Q-Orbitrap高分辨质谱法测定牛奶中赖丙氨酸及其含量随温度...

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Q-Orbitrap高分辨质谱法测定牛奶中赖丙氨酸及其含量随温度变化的规律
聂雪梅1,2，王 菡2,3，许秀丽2，张 峰2,*，陈 达1
（1.天津大学精密仪器与光电子工程学院，天津 300072；2.中国检验检疫科学研究院食品安全研究所，北京 100176；3.陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西 西安 710021）
摘 要：建立一种快速、准确测定牛奶中赖丙氨酸的超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨率质谱法分析方法。牛奶样品使用盐酸酸解法进行前处理，并选用Ascentis-C8色谱柱（100 mmh4.6 mm，3 μm）对待测物进行分离，以0.1%甲酸溶液和乙腈作为流动相进行梯度洗脱，在全扫描-数据依赖二级扫描模式进行检测。结果表明：赖丙氨酸的精确质量数偏差小于1.0h10-6，在1～200 μg/L范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999；牛奶中赖丙氨酸的检出限为0.01 mg/kg，定量限为0.025 mg/kg。加标量分别为0.025、0.1 mg/kg和0.25 mg/kg，样品的回收率为78.7%～117.1%，相对标准偏差为3.64%。同时采用小型模拟加工设备加热液态奶，研究赖丙氨酸在不同加工条件下含量的变化规律。本方法重复性好、准确、灵敏度高，可用于牛奶中赖丙氨酸的定性、定量筛查。
关键词：超高效液相色谱；高分辨率质谱；赖丙氨酸；牛奶；检测
牛奶富含蛋白质，在高温加热时发生美拉德反应易产生一种副产物氨基酸——赖丙氨酸[1]。赖丙氨酸的产生不仅使牛奶的营养价值降低[2]，在毒理实验中还发现其能螯合金属酶，特异地引发小鼠肾钙质沉着、肾细胞巨大及肾小管细胞坏死[3]，尤其对常饮用牛奶的婴幼儿的健康有重要影响[4-5]。随着研究深入，发现赖丙氨酸的形成有很多因素，包括食品组分、食品加工方式、食品储存条件[6-8]等，而其中热加工方式是对赖丙氨酸含量影响最大的因素[9]，赖丙氨酸也在很多热加工食品中被测出[10-12]，尤其在很多婴儿配方食品中，赖丙氨酸已经开始作为一个质量指标，用以衡量其对婴儿是否造成伤害[13]。Faist等[14]研究显示赖丙氨酸能够评估奶制品热处理程度的灵敏的指示剂。Calabrese等[15]在酪蛋白钙和奶粉中检测到高含量的赖丙氨酸，也证明赖丙氨酸可作为牛奶加工工艺评定的重要指示物之一[16]。因此开展牛奶中赖丙氨酸分析方法研究，并研究其在热加工温度下的含量变化规律，对于准确了解市场上牛奶中赖丙氨酸的含量水平，科学制定牛奶中赖丙氨酸的限量水平，都具有重要意义。
对于赖丙氨酸的检测方法主要包括氨基酸分析仪法[17]、气相色谱（gas chromatography，GC）法[18]、液相色谱（liquid chromatography，LC）法[19]以及液相色谱-质谱（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）联用法[20]、脉冲-傅里叶变换核磁共振谱仪法[21]等。目前并未检索到高分辨质谱检测方法，其中脉冲-傅里叶变换核磁共振谱仪分析过程不需要衍生，处理简单，但其只适于合成的赖丙氨酸及其标准品的检测，并不适合成分复杂的食品中赖丙氨酸的分析。而GC、LC和LC-MS均需要衍生，其中GC衍生理由为赖丙氨酸作为一种交联氨基酸[21]，不能直接用GC进行检测，必须经过衍生得到弱极性、低挥发性和良好热稳定性的衍生物才能进行GC分离测定。LC衍生理由为由于赖丙氨酸在紫外-荧光检测器响应值较低，因此需引入衍生试剂提高其响应值。LC-MS衍生理由为由于引入衍生试剂后更易离子化，可提高质谱响应。且目前测定乳制品中赖丙氨酸的方法大多需要衍生，样品基质复杂且干扰物质多[22-24]，定性准确度差[25-27]。例如Lourdes等[28]用6 mol/L盐酸溶液110 ℃水解24 h，用硅烷化试剂N-(特丁基二甲基硅烷基)-N-甲基三氟乙酰胺与赖丙氨酸进行衍生，形成N-tert-butyldimethylsilyl衍生化合物，之后采用GC-氢火焰离子检测器进行定量，定性又需气相色谱-质谱仪器，前处理复杂。
本研究经过盐酸水解后直接定量，同时采用的高分辨质谱具有高分辨能力和高灵敏度，能够准确定性定量等优势，无需衍生也能准确测定赖丙氨酸，且测定时间短，对于提高行业检测水平和科学制定牛奶中赖丙氨酸的限量有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜牧场牛奶来自牧场当天牛奶采集样本，其他牛奶样品均为市购。牛奶中主要营养成分分别为脂肪3.5%、蛋白质3.3%、碳水化合物4.8%、钠50 mg/100 g。
赖丙氨酸标准品（纯度＞95%） 加拿大多伦多研究化学品公司；甲酸（质谱级） J&K科学有限公司；盐酸（分析纯） 安徽八一化工股份有限公司；硼酸（分析纯） 富凯化工责任有限公司；硼氢化钠（HPLC级） 百灵威科技有限公司；氢氧化钠（分析纯） 天津科密欧化学试剂有限公司；乙腈、甲醇（色谱纯） 美国Thermo Fisher Scientific公司；实验室超纯水由Millipore 纯水仪制备。
1.2 仪器与设备
Q-Exactive超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨率质谱仪 美国Thermo Fisher Scientific公司；Milli-R04纯水仪 德国Millipore公司；XP105DR分析天平 梅特勒-托利多上海有限公司；HSC-12B针式氮吹仪天津恒奥科技有限公司；VM-6涡旋振荡器 北京五洲东方科技发展有限公司；一次性注射器（2 mL）及滤膜美国Welch公司。
1.3 方法
1.3.1 标准溶液配制
准确称取赖丙氨酸标准品10 mg（精确至0.1 mg），用水定容至10 mL，配制成1 mg/mL的标准储备液，置于-20 ℃贮存，再用水稀释成质量浓度为1.00 μg/mL标准溶液。测定前用水稀释成1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00 ng/mL和200.00 ng/mL系列标准溶液。
1.3.2 超高效液相色谱条件
色谱柱为Ascentis-C8（100 mmh4.6 mm，3 μm）；流动相A为水相，含0.1%（V/V）甲酸，流动相B为乙腈；流速0.4 mL/min；进样体积5 μL，柱温40 ℃；梯度洗脱程序：0 min，95% A；8 min，60% A；10～13 min，0% A；13.1～15 min，95% A。
1.3.3 质谱条件
离子源：加热电喷雾离子源；离子源参数：离子传输管温度350 ℃；鞘气压力206.85 kPa；辅助气压力1 000 kPa；喷雾电压3.5 kV；监测模式：正离子监测模式；全扫描-数据依赖二级扫描模式；实验中所用的气体均为高纯氮气，质量扫描范围m/z 100～500，待测化合物信息如表1所示。
表1 监测化合物质谱信息
Table 1 Mass spectrometric parameters of lysinoalanine

1.3.4 样品前处理
首先准确称取空白鲜奶样品1 g（精确至0.001 g）于酸解管中，加入1.33 mL硼酸缓冲液（0.5 mol/L，pH 9.5）和173 μL硼氢化钠（NaBH4，1 mol/L在0.2 mol/L NaOH中）混合。在室温下孵育6 h后，加入4 mL盐酸（6 mol/L），在110 ℃氮气中水解24 h，加水至10 mL，用0.45 μm滤膜过滤，取200 μL滤液至氮吹管中，吹干后用500 μL纯水复溶，过0.22 μm滤膜，上机待测。
1.4 数据处理
超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱原始数据利用Thermo Scientific Xcaliber软件采集及定性定量处理。表格制作利用Microsoft Office 2007软件，绘制图形利用Origin Pro软件。
2 结果与分析
2.1 测定条件的优化
2.1.1 色谱柱的优化
如图1所示，采用C18柱有拖尾现象且无保留，这可能是由于柱长较短，未洗脱干净；使用HILIC及aQ色谱柱分离目标物时，色谱峰响应比Ascentis-C8柱低，影响定量的准确性。Ascentis-C8为中等极性分析柱，Ascentis-C8分析柱可以对较弱极性化合物有较好的保留。根据色谱峰响应、峰性和保留时间，本方法采用Ascentis-C8色谱柱对目标物进行分离。

图1 4 种色谱柱效果对比图
Fig. 1 Comparison of separation efficiencies with four columns
2.1.2 流动相的优化
考察甲醇和乙腈2 种有机相对色谱峰形的影响，如图2所示。乙腈作为流动相时目标化合物响应更高。乙腈作为有机相对分析物产生更高的响应，这可能是由于乙腈表面张力小，可以更好地溶液去溶剂化，离子化效率更高。选择水相时对比加不同体积分数的甲酸（0%、0.05%、0.1%、0.2%）对色谱峰形的影响。如图3所示，在使用0.1%甲酸溶液作为流动相时对赖丙氨酸有良好的色谱分离效果，可兼顾质谱响应，色谱峰峰形较优，流动相中甲酸含量会影响赖丙氨酸的离子化效果，甲酸含量过高会引起竞争性的电离抑制，使得赖丙氨酸在质谱中的响应降低，含量过低会导致离子化效果较差，因此选择0.1%甲酸溶液作为流动相。

图2 2 种有机相效果对比图
Fig. 2 Comparison of separation efficiencies with two organic phases


图3 4 种不同比例甲酸效果对比图
Fig. 3 Comparison of separation efficiencies with different concentrations of formic acid
2.1.3 质谱参数的优化
对比全扫描、全扫描-数据依赖二级扫描2 种扫描模式。全扫描模式下虽然可以达到对目标物的定量检测，但其仅以母离子精确质量数和保留时间对目标物进行定性，易造成假阳性检测结果。因此选择全扫描-数据依赖二级扫描模式进行目标物的筛查监测，以母离子和碎片离子精确质量数定性，精确母离子定量，可达到对目标物的筛查及定量目的。在全扫描-数据依赖二级扫描模式下，质谱方法设置一级分辨率70 000，二级分辨率35 000，归一化碰撞能量在25%可得到最佳监测结果，质荷比偏差均小于1.0h10-6。
2.1.4 优化后的赖丙氨酸色谱峰

图4 赖丙氨酸标准色谱图
Fig. 4 Chromatogram of lysinoalanine standard
如图4所示，经过色谱和质谱条件的优化，选用Ascentis-C8色谱柱（100 mmh4.6 mm，3 μm）对待测物进行分离，以0.1%甲酸溶液和乙腈作为流动相进行梯度洗脱，在全扫描-数据依赖二级扫描模式下进行检测，色谱峰峰形较好。
2.2 前处理条件的优化
由于牛奶中的赖丙氨酸多与蛋白质结合，所以分析牛奶中的赖丙氨酸时都要先经过水解，使赖丙氨酸得到释放[29-30]。本实验测定2 种QuECHERS方法乙酸锌净化除脂、乙酸锌+亚铁氰化钾净化除脂和盐酸水解3 种提取方式下赖丙氨酸的含量，发现未经盐酸水解的2 种方法均未检出赖丙氨酸，所以本实验采用盐酸水解的方法。盐酸水解后，净化方式对比了PSA和C18单独净化、两者结合净化以及直接氮吹复溶，发现响应值并无较大区别，因此为节省前处理步骤采用直接氮吹复溶。
2.3 方法验证
2.3.1 标准曲线、检出限和定量限结果
配制赖丙氨酸标准溶液（1～200 μg/L），以峰面积（Y）为纵坐标，质量浓度（X，μg/L）为横坐标，绘制标准曲线，在1～200 μg/L质量浓度范围内赖丙氨酸色谱峰面积与质量浓度呈良好线性相关，回归方程为y＝111 362x+17 995.4；相关系数R2为0.999 0。同时样品中赖丙氨酸的检出限和定量限分别为0.01 mg/kg和0.025 mg/kg，表明该方法具有较好的灵敏度，可以对含量较低的分析物进行定量。
2.3.2 回收率测定结果
选取鲜奶进行回收率实验，在处理样品前加入不同含量标准品，按照前处理方法分别进行样品处理后，在相同条件下进行分析，分2 批次共测定6 次，结果见表2，回收率在78.7%～117.1%范围内。
表2 回收率实验结果
Table 2 Recoveries of lysinoalanine from spiked samples

2.3.3 精密度测定结果
表3 精密度实验结果
Table 3 Precision of the method

选取某灭菌乳进行重复性实验，按照前处理方法分别进行前处理后，在相同条件下进行分析，分3 批次共测定6 次，结果见表3。相对标准偏差为3.64%，此方法的精密度良好。
2.4 样品分析及评价
2.4.1 样本中赖丙氨酸定性分析
运用全扫描-数据依赖二级扫描模式收集化合物信息，选取2 个响应值高且有特征性的碎裂片段C5H10N+（m/z 84.081 5）与C6H12NO2+（m/z 130.086 3）以及丰度比进行定性。由图5可得，二级碎片质荷比、分子离子质荷比、母离子的保留时间基本可对复杂牛奶样本中的赖丙氨酸准确定性。

图5 赖丙氨酸标准品和样品中赖丙氨酸色谱图和子离子质谱图
Fig. 5 Chromatograms and daughter ion mass spectra of 50 μg/L lysinoalanine standard and sample
2.4.2 温度样品含量变化规律的影响
从牧场采集的新鲜牛奶，在6 h内混匀并置于小型模拟牛奶加工设备上，分别加热至50～150 ℃（每隔10 ℃测定1 个样品），加热时间5～10 s，加热处理后置于50 mL样品管中（每个温度点取2 个样），按照赖丙氨酸前处理方式盐酸酸解处理并上机。如图6所示，当加热温度升高时，赖丙氨酸含量会随着温度不断变化，从50～110 ℃赖丙氨酸含量随着温度的升高而增加，当加热到120 ℃时含量下降，从120～140 ℃含量波动较小。

图6 赖丙氨酸含量随温度变化图
Fig. 6 Variation in lysinoalanine content of fresh milk with heating temperature
2.4.3 市场样品检测结果
表4 市售乳制品中的赖丙氨酸含量
Table 4 Lysinoalanine contents in commercial liquid milk products

对来自市场不同品牌的12 种液态乳进行测定，根据赖丙氨酸的保留时间及选择的两对子离子峰高的比值进行定性分析，结果如表4所示。超高温瞬时灭菌牛奶的8 个样品的平均含量为5.554 mg/kg，巴氏杀菌牛奶的4 个样品的平均含量为3.745 mg/kg，其含量值在上述赖丙氨酸的变化规律范围内。目前，对于赖丙氨酸在乳制品中的限量，各国均无限量标准。因此，本方法的建立，对于准确获取市场上牛奶中赖丙氨酸的含量情况，制定出符合我国国情的限量标准具有重要参考意义。
3 结 论
本研究采用高分辨质谱对液态奶中赖丙氨酸进行分析，并进行方法学验证。由于高分辨质谱具有高分辨能力、准确定性、超高灵敏度等优势，又采用了简化前处理的方法，处理时间短，不需要衍生，相对于其他文献中赖丙氨酸的测定方法，具有明显的优势。同时采用小型模拟加工设备对牧场采集的新鲜液态奶进行不同加工条件的处理，并研究赖丙氨酸含量随加热温度的变化规律，在50～110 ℃赖丙氨酸含量随着温度的升高增加，当加热到120 ℃时含量下降，从120～140 ℃含量波动不大。其后对来自市场不同品牌的12 种液态奶进行测定，其含量符合赖丙氨酸的变化规律范围。通过采用超高效液相色谱-串联质谱可对乳品中的赖丙氨酸实现快速、准确、灵敏检测，对于准确获取市场上乳制品中赖丙氨酸含量情况，制定出符合我国国情的限量标准具有重要参考意义，本方法将在保障乳制品安全中发挥积极作用。
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Determination of Lysinoalanine in Milk Products by Q-Orbitrap High Resolution Mass Spectrometry and Variation in Its Content with Temperature
NIE Xuemei1,2, WANG Han2,3, XU Xiuli2, ZHANG Feng2,*, CHEN Da1
(1. School of Precision Instrument and Opto-Electronics Engineering, Tianjin University, Tianjin 300072, China;2. Institute of Food Safety, Chinese Academy of Inspection & Quarantine, Beijing 100176, China;3. School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi’an 710021, China)
Abstract: A rapid method for the determination of lysinoalanine in milk products by ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole/electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry (UPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS) was developed. Samples were hydrolyzed with hydrochloric acid to remove impurities such as proteins and then separated on an Ascentis C8 column (100 mm × 4.6 mm, 3 μm) by gradient elution using a binary solvent system composed of acetonitrile and 0.1% formic acid in water. The analytes were detected by quadrupole-orbitrap high resolution mass spectrometry in full-MS and data dependent scan (ddMS2) mode. The results showed that the deviation between the theoretical and measured accurate mass to charge ratio of lysinoalanine was lower than 1.0 × 10-6, and a good linear relationship was observed in the concentration range of 1–200 μg/L with a correlation coefficient higher than 0.999. The limit of detection (LOD) was 0.01 mg/kg and the limit of quantitation (LOQ) was 0.025 mg/kg. Recoveries of the method were in the range of 78.7%–117.1% at spiked concentration levels of 0.025, 0.1, and 0.25 mg/kg, and the relative standard deviation (RSD) for precision was 3.64%. The method had high accurate, repeatability and sensitivity, and consequently was suitable for the qualitative and quantitative screening of lysinoalanine in milk products. Furthermore, the pattern of variation in lysinoalanine content of liquid milk processed using small-scale simulated processing equipment at different temperatures was studied.
Keywords: utlra-high performance liquid chromatography; high resolution mass spectrometry; lysinoalanine; milk;determination
收稿日期：2019-03-28
基金项目：中国检验检疫科学研究院基本科研业务费项目（2017JK005）
第一作者简介：聂雪梅（1978ü）（ORCID: 0000-0002-7814-5694），女，副研究员，硕士，研究方向为食品安全。E-mail: niexuemei_00@163.com
*通信作者简介：张峰（1974ü）（ORCID: 0000-0003-0155-9087），男，研究员，博士，研究方向为分析化学。E-mail: fengzhang@126.com
DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190328-350
中图分类号：TS207.7
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2020）04-0280-07
引文格式：聂雪梅, 王菡, 许秀丽, 等. Q-Orbitrap高分辨质谱法测定牛奶中赖丙氨酸及其含量随温度变化的规律[J]. 食品科学,2020, 41(4): 280-286. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190328-350. http://www.spkx.net.cn
NIE Xuemei, WANG Han, XU Xiuli, et al. Determination of lysinoalanine in milk products by Q-Orbitrap high resolution mass spectrometry and variation in its content with temperature[J]. Food Science, 2020, 41(4): 280-286. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190328-350. http://www.spkx.net.cn