NaOH处理对霞多丽葡萄籽原花青素的影响

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NaOH处理对霞多丽葡萄籽原花青素的影响
张 杰1,2，王文雅1,2,*，袁其朋1,*
（1.北京化工大学生命科学与技术学院，北京 100029；2.北京化工大学厦门北化生物产业研究院有限公司，福建 厦门 361022）
摘 要：为获得更多能被吸收的低聚原花青素（oligomeric procyanidins，OPC）（聚合度＜5），研究NaOH预处理对葡萄籽中原花青素（procyanidin，PC）解聚及体外抗氧化活性的影响。考察预处理温度（40、60、80 ℃）、处理时间（15、30、60 min）、NaOH浓度（0、1、2、4、6、8、10、15、20、25 mol/L）对OPC生成的影响，并测定不同条件下PC的平均聚合度（mean degree of polymerization，mDP）、OPC组分、OPC含量以及体外抗氧化活性。结果显示，NaOH处理生成OPC的最佳条件为NaOH浓度10 mol/L、预处理温度60 ℃、处理时间15 min。与对照组（0 mol/L NaOH、预处理温度60 ℃、处理时间15 min）相比，最佳条件处理后，PC的mDP由对照组的5.39f0.12降至1.30f0.014，OPC组分的总面积增加了7.28 倍，OPC含量增加了5.42 倍，体外抗氧化活性1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐、铁离子还原能力分别提高3.22、4.13 倍和2.84 倍。综上，本研究为生产OPC提供了一种新思路，为葡萄籽的高附加值开发提供新方向。
关键词：葡萄籽；原花青素；解聚；低聚原花青素；抗氧化活性
葡萄籽是红酒产业的主要副产物之一，含有较多活性物质，如维生素、矿物质、脂类、蛋白质、碳水化合物、多酚等，其中最著名是原花青素（procyanidin，PC）。来源于葡萄籽的PC有很好的药理学功能，如抗氧化性、抗炎性和广谱抗菌性等[1]。PC的上述生理学活性使其在制药、食品、医疗保健等领域应用广泛。黄烷-3-醇（儿茶素（catechin，C）/表儿茶素（epicatechin，EC））和其衍生物（表儿茶素没食子酸酯（epicatechin 3-O-gallate， ECG））为葡萄籽中PC的主要聚合单元，它们通过CüC键聚合成B型的PC[2-3]。研究发现葡萄籽中65% PC的聚合度（degree of polymerization，DP）大于5[3]，生物利用率研究显示，仅DP小于5的PC能被人体吸收[4-7]。虽然PC有很好的生物活性，但多数大分子PC不能被人吸收，因此将高聚原花青素（polymeric procyanidins，PPC）（DP＞5）转化为能被人吸收的低聚原花青素（oligomeric procyanidins，OPC）（DP＜5）或单体是葡萄籽高附加值利用的重要途经之一。
目前，国内外PC解聚的方法主要有单体链断裂剂法[8]、弱酸法[3]、酸式盐法[9]、催化剂加氢裂解法[10]、碱裂解法[11]等。这些解聚方法中，部分方法或由于生产成本高，或对设备要求苛刻，或者易产生有毒刺激性气体，不适用于食品工业生产。碱裂解法最早被应用于蔓越莓中制备A型PC，结果显示二聚体增加了8.4 倍，单体增加14.9 倍，综合评价碱法表现出了较高的工业应用潜力，但碱法对葡萄籽中B型PC制备的影响及活性研究鲜见报道。因此，本实验研究不同条件NaOH处理对葡萄籽中提取B型PC制备的影响，包括PC的平均聚合度（mean degree of polymerization，mDP）、PC含量、体外抗氧化活性、OPC组分的变化等，并且探究PC含量和体外抗氧化活性的关系。研究确定碱法对于葡萄籽中B型PPC有解聚和促进OPC释放的作用，并且确定最佳水解条件。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
法国霞多丽葡萄籽（酒厂） 西安昊轩生物科技有限公司；葡萄籽PC（纯度95%） 西安瑞林生物科技有限公司；总抗氧化能力检测试剂盒 碧云天生物技术公司；福林-酚试剂、标准品C 美国Sigma公司；NaOH（分析级） 北京化工厂；乙酸（色谱级） 天津赛孚瑞科技有限公司；乙腈、甲醇（色谱级） 赛默飞世尔科技有限公司。
标准品EC、ECG、原花青素二聚体B1、原花青素二聚体B2 成都曼思特生物科技有限公司；原花青素二聚体B3、原花青素三聚体C1 上海源叶科技有限公司；原花青素四聚体A2 北京大道正行科技发展有限公司；2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS） 梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；香草醛、苄硫醇、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl hydrate，DPPH） 上海麦克林生化科技有限公司。以上标准品纯度均大于96%。
1.2 仪器与设备
MS-H-ProT加热磁力搅拌器 美国赛洛捷克有限公司；V-5100B紫外分光光度计 上海元析仪器有限公司；LC-20AT液相色谱仪 日本岛津公司；Seven2Go高级单通道便携式pH计 梅特勒-托利多国际贸易有限公司；50 mL NEST刻度尖底离心管 北京科华经纬科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 霞多丽葡萄籽预处理
参考Gu Liwei等[12]的方法，略有修改。葡萄籽洗净，冷冻干燥48 h，粉碎过20 目筛。称粉碎后葡萄籽50.00 g，置于500 mL烧杯中，加入250 mL正己烷，300 r/min磁力搅拌脱脂12 h，静置30 min，抽滤得滤渣，置于通风橱中，静置24 h。上述实验操作尽量在避光条件下进行。
1.3.2 碱预处理及PC粗提液制备
参考文献[11-12]的方法，略有修改。脱脂葡萄籽0.500 0 g，置于50 mL离心管中。加入5 mL NaOH溶液，NaOH溶液浓度分别为0、1、2、4、6 mol/L，处理温度分别为40、60、80 ℃，处理时间分别为15、30、60 min。处理结束后，将离心管置于冰浴中至调pH值，用4 mol/L HCl溶液调节pH值至6～7，加入丙酮-水-乙酸（70∶29.5∶0.5，V/V）溶液，将离心管溶液稀释至35 mL。稀释后的处理液37 ℃水浴超声10 min。随后，室温遮光，600 r/min搅拌提取50 min，9 000 r/min离心15 min，收集上清液即获得PC粗提液，粗提液备测。在此基础上，设定温度和时间为60 ℃、15 min，NaOH溶液浓度分别为8、10、15、20、25 mol/L，按照前述流程进一步优化碱裂解条件，提取PC备测。
1.3.3 PC粗提液的除盐液制备
参考Li Zheng等[10]的方法，用乙酸乙酯萃取去除粗提液中的盐分。取5.00 mL PC粗提液于25 mL鸡心瓶中，45 ℃旋干，用15 mL超纯水溶解固体洗涤鸡心瓶，转移至125 mL分液漏斗。加30 mL乙酸乙酯，萃取3 次，收集乙酸乙酯相。取72 mL乙酸乙酯相于100 mL鸡心瓶中，45 ℃旋干。用4 mL甲醇溶解洗涤鸡心瓶，过0.45 μm滤膜，滤液备测。
1.3.4 PC的mDP测定
各称10.00 mg C、EC、ECG、原花青素二聚体B1、原花青素二聚体B3置于10 mL容量瓶中，加入适量甲醇溶解，定容得1 mg/mL标准品溶液。C、EC、ECG为末端单元对照直接进行液相色谱测定，原花青素二聚体作为延伸单元的对照进行硫解实验。通过硫解原花青素二聚体B1和原花青素二聚体B3，鉴定C末端及3,4-反-表儿茶素苄硫醚、3,4-反-儿茶素苄硫醚和3,4-顺-儿茶素苄硫醚[13]。
硫解的方法参考文献[2,12,14-15]，采用反相高效液相色谱（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）略有改动。各取50 µL甲醇和原花青素二聚体B1及原花青素二聚体B3溶液分别置于250 µL内插管中，加入50 µL体积分数3.3% HCl-甲醇溶液和100 µL体积分数5%苄硫醇-甲醇溶液，然后将置于1.5 mL的液相小瓶中的内插管盖紧，40 ℃水浴30 min，-20 ℃保存10 h。甲醇组为溶剂对照组，PC粗提液及除盐液按照上述操作硫解，硫解产物采用液相色谱检测。
HPLC测定条件参考Gu Liwei等[15]的方法。Diamonsil-C18色谱柱（250 mmh4.6 mm，5 µm）；柱温35 ℃；流速1.0 mL/min；进样量20 µL；检测波长280 nm；流动相A为2%乙酸溶液，流动相B为甲醇；梯度洗脱：0～45 min，15%～80% B；45～50 min，80% B；50～55 min，80%～15% B；55～70 min，15% B。mDP按式（1）计算：

式中：末端单元分别为C、EC、ECG；延伸单元苄硫醚分别为3,4-反-儿茶素苄硫醚、表没食子儿茶素苄硫醚、3,4-顺-儿茶素苄硫醚、3,4-反-表儿茶素苄硫醚、表儿茶素-3-O-没食子酸酯苄基硫醚。
1.3.5 正相高效液相色谱（normal-phase high performance liquid chromatography，NP-HPLC）分析OPC组分
各称10.00 mg C、EC、ECG、原花青素二聚体B1、原花青素二聚体B2、原花青素二聚体B3、原花青素三聚体C1、原花青素四聚体A2置于10 mL容量瓶中，加入适量甲醇溶解固体，定容得1 mg/mL标准品溶液，过0.45 µm滤膜，备测。各取1 mL 1 mg/mL的C、EC、ECG、原花青素二聚体B1、原花青素二聚体B2、原花青素二聚体B3溶液于10 mL带塞螺纹玻璃管，混合均匀得混合标准品1。同样配制混合标准品2（C、EC、ECG）、混合标准品3（原花青素二聚体B1、原花青素二聚体B2、原花青素二聚体B3）、混合标准品4（C、EC、ECG、原花青素二聚体B1、原花青素二聚体B2、原花青素二聚体B3、原花青素三聚体C1、原花青素四聚体A2），-20 ℃贮存备测。
HPLC条件参考Choy等[16]的方法，略有改动。Develosil diol 100色谱柱（250 mmh4.6 mm，5 µm）；柱温30 ℃；流速1.0 mL/min；进样量20 µL；检测波长280 nm；流动相A为乙腈-乙酸溶液（98∶2，V/V），流动相B为甲醇-超纯水-乙酸溶液（95∶3∶2，V/V）；梯度洗脱：0～3 min，7% B；3～53 min，7%～37.6% B；53～56 min，37.6%～100% B；56～69 min，100% B；69～75 min，100%～7% B；75～85 min，7% B。参考文献[16]的液相色谱测定条件对DP大于10的PC检测有干扰，因此将流动相A改为乙腈-水（98∶2，V/V），其他测定条件同上。
1.3.6 PC含量的测定
参考Çam等[17]的方法，略有修改。称25.00 mg C置于25 mL容量瓶，加入适量甲醇溶解C，定容得100 µg/mL母液。分别取1、2、4、6、8 mL母液置于10 mL容量瓶，定容得10、20、40、60、80 µg/mL梯度溶液。取1.00 mL待测液于10 mL试管中，加2.50 mL质量分数1%香草醛-甲醇溶液，加2.50 mL体积分数25% H2SO4-甲醇溶液，30 ℃水浴15 min，于波长500 nm处测吸光度，甲醇作空白对照。以吸光度为纵坐标，以C质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程y=0.008 1x+0.068（R2=0.999 8）。除盐液稀释8 倍，进行测定，根据方程计算，结果以C当量表示（µg/mL），以干基计。
1.3.7 体外抗氧化测定
1.3.7.1 DPPH自由基清除能力测定
参考Xu Changmou等[18]的方法，略有修改。称6.26 mg Trolox置于25 mL容量瓶，加入适量甲醇溶解Trolox，定容得1 000 µmol/L母液。分别各取1、2、4、6、8 mL母液置于10 mL容量瓶，定容得100、200、400、600、800 µmol/L Trolox溶液。取100 µL待测液于10 mL试管，加入3.90 mL 2.5 mg/100 mL DPPH-甲醇溶液。空白组为甲醇，于波长515 nm处测得吸光度A0。对照组在30 ℃黑暗条件下反应60 min，于波长515 nm处测定吸光度A。DPPH自由基清除率按式（2）计算。以清除率为纵坐标，以Trolox为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程y=0.055x+0.976 2（R2=0.999 6）。除盐液稀释8 倍后，进行测定，根据方程计算，结果以Trolox当量（µmol/g）表示，以干基计。

1.3.7.2 Fe3+还原能力（Ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）测定
参考相关文献[19-20]的方法，略有改动。称量12.52 mg Trolox置于50 mL容量瓶，加入适量超纯水溶解，定容得2 000 µmol/L母液。分别取0.5、2.5、5、7.5 mL母液置于10 mL容量瓶，定容得150、300、600、900、1 200、1 500 µmol/L Trolox溶液。取试剂盒中TPTZ稀释液、TPTZ溶液和检测缓冲液以10∶1∶1比例混匀，37 ℃孵育60 min得FRAP工作液。取180 µL FRAP工作液加入到96 孔板中，加入5 µL待测样品混匀，37 ℃孵育5 min，于波长593 nm处测定吸光度，超纯水作空白对照。以还原产物吸光度为纵坐标，Trolox为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程y=0.000 6x-0.027 7（R2=0.998 3）。除盐液稀释8 倍后，进行测定，根据方程计算，结果以Trolox当量（µmol/g）表示，以干基计。
1.3.7.3 ABTS阳离子自由基清除能力测定
参考相关文献[19,21]的方法，略有改动。取100 mL 7 mmol/L ABTS溶液和50 mL 2.45 mmol/L K2S2O8溶液置于250 mL蓝色螺纹瓶，25 ℃黑暗条件下反应12 h，得ABTS反应初始液。用乙醇稀释ABTS反应初始液于波长734 nm处测定吸光度为0.700f0.200。称12.52 mg Trolox置于50 mL容量瓶，加入适量甲醇溶解，定容得2 000 µmol/L母液。分别取0.5、2.5、5、7.5 mL母液置于10 mL容量瓶，定容得100、500、1 000、1 500 µmol/L溶液。取30 µL待测液于10 mL试管中，加入3.00 mL ABTS-甲醇溶液，30 ℃反应6 min，在734 nm波长处测定吸光度A，空白组为乙醇溶液A0。清除率计算同式（2）。以ABTS阳离子自由基清除率为纵坐标，以Trolox为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程y=0.000 4x-0.024 8（R2=0.995 9）。除盐液稀释8 倍后，进行测定，根据方程计算，结果以Trolox当量表示（µmol/g），以干基计。
1.3.8 PPC的制备
参考Saucier等[22]的方法，略有改动。制备文献[22]中报道的mDP较高的组分F1。称2.00 g 95%葡萄籽PC于200 mL容量瓶，加入适量超纯水溶解，定容得10 g/L母液。取50 mL的母液置于250 mL的分液漏斗中，加入100 mL乙酸乙酯萃取，萃取3 次，收集水相。将水相置于100 mL鸡心瓶中，45 ℃旋干。加入25 mL的甲醇重新溶解和洗涤鸡心瓶，并将液体转移至100 mL离心管中，加入25 mL氯仿，混合均匀后静置30 min。将液体分别置于2 个50 mL离心管中，10 000 r/min离心15 min。弃上清液，收集固体，加少许甲醇溶解，将溶液置于100 mL鸡心瓶，45 ℃旋干，得50.00 mg PPC固体。
称10.00 mg PPC，置于10 mL容量瓶，加入适量甲醇溶解，定容得1 mg/mL PPC，过0.45 μm滤膜，备测。进行硫解实验，测定PPC的mDP。
中和反应会生成较多NaCl引起柱子堵塞，因此选取低浓度2 mol/L NaOH溶液进行研究。称20.00 mg PPC于50 mL离心管中，加入1 cm转子，加20 mL 2 mol/L的NaOH溶液，60 ℃、200 r/min水浴15 min。然后将离心管冰浴，200 r/min持续搅拌，用4 mol/L HCl溶液调节pH值至6～7。取15 mL粗反应液按照1.3.3节步骤除盐得除盐液，过0.45 μm滤膜，备测。
1.4 数据处理
所有实验重复3 次，采用Origin 2017处理数据并作图，结果以fs表示。用One-way ANOVA分析显著性差异，P＜0.05，差异显著。
2 结果与分析
2.1 NaOH处理条件对PC的mDP的影响


图1 RP-HPLC检测除盐液样品、聚合终端标准品、聚合延伸单元（二聚体硫解）色谱图
Fig. 1 RP-HPLC analysis of desalted sample, polymerization terminal standard, polymerization extension unit (dimer thiolysis)

图2 NaOH处理对PC mDP的影响
Fig. 2 Effect of different NaOH pretreatments on the mDP of procyanidins
如图1A所示，分离出9 个峰，其他样品出峰相似。图1B～G为PC末端单元及延伸单元的出峰时间，与Gu Liwei等[12]结果一致。其中峰5和峰8对应的表没食子儿茶素苄硫醚和表儿茶素-3-O-没食子酸酯苄基硫醚无标准品，只能根据相关文献出峰时间及顺序鉴定[12,14-15,23-24]。由图2A可知，粗提液组中经NaOH处理的实验组与NaOH浓度为0 mol/L的对照组相比，整体mDP均显著降低，说明温度、时间及NaOH浓度都会影响mDP，可推测NaOH对PC可能有解聚的作用。但粗提液中含NaCl较多会堵塞液相色谱柱，因此后续检测需进行除盐处理。由图2B可知，与粗提液相比，除盐液的mDP稳定在1.2～2.5之间，十分接近。
2.2 NaOH处理条件对PC及体外活性的影响
2.2.1 液相色谱测定条件的优化



图3 液相色谱条件优化
Fig. 3 Optimization of mobile phase composition
目前用于葡萄籽PC检测的方法有MonoChrom Diol[25]和Develosil Diol[16,26-28]。Develosil Diol能测DP 1～10及DP大于10的PC，MonoChrom Diol能测DP 1～5及DP大于5的PC，为更准确地表征PC，本研究采用Develosil Diol对PC的DP进行测定。首先进行单体和二聚体混合标准品检测的优化，从图3A可以看出，将乙腈-乙酸（98∶2，V/V）作为流动相条件下，在60 min出现一个非目标大峰，为减少非目标因素的干扰，对流动相进行优化，流动相改为乙腈-水（98∶2，V/V）；调整后的结果如图3B所示，60 min大峰减小，说明干扰减小。在此基础上，使用新的流动相体系对C、EC、ECG、原花青素二聚体B1、原花青素二聚体B2、原花青素二聚体B3、原花青素三聚体C1、原花青素四聚体A2单标和混标进行检测，结果显示，分子质量相同的单体混合仅出现一个峰；分子质量不同的混标，按照分子质量大小，分子质量小的先出峰，分子质量大的后出峰；混标各单体的出峰时间与单标的出峰时间有差异，但差异较小（图3C～M）。这说明乙腈-水（98∶2，V/V）为较优的流动相，能够用于后期葡萄籽OPC制备物的鉴定。
2.2.2 NP-HPLC测定OPC组分及OPC含量

图4 样品的NP-HPLC分析
Fig. 4 NP-HPLC analysis of crude and desalted samples


图5 碱处理样品的液相色谱分析及OPC含量的变化
Fig. 5 Effect of NaOH concentration on OPC contents as a function of pretreatment temperature
生物利用率研究显示，OPC是被人体吸收的主要PC组分。因此，研究碱对PC的解聚效果需要重点分析产物中OPC含量的变化。依据DP小于5混标的出峰时间，可以对OPC的组分进行分析（图3M）。图4分别为60 ℃，15 min，NaOH浓度分别为0、1、2、4、6 mol/L粗提液和除盐液的液相色谱图，OPC的组成和含量有明显的变化，其中粗提液中10～15 min出现了一个明显的大峰（图4A），但在除盐液中却没有（图4B），可以推测这个未知峰对应的化合物不溶于乙酸乙酯，可能是杂质，因此不再进一步分析。图4B中25 min后基本没有出峰，也说明除盐后样品中的主要PC为OPC。由图5A～I可知，OPC各组分占比为单体＞二聚体＞ECG＞三聚体＞四聚体，四聚体较少。以下除特殊说明，对照组均为0 mol/L NaOH。
考察处理时间15、30、60 min对OPC组分的单峰面积、总峰面积、OPC含量的影响发现（图5A～C），随着时间的延长，对照组OPC组分的单峰面积、总峰面积、OPC含量变化不大，而实验组OPC组分的单峰面积、总峰面积、OPC含量均呈减小趋势。研究温度40、60、80 ℃对OPC组分的单峰面积、总峰面积、OPC含量的影响发现（图5A、D、G），随着温度的升高，对照组的OPC组分的单峰面积、总峰面积、OPC含量变化不大，实验组除1 mol/L碱处理外，OPC组分的单峰面积、总峰面积、OPC含量均呈现增加趋势，其中6 mol/L表现最优，而80 ℃结果最差。
NaOH浓度变化对OPC组分的单峰面积、总峰面积、OPC含量的影响显示，与对照组相比，1 mol/L时单峰面积小于对照，大于1 mol/L时峰面积均大于对照，且随着NaOH浓度的增加而增加；OPC组分的总峰面积及OPC含量的变化与单体峰面积变化相似，且进一步增加NaOH浓度仍有可能增加OPC组分、总峰面积及OPC含量（图5）。
综合处理时间、处理温度、NaOH浓度3 个因素分析，当6 mol/L NaOH溶液处理15 min时，对比处理温度40、60、80 ℃的数据发现，80 ℃和60 ℃较高，且80 ℃的OPC总峰面积和OPC含量高于60 ℃，依次分别为10 265 300.00f10 750.08，（72.96f2.60）μg/mL和9 878 310.00f15 417.32，（60.25f1.84） μg/mL，但60 ℃时有3 种PC：单体7 332 290.00f7 846.53、ECG 672 790.33f1 149.17和二聚体1 873 230.00f6 690.29，而80 ℃仅有2 种PC：单体8 023 860.00f7 010.10和二聚体2 241 460.00f4 675.69。苏惠娟[29]尝试4 种碱解聚PPC，解聚效果为氢氧化钠＞碳酸钠＞碳酸氢钠≈碳酸氢钾，最佳解聚条件为60 ℃、1 mol/L NaOH溶液处理25 min，得单体15.6 mg/g，二聚体20.1 mg/g，与本研究解聚产物相似。
2.2.3 NaOH处理样品体外抗氧化活性


图6 不同碱处理样品的体外抗氧化活性及体外活性与PC含量的相关性分析
Fig. 6 In vitro antioxidant activities of different alkali-treated samples and their correlation with PC content
由图6所示，当温度和时间一定时，与对照组相比，1 mol/L NaOH处理样品的抗氧化活性小于对照，大于1 mol/L时活性均大于对照，且随着NaOH浓度的增加而增加。当温度和NaOH浓度一定时，活性随着时间的延长而降低。当时间和NaOH浓度一定时，随着温度的变化，活性的变化无规律。6 mol/L NaOH处理15 min，对比不同温度发现，DPPH、FRAP、ABTS抗氧化实验结果均表现为60 ℃时活性最高，分别为（967.40f14.69）、（856.72f10.046 19）、（1 331.17f12.38） μmol/g。综上分析，60 ℃条件下，6 mol/L NaOH处理15 min，获得的OPC活性最高，OPC组成分析结果显示，该条件下获得OPC富含ECG组分（图5D）。Zhang Shuting等[30]的研究结果与本研究相似，且其研究指出ECG的活性高于C和EC。故ECG组分含量较高可能是60 ℃、6 mol/L NaOH处理15 min后，OPC活性最大的原因。
2.2.4 最优碱处理条件
6 mol/L NaOH、60 ℃碱处理15 min时，OPC组分的总峰面积、OPC含量及体外抗氧化活性均呈增加趋势（图6），推测进一步增加NaOH浓度仍可以增加OPC组分的总峰面积、OPC含量及体外抗氧化活性。25 ℃时，饱和NaOH浓度为26.4 mol/L，因此进一步研究8、10、15、20、25 mol/L NaOH对PC解聚的影响。由图7A可知，粗提液mDP在10 mol/L NaOH处理时降至最低，随着NaOH浓度的增加又呈缓慢增加；而除盐液的mDP较平稳地维持在1.29f0.019～2.51f0.017。图7B～D显示，除盐液的OPC总峰面积与PC含量均在10 mol/L NaOH处理时达最大值，DPPH、FRAP、ABTS 3 种方法对于除盐液抗氧化活性检测均显示在10 mol/L NaOH处理时达最高值。且PC含量与DPPH、FRAP、ABTS抗氧化活性均表现良好的线性关系。综上，最佳预处理条件为60 ℃、15 min、10 mol/L NaOH。在此条件下，与对照组相比，mDP由5.39f0.12降至1.30f0.014，OPC组分的总面积增加了7.28 倍（单体8.09 倍，二聚体7.53 倍，三聚体4.66 倍），OPC含量增加了5.42 倍，体外抗氧化活性DPPH、FRAP、ABTS分别提高3.22、4.13 倍和2.84 倍。


图7 NaOH浓度对PC的影响
Fig. 7 Effect of different NaOH concentrations on mDP and total area and content of OPC and correlation between antioxidant activities and OPC content
2.2.5 碱处理对葡萄籽中PC释放和解聚的规律


图8 碱处理对PC解聚的影响
Fig. 8 Effect of alkali treatment on depolymerization of procyanidins
依据2.2.4节分析NaOH浓度0～25 mol/L，60 ℃碱处理15 min对OPC组分及OPC含量的影响，发现碱对葡萄籽中的PC可能存在2 种作用：首先根据OPC含量先降低后增加的趋势分析，碱可以促进OPC释放。其次根据液相结果分析单体、ECG、二聚体、三聚体等对应的峰面积都有或多或少的增加，其中单体占比最高，增加最显著，可以推测碱对PPC可能存在解聚作用。这与相关报道[31-32]的酚酸在植物中的2 种存在状态（游离态和结合态）一致。随着NaOH浓度提高，OPC含量先增加后减少的规律也支持本实验推测的可能性（图7B）。图8A对NaOH浓度影响葡萄籽中游离和结合的OPC含量变化的机制进行了解释：对照组没有碱的作用，游离层的OPC可以被丙酮混合液提取。1 mol/L NaOH处理时，碱对结合层作用很小，不足以破坏其结构或与其成分发生反应，NaOH则会与部分游离层释放的OPC反应破坏其结构。当2～10 mol/L NaOH处理时，随着NaOH浓度的增加，结合层被逐渐破坏瓦解，随着结构破坏的加剧更多的OPC被释放，同时也有更多OPC与碱反应，但释放大于损失。在10 mol/L NaOH处理时，释放远大于损失，故溶液中OPC最多。当10～25 mol/L NaOH处理时，结合层释放的OPC在10 mol/L NaOH时已达到最大值，随着NaOH浓度的增加，OPC损失加剧，损失逐渐大于最大释放量，故溶液中能检测到的OPC越来越少。0～25 mol/L NaOH，60 ℃处理15 min时检测结果显示，碱对OPC组分有明显增加作用（图7B）。进一步PPC碱处理，如图8B所示，碱处理使60 min单峰变为在3～20 min的系列小峰，而图3M显示在此时间段内出现的单峰为单体、ECG、二聚体、三聚体，说明碱对PPC存在解聚作用，此结果与White等[11]的研究结果一致。上述这些结果说明了碱对葡萄籽中的OPC存在释放和解聚制备2 种作用机制，二者的动态平衡显示为最终OPC的产量。
3 结 论
通过探究不同NaOH浓度条件对葡萄籽PC的mDP、OPC组分、OPC含量以及体外抗氧化活性的影响，发现碱对于PC的释放及解聚均有作用，并且得到了最优条件为60 ℃、15 min、10 mol/L NaOH处理。与对照组相比，优化处理条件下PC的mDP由5.39f0.12降至1.30f0.014，OPC组分的总面积增加7.28 倍（单体8.09 倍、二聚体7.53 倍、三聚体4.66 倍），OPC含量增加（5.42f0.56）倍，体外抗氧化活性DPPH、FRAP、ABTS分别提高3.22、4.13、2.84 倍。
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Effect of NaOH Pretreatment on Depolymerization and in Vitro Antioxidant Activity of Chardonnay Grape Seed Procyanidins
ZHANG Jie1,2, WANG Wenya1,2,*, YUAN Qipeng1,*
(1. College of Life Science and Technology, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, China;2. Amoy-BUCT Industrial Bio-technovation Institute, Beijing University of Chemical Technology, Xiamen 361022, China)
Abstract: In order to produce in large scale oligomeric procyanidins (OPC) (with polymerization degree (DP) less than 5) that can be absorbed by the body, we studied the effects of NaOH pretreatment on the depolymerization of grape seed procyanidins (PC) and the antioxidant activity in vitro of OPC. The effects of different pretreatment temperatures (40, 60,and 80 ℃), times (15, 30, and 60 min) and NaOH concentrations (0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, and 25 mol/L) on the mean degree of polymerization (mDP) of PC, and the composition and content as well as antioxidant activity in vitro of OPC.The results showed that the optimum conditions for generating OPC were as follows: NaOH concentration 10 mol/L and pretreatment at 60 ℃ for 15 min. Compared with the control (pretreated with 0 mol/L NaOH at 60 ℃ for 15 min), the optimized NaOH pretreatment reduced the mDP of PC from 5.39 ± 0.12 to 1.30 ± 0.014, increased the total area of OPC by 8.28 times and OPC content by 6.42 times, and enhanced in vitro scavenging capacity against 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl hydrate (DPPH) and 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) radicals and ferric reducing antioxidant power (FRAP) by 4.22, 5.13 and 3.84 times, respectively. In summary, this study provides a novel way of producing OPC, which could facilitate the high value-added utilization of grape seeds.
Keywords: grape seeds; procyanidins; depolymerization; oligomeric procyanidins; antioxidant activity
收稿日期：2019-03-10
基金项目：“十三五”国家重点研发计划重点专项（2016YFD0400600）
第一作者简介：张杰（1993ü）（ORCID: 0000-0001-5249-4266），女，硕士研究生，研究方向为天然产物测定。E-mail: 13260482105@163.com
*通信作者简介：袁其朋（1969ü）（ORCID: 0000-0001-7098-7451），男，教授，博士，研究方向为生物制药、天然产物研究与开发基因工程药物。E-mail: yuanqp@mail.buct.cn
DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190310-116
中图分类号：TS201.4
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2020）04-0041-11
引文格式：张杰, 王文雅, 袁其朋. NaOH处理对霞多丽葡萄籽原花青素的影响[J]. 食品科学, 2020, 41(4): 41-51. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190310-116. http://www.spkx.net.cn
ZHANG Jie, WANG Wenya, YUAN Qipeng. Effect of NaOH pretreatment on depolymerization and in vitro antioxidant activity of Chardonnay grape seed procyanidins[J]. Food Science, 2020, 41(4): 41-51. (in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190310-116. http://www.spkx.net.cn