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转基因检测中大豆蛋白DNA提取方法筛选及其lectin基因降解分析转基因检测中大豆蛋白DNA提取方法筛选及其lectin基因降解分析 杜 艳，陈复生*，陈 晨，刘 营 （河南工业大学粮油食品学院，河南 郑州 450001） 摘 要：采用紫外分光光度法、琼脂糖凝胶电泳法和实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）等检测DNA浓度、纯度、完整性和反应灵敏度，综合评价Nucleo试剂盒、Wizard试剂盒、Dneasy试剂盒、Ezup试剂盒、Dzup试剂盒和十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）法对大豆蛋白及大豆籽粒中DNA的提取效果，旨在筛选出适用于大豆分离蛋白（soybean protein isolate，SPI）、大豆浓缩蛋白（soybean protein concentrate，SPC）及大豆籽粒中DNA提取的最佳方法，提高转基因大豆检测的精确性和准确性。结果表明，Nucleo试剂盒和Dneasy试剂盒能够得到纯度高、完整性好的DNA，符合实时荧光PCR的检测要求。Dneasy试剂盒提取的DNA纯度更高，更有利于提高后续PCR的重复性、稳定性和精确性，普遍适用于SPI、SPC以及大豆籽粒中DNA的提取。Wizard试剂盒、Ezup试剂盒和SDS法提取效果适中，SDS法成本最低，但耗时最长。Dzup试剂盒得到的DNA虽然浓度高，但含杂质较多，对实时荧光PCR具有抑制作用，且无法保持完整的基因组DNA，不适用于大豆转基因检测中的DNA提取。采用Dneasy试剂盒提取得到的SPI和SPC样品DNA，对不同长度lectin基因扩增结果不同，表明在蛋白制备过程中lectin基因可能存在降解。 关键词：大豆分离蛋白；大豆浓缩蛋白；大豆籽粒；DNA提取；实时荧光聚合酶链式反应 大豆（Glycine max (L.) Merr）通称黄豆，起源于中国，种植面积广泛，距今已有五千多年的栽培历史，是现今人们的主要食品之一。大豆蛋白中含有大量的必需氨基酸，不含胆固醇，具有非常高的营养价值[1]，逐渐走向人们的生活饮食中。当前市售的大豆蛋白主要有大豆分离蛋白（soybean protein isolate，SPI）和大豆浓缩蛋白（soybean protein concentrate，SPC）[2]。 近年来，我国的大豆消耗量巨大，以至于国产大豆供不应求，无法满足人们及饲料行业日益增长的需要。因此，大量的大豆依赖进口。数据显示，2017ü2018年度中国大豆消费量为1.1亿 t，而自产量仅1 500万 t左右，大豆进口量高达9 700万 t，这其中大部分为来自美国和巴西的转基因大豆[3]。 转基因作物自出现以来，争议不断。为规范转基因作物在国际市场上的流通，世界各国纷纷建立转基因标识制度[4]，我国农业部颁布的《农业转基因生物标识管理办法》要求“凡列入标识管理目录并用于销售的农业转基因生物，应进行标识”。然而转基因成分含量甚微且可能在产品加工过程中发生降解或损失，使得定性和定量检测难度增大。 为检测饲料和食品中的转基因成分，国家农业部发布第1485号公告[5]，描述了适用于富含多糖的植物及其粗加工测试样品DNA提取和纯化的溴化十六烷基三甲铵（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）法，适用于植物深加工样品DNA提取和纯化的改良CTAB法，以及适用于蛋白含量较高的植物及其粗加工测试样品DNA提取和纯化的十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）等DNA提取方法。此外，GB/T 19495.3ü 2004《转基因产品检测 核酸提取纯化方法》[6]描述了用于DNA提取的酚-三氯甲烷法、聚乙烯吡咯烷酮法、CTAB法和硅土法。国家农业部2259号公告[7-8]和其他标准[9-14]均针对不同种类的转基因植物及其产品，提出了转基因成分定性聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）、实时荧光定量PCR、数字PCR以及基因芯片等检测方法。 DNA的提取是转基因检测的关键步骤[15]。豆类食品成分复杂，常含有多糖、酚类、蛋白等PCR抑制剂，食品加工过程中的机械作用、热效应以及化学处理等也会对DNA的含量和完整性造成影响，为DNA提取带来难度[16]。而DNA模板的浓度和纯度决定着PCR的成败，从而对检测结果产生影响。DNA模板浓度或纯度过低，可能由于含量低于PCR检测限或PCR抑制剂的存在，降低PCR的灵敏度，造成假阴性结果。 研究人员对多种DNA提取方法进行了比较，并提出对于不同的食品基质应选用不同的提取方法。Kamiya等[17]表示SDS法有助于大豆及大豆粕中DNA的提取。Wang Xiumin等[18]分别采用CTAB法、SDS法和盐酸胍试剂盒对山东、江苏、广东、河北、广西五省的54 种大豆种子和大豆粕进行DNA提取，从成本、DNA质量浓度和纯度以及反应时间4 个层面进行分析，发现SDS法每次反应约消费0.13 美元，成本较CTAB法（0.24 美元）更低，DNA产量高（164～1 750 ng/mg），A260 nm/A280 nm在1.8～2.0之间，符合PCR要求，且提取时间适中，比另2 种方法更适用于大豆及豆粕中DNA提取。Turkec等[4]随机选取了47 种市售豆制品，研究CTAB法和Foodproof试剂盒、Dneasy Plant Mini Kit（Dneasy试剂盒）、Wizard Genomic DNA Purification Kit（Wizard试剂盒）、GeneSpin试剂盒的适用范围，并未发现某一种方法可通用于所有样品DNA的提取，大豆种子、饼干、巧克力、婴儿配方奶粉宜使用CTAB法，豆粉、豆芽、豆奶宜使用GeneSpin试剂盒，豆粕、豆酱、面包和肉宜使用Foodproof试剂盒。 此外，刘欣等[19]分别使用DuPont试剂盒、Bayer试剂盒、Qiagen试剂盒、Monsanto试剂盒和Tiangen试剂盒提取大豆籽粒DNA，结果表明Monsanto试剂盒和Bayer试剂盒均由于PCR抑制剂的存在而影响后续检测，Qiagen试剂盒、DuPont试剂盒与Tiangen试剂盒得到的DNA质量浓度高、纯度好，完整度高，为大豆转基因检测中DNA提取的适宜方法。喻志学等[20]对比了CTAB法和改良SDS法对转基因和非转基因大豆DNA的提取效果，认为SDS法更优。然而，大豆蛋白作为一种重要的动物饲料和食品添加剂[21]，针对其DNA提取方法的对比讨论相对较少。 因此，本研究选择DNA提取常用的Macherey-Nagel Nucleo Spin Kit（Nucleo试剂盒）、Wizard试剂盒、Dneasy试剂盒、Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒（Ezup试剂盒）、Dzup基因组DNA抽提试剂盒（Dzup试剂盒）和SDS法6 种方法，对比其对7 种中国市售大豆蛋白（4 种SPI和3 种SPC）和大豆籽粒中DNA的提取效果，旨在提高转基因大豆及其蛋白制品检测的灵敏度和准确性，为转基因检测方法的健全和转基因标识制度的完善奠定基础。最后，使用优选出的方法提取市售SPI和SPC中的DNA，并对其中大豆内源lectin基因不同长度的片段进行扩增，探究大豆蛋白中lectin基因的降解情况。 5家区域管道公司主要根据市场需要和中国石油总体规划开展管道设施投资建设和安全维护（包括实施扩能改造工程），相互间互联互通，打破物理界限，建立资源双向调度通道。管道设施建成后，所有站场的关键设备、所有向用户分输的计量数据和控制阀门都经数据接入和联合调试，一并纳入北京油气调控中心系统，接受北京油气调控中心远程调度控制。区域管道公司受托输送天然气，管输价格大致按运距在公司间分摊，相对固定且接受国家监管，按量获取管输收益，多输多收。 1 材料与方法1.1 材料与试剂4 种市售SPI分别来自广东（SPI 1）、四川（SPI 2）、陕西（SPI 3）和临沂（SPI 4），3 种SPC分别来自上海（SPC 1）、四川（SPC 2）和河南（SPC 3），3 种大豆籽粒分别来自东北（大豆籽粒1）、河南（大豆籽粒2）和巴西（大豆籽粒3）。 Wizard试剂盒（目录号：A1120） 美国Promega公司；Nucleo试剂盒（目录号：740945） 德国Macherey-Nagel公司；Dneasy试剂盒（目录号：69104） 德国Qiagen公司；Ezup试剂盒（目录号：B518261）、Dzup试剂盒（目录号：B518203）、SDS（分子生物级）、琼脂糖M、4S Green Plus核酸染色剂 生工生物工程（上海）股份有限公司；蛋白酶K、核糖核酸酶A（ribonuclease A from bovine pancreas，RNase A）、2hPremix Taq 日本TaKaRa公司；6hLoading Buffer 北京Solarbio科技有限公司；λ DNA/Hind III Marker、DNA Marker I、Marker D2000 DNA北京Tiangen生化科技有限公司；荧光定量PCR扩增试剂PowerUp SYBR Green Master Mix 美国Thermo Fisher公司；其他化学试剂均为分析纯。 1.2 仪器与设备FW-100高速万能粉碎机 北京市光明医疗仪器有限公司；BSA224S-CW型分析天平 德国Sartorius公司；Sorvall BIOFUGE Stratos全能台式高速离心机、Nanodrop 2000微量紫外分光光度计、QuantStudio 3实时荧光PCR扩增仪 美国Thermo Fisher公司；HH-4J数显恒温水浴锅 上海维诚仪器有限公司；D1008掌中宝离心机 北京大龙兴创实验仪器有限公司；T100 Thermal Cycler PCR仪、UV light tray Gel Doc XR+凝胶成像系统美国Bio-Rad公司。 1.3 方法1.3.1 DNA提取方法 1.3.1.1 Nucleo试剂盒 取0.1 g磨碎的样品于2 mL无菌离心管，根据试剂盒说明书进行后续的DNA提取，最后用50 μL TE缓冲液洗脱，-20 ℃保存，备用。 近年来，违法捕捞、项目建设、沉箱养殖等非法占用锚地水域情况严重，1#锚地及其周边水域，5#锚地北侧水域，大量渔业养殖占用锚地及周边海域，不仅影响船舶锚泊安全，而且不利于险情的应急处置（发生险情时，由于周边都是沉箱或渔排，救助船舶难以接近遇险船舶）。 1.3.1.2 Wizard试剂盒 在此之后，英特诺面向亚洲和中国市场正式发布的英特诺新型模块化输送机平台（MCP）、全球首款内置涡流制动装置的新型磁力速度控制器MS C 50等产品，证明了英特诺对中国客户的需求有了更加深入的认识。 取0.1 g磨碎的样品于2 mL无菌离心管，根据试剂盒说明书进行后续的DNA提取，最后用50 μL TE缓冲液溶解DNA，-20 ℃保存，备用。 1.4统计学处理采用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计分析,计量资料用(±s)表示,比较采用t检验;计数资料以率(%)表示,比较采用字2检验,P<0.05为差异有统计学意义。 1.3.1.3 Dneasy试剂盒 取0.1 g磨碎的样品于2 mL无菌离心管，加入800 μL AP1缓冲液和4 μL RNase A，根据试剂盒说明书进行后续的DNA提取，最后用50 μL TE缓冲液洗脱，-20 ℃保存，备用。 实地调查数据显示，珠三角有超七成的企业有招聘外籍员工的需求，但是这些有需求的企业当中有大部分(62%)表示招聘需求很难得到满足。外籍人才处于供不应求状态。随着“一带一路”战略的不断深入，这种人才紧缺的状态有可能不断加剧。由于外籍人才供不应求，珠三角企业普遍愿意支付比一般高校毕业生更高的薪酬。调查企业对应届外籍毕业生给出的起薪中位数为7 000元，而管理岗、设计岗以及技术岗的起薪则达到9 000元甚至更高。 1.3.1.4 Ezup试剂盒 取0.1 g磨碎的样品于2 mL无菌离心管，加入800 μL PCB缓冲液（预热至65 ℃），振荡混匀，置于65 ℃水浴保温25 min，加入20 μL RNase A，室温放置2～5 min，加同体积混合溶液（氯仿-异戊醇24∶1，V/V），12 000hg离心5 min，移上清液于新的离心管，根据试剂盒说明书进行后续的DNA提取，最后用50 μL TE缓冲液洗脱，-20 ℃保存，备用。 1.3.1.5 Dzup试剂盒 孙中山《建国大纲》规定的训政时期的国民党党治具有过渡性，且以宪政为其最终目标。三民主义体系中的民主宪政目标，使蒋介石的威权体制处于十分尴尬的境地，也时常成为体制外政治势力用来批判和攻击其党治的有力武器，这对于蒋介石在意识形态上宣扬“一个党、一个主义、一个领袖”是很大的制约。 取0.1 g磨碎的样品于2 mL无菌离心管，加入400 μL Dzup溶液，振荡混匀，后续操作按照试剂盒说明书进行，最后用50 μL TE缓冲液溶解DNA，-20 ℃保存，备用。 1.3.1.6 SDS法 在评估刑事立法政策时，也应当按照刑事立法价值的三个层次的梯级结构逐步逐层进行。首先必须具有现实指导性和可行性，其次要有利于维持社会秩序，维护社会稳定。而最终要评价这一政策是否更多地从社会个体的角度去考虑政策施行的目的性和有效性，有利于维护社会和谐。如果特定的刑事立法政策有助于社会秩序的维护和公民权利的保障，使人们在日常生活中具有安全感，对自己及家人的人身及财产方面没有担忧，能够正常地开展日常生活和工作，社会管理井然有序地进行，那么这样的刑事立法政策就是一个“良策”，反之，则为“恶策”。 在Tian Fang等[22]方法基础上稍作修改。取0.1 g磨碎的样品于2 mL无菌离心管，加入1 mL 65 ℃预热的SDS溶液，于65 ℃保温混匀1 h，间或混匀，再加入10 μL RNase A，摇匀后于37 ℃保温30 min。之后14 000hg离心10 min，移上清液于新的离心管中，加入0.7 倍的混合溶液（氯仿-异戊醇24∶1，V/V），于12 000hg离心10 min，将上清液移入到新的2 mL离心管。再加0.7 倍的混合溶液（氯仿-异戊醇24∶1，V/V），12 000hg离心10 min，将上清液移入到新的2 mL离心管。加0.6 倍的异丙醇，混匀后于-20 ℃保存1 h，12 000hg离心10 min，弃去上清液，向沉淀中加入500 μL无水乙醇，将沉淀弹至溶解后，于12 000hg离心5 min，弃去上清液。使用500 μL无水乙醇重复洗涤沉淀1～2 次，于12 000hg离心5 min后，弃去上清液，并将沉淀晾干，然后用50 μL TE缓冲液溶解，-20 ℃保存，备用。 1.3.2 DNA质量浓度和纯度检测 滨660块沙四层直井长缝日均产液14.5t，日产油量为10.5t；常规压裂日均产液13.3t，日产油量为3.92t；直井长缝压裂日均产油量为常规压裂日均产油量的2.68倍。 用Nanodrop 2000微量紫外分光光度计测定各DNA样品的浓度和纯度。 1.3.3 DNA分子完整性检测 用0.5 hT B E溶液配制1%的琼脂糖凝胶，以0.1 μL/mL的比例，向琼脂糖凝胶中加入4S Green Plus核酸染色剂。取10 μL DNA溶液与2 μL 6hLoading Buffer混合后点样。于80 V恒压条件下电泳1 h。使用UV light tray Gel Doc XR+凝胶成像系统对DNA扩增结果进行观察、拍照和分析[23]。 (2)优化水利工程项目管理体系。在水利工程建设施工的过程中，做好与项目相关的优化管理工作，这时就需要经过多方讨论删减不必要的管理部门，留下真正可以将工作落实到位的管理部门，节省资金成本，将责任落实到个人身上，提升管理人员的工作热情和责任心，为水利工程的建设打下夯实的基础。 1.3.4 DNA用于实时荧光PCR的灵敏度检测 选取大豆内源lectin基因81 bp的片段进行实时荧光PCR扩增，反应体系总体积为20 μL，包括PowerUp SYBR Green Master Mix 10 μL，上下游引物（表1）各0.3 μmol/L，模板DNA 40～50 ng，剩余体积用无菌水补齐。实时荧光PCR条件如表2所示。 表1 lectin基因实时荧光PCR及普通定性PCR的扩增引物序列及长度
Table 1 Primers used in real-time PCR and qualitative PCR ampli fi cation of lectin gene  反应类型 扩增长度/bp 引物序列实时荧光PCR 81[24] F：TCCACCCCCATCCACATTT R：GGCATAGAAGGTGAAGTTGAAGGA普通定性PCR 201[25] F：TGGGACAAAGAAACCGGTAG R：GTCAAACTCAACAGCGACGA 414[22] F：TGCCGAAGCAACCAAACATGATCCT R：TGATGGATCTGATAGAATTGACGTT 836[26] F：GACTCCCCATGCATCACAGT R：GGCAAATTGGAAGCAAAAGA 1 487[27] F：TCTTTTAGTCCATGTATTCT R：AAAGGATCAATGTTACTGCT
表2 lectin基因实时荧光PCR条件
Table 2 Conditions for real-time PCR ampli fi cation of the lectin gene  循环次数 温度/℃ 保持时间 目的无95 2 min 激活Dual-Lock DNA聚合酶40 个循环 95 15 s 变性60 1 min 退火/延伸50 5 min 激活UDG无95 15 s无60 1 min 95 15 s绘制熔解曲线
1.3.5 不同长度lectin基因片段的定性PCR检测 尽管通过启闭机使用许可管理制度的实施，已取证企业在质量管理水平和技术能力等方面取得了明显进步，但许多启闭机生产企业质量管理和技术水平长期得不到提高，行业整体水平与当前水利事业快速发展需要相比，与国内外其他行业相比还存在一定差距。特别是中小型产品获证企业数量多、规模小、质量管理水平不高、技术水平低下，产品结构不合理，低水平重复生产产品现象严重。 以Dneasy试剂盒提取的大豆蛋白DNA作为模板，分别扩增不同长度的大豆内源lectin基因片段，探究大豆蛋白中lectin基因的降解情况。定性PCR体系的总体积为25 μL，包括2hPremix Taq 10 μL，上下游引物（表1）各0.4 μmol/L， 模板DNA 40～50 ng，剩余体积用无菌水补齐。定性PCR条件如表3所示。 除气调运输外，新鲜果蔬因自身呼吸、容器材料性质以及运输工具的不同，容器内气体成分也会有相应的改变。使用普通纸箱时，因气体分子可从箱面上自由扩散，箱内气体成分变化不大，CO2的浓度都不超过0.1%。 表3 lectin基因普通定性PCR条件
Table 3 Conditions for qualitative PCR amplification of the lectin gene  循环次数 温度/℃ 保持时间无95 5 min 35 个循环95 30 s 55 30 s 72 45 s无72 10 min
1.4 数据统计与处理所有实验均重复4 次，所有测试均进行4 次以上，采用SPSS 20.0软件进行方差分析，实验数值之间以Duncan法进行差异显著性分析（P＜0.05，差异显著），采用Origin 8.5软件对实验结果作图。 2 结果与分析2.1 6 种DNA提取方法得到的DNA质量浓度和纯度应用6 种常用的DNA提取方法提取0.1 g大豆蛋白或大豆中的DNA，DNA质量浓度和纯度结果如表4所示。所有方法均可有效提取所有样品中的DNA，但DNA质量浓度和纯度差异显著，有必要针对不同样品种类进行具体分析。根据表4，将所有的样品分为SPI、SPC和大豆籽粒3 类，分别求得6 种方法提取这3 类样品得到的DNA质量浓度和DNA纯度（A260 nm/A280 nm和A260 nm/A230 nm）平均值，结果如图1、2所示。 表4 6 种方法提取所得的DNA质量浓度、纯度、Ct值结果对比
Table 4 Comparison of DNA yield, purity, and real-time PCR results by six extraction methods  样品 提取方法DNA质量浓度/（ng/μL）DNA纯度（A260 nm/A280 nm）DNA纯度（A260 nm/A230nm）Realtime（+/total） Ct SPI1 Nucleo 158.33f17.21b 1.88f0.07a 2.32f0.04b 4/4 20.86f0.10a Wizard 876.33f27.50c 1.84f0.02a 1.17f0.07a 4/4 26.03f0.17e Dneasy 39.00f16.46a 1.88f0.05a 2.63f0.30b 4/4 21.09f0.21b Ezup 31.67f7.57a 2.12f0.10b 2.71f0.50b 4/4 22.62f0.11c Dzup 2 222.67f39.31e 2.34f0.24c 1.14f0.02a 4/4 24.11f0.06d SDS 1 424.67f55.90d 1.86f0.03a 0.87f0.10a 4/4 23.92f0.04d SPI2 Nucleo 157.00f30.05a 1.84f0.05a 2.07f0.20b 4/4 20.32f0.08a Wizard 1 027.33f74.59b 1.79f0.06a 0.93f0.23a 4/4 25.19f0.10e Dneasy 40.67f5.13a 1.90f0.04a 3.51f0.32d 4/4 20.25f0.02a Ezup 36.67f11.59a 2.23f0.01b 2.44f0.02c 4/4 21.20f0.09b Dzup 2 507.00f343.98c 2.37f0.32b 1.17f0.08a 4/4 23.85f0.10d SDS 1 365.67f89.20d 1.81f0.08a 0.83f0.09a 4/4 23.64f0.07c SPI3 Nucleo 79.33f11.06a 1.89f0.07b 3.39f0.95c 4/4 20.61f0.09a Wizard 1 690.00f161.08c 1.83f0.03ab 1.17f0.08a 4/4 25.25f0.15e Dneasy 31.67f9.50a 1.88f0.02b 3.05f0.17bc 4/4 21.71f0.25b Ezup 45.67f13.01a 2.24f0.01c 2.47f0.01b 4/4 22.32f0.29c Dzup 1 210.00f145.08b 1.75f0.02a 0.46f0.02a 4/4 24.54f0.30d SDS 1 982.67f90.63d 1.89f0.10b 1.00f0.13a 4/4 25.69f0.04f SPI4 Nucleo 45.00f11.00a 1.90f0.10c 2.36f0.18c 4/4 22.75f0.24b Wizard 1 097.33f66.26b 1.84f0.02ab 1.28f0.04b 4/4 23.70f0.08e Dneasy 44.67f9.07a 1.90f0.03c 3.67f0.57d 4/4 19.89f0.06a Ezup 49.33f5.13a 2.23f0.01d 2.40f0.01c 4/4 23.39f0.15d Dzup 1 871.00f86.54d 1.75f0.02a 0.58f0.07a 4/4 24.90f0.03f SDS 1 373.33f97.71c 1.80f0.12ab 0.83f0.04a 4/4 23.06f0.05c SPC1 Nucleo 23.00f4.00a 2.03f0.19c 0.57f0.07a 4/4 22.93f0.10d Wizard 788.00f52.31b 1.76f0.02ab 1.25f0.06ab 4/4 23.95f0.11e Dneasy 30.67f6.11a 1.87f0.02b 6.21f1.63c 4/4 20.05f0.14a Ezup 38.67f8.02a 2.20f0.01d 2.38f0.01b 4/4 21.47f0.09b Dzup 1 420.00f237.03c 1.69f0.09a 0.37f0.05a 4/4 24.55f0.09f SDS 942.00f45.51b 1.80f0.03ab 0.94f0.27a 4/4 22.25f0.04c
续表4  注：所有数值以4 次重复实验的fs表示；同列不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。 样品 提取方法DNA质量浓度/（ng/μL）DNA纯度（A260 nm/A280 nm）DNA纯度（A260 nm/A230nm）Realtime（+/total） Ct SPC2 Nucleo 22.00f5.56a 1.75f0.03a 0.50f0.11a 4/4 23.99f0.05d Wizard 765.00f156.37b 1.76f0.04a 1.36f0.08ab 4/4 25.64f0.22e Dneasy 25.67f8.62a 1.89f0.08c 6.28f1.36c 4/4 21.45f0.24a Ezup 47.00f7.21a 2.20f0.01d 2.40f0.01b 4/4 22.15f0.05b Dzup 1 395.00f512.75c 1.78f0.09ab 0.31f0.10a 4/4 26.70f0.09f SDS 1 024.33f88.44bc 1.87f0.02bc 0.91f0.14ab 4/4 23.04f0.09c SPC3 Nucleo 22.33f5.03a 1.83f0.07cd 0.64f0.20a 4/4 21.36f0.09c Wizard 788.67f50.64b 1.63f0.03a 0.86f0.02a 4/4 22.27f0.10d Dneasy 30.00f5.56a 1.90f0.06d 4.70f0.71c 4/4 19.91f0.10a Ezup 34.33f4.04a 2.20f0.01e 2.40f0.03b 4/4 20.18f0.14b Dzup 1 335.33f324.27d 1.71f0.01b 0.45f0.06a 4/4 25.00f0.20e SDS 1 034.67f75.37c 1.82f0.01c 0.77f0.14a 4/4 22.27f0.07d大豆籽粒1 Nucleo 91.33f26.27a 1.81f0.02c 1.94f0.48c 4/4 20.30f0.19b Wizard 1 107.33f87.12c 1.67f0.05b 0.78f0.09b 4/4 23.42f0.13d Dneasy 77.00f5.56a 1.83f0.04c 2.32f0.25c 4/4 19.22f0.20a Ezup 76.67f15.14a 2.00f0.01d 2.32f0.16c 4/4 22.77f0.07c Dzup 529.67f178.02b 1.55f0.12a 0.24f0.11a 4/4 24.96f0.20e SDS 2 021.67f78.08d 1.96f0.01d 1.06f0.03b 4/4 23.59f0.19d大豆籽粒2 Nucleo 85.33f27.65a 1.78f0.04bc 2.13f0.68c 4/4 21.57f0.13b Wizard 1 122.00f110.67c 1.73f0.02b 0.84f0.07b 4/4 24.08f0.04d Dneasy 75.00f24.02a 1.85f0.04bcd 2.40f0.36c 4/4 19.64f0.29a Ezup 68.33f16.19a 2.01f0.01d 1.87f0.11c 4/4 24.19f0.13d Dzup 519.67f235.67b 1.51f0.21a 0.22f0.09a 4/4 24.60f0.11e SDS 1 851.67f62.85d 1.94f0.02cd 1.10f0.26b 4/4 23.52f0.18c Nucleo 63.67f11.85a 1.86f0.01bc 2.57f0.36c 4/4 21.76f0.04b Wizard 846.00f35.34c 1.74f0.04b 0.88f0.06b 4/4 24.66f0.22d Dneasy 73.00f20.66a 1.89f0.04bc 3.62f0.41d 4/4 20.68f0.20a Ezup 72.00f10.82a 1.98f0.01d 2.32f0.08c 4/4 24.59f0.13d Dzup 357.67f91.82b 1.52f0.20a 0.34f0.13a 4/4 26.01f0.09e SDS 1 364.67f91.15d 1.81f0.07bc 0.82f0.04b 4/4 23.50f0.26c大豆籽粒3
 图1 6 种方法提取SPI、SPC和大豆籽粒中的DNA质量浓度
Fig. 1 DNA concentrations from SPI, SPC, and soybean seeds by six extraction methods
由图1可知，对于SPI，不同方法提取得到的DNA质量浓度从高到低依次为Dzup、SDS、Wizard、Nucleo和Dneasy、Ezup；对于SPC，该顺序依次为Dzup、SDS、Wizard和Ezup、Dneasy、Nucleo。大豆籽粒成分复杂，不同提取方法得到的DNA质量浓度与SPI和SPC相比，无明显的规律，如SDS法提取得到的大豆籽粒DNA质量浓度均高于SPI和SPC，Dzup试剂盒提取得到的大豆籽粒DNA质量浓度均低于SPI和SPC，而Wizard试剂盒提取得到的大豆籽粒DNA质量浓度界于SPI和SPC之间。这可能与不同的DNA提取方法对大豆细胞裂解程度不同，从而导致DNA释放差异。 DNA提取的基本原则是释放样品中的DNA，随后纯化DNA，去除PCR抑制剂[6]。Nucleo、Dneasy和Ezup试剂盒技术原理属于膜过滤法，分别用盐酸胍、AP1缓冲液和PCB缓冲液裂解样品，通过硅胶吸附柱将释放出的DNA吸附[28]，再采用化学试剂溶解清除DNA上附着的蛋白质、多酚、多糖等物质，最后使用能够溶解和稳定贮存DNA的TE缓冲液将纯化的DNA从硅胶吸附柱上洗脱下来。Wizard试剂盒技术原理属于CTAB法，是利用阳离子去污剂CTAB可与蛋白质和多糖形成聚合物，并从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多糖的能力，通过有机溶剂抽提，进一步除去蛋白、多糖、酚类等杂质，在乙醇的沉淀作用下，达到分离核酸的目的。Dzup试剂盒技术原理属于盐酸胍法，通过高pH值条件下的胍盐等离液剂和变性剂将植物组织裂解，并水解RNA，再经过乙醇沉淀得到基因组DNA。SDS法是基于阴离子去污剂SDS在高温下能裂解细胞，使染色体解离、蛋白变性，同时与蛋白和多糖形成聚合物，释放核酸。整体而言，本研究中的Nucleo、Dneasy、Ezup试剂盒提取的DNA质量浓度均低于Dzup、Wizard试剂盒和SDS法提取的DNA质量浓度。这表明膜过滤法在DNA纯化过程中，可能造成部分DNA的损失，从而降低产品DNA质量浓度。  图2 6 种方法提取SPI、SPC和大豆籽粒中的DNA纯度
Fig. 2 DNA purities from SPI, SPC, and soybean seeds by six extraction methods
DNA的纯度主要包含两个方面[29]：通过DNA溶液在260 nm和280 nm波长处的吸光度比值（A260 nm/A280 nm）的大小判断DNA样品受蛋白质、酚类的污染情况，通过DNA溶液在260 nm和230 nm波长处的吸光度比值（A260 nm/A230 nm）判断多糖、盐等小分子的污染情况[30]。6 种方法提取SPI、SPC和大豆籽粒中的DNA纯度对比结果如图2所示。 以V2O5为掺杂源,采用水热法成功制备了V掺杂Bi2MoO6光催化剂,研究了掺杂量对Bi2MoO6结构和性能的影响,并利用XPS、XRD、SEM、UV-vis DRS和PL等手段对其进行表征和分析。结果表明:V掺杂并没有影响催化剂的晶型,掺杂前后Bi2MoO6均为斜方晶系;但掺杂抑制晶粒生长,掺杂后光吸收性能增强,禁带宽度变窄,光生电子-空穴对复合率降低。掺杂V后样品的活性得到了有效提高,V掺杂量为1.0% 的样品的光催化活性最佳,光照50min后对罗丹明B的降解率达73%左右,较纯Bi2MoO6提高了21%。 由图2可知，对于SPI，Nucleo试剂盒、Dneasy试剂盒得到的样品A260 nm/A280 nm值在1.7～2.0之间，A260 nm/A230 nm＞2.0，表明样品纯度高；Wizard试剂盒和SDS法提取DNA的A260 nm/A280 nm值也界于1.7～2.0，但A260 nm/A230 nm＜2.0，表明这两种方法对蛋白和RNA等的去除效果较好，但对盐等小分子的去除效果较差；Ezup试剂盒提取的DNA A260 nm/A280 nm和A260 nm/A230 nm均在2.0以上，表明样品中有RNA污染；Dzup试剂盒得到的DNA纯度最低，A260 nm/A280 nm＞2.0，A260 nm/A230 nm＜2.0，表明样品中不仅存在RNA，也存在盐等杂质。 对于SPC，仅Dneasy试剂盒提取的DNA纯度最高，A260 nm/A280 nm为1.9f0.1，A260 nm/A230 nm为5.7f1.7；Nucleo试剂盒、Wizard试剂盒、Dzup试剂盒和SDS法得到的DNA样品，A260 nm/A280 nm值界于1.7～2.0，但A260 nm/A230 nm＜2.0，其中Dzup试剂盒A260 nm/A230 nm值最小，仅为0.4，表明采用这4 种方法提取的DNA中残存多糖、盐和其他小分子等杂质；Ezup试剂盒得到DNA的A260 nm/A280 nm和A260 nm/A230 nm均在2.0以上，表明样品受RNA污染。 对于大豆籽粒，所有方法得到DNA的A260 nm/A280 nm均处于1.7～2.0的范围内，A260 nm/A230 nm值从高到低依次为Dneasy试剂盒、Nucleo试剂盒、Ezup试剂盒、SDS法、Wizard试剂盒、Dzup试剂盒，DNA样品的纯度随之递减。 造成DNA纯度不同的原因与不同方法纯化DNA的原理不同有关。Nucleo试剂盒、Dneasy试剂盒、Ezup试剂盒是基于硅胶吸附柱将DNA吸附，再通过化学试剂除杂，从而提高样品纯度。而Wizard试剂盒、Dzup试剂盒、SDS法不借助物理吸附，仅通过蛋白酶、RNA酶及其他化学试剂，除去样品中的蛋白和RNA，接着根据相似相溶原理将样品中的非DNA类物质溶解，并通过离心去除。尽管膜过滤法得到的DNA样品浓度偏低，但其纯度较高。在浓度不影响后续检测的情况下，DNA纯度对转基因检测十分重要。DNA纯度越高，PCR抑制剂存在越少，越有利于提高后续定性、定量PCR的重复性、稳定性和精确性，降低出现假阴性或假阳性结果的概率[15]。 2.2 6 种DNA提取方法的成本和时间如图3所示，DNeasy试剂盒提取DNA的过程耗时最短，约2 h即可完成，但成本最高，提取一个样品DNA需要41 元；SDS法成本最低，一次提取折合不到1 元钱，但耗时最长，完成一轮操作往往需要12 h以上。Wizard试剂盒和Ezup试剂盒的时间成本和经济成本比较适中。  图3 6 种DNA提取方法的成本（A）和时间（B）对比
Fig. 3 Differences in cost (A) and time (B) between six DNA extraction methods
2.3 6 种DNA提取方法得到的DNA完整性
 图4 6 种方法提取SPI、SPC和大豆籽粒的DNA凝胶电泳结果
Fig. 4 Agarose gel electrophoresis analysis of DNA samples extracted from SPI, SPC and soybean seeds by six extraction methods
由图4a～g可以看出，SPI和SPC的基因组DNA分布于整个泳道或亮度很弱，几乎检测不到，表明以上样品的DNA存在降解，也印证了大豆蛋白制备工艺参数可能会对大豆DNA产生降解作用。大豆蛋白中DNA的降解可能与蛋白制备工艺有关。国内外生产SPI大多采用碱溶酸沉法，是将脱脂大豆粉用稀碱液浸提后，离心除去不溶性的多糖或其他杂质后再将浸出液的pH值调至4.5左右，使蛋白质处于等电状态沉淀下来[31]。在制备过程中主要经历碱性、酸性环境的化学作用、热作用和离心等物理作用。SPC的制备主要采用溶剂浸提法，逐步除去大豆粉中的非蛋白质类可溶性物质，并将剩下的不溶物干燥而得[2]。在此过程中DNA主要受到热作用和有机溶剂的化学作用，最常用的溶剂为乙醇。 前人研究表明，pH值[32]、温度[33]和化学试剂[34]会影响DNA的稳定性。在偏碱性条件下，基因的稳定性较高，受温度影响不大，而在极端pH值条件下双链DNA会变性成为单链DNA，甚至发生脱嘌呤反应，当pH值为4.0时，辅以温度65 ℃处理90 min，DNA降解率达到99%[35]。热处理过程中，DNA会发生物理变性，100 ℃以上可引起显著的链断裂，脱嘌呤或脱氨基反应，二级结构发生不可逆损失[32]。Lu Zhengfei等[36]在水醇浸提洋甘菊提取物时，发现不论水醇比例为多少，洋甘菊提取物中的DNA均无法被完全除去，DNA的片段长度大多在100～400 bp之间。 图4h～j为未经加工处理的大豆籽粒DNA，可见，Nucleo试剂盒、Dneasy试剂盒、Ezup试剂盒、SDS法均可提取出片段大小在23 kb左右的DNA，完整性较高，较适用于大豆DNA降解规律的研究。 2.4 大豆内源lectin基因的实时荧光PCR分析[37]
 图5 6 种方法对lectin基因的扩增结果
Fig. 5 Fluorescent PCR amplification curves of the lectin gene using DNA samples extracted by six extraction methods
6 种方法对10 种样品中大豆内源lectin基因81 bp的实时荧光PCR检测结果如图5所示，所有方法提取出的DNA均可以得到典型的扩增曲线，4 次平行实验的扩增结果均呈阳性（表4）[13]，但Ct值大小差异明显。Fernandes等[38]也有类似结论：不同的DNA提取方法得到的DNA样品在进行荧光PCR时，Ct值大小可能不同。其中，Ct值越小，表明样品中的PCR抑制剂越少[39]。对于SPI，Nucleo试剂盒与Dneasy试剂盒的Ct值（19.9～22.7）均显著小于其他4 种方法，Dzup试剂盒和SDS法的Ct值相对偏高，Wizard试剂盒、Ezup试剂盒较为适中。对SPC以及大豆籽粒，Dneasy试剂盒的Ct值（19.2～21.5）均显著小于其他5 种方法，而Dzup试剂盒的Ct值（24.6～26.7）均显著大于其他5 种方法。该现象与DNA纯度结果基本一致，表明Dneasy试剂盒得到的DNA纯度较高，对实时荧光PCR检测具有较高的灵敏度，而Dzup试剂盒纯度较低，可能存在实时荧光PCR抑制剂，在实际检测中可能会影响结果的准确性。 2.5 SPI和SPC中lectin基因片段降解情况
 图6 SPI和SPC样品不同长度lectin基因片段的扩增电泳图
Fig. 6 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products of the lectin gene with different lengths in SPI and SPC samples
以Dneasy试剂盒提取得到的大豆蛋白样品DNA作为模板，对不同长度的大豆内源lectin基因进行扩增，电泳结果如图6所示。所有样品中均可以明显扩增出lectin基因81、201、414 bp的片段，扩增条带清晰、明亮。lectin基因836 bp的片段也广泛存在于SPI和SPC样品DNA中，但SPI 3和SPC 1～3的条带亮度较低。在7 种大豆蛋白样品中，同样存在lectin基因1 487 bp的片段，但条带非常弱，几乎观察不到，这表明在蛋白制备过程中lectin基因可能发生了降解，长片段逐渐消失。通过长片段与短片段的扩增条带亮度对比还可知，基因片段长度越高，越不稳定，与短片段相比更容易发生降解。除此之外，在扩增片段长度相同的情况下，样品不同得到的条带亮度不同，说明不同产地的蛋白样品可能经受了不同的制备过程，在此期间DNA所受到的降解程度和降解规律有所不同。 我院《网店运营》课程之前的教学资源主要包括课件、习题和案例等，主要偏向于理论知识，知识内容不够丰富，形式比较单一，缺少实战性的任务。前期在对教材内容进行重构时，已经积累了一些企业的丰富实战素材，所以在教学资源库建设中，同样也得到了企业导师团队的大力支持和共同参与。丰富网店运营中商品的品类资源，教学案例，图片素材等，拓展课程教学资源库。充分利用学院建设的信息化平台，将教学资源上传至超星学习通进行分享，为学生搭建一个随时随地进行自主学习的网络资源环境，为课程的翻转课堂教学提供保障。 3 结 论本实验以不同产地的SPI、SPC和大豆籽粒为原料，研究6 种常用的DNA提取方法——Nucleo试剂盒、Wizard试剂盒、Dneasy试剂盒、Ezup试剂盒、Dzup试剂盒、SDS法对DNA的提取效果，筛选出最适合SPI、SPC和大豆籽粒中DNA提取的方法，以根据检测工作的实际需求，有针对性地选择合适的方法，提高工作效率和结果可靠性。 通过对比可知，Dneasy试剂盒提取DNA的浓度较低，但纯度最高，操作过程耗时最短，成本较高，DNA产品的完整性保持较好，实时荧光PCR检测过程中灵敏度高，在现场快检和对结果灵敏度、准确度要求较高的检测中较为适用。同样地，Nucleo试剂盒得到的DNA质量浓度也较低，但纯度较高，能够很好地保持DNA完整度，操作时间短，成本适中，对SPI的检测灵敏度高，而在SPC的检测方面灵敏度略低于Dneasy试剂盒。Ezup试剂盒和SDS法提取的DNA同样可以保持较高的完整性，SDS法价格最低，但纯度较差。Wizard试剂盒提取的DNA完整性相对较差，但由于该方法的实时荧光PCR灵敏度以及价格和操作时间均较低，也可以作为备选方法之一。Dzup试剂盒无论从DNA完整性还是浓度等方面均无法与以上5 种方法相提并论，因此不推荐作为大豆DNA的提取方法。 除此之外，本研究还发现SPI和SPC中DNA含量不同，SPI中的DNA含量整体高于SPC，推测其原因可能与DNA的降解有关。通过对4 种市售SPI和3 种SPC中不同长度的内源lectin基因扩增结果，印证了这一推测：在大豆蛋白制备过程中lectin基因836 bp和1 487 bp存在降解，条带亮度与81、201、414 bp相比明显较暗，也表明长片段比短片段更容易发生降解，且制备工艺不同，降解程度也有所不同。 因此，下一步可以在筛选出最适提取方法的基础上，对大豆蛋白制备过程中DNA的降解规律进行研究，为转基因大豆制品的检测和生产调控提供科学依据。 参考文献： [1] NAGAO K, MATSUMOTO A, KAI S, et al. 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Comparative Evaluation of DNA Extraction Methods for Detection of Transgenic Soybean Protein and Analysis of lectin Gene Degradation during Soybean Protein Extraction DU Yan, CHEN Fusheng*, CHEN Chen, LIU Ying
(College of Food Science and Technology, Henan University of Technology, Zhengzhou 450001, China) Abstract: In this paper, six methods of DNA extraction, namely Macherey-Nagel Nucleo Spin Kit (Nucleo kit), Wizard Genomic DNA Purification Kit (Wizard kit), Dneasy Plant Mini Kit (Dneasy kit), Ezup column plant genomic DNA extraction kit (Ezup kit), Dzup genomic DNA extraction kit (Dzup kit) and sodium dodecyl sulfate (SDS) method, were comparatively applied to extract DNA from soybean protein extracts and soybean seeds. The DNA concentration, purity and integrity were determined by ultraviolet spectrophotometry, agarose gel electrophoresis and real-time fl uorescent PCR, and the reaction sensitivity was evaluated. We aimed to fi nd the optimum method to extract DNA from soybean protein isolate(SPI), soybean protein concentrate (SPC) and soybean seeds so as to improve the sensitivity and accuracy of transgenic soybean detection. Results showed that the purity and integrity of DNA extracted with Nucleo kit and Dneasy kit were high enough for real-time PCR detection. The purity of DNA obtained by Dneasy kit was the highest, being beneficial for improving the repeatability, stability and accuracy of subsequent PCR reaction, so that Dneasy kit was applicable to SPI,SPC and soybean seeds. The extraction efficiencies of Ezup kit and SDS method were moderate. SDS method costed the least but took the longest time. Despite the high yield, the DNA obtained with Dzup kit was fragmentary and contained lots of impurities, which could limit the applicability of Dzup kit for DNA extraction for transgenic soybean detection.Furthermore, the lectin gene was inferred to be degraded during SPI and SPC preparation with Dneasy kit. Keywords: soybean protein isolate; soybean protein concentrate; soybean seeds; DNA extraction; real-time PCR
收稿日期：2019-07-02 基金项目：国家自然科学基金面上项目（21676073；21376064）；“十三五”国家重点研发计划重点专项（2018YFD0401100） DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190702-020 中图分类号：TS201.6 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2020）04-0102-10 引文格式：杜艳, 陈复生, 陈晨, 等. 转基因检测中大豆蛋白DNA提取方法筛选及其lectin基因降解分析[J]. 食品科学, 2020, 41(4):102-111. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190702-020. http://www.spkx.net.cnDU Yan, CHEN Fusheng, CHEN Chen, et al. Comparative evaluation of DNA extraction methods for detection of transgenic soybean protein and analysis of lectin gene degradation during soybean protein extraction[J]. Food Science, 2020, 41(4):102-111. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190702-020. http://www.spkx.net.cn
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发表于 2021-1-31 21:55:19
