育、淋巴细胞增殖，以及降低迟发性过敏反应[6–8]。然而，在免疫低下小鼠模型中，美拉德糖基化反应对酪蛋白消化物的免疫增强作用是否有影响的相关研究鲜见报道。

环磷酰胺是一种细胞毒性化疗药物，属于烷化剂类免疫抑制剂，因此常被用于建立免疫低下动物模型[9–10]。本研究利用环磷酰胺诱导免疫低下小鼠模型，确定糖基化酪蛋白消化物对免疫低下小鼠免疫状况的改善作用，并与酪蛋白消化物对比，以揭示酪蛋白美拉德糖基化反应对其消化物免疫活性的潜在影响。

1 材料与方法1.1 材料与试剂

雌性BALB/c小鼠（6～8 周龄；生产许可证号：SCXK（京）2012-0001，使用许可证号SYXK（黑）2016-007）和饲料 北京维通利华实验动物技术有限公司；小鼠淋巴瘤YAC-1细胞 中国科学院细胞库。动物实验按照哈尔滨医科大学实验动物准则执行。

酪蛋白、乳糖、环磷酰胺和刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA） 美国Sigma公司；磷酸盐缓冲液 北京索莱宝科技有限公司；胰蛋白酶（120 000 U/g） 北京奥博星生物技术有限公司；台盼蓝 美国Amresco公司；RPMI-1640培养基 美国HyClone公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）加拿大Wisent公司；半乳糖测试盒 美国BioAssay Systems公司；CCK-8检测试剂盒 日本Dojindo公司；鼠免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）（IgM、IgA、IgG）检测试剂盒 南京建成生物技术有限公司；其他化学试剂均为分析纯级。

1.2 仪器与设备

DELTA 320型精密pH计、AL204型电子分析天平梅特勒-托利多（上海）仪器有限公司；HF-90型CO2培养箱 美国力康公司；Model 680型酶标仪 美国Bio-Rad公司；DK-98-1型电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳糖糖基化酪蛋白消化物的制备

取一定量乳糖均匀分散于60 g/L酪蛋白溶液中，使乳糖和酪蛋白质量比为1.6∶1，调整酪蛋白终质量浓度为50 g/L、溶液pH 6.8。将反应物于沸水浴（100 ℃）中反应3 h，然后将样品在冰浴中迅速冷却至室温。调整溶液pH值至4.5，4 000×g离心10 min，收集沉淀，pH 4.5下水洗2 遍，所得沉淀用0.5 mol/L NaOH溶液调节pH 7，冷冻干燥后粉碎得到糖基化酪蛋白（乳糖含量（13.2±0.4）g/kg pro）。

老三这时也看到了孔老一，连滚带爬冲了过来，也不说话，见面就跪：“哥，哥，咱爸过山去了。”说罢便伏地嚎啕大哭说罢便伏地号啕大哭。

质量浓度为50 g/L、pH 7.0的酪蛋白溶液和糖基化酪蛋白溶液中分别加入胰蛋白酶（7 000 U/g pro），37 ℃水解4 h，沸水浴灭酶5 min，快速冷却至20 ℃，再用0.5 mol/L NaOH溶液调整pH值至7.0，冷冻干燥粉碎后得到酪蛋白消化物和糖基化酪蛋白消化物（乳糖含量（10.6±0.3）g/kg pro）。

从单个英文译本内部来看,53个术语只出现过1次(不存在不一致的问题),109个术语出现2次以上:t1中31个术语有多个译文(一处误译guarantor);78个术语仅1个译文版本。t2中26个术语有多个译文(一处误译mortgagee);83个术语仅1个译文版本。t3中31个术语有多个译文;78个术语仅1个译文版本。

1.3.2 化学指标测定

浙江省国土资源网上交易平台建设及运行特点分析（黄炎等） ......................................................................4-22

蛋白含量：用凯氏定氮法测定样品含氮量，转换因子为6.38。

乳糖含量：按照文献[11]方法测定乳糖含量。称取一定量样品于安瓿瓶，加入2 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液，100 ℃水解4 h，冷却至20 ℃，用0.1 mol/L NaOH溶液调整pH值至7.0，用半乳糖测试盒测定水解液半乳糖浓度，然后换算为样品中的乳糖含量。

要保证就业指导工作的质量和效果，高职院校首先要对教师的专业能力和综合素养进行系统提升，为此，学校可通过举办教学技能和专业技能大赛来强化教师的专业能力，并聘请这方面的专家进行知识讲座和能力培训，从而提升教师的业务能力。与此同时，大学生就业指导工作应贯穿到大学生学习培养的整个过程当中，结合不同阶段的教学目标和培养标准，帮助学生进行合理的职业定位。在这个过程中，可以通过举办模拟招聘会等形式帮助学生掌握应试技巧、提升心理素质。

1.3.3 小鼠分组及模型建立

雌性BALB/c小鼠80 只，适应性饲养1 周后，分为8 组：正常组、模型组、6 个实验组，每组10 只。正常组小鼠每天灌胃生理盐水28 d；模型组小鼠灌胃80 mg/kg mb环磷酰胺3 d后，再灌胃生理盐水25 d；实验组小鼠先灌胃80 mg/kg mb环磷酰胺3 d，再分别给予100、200、400 mg/kg mb的酪蛋白消化物或糖基化酪蛋白消化物25 d。

1.3.4 血清生化指标和Ig质量浓度测定

小鼠最后1 次灌胃24 h后，称体质量，眼球采血。血液样品于2 000×g离心10 min，用Beckman DXC 800自动生化分析仪测定血清生化指标。按照相应试剂盒说明书操作测定血清IgM、IgA、IgG质量浓度。

1.3.5 脾脏指数和胸腺指数测定

小鼠眼球取血后，脱颈处死，剖取脾脏和胸腺，滤纸吸取表面残留血液及多余水分，分别称湿质量。脾脏指数和胸腺指数分别按式（1）、（2）计算。

   

1.3.6 脾淋巴细胞增殖实验

新媒体时代对记者型主持人提出了更高的要求，传统的记者型主持人作为具有社会影响力的公众人物，不仅要承担起自身特定的身份所赋予的社会责任，更应积极提高自身的综合素质，以适应新时代的媒体工作需求。在这个关键时刻，记者型主持人既要守住自身的独特优势，又要善于充分运用新媒体技术，在围绕中心、服务大局中找准定位，牢记社会责任，提高自身的业务水平，不断地推出有思想、有温度、有品质的作品，为中国的媒体事业贡献力量。

无菌条件下将各组小鼠剖腹，取脾脏，剪成小块，置于200 目不锈钢网筛，筛网中央浸没于盛有Hank’s液的平皿中。无菌注射器芯研磨脾脏组织，用Hank’s液吹洗掉网筛上的剩余组织，收集脾脏组织悬液于无菌离心管，199×g离心5 min，弃去上清液。用3 mL红细胞裂解液重悬细胞，静置3 min，199×g离心5 min，弃去上清液；RPMI-1640培养液重悬细胞制成单细胞悬液，通过台盼蓝实验计算细胞数，活细胞数不少于95%，调整细胞浓度为2×105 个/mL。

将脾细胞悬液接种于96 孔板（200 μL/孔），同时每孔加20 μL ConA（终质量浓度5 μg/mL），置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24～48 h。每孔加20 μL CCK-8，继续培养4 h，利用酶标仪在450 nm波长处测定光密度。以不添加脾细胞添加RPMI-1640培养液作空白孔。脾淋巴细胞增殖指数按式（3）[12]计算。

   

1.3.7 NK细胞活力分析

将YAC-1细胞（靶细胞）用RPMI培养液（含10% FBS）调整细胞浓度为1×104 个/mL。将脾细胞悬液（5×105 个/mL）和YAC-1细胞悬液（1×104 个/mL）各100 μL/孔接种于96 孔板，同时设定效应细胞和靶细胞孔。细胞在37 ℃、5% CO2培养箱中培养24～48 h后，每孔加15 μL CCK-8，继续培养4 h，用酶标仪于450 nm波长处测定各孔光密度值。自然杀伤（natural killer，NK）细胞活力按式（4）[13]计算。

   
1.4 数据处理与分析

实验结果均以平均值±标准差表示。采用SPSS 16.0软件进行Duncan’s多重比较，确定各组间数据的差异显著性（P＜0.05）。

2 结果与分析2.1 2 种酪蛋白消化物对小鼠血清生化指标的影响

表 1 酪蛋白消化物及糖基化酪蛋白消化物对小鼠血清生化指标的影响
Table 1 Effect of glycated casein digest and casein digest on serum biochemical indices of mice

     

注：同行肩标小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。

总蛋白质量浓度/（g/L） 57.3±2.3b 45.8±2.5a 59.4±2.4bcd 62.9±1.8de 67.1±2.4fg 58.5±1.6bc 61.6±1.7cde 66.9±1.8fg白蛋白质量浓度/（g/L） 33.5±1.7b 26.7±1.3a 34.1±2.1b 35.9±1.4bcd 37.7±1.3cd 33.2±2.0b 34.9±1.9bc 36.4±1.6bcd球蛋白质量浓度/（g/L） 23.5±1.6b 18.9±1.1a 24.1±1.8bc 27.5±1.9bcde 31.6±1.7ef 23.8±1.3b 24.9±1.6bcde27.3±1.4bcde谷丙转氨酶活力/（U/L） 54±4bc 36±2a 40±2a 56±4bcd 61±4de 37±3a 51±4b 58±5cd尿素氮浓度/（mmol/L） 3.1±0.1bc 2.4±0.1a 3.0±0.1b 3.1±0.1bc 3.3±0.2c 2.9±0.1b 3.1±0.2bc 3.2±0.2c总胆红素浓度/（µmol/L） 0.64±0.11ab 0.48±0.06a 0.69±0.08bcd0.76±0.08bcd0.84±0.11cde 0.63±0.10ab 0.68±0.03bc0.79±0.07bcd胆汁酸浓度/（µmol/L） 0.035±0.004b0.026±0.002a0.050±0.005cd0.059±0.006fg0.062±0.003g 0.047±0.002bc0.050±0.004bc0.053±0.002def甘油三酯浓度/（mmol/L） 2.26±0.12b 2.05±0.08a 2.40±0.14bc 2.78±0.10e 2.99±0.12f 2.27±0.09b 2.54±0.07cd 2.79±0.10e胆固醇浓度/（mmol/L） 7.24±0.32abc 6.78±0.24a 7.38±0.29bc 7.96±0.32de 8.84±0.42f 7.09±0.21ab 7.73±0.23cd 8.30±0.26e高密度脂蛋白浓度/（mmol/L） 0.87±0.04gh 0.37±0.05a 0.45±0.03b 0.58±0.04de 0.63±0.03e 0.38±0.02a 0.51±0.04bc 0.53±0.03cd低密度脂蛋白浓度/（mmol/L） 0.28±0.01b 0.23±0.01a 0.31±0.01bcd0.34±0.02defg 0.37±0.01g 0.30±0.03bc0.33±0.04cdef0.35±0.03efg乳酸脱氢酶活力/（U/L） 1 421±32b 1 269±35a 1 516±26c 1 724±37e 1 806±39f 1 421±27b 1 624±28d 1 742±33e肌酸激酶活力/（U/L） 1 124±24b 987±21a 1 498±19d 1 726±19g 1 908±17i 1 481±18cd 1 698±16g 1 821±20h肌酐浓度/（µmol/L） 32.67±2.58b26.28±3.56a38.14±3.15bcde40.23±2.39cde43.15±3.36ef 33.59±2.65b36.24±2.65bc40.66±3.54cde尿酸浓度/（µmol/L） 211.6±18.4bc167.1±13.2a192.7±12.4ab223.1±18.7bcd231.6±13.8cde 176.3±17.2a218.9±14.2bcd223.4±19.6bcd葡萄糖浓度/（mmol/L） 3.2±0.2bc 1.8±0.2a 2.6±0.3b 3.9±0.6cd 4.9±0.7ef 3.3±0.4bc 4.9±0.3ef 5.7±0.6fg谷草转氨酶活力/（U/L） 164±13b 139±10a 212±11de 248±12fg 272±14h 197±8cd 231±10ef 266±11gh

动物的血清生化指标常用于反映实验动物的健康与生理状况。已有研究表明，膳食咖啡酸通过影响血清生化指标，调控机体免疫功能[14]。饲料中添加β-伴大豆球蛋白可影响幼鲤生长以及其血清生化指标，实现幼鲤免疫状态改善[15]。本研究中2 种酪蛋白消化物对小鼠17 项生化指标的影响如表1所示。与正常组小鼠相比，模型组小鼠各项指标水平均显著降低（P＜0.05），表明环磷酰胺对小鼠产生不良影响。与模型组小鼠相比，糖基化酪蛋白消化物组小鼠各项指标水平均显著增加（P＜0.05），表明糖基化酪蛋白消化物可改善小鼠生理状况。然而，与酪蛋白消化物相比，糖基化酪蛋白消化物对小鼠生理状况的改善程度要低一些。糖基化酪蛋白消化物的活性低于酪蛋白消化物，这可能与酪蛋白的糖基化反应有关。美拉德反应破坏了蛋白质中赖氨酸等必需氨基酸[16]，因此导致糖基化酪蛋白消化物在免疫低下小鼠中活性降低。

4.3.1 居住区级医养结合养老设施服务功能 居住区级医养结合型养老设施包含了上述3种模式的所有类型(表2),以支撑辐射模式运行的医养设施主要为健康自理、部分失去自理能力的老年人提供生活照料、基础医疗诊断和康复保健等全面的服务,服务对象主要为依托社区居家养老的老年人;而以整合照料、联合运行模式运行的设施主要为失能失智或部分失去自理能力的老年人提供医、护、养于一体的全方位服务,服务对象主要是选择入住养老机构的老年人．

血清总蛋白（total protein，TP）主要由血清球蛋白（globulin，GLO）和血清白蛋白（albumin，ALB）构成。TP含量高，则动物营养状况良好[17]。谷丙转氨酶（alanine amiotransferase，ALT）是检测肝功能的重要指标。血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）为蛋白质代谢后产物，是反映动物体内蛋白质代谢和氨基酸平衡状况的指标[18]。对于5 项重要生化指标（TP、ALB、GLO质量浓度，ALT活力及BUN浓度），与模型组小鼠相比，酪蛋白消化物组小鼠5 项指标分别从45.8、26.7、18.9 g/L，36 U/L及2.4 mmol/L增加到59.4～67.1、34.1～37.7、24.1～31.6 g/L，40～61 U/L及3.0～3.3 mmol/L，而糖基化酪蛋白消化物处理组小鼠5 项指标分别增加到58.5～66.9、33.2～36.4、23.8～27.3 g/L，37～58 U/L及2.9～3.2 mmol/L。这些数据表明，酪蛋白消化物比糖基化酪蛋白消化物具有更好的免疫提升效率。

2.2 2 种酪蛋白消化物对血清中Ig分泌的影响   
     

图 1 酪蛋白和糖基化酪蛋白消化物对小鼠血清IgM（A）、IgA（B）和IgG（C）分泌的影响
Fig. 1 Effects of glycated casein digest and casein digest on serum IgM (A), IgA (B), and IgG (C) levels of mice

Ig是机体主要的免疫分子，其含量高低直接反映动物机体免疫应答能力[19]。已有研究结果表明，大豆低聚糖可以增强小鼠IgM、IgA和IgG分泌[20]。酪蛋白肽通过促进Ig产生和免疫分子分泌，调控机体的免疫功能[21]。由图1可知，与正常组小鼠比较，模型组小鼠血清IgM、IgA和IgG质量浓度分别从806.4、724.7 μg/mL和13.9 mg/mL降低至726.9、654.1 μg/mL和11.3 mg/mL，表明环磷酰胺导致小鼠免疫低下。与模型组小鼠比较，酪蛋白消化物组小鼠血清IgM、IgA和IgG质量浓度分别增加至821.9～947.9、721.8～927.4 μg/mL和13.1～16.4 mg/mL，而糖基化酪蛋白消化物组小鼠血清IgM、IgA和IgG质量浓度分别增加至799.4～937.7、699.7～885.3 μg/mL和12.4～16.0 mg/mL。在同一剂量水平下，酪蛋白消化物显示出比糖基化酪蛋白消化物更强的提升效果，证明糖基化反应降低了酪蛋白消化物提升Ig分泌的能力。Shi Jia等发现酪蛋白与乳糖的糖基化反应降低了酪蛋白消化物的免疫活性[5]；蔺海鑫等发现原肌球蛋白与核糖的糖基化反应也降低了其免疫活性[22]；Shi Jia等研究结果表明，酪蛋白与乳糖的美拉德反应减弱了酪蛋白消化物对丙烯酰胺诱导小肠上皮细胞屏障损伤的保护作用[23]。

2.3 2 种酪蛋白消化物对小鼠免疫器官指数的影响

脾脏是动物的外周免疫器官，产生淋巴细胞，参与体液和细胞免疫。胸腺是动物的一级免疫器官，对T细胞成熟和分化起作用[24]。因此，脾脏指数、胸腺指数直接反映机体免疫状况。研究表明，毛豆腐提取物可以增加脾脏指数和胸腺指数，提高动物免疫状况[25]。来源于κ-酪蛋白的糖巨肽具有免疫抑制活性，鸡蛋卵清蛋白源糖肽具有显著的免疫调节功能[26-27]。甘薯糖蛋白可显著提高小鼠脾脏指数和胸腺指数，脾淋巴小节增多增大，胸腺T细胞线粒体数量增多，表明甘薯糖蛋白具有明显的增强免疫调节作用[28]。

     

图 2 酪蛋白和糖基化酪蛋白消化物对小鼠脾脏指数（A）和胸腺指数（B）的影响
Fig. 2 Effects of glycated casein digest and casein digest on spleen (A)and thymus (B) indices of mice

由图2可知，与正常组小鼠比较，模型组小鼠的脾脏和胸腺指数均显著降低（P＜0.05），表明环磷酰胺影响小鼠免疫器官的发育。与模型组小鼠比较，给予酪蛋白消化物和糖基化酪蛋白消化物后，小鼠胸腺指数和脾脏指数均显著增加（P＜0.05），且呈剂量依赖效应。酪蛋白消化物导致小鼠的脾脏和胸腺指数分别增加至3.24～4.26 mg/g和1.32～1.58 mg/g，而糖基化酪蛋白消化物仅分别增加至3.06～3.89 mg/g和1.26～1.48 mg/g。同一剂量水平下，酪蛋白消化物对小鼠脾脏和胸腺指数的提升作用强于糖基化酪蛋白消化物，证明糖基化反应不利于酪蛋白消化物改善小鼠脾脏和胸腺的生长发育状况。

2.4 糖基化酪蛋白消化物对脾淋巴细胞增殖和NK细胞活力的影响

脾淋巴细胞是体内免疫细胞之一，其增殖和分化是机体免疫应答过程的一个重要阶段。因此，淋巴细胞增殖水平评估是研究细胞免疫的常用方法[29]。NK细胞是重要的免疫效应细胞，在体内抗肿瘤非特异性免疫中发挥重要作用[30]。已有研究结果表明，乳蛋白肽可以促进小鼠脾淋巴细胞增殖、提高NK细胞活力[21,31]。胃蛋白酶水解鲤鱼卵蛋白后，其水解物显著提高了脾淋巴细胞增殖作用和NK细胞活力[32]。大豆糖肽对ConA诱导的脾细胞有增殖抑制作用，而对正常生长的脾细胞有增殖促进作用[33]。由图3可知，与正常组小鼠相比，模型组小鼠的脾淋巴细胞增殖指数和NK细胞活力均显著下降（P＜0.05），而2 种消化物以剂量依赖方式促进小鼠脾淋巴细胞增殖和增强NK细胞活力。与模型组小鼠相比，酪蛋白消化物处理24 h和48 h后，小鼠脾淋巴细胞增殖指数分别从0.951和0.974增加至1.154～1.342和1.184～1.472，NK细胞活力分别从30.8%和32.2%增加至35.8%～48.8%和46.1%～61.4%；糖基化酪蛋白消化物处理24 h和48 h后，小鼠脾淋巴细胞增殖指数分别增加至1.147～1.316和1.176～1.379，NK细胞活力分别增加至33.1%～45.7%和41.5%～58.3%。整体上看，糖基化酪蛋白消化物刺激小鼠脾细胞的能力仍然低于酪蛋白消化物，再次证明糖基化反应降低了酪蛋白消化物提升小鼠免疫细胞活性的作用。

     

图 3 酪蛋白和糖基化酪蛋白消化物对小鼠淋巴细胞增殖指数和NK细胞活力的影响
Fig. 3 Effects of glycated casein digest and casein digest on lymphocyte proliferation index and NK cell activity of mice

3 结 论

采用环磷酰胺处理后，小鼠免疫功能显著下降，与正常组小鼠相比，模型组小鼠17 项血清生化指标水平显著降低，同时3 种血清Ig质量浓度、脾脏、胸腺、脾淋巴细胞增殖指数、NK细胞活力等其他重要免疫指标也显著降低。实验结果表明，免疫低下模型小鼠给予酪蛋白消化物和糖基化酪蛋白消化物后，小鼠免疫状况均得到改善，各项免疫指标水平增加，提示两种消化物均具有提升免疫作用。本研究结果进一步表明，酪蛋白消化物具有比糖基化酪蛋白消化物更好的免疫提升效率，酪蛋白经美拉德糖基化反应导致其消化物的免疫活性降低，从而揭示蛋白质美拉德糖基化反应的潜在不利作用。考虑到蛋白质的美拉德糖基化反应导致蛋白质氨基酸被破坏和免疫活性降低，因此，控制乳制品加工处理过程中的美拉德反应具有必要性。

其中，γ和Γ均为各经济变量的待估系数；MS代表制造业结构，作为被解释变量；LC表示劳动力成本，作为解释变量；X为控制变量。控制其他相关的重要指标是为了使模型估计更为稳健，参照已有的研究成果，分别选取经济发展水平、经济开放程度和研发投入强度等作为控制变量，分别用ED、FDI和RD表示。

参考文献：

[1] ZHONG Lei, MA Ning, WU Yiliang, et al. Characterization and functional evaluation of oat protein isolate-Pleurotus ostreatus β-glucan conjugates formed via Maillard reaction[J]. Food Hydrocolloids, 2019,87: 459-469. DOI:10.1016/j.foodhyd.2018.08.034.

[2] WANG Qian, ISMAIL B. Effect of Maillard-induced glycosylation on the nutritional quality, solubility, thermal stability and molecular configuration of whey proteins[J]. International Dairy Journal, 2012,25(2): 112-122. DOI:10.1016/j.idairyj.2012.02.009.

[3] CHEVALIER F, CHOBERT J M, POPINEAU Y, et al. Improvement of functional properties of β-lactoglobulin glycated through the Maillard reaction is related to the nature of the sugar[J]. International Dairy Journal, 2001, 11(3): 145-152. DOI:10.1016/S0958-6946(01)00040-1.

[4] BIELIKOWICZ K, KOSTYRA H, KOSTYRA E, et al. The influence of non-enzymatic glycosylation on physicochemical and biological properties of pea globulin 7S[J]. Food Research International, 2012,48(2): 831-838. DOI:10.1016/j/foodres.2012.06.028.

[5] SHI Jia, ZHAO Xinhuai. In vitro immuno-modulatory ability of tryptic caseinate hydrolysate affected by prior caseinate glycation using the Maillard reaction or transglutaminase[J]. Food and Agricultural Immunology, 2017, 28(6): 1029-1045. DOI:10.1080/09540105.2017.1 325842.

[6] BEISEL L, WILLIAM R. Nutrition and immune function: overview[J].Journal of Nutrition, 1996, 126(10): 2611-2613. DOI:10.1093/jn/126.suppl_10.2611S.

[7] AWARD A B, FINK C S. Phytostertols as anticancer dietary components: evidence and mechanism of action[J]. Journal of Nutrition, 2000, 130(9): 2127-2130. DOI:10.1093/jn/130.9.2127.

[8] WILSON J K, RUIZ L, DAVIDOWITZ G. Dietary protein and carbohydrates affect immune function and performance in a specialist herbivore insect (Manduca sexta)[J]. Physiological and Biochemical Zoology, 2019, 92(1): 58-70. DOI:10.1086/701196.

[9] 王青, 胡明华, 董燕, 等. 茯苓多糖对免疫抑制小鼠粘膜淋巴组织及脾脏中CD3+和CD19+细胞变化的影响[J]. 中国免疫学杂志, 2011,27(3): 228-231. DOI:10.3969/j.issn.1000-484X.2011.03.008.

[10] ARTYM J, ZIMECKI M, KRUZEL M L, et al. Reconstitution of the cellular immune response by lactoferrin in cyclophosphamide-treated mice is correlated with renewal of T cell compartment[J]. Immunobiology,2003, 207(3): 197-205. DOI:10.1078/0171-2985-00233.

[11] WANG Xiaopeng, ZHAO Xinhuai. Using an enzymatic galactose assay to detect lactose glycation extents of caseinate and soybean protein isolate via the Maillard reaction[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2017, 97(8): 2617-2622. DOI:10.1002/jsfa.8084.

[12] WANG Mingchun, JIANG Changxing, MA Liping, et al.Preparation, preliminary characterization and immunostimulatory activity of polysaccharide fractions from the peduncles of Hovenia dulcis[J]. Food Chemistry, 2013, 138(1): 41-47. DOI:10.1016/j.foodchem.2012.09.098.

[13] YUAN Chengfu, WANG Changdong, BU Youquan, et al.Antioxidative and immunoprotective effects of Pyracantha fortuneana(Maxim.) lipolysaccharides in mice[J]. Immunology Letters, 2010,133(1): 14-18. DOI:10.1016/j.imlet.2010.04.004.

[14] YILMAZ S. Effects of dietary caffeic acid supplement on antioxidant,immunological and liver gene expression responses, and resistance of Nile tilapia, Oreochromis niloticus to Aeromonas veronii[J].Fish and Shellfish Immunology, 2018, 86: 384-392. DOI:10.1016/j.fsi.2018.11.068.

[15] 郑鑫, 殷海成, 李昕硕, 等. β-伴大豆球蛋白对幼鲤生长、血清生化及免疫指标的影响[J]. 中国饲料, 2018(41): 46-52. DOI:10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20182110.

[16] RANNOU C, LAROQUE D, RENAULT E, et al. Mitigation strategies of acrylamide, furans, heterocyclic amines and browning during the Maillard reaction in foods[J]. Food Research International, 2016, 90:154-176. DOI:10.1016/j.foodres.2016.10.037.

[17] ISHIBASHI T, YONEMOCHI C. Amino acid nutrition in egg production industry[J]. Animal Science Journal, 2003, 74(6): 457-469.DOI:10.1046/j.1344-3941.2003.00139.x.

[18] 孙志洪, 谭支良, 姚军虎. 限制性氨基酸对生长山羊血清胰岛素和总蛋白的影响[J]. 家畜生态, 2004, 25(3): 14-17. DOI:10.3969/j.issn.1673-1182.2004.03.005.

[19] 杨汉春. 动物免疫学[M]. 北京: 中国农业大学出版社, 1996: 32-33.

[20] MA Yan, WU Xingzhuang, GIOVANNI V, et al. Effect of soybean oligosaccharides on intestinal microbial communities and immune modulation in mice[J]. Saudi Journal of Biological Sciences, 2017,24(1): 114-121. DOI:10.1016/j.sjbs.2016.09.004.

[21] GILL H S, DOULL F, RUTHERFURD K J, et al. Immunoregulatory peptides in bovine milk[J]. British Journal of Nutrition, 2000, 84: 111-117. DOI:10.1017/s0007114500002336.

[22] 蔺海鑫, 林洪, 王晓斐, 等. 美拉德反应对菲律宾蛤仔原肌球蛋白结构及免疫活性的影响[J]. 食品科学, 2016, 37(3): 22-26.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603005.

[23] SHI Jia, YU Fu, ZHAO Xinhuai. Effects of Maillard-type caseinate glycation on the preventive action of caseinate digests in acrylamideinduced intestinal barrier dysfunction in IEC-6 cells[J]. RSC Advances,2018, 8: 38036-38046. DOI:10.1039/c8ra08103d.

[24] OH M J, CHOI H D, HA S K, et al. Immunomodulatory effects of polysaccharide fraction isolated from Fagopyrum esculentum on innate immune system[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2018, 496(4): 1210-1216. DOI:10.1016/j.bbrc.2018.01.172.

[25] LIU Xin, ZHAO Xinhuai. Immune potentials of the Mucor-fermented Mao-tofu and especially its soluble extracts for the normal mice[J].Food and Agricultural Immunology, 2017, 28(5): 859-875. DOI:10.10 80/09540105.2017.1318834.

[26] OTANI H, MONNAI M. Inhibition of proliferative responses of mouse spleen lymphocytes by bovine milk κ-casein digests[J].Food and Agricultural Immunology, 1993, 5(4): 219-229.DOI:10.1080/09540109309354801.

[27] MATSUDA T, GU J X, TSURUTA K, et al. Immunoreactive glycopeptide separated from peptide hydrolysate of chicken egg white ovomucoid[J]. Journal of Food Science, 1985, 50: 592-594.DOI:10.1111/j.1365-2621.1985.tb13751.x.

[28] 阚建全, 阎磊, 陈宗道, 等. 甘薯糖蛋白的免疫调节作用研究[J].西南农业大学学报, 2000, 22(3): 257-260. DOI:10.13718/j.cnki.xdzk.2000.03.021.

[29] SINKORA M, BUTLER J E. Progress in the use of swine in developmental immunology of B and T lymphocytes[J]. Developmental and Comparative Immunology, 2016, 58: 1-17. DOI:10.1016/j.dci.2015.12.003.

[30] MONMAI C, PARK S H, YOU S, et al. Immuno-enhancement effect of polysaccharide extracted from Stichopus japonicus on cyclophosphamideinduced immunosuppression mice[J]. Food Science and Biotechnology,2018, 27(2): 565-573. DOI:10.1007/s10068-017-0248-2.

[31] MIGLIORE-SAMOUR D, JOLLES P. Casein, a prohormone with an immuno-modulating role for the newborn[J]. Experientia, 1988, 44(3):188-193. DOI:10.1007/BF01941703.

[32] CHALAMAIAH M, HEMALATHA R, JYOTHIRMAYI T, et al.Chemical composition and immunomodulatory effects of enzymatic protein hydrolysates from common carp (Cyprinus carpio) egg[J].Nutrition, 2015, 31: 388-398. DOI:10.1016/j.nut.2014.08.006.

[33] 张雪梅. 大豆蛋白酶解产物中的糖肽及其对小鼠脾细胞增殖效果的研究[D]. 北京: 中国农业大学, 2004: 34-35. DOI:10.7666/d.y556777.

Effect of Casein Glycation on Immunoenhancing Activity of Tryptic Caseinate Digest in Immunosuppressed Mice

SHI Jia1, LIU Wanning1, FU Yu2, ZHAO Xinhuai1,*
(1. Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China;2. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Abstract: This study aimed to assess the potential effect of casein glycation via the Maillard reaction on in vivo immunoenhancing efficacy of tryptic casein digest in immunosuppressed mice. Glycated casein was prepared by the Maillard reaction of casein with lactose. Glycated and native casein were digested with trypsin to generate glycated casein digest and casein digest, respectively. Mice were treated with cyclophosphamide at 80 mg/kg mb for 3 days to induce immunosuppression, and then were given the two digests, separately at dose levels of 100, 200, and 400 mg/kg mb for 25 days. Afterwards, immune organ (spleen and thymus) indices, serum biochemical indices, immunoglobulin (IgM, IgA,and IgG) levels, lymphocyte proliferation capacity, and natural killer (NK) cell viability were evaluated. Results indicated that the immune status of mice in the model group was lower than that in the control group treated with normal saline as manifested by a significant decrease in immune organ indices, serum biochemical indices, serum Ig levels, spleen lymphocyte proliferation index and NK cell viability (P ＜ 0.05). Compared with the immunosuppressed mice, spleen and thymus indices, serum IgM, IgA and IgG levels, spleen lymphocyte proliferation index, and NK cell viability increased by 35.9%–66.4%, 50.5%–62.9%, 21.6%–30.4%, 27.1%–41.8%, 37.2%–45.1%, 34.2%–51.1%, and 32.1%–90.7% in the mice treated with casein digest at the medium and high doses, and by 27.7%–51.9%, 39.2%–52.6%, 19.1%–29.0%, 21.8%–35.3%,30.1%–41.6%, 32.9%–41.6%, and 27.3%–81.1% in the mice treated with glycated casein digest at the medium and high doses, respectively. Both digests were able to attenuate the decrease in immune indices of immune suppressed mice induced by cyclophosphamide, while casein digest showed higher immuno enhancing efficacy than glycated casein digest. Therefore,casein glycation via the Maillard reaction could decrease the immunoenhancing activity of its tryptic digest on mice.

Keywords: casein; Maillard reaction; glycation; mice; immunoenhancing effect

收稿日期：2018-12-13

基金项目：国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2013AA102205）

第一作者简介：时佳（1993—）（ORCID: 0000-0002-4765-6512），女，硕士，研究方向为食品科学。E-mail: shij@neau.edu.cn

*通信作者简介：赵新淮（1963—）（ORCID: 0000-0001-9682-5426），男，教授，博士，研究方向为食品科学。E-mail: zhaoxh@neau.edu.cn

DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181213-163

中图分类号：TS201.4

文献标志码：A

文章编号：1002-6630（2020）05-0122-06

引文格式：

时佳, 刘宛宁, 付余, 等. 酪蛋白糖基化对其胰蛋白酶消化物在免疫低下模型小鼠中免疫活性的影响[J]. 食品科学,2020, 41(5): 122-127. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181213-163. http://www.spkx.net.cn

计算既包括图灵机意义上的计算，也包括信息处理。尽管“信息”包含有“计算”之意，然而，“信息”不能仅仅解释为“计算”。它主要包括(1)信息环境的构成和模式；(2)信息的生命周期；(3)计算。一般情况下，信息表现为两种形式，即图灵语境下的计算加工和传统意义上的信息加工，相对于前者，后者是一种更为广义的提法。 李建会在《走向计算主义》一书中指出，思维就是信息加工也就是计算，亦即符号串按规则而变换，旨在说明计算与信息关系密不可分。

SHI Jia, LIU Wanning, FU Yu, et al. Effect of casein glycation on immunoenhancing activity of tryptic caseinate digest in immunosuppressed mice[J]. Food Science, 2020, 41(5): 122-127. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181213-163.http://www.spkx.net.cn

总之，在布雷顿森林协议基础上建立的现行的国际经济秩序，尽管在制度设计上存在着自由主义因素，这些因素包括自由平衡贸易的思想、古典经济学货币数量论以及保留了大危机之前建立的主张金融自由的跨国金融组织，但是总体而言，它的运行主要是为给西方国家的国内政府干预政策提供良好的外部环境。因此，它的政策选择次序是先国内、后国际，先贸易、后金融。这一制度特征在1945～1958年间没有发生本质性的变化。