植物甾醇酯对非酒精性脂肪肝大鼠部分血清代谢物的影响

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植物甾醇酯对非酒精性脂肪肝大鼠部分血清代谢物的影响
欧阳鹏凌1，管 玘1，曲 丹2，丁信文1，杨 丽1，宋立华1,3,*
（1.上海交通大学农业与生物学院，上海 200240；2.上海市第七人民医院营养科，上海 200137；3.上海交通大学陆伯勋食品安全研究中心，上海 200240）
摘 要：在前期研究的基础上，通过分析植物甾醇酯（phytosterol esters，PSE）对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）大鼠血清中部分小分子代谢物的变化，进一步了解PSE发挥预防NAFLD作用的代谢分子机制。利用高脂饮食诱导建立NAFLD大鼠模型的同时，PSE干预组分别灌胃低（0.05 g/100 g mbgd）、高剂量（0.10 g/100 g mbgd）PSE强化牛奶，采用超高效液相色谱联用四极杆串联飞行时间质谱（ultra performance liquid chromatography-quadrupole-tandem time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）分析大鼠血清中的小分子代谢物，通过Progenesis QI v2.3软件进行无监督和有监督的模式判别，并利用UNIFI数据分析平台对各组差异代谢物进行筛选，最终在Metabo Analyst等数据库中寻找差异代谢物所参与的代谢通路。结果显示，共筛选出甘油二酯（14∶0/22∶2(13Z,16Z)/0∶0、15∶0/18∶3(6Z,9Z,12Z)/0∶0、16∶0/20∶3(8Z,11Z,14Z)/0∶0、18∶1(11Z)/18∶1(11Z)/0∶0）、神经酰胺（d18∶2/20∶0）、鞘糖脂（d18∶1/18∶1(9Z)）、二十一烷二酸、溶血卵磷脂（15∶0、16∶1(9Z)、20∶3(5Z,8Z,11Z)、20∶3(8Z,11Z,14Z)、18∶1(9Z)、18∶2(9Z,12Z)）、磷脂酸（22∶4(7Z,10Z,13Z,16Z)/0∶0）、磷脂酰胆碱（16∶0/20∶3(5Z,8Z,11Z)、16∶0/P-18∶0、18∶1(11Z)/20∶1(11Z)、17∶1(10Z)/0∶0、20∶3(8Z,11Z,14Z)/18∶0、O-18∶0/0∶0）、磷脂酰乙醇胺（16∶0/0∶0、18∶3(6Z,9Z,12Z)/22∶6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)、20∶3(8Z,11Z,14Z)/0∶0、18∶4(6Z,9Z,12Z,15Z)/18∶0）、磷脂酰肌醇（20∶0/22∶2(13Z,16Z)）、鞘磷脂（d16∶1/25∶0、d18∶1/24∶0）27 种差异代谢物，且PSE可通过纠正高脂饮食诱导的甘油磷脂代谢及醚脂质代谢通路的紊乱发挥对NAFLD的预防作用。
关键词：植物甾醇酯；非酒精性脂肪肝；血清小分子代谢物；超高效液相色谱联用四极杆串联飞行时间质谱
非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是由除酒精和其他对肝脏有明确损害因素导致的脂肪在肝细胞中过度沉积为主要特征的临床病理表现[1]，包括从简单的脂肪变性发展到脂肪性肝炎、肝纤维化及肝硬化的整个疾病谱[2]。调查显示，NAFLD的全球患病率为25.24%[3]，在我国的发病率为20.09%[4]。NAFLD的发生与2型糖尿病、动脉粥样硬化、慢性肾病等密切相关，是代谢综合征在肝脏中的体现[5]。研究发现，NAFLD患者患病4 年间2型糖尿病的发病率约为9.9%[6]，而2型糖尿病患者伴有NAFLD的概率接近60%[7]。NAFLD也是冠状动脉粥样硬化的一个危险标志[8]，Wong等[9]的研究显示，84.6%的NAFLD患者体内冠状血管狭窄至少超过50%，而冠状动脉狭窄程度是冠状动脉粥样硬化严重程度的最直接体现。另有研究结果表明NAFLD患者在5 年内慢性肾病的累积发病率为3.1%，在10 年内的累计发病率为12.2%[10]。可见NAFLD与多种疾病互相关联，已成为21世纪世界范围内的一个重要公共健康问题。
肝脏是人体最大的代谢器官，参与的代谢通路十分复杂，一旦肝脏出现病变，难以通过检测单一代谢物的水平来反映代谢改变的全貌，而代谢组学能够反映经历一系列变化之后机体在代谢产物上的整体性变化，运用此方法研究肝脏疾病的演变具有技术优势[9]。血清中含有1 000多种内源性小分子代谢物，是代谢组学中非常重要的体液样本。Barr[11]利用超高效液相色谱-质谱（ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS）对NAFLD小鼠的血液进行代谢组学分析，发现NAFLD模型组小鼠血清中有机酸、鞘磷脂、卵磷脂、游离脂肪酸以及胆酸含量上升。苏赵威[12]对NAFLD大鼠血清进行代谢组学研究，结果表明大鼠血清中糖类、氨基酸类和脂肪酸类代谢物较正常组有明显差异，提示NAFLD状态下机体能量代谢及脂类代谢出现紊乱。袁洋[13]的研究也发现NAFLD状态下血清类脂含量降低，而乳酸含量显著升高，进一步证明NAFLD状态下机体代谢出现紊乱。上述研究结果提示，通过检测分析血清中小分子代谢物，可在一定程度上揭示NAFLD在代谢途径方面的致病机制及预防靶点。
目前，诱导大鼠出现NAFLD的主要方法是进行高脂饮食的饲喂。该方法可诱导大鼠肥胖，使其产生胰岛素抵抗等症状，能较好地体现人体内出现NAFLD时的机制[14]。因此，从饮食调节和膳食干预的角度出发，可从源头上对NAFLD进行预防。植物甾醇（phytosterols，PS）是玉米、大豆等油料作物中的主要活性物质，其酯类形式植物甾醇酯（phytosterol esters，PSE）较PS具有更好的溶解性和吸收率[15]。前期研究发现PSE可显著减轻NAFLD大鼠肝脏的脂肪变性程度[16-17]，并且其可通过调节PPAR-α、PPAR-γ等脂代谢相关基因发挥预防NAFLD的作用[16]，但具体机制不明。为进一步探究PSE干预对NAFLD预防作用的代谢分子机制，本实验在前期研究基础上利用UPLC联用四极杆串联飞行时间质谱（UPLC-quadrupole-tandem time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）技术检测NAFLD大鼠血清中小分子代谢物的变化，从代谢组学的角度进一步阐明PSE发挥NAFLD预防作用的机制。
1 材料与方法
1.1 动物、材料与试剂
清洁级SD大鼠，6 周龄，雄性，体质量（170f10）g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK（沪）2012-0002。大鼠饲料购自福贝世亨生物医药（上海）有限公司。基础饲料组成：粗蛋白≥20%（质量分数，下同）、水分≤10%、灰分≤8%、粗纤维≤5%、粗脂肪≥4%、钙1%～1.8%、赖氨酸1.32%、蛋氨酸+胱氨酸0.78%、磷0.6%～1.2%；高脂饲料配方：基础饲料52.65%、猪油21%、酪蛋白10%、蔗糖10%、麦芽糊精2.7%、预混料1.9%、胆固醇1.25%、胆盐0.5%。
PSE混合标准品（纯度≥91%，包括β-谷甾醇（42.0%～55.0%）、菜油甾醇（20.0%～29.0%）、豆甾醇（12.0%～23.0%）） 巴斯夫中国有限公司；乙腈、甲醇（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
Acquity UPLC I-Class系统（配备二元泵、真空脱气机、自动进样器和柱温箱）、VION IMS Q-TOF-MS仪美国Waters公司。
1.3 方法
1.3.1 灌胃用PSE强化牛奶的制备
于65 ℃水浴锅中将PSE液化，将其与牛奶混合并通过高压均质乳化（20 MPa），分别制成0.05、0.10 g/mL PSE强化牛奶。
1.3.2 实验动物分组与样本收集
大鼠适应性喂养一周后随机分为以下4 组：正常对照组（NC，n＝4）、高脂模型组（HF，n＝9）、低剂量PSE组（PSE-L，n＝9）和高剂量PSE组（PSE-H，n＝9）。NC组大鼠饲喂基础饲料，其余各组饲喂高脂饲料。NC和HF组灌胃给予普通纯牛奶（1 mL/100 g mbgd），PSE-L和PSE-H组分别灌胃给予与NC组同体积的低（0.05 g/100 g mbgd）、高剂量（0.10 g/100 g mbgd）PSE强化牛奶（相当于成人3 g/d和6 g/d的摄入量），连续灌胃12 周。大鼠饲养环境：相对湿度为45%～65%，室温为（25f1）℃，12 h明暗轮换采光，可自由进食及饮水。实验期间每天记录各组大鼠摄食量，每周称量记录各组大鼠体质量。实验结束时，腹腔注射40 mg/kg质量分数2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，用普通采血管于腹主动脉取血，血液室温凝结后离心取血清。
1.3.3 血清样品前处理条件优化
取50 μL血清，分别加150 μL和200 μL前处理试剂甲醇-乙腈（1∶1（V/V，下同）），振荡混合均匀，静置2 h后于12 000 r/min离心20 min，取上清液于试剂瓶中待测。
1.3.4 UPLC-Q-TOF-MS分析
色谱条件：色谱柱为Acquity UPLC BEH C18（100 mmh2.1 mm，1.7 μm），进样量为1 μL，柱温为45 ℃，流速为0.4 mL/min。流动相A为体积分数0.1%甲酸溶液，流动相B为体积分数0.1%甲酸-乙腈溶液；梯度洗脱程序为5%～20% B，1 min；20%～40% B，1.5 min；40%～100% B，6.5 min；100% B，3 min；100%～5% B，0.5 min；5% B，2 min。
质谱条件：在正、负电喷雾电离模式下运行。全信息串联质谱扫描模式：低能量（4 eV）和高能量（20～45 eV）两种全信息串联质谱模式在运行期间交替采集信息。碰撞诱导解离气体：氩气（99.999%），去溶剂化和锥形气体：氮气（＞99.5%）。扫描范围为50～1 000 amu；一次扫描用时0.2 s；毛细管电压分别为2 kV（正离子模式）、1 kV（负离子模式）；源偏置电压60 V；锥形电压40 V；去溶剂化气体温度450 ℃；源温度115 ℃；锥形气体流量50 L/h；去溶剂化气体流量900 L/h。通过参比探针将乙腈-水-甲酸（体积比50∶49.9∶0.1）中的250 ng/mL亮氨酸脑啡肽标准校正溶液（5 μL/ min）连续输注，从而进行锁定质量校正，每30 s扫描一次。
1.4 数据统计与分析
UNIFI 1.8.1软件用于血清代谢组学数据采集，在Progenesis QI v2.3软件中导入原始数据并进行峰采集、比对和归一化，从而得到保留时间和质荷比（m/z）等。将筛选编辑后的数据组织为二维矩阵，在SIMCA-P软件中进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法判别分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA），根据模型得到的变量权重值（VIP＞1）、最小变异系数（min CV＜30%）以及Student-t检验的P值（P＜0.05）来寻找差异代谢物。在HMDB（the Human Metabolome Database）（http://www.hmdb.ca/）、LIPID MAPS（http://www.lipidmaps.org/tools/）数据库以及UNIFI软件中，将精确质量和高能质谱中的碎片做进一步比对，从而鉴定化合物。运用EZinfor V3.0.3软件对得到的归一化峰强度做进一步统计分析。通过Metabo Analyst（http://www.metaboanalyst.ca/faces/upload/PathUploadView.xhtml）等在线数据库检索差异性代谢物及其所参与的代谢通路。利用GraphPad Prism 6软件作图，数据采用SPSS Statistics 20软件作单因素方差分析，并用多重比较法两两比较，P＜0.05表示两组差异显著。
2 结果与分析
2.1 血清小分子代谢物检测不同前处理方法比较
本实验中150、200 μL甲醇-乙腈（1∶1）处理的血清在正、负离子模式下得到的基峰离子流图差别不明显，图1为200 μL甲醇-乙腈（1∶1）处理血清后得到的基峰离子流图。为了使样品浓度较小时不易污染离子源，从而增加仪器的耐受性，并使蛋白质沉淀完全，在50 μL血清中加入200 μL甲醇-乙腈（1∶1）进行前处理。

图 1 在UPLC-Q-TOF-MS正、负离子模式下的基峰离子流图谱
Fig. 1 Base peak ion current pattern in positive and negative modes of UPLC-Q-TOF-MS
2.2 PSE干预对NAFLD大鼠血清中小分子代谢物的影响
2.2.1 多维统计分析结果
利用SIMCA-P软件对各组大鼠血清小分子代谢物进行无监督的数据分析（PCA）后，可得到模型概括X矩阵解释率（R2X），当R2X＞0.4时说明该模型可靠。本实验样品在正离子模式下R2X＝0.78，负离子模式下R2X＝0.74，因此所建立的模型可以很好地解释各组间差异。为了对正交信号进行校正并运用排列试验和交叉验证对模型的可靠性进行验证，以更好地区分各组间的差异，对数据进行标准化处理，采用有监督的多维统计分析（PLS-DA）法对样品做进一步分析，可得到R2Y和Q2两个数据，其中R2Y可反映模型的稳定性，其越接近于1说明模型的稳定性越好；Q2反映的是模型的预测性，当Q2＞0.5时表明模型可靠。在正离子模式下R2Y＝0.65、Q2＝0.56，负离子模式下R2Y＝0.80、Q2＝0.50。由图2中的PLS-DA得分图可看出，PSE-H组与模型组区分较明显，而PSE-L组与模型组差异较小。


图 2 各组大鼠血清小分子代谢物PCA和PLS-DA得分图
Fig. 2 PCA and PLS-DA score plots for serum samples of rats from different groups
2.2.2 差异代谢物的确认
利用TOF-MS可以通过低、高能量扫描得到低能量通道和高能量通道的质谱图。低能量扫描中的一级质谱图能提供精确相对分子质量、分子离子峰以及加合峰的信息，可结合Mass FragmentTM软件进一步确定化合物的可能分子式。通过高能量扫描产生的碎片离子信息可以明确碎片的元素组成，推断可能的化合物结构，并结合已建立的MOL文件数据库对化合物进行初步的定性。图3A、B分别为本研究得到的化合物在低、高能量扫描下的图谱，可以看出其准分子离子峰为m/z 482.324 5[M+H]+；溶血卵磷脂（15∶0）的精确相对分子质量为481.316 84。该物质在高能量通道中的部分碎片离子如图4所示，通过与UNIFI软件中数据库给出的结构进行比对从而推断其为溶血卵磷脂（15∶0）。以此方式对正、负离子模式下得到的差异代谢物进行筛选比对。表1为筛选后得到VIP值大于1的27 种差异代谢物的质荷比和保留时间，以及其在HMDB、LIPID MAPS中的编号。从表1中可以看出，与HF组相比，上述差异代谢物的离子强度在NC组与低、高剂量PSE组（尤其是PSE-H组）中的变化趋势基本一致（除溶血卵磷脂（18∶2(9Z,12Z)）外），说明在高脂饮食条件下，PSE干预可纠正NAFLD病理状态下发生的代谢紊乱。

图 3 正离子模式下溶血卵磷脂（15∶0）的低（A）、高（B）能量谱图
Fig. 3 Low- (A) and high- (B) energy spectra of Lyso PC (15∶0) in positive ion mode

图 4 溶血卵磷脂（15∶0）高能量谱图中部分碎片离子
Fig. 4 Selected fragment ions Lyso PC (15∶0) in high energy spectra
图5为通过单因素方差分析得到的27 种差异代谢物在各组大鼠血清中离子强度的比较结果。与NC组相比，HF组27 种差异代谢物的离子强度均有显著性差异（P＜0.05）。与HF组相比，PSE-H组甘油二酯（15∶0/18∶3(6Z,9Z,12Z)/0∶0、14∶0/22∶2(13Z,16Z)/0∶0）、溶血卵磷脂（18∶2(9Z,12Z)、15∶0、16∶1(9Z)、20∶3(5Z,8Z,11Z)、20∶3(8Z,11Z,14Z)、18∶1(9Z)）、磷脂酰胆碱（16∶0/P-18∶0、17∶1(10Z)/0∶0)、20∶3(8Z,11Z,14Z)/18∶0、18∶1(11Z)/20∶1(11Z)、O-18∶0/0∶0）、磷脂酸（22∶4(7Z,10Z,13Z,16Z)/0∶0）、磷脂酰乙醇胺（16∶0/0∶0、20∶3(8Z,11Z,14Z)/0∶0）、磷脂酰肌醇（20∶0/22∶2(13Z,16Z)）的离子强度降低，鞘磷脂（d18∶1/24∶0、d16∶1/25∶0）、鞘糖脂（d18∶1/18∶1(9Z)）、神经酰胺（d18∶2/20∶0）的离子强度升高；PSE-L组甘油二酯（16∶0/20∶3(8Z,11Z,14Z)/0∶0）、二十一烷二酸和磷脂酰乙醇胺（18∶4(6Z,9Z,12Z,15Z)/18∶0）离子强度下降，甘油二酯（18∶1(11Z)/18∶1(11Z)/0∶0）、磷脂酰胆碱（16∶0/20∶3(5Z,8Z,11Z)）、磷脂酰乙醇胺（18∶3(6Z,9Z,12Z)/22∶6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)）离子强度显著下降。
表 1 PSE干预对NAFLD大鼠血清中差异代谢物的影响
Table 1 Effect of PSE intervention on differential metabolites in the serum of NAFLD rats

注：[NC]/[HF]、[PSE-L]/[HF]、[PSE-H]/[HF].分别为NC、PSE-L、PSE-H组与HF组的离子强度比值；↑、↓.分别为离子强度升高、降低。





图 5 各组大鼠血清中主要差异代谢物的离子强度比较
Fig. 5 Comparison of ionic strengths of major different metabolites in serum of rats in each group
2.2.3 代谢通路分析
将表1中差异代谢物输入Metabo Analyst（http://www.metaboanalyst.ca/faces/upload/PathUploadView.xhtml）数据库中进行代谢通路的检索及分析评估，构建的代谢通路如图6所示。图6包含了甘油磷脂代谢、醚脂质代谢以及糖基磷脂酰肌醇-锚生物合成这3 种代谢通路，其影响值分别为0.275、0.214 29和0.043 9。选择影响值大于0.10的代谢通路作为潜在的靶向途径，得到由磷脂酰胆碱（16∶0/P-18∶0、18∶1(11Z)/20∶1(11Z)、20∶3(8Z,11Z,14Z)/18∶0、16∶0/20∶3(5Z,8Z,11Z)）、磷脂酰乙醇胺（18∶3(6Z,9Z,12Z)/22∶6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)、18∶4(6Z,9Z,12Z,15Z)/18∶0）以及溶血卵磷脂（15∶0、16∶1(9Z)、18∶1(9Z)、18∶2(9Z,12Z)、20∶3(5Z,8Z,11Z)、20∶3(8Z,11Z,14Z)）参与的甘油磷脂代谢通路（图7）和磷脂酰胆碱（O-18∶0/0∶0）参与的醚脂质代谢通路（图8）。表2为这14 种VIP＞1的差异代谢物在HMDB、PubChem和KEGG数据库中的编号。由代谢通路的分析可以看出，NAFLD病理状态下PSE干预主要调节甘油磷脂以及醚脂质的代谢紊乱。

图 6 通过Metabo Analyst数据库构建的通路分析概要图
Fig. 6 Pathway analysis profile obtained by Metabo Analyst

图 7 通过Metabo Analyst数据库得到的甘油磷脂代谢通路
Fig. 7 Glycerophospholipid metabolism pathway obtained by Metabo Analyst

图 8 通过Metabo Analyst数据库得到的醚脂质代谢通路
Fig. 8 Ether lipid metabolism pathway obtained by Metabo Analyst
表 2 参与代谢通路的差异代谢物
Table 2 Differential metabolites involved in metabolic pathways

3 讨 论
目前，代谢组学技术已经被广泛用于营养学、毒理学、药物开发等方面的研究，揭示营养、毒性物质及药物等因素对人体或动物体代谢的分子机制。本研究利用甲醇-乙腈（1∶1）混合试剂处理血清样本，检测PSE对NAFLD大鼠血清中小分子代谢物的影响，筛选出甘油二酯（14∶0/22∶2(13Z,16Z)/0∶0、15∶0/18∶3(6Z,9Z,12Z)/0∶0、16∶0/20∶3(8Z,11Z,14Z)/0∶0、18∶1(11Z)/18∶1(11Z)/0∶0）、神经酰胺（d18∶2/20∶0）、鞘糖脂（d18∶1/18∶1(9Z)）、二十一烷二酸、溶血卵磷脂（15∶0、16∶1(9Z)、20∶3(5Z,8Z,11Z)、20∶3(8Z,11Z,14Z)、18∶1(9Z)、18∶2(9Z,12Z)）、磷脂酸（22∶4(7Z,10Z,13Z,16Z)/0∶0）、磷脂酰胆碱（16∶0/20∶3(5Z,8Z,11Z)、16∶0/P-18∶0、18∶1(11Z)/20∶1(11Z)、17∶1(10Z)/0∶0、20∶3(8Z,11Z,14Z)/18∶0、O-18∶0/0∶0）、磷脂酰乙醇胺（16∶0/0∶0、18∶3(6Z,9Z,12Z)/22∶6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)、20∶3(8Z,11Z,14Z)/0∶0、18∶4(6Z,9Z,12Z,15Z)/18∶0）、磷脂酰肌醇（20∶0/22∶2(13Z,16Z)）、鞘磷脂（d16∶1/25∶0、d18∶1/24∶0）共27 种差异代谢物。代谢途径检索结果表明，部分磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺以及溶血卵磷脂参与了甘油磷脂代谢通路，磷脂酰胆碱（O-18∶0/0∶0）参与了醚脂质代谢通路。结合代谢通路中部分差异代谢物在NAFLD发生发展中的生理作用，可初步阐述PSE调节NAFLD大鼠脂代谢紊乱的作用途径。
在27 种差异代谢物中，HF组血清中甘油二酯离子强度较NC组显著升高，提示甘油磷脂代谢出现紊乱，这与Wang Ya等[18]的研究结果相同；而PSE组中（尤其是PSE-L组）部分甘油二酯离子强度显著低于HF组。研究表明，甘油二酯与NAFLD的发生发展关系密切[19]。甘油二酯含量的增加会激活蛋白激酶C，而蛋白激酶C可抑制胰岛素受体酪氨酸激酶的自身磷酸化，从而加剧胰岛素抵抗[20]，而胰岛素抵抗是NAFLD的致病因素之一[21]。另外，甘油二酯含量的提高会导致肝脏脂肪变性，增加活性氧的产生，加剧氧化应激及脂质过氧化反应，进一步促进NAFLD的发生发展[20]。
HF组中鞘磷脂、神经酰胺、鞘糖脂的离子强度也显著低于NC组，而PSE-H组中这些差异代谢物的离子强度显著高于HF组，提示较高剂量PSE干预可以有效纠正NAFLD病理状态所引起的鞘脂类代谢异常。
鞘磷脂由鞘氨醇、磷酸胆碱和脂酸构成，在鞘磷脂酶的作用下可以生成神经酰胺[22]，是体内含量第二的磷脂。文献[23]表明血清中的鞘磷脂（d18∶1/24∶0）含量可以间接反映肝损伤程度，与炎症等级呈负相关。神经酰胺是鞘脂类的一种重要化合物，作为第二信使存在于细胞膜和细胞质之间，是与胰岛素抵抗、氧化应激以及炎症等相关的重要细胞信号因子[24]，能够调节细胞增殖、凋亡、分化等过程。神经酰胺可通过抑制由炎症因子比如炎症因子所导致的超氧化物含量升高，进一步对炎症反应进行调节[25]。鞘糖脂是由神经酰胺经过葡糖基转移酶的糖基化作用合成[26]，是所有动物细胞中的重要生物小分子，通过糖基转移酶和糖苷水解酶等调控机制维持生物体内的鞘脂类动态平衡[27]，参与信号传导、细胞生长、分化以及凋亡等生命活动[28]。
此外，本研究还发现HF组中溶血卵磷脂和磷脂酰胆碱的离子强度显著高于NC组，与Barr[11]的研究结果相同；而PSE干预可降低溶血卵磷脂和磷脂酰胆碱的含量，使其趋于正常。磷脂酰胆碱含量增加时可被分解，代谢后可生成甘油三酯，导致肝脏脂质堆积和变性[29]；磷脂酰胆碱合成异常加剧还会引起血液中低密度脂蛋白的分泌增多，造成脂代谢异常[30]。
由图7可看出，溶血卵磷脂、磷脂酰胆碱以及磷脂酰乙醇胺参与了甘油磷脂代谢通路，图8显示磷脂酰胆碱（O-18∶0/0∶0）参与了醚脂质代谢通路。甘油磷脂是细胞膜的重要组成成分，甘油磷脂代谢通路紊乱会导致炎症、内皮功能障碍、细胞膜破坏等情况的发生[31]。溶血卵磷脂是血液中的重要信号传导分子，参与细胞迁移、增殖、血管的生成以及炎症效应等[32]。溶血卵磷脂与G蛋白偶联受体结合后可发挥诱导T淋巴细胞和单核细胞的趋化、刺激巨噬细胞活化等作用，从而促进炎症的发生[33]；并可在组织间转运甘油磷脂组分，如脂肪酸、磷脂酰甘油和胆碱。以上研究结果提示PSE可通过纠正甘油磷脂和醚脂质代谢通路，减轻NAFLD大鼠肝脏脂质积累引发的炎症反应。
磷脂酸由磷脂酶D催化水解卵磷脂生成[34]。磷脂酸可通过磷脂酸磷酸水解酶转化为甘油二酯，进一步参与细胞内信号传导的调节和脂质代谢[35]。在NAFLD病理状态下细胞膜的通透性会增加[36]，促进炎症反应，可能会导致磷脂酶D进入血液的量增多且活性增强[37]，最终引起磷脂酸含量升高。本研究结果显示，HF组的磷脂酸离子强度较NC组显著上升，而高剂量PSE干预则可显著降低磷脂酸的离子强度，进一步证明PSE能够有效缓解肝脏脂质积累引发的炎症反应。
4 结 论
本实验通过UPLC-Q-TOF-MS技术检测PSE干预后NAFLD大鼠血清中小分子代谢物的变化，筛选出27 种差异代谢物，包括甘油二酯、神经酰胺、鞘糖脂、溶血卵磷脂、磷脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、鞘磷脂以及脂肪酸，涉及的代谢通路为甘油磷脂代谢和醚脂质代谢通路。研究结果表明，PSE干预可降低血清中甘油二酯、溶血卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇、二十一烷二酸的离子强度，升高鞘磷脂、神经酰胺、鞘糖脂的离子强度，说明PSE可以通过对甘油磷脂以及醚脂质代谢通路进行调节以纠正脂类代谢紊乱，减轻高脂饮食造成的脂质积累，影响NAFLD的发生发展。
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Effect of Phytosterol Esters on Selected Serum Metabolites of Rats with Non-alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD)
OUYANG Pengling1, GUAN Qi1, QU Dan2, DING Xinwen1, YANG Li1, SONG Lihua1,3,*
(1. College of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China;2. Department of Nutrition, Shanghai the Seventh People’s Hospital, Shanghai 200137, China;3. Bor S. Luh Food Safety Research Center, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)
Abstract: Based on our previous studies, the effect of phytosterol esters (PSE) on selected serum small-molecule metabolites of rats with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) was investigated in the present study. Further,we explored the molecular mechanism underlying the preventive effect of PSE on NAFLD. Rats were fed with a high-fat diet to establish a NAFLD animal model, and PSE fortified milk at low (0.05 g/100 g mb·d) and high(0.10 g/100 g mb·d) doses were respectively given to rats in the PSE intervention groups by intragastric administration at the same time. Serum small-molecule metabolites of NAFLD rats were detected using ultra performance liquid chromatography-quadrupole-tandem time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS). In addition,Progenesis QI v2.3 software, UNIFI data analysis platform and Metabo Analyst were used to analyze differential serum metabolites and the metabolic pathways involving the identified differential metabolites. Our results showed that 27 metabolites were identified, including diglyceride (14:0/22:2(13Z,16Z)/0:0, 15:0/18:3 (6Z,9Z,12Z)/0:0,16:0/20:3(8Z,11Z,14Z)/0:0, 18:1(11Z)/18:1(11Z)/0:0), glucosylceramide (d18:2/20:0), lactosylceramide (d18:1/18:1(9Z)),heneicosanedioic acid, lysophospholipid (Lyso PC) (15:0, 16:1(9Z), 20:3(5Z,8Z,11Z), 20:3(8Z,11Z,14Z), 18:1(9Z),18:2(9Z,12Z)), phosphatidic acid(22:4(7Z,10Z,13Z,16Z)/0:0), phosphatidylcholine(16:0/20:3(5Z,8Z,11Z), 16:0/P-18:0,18:1(11Z)/20:1(11Z), 17:1(10Z)/0:0, 20:3(8Z,11Z,14Z)/18:0, O-18:0/0:0), phosphatidylethanolamine (16:0/0:0, 18:3(6Z,9Z,12Z)/22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z), 20:3(8Z,11Z,14Z)/0:0, 18:4(6Z,9Z,12Z,15Z)/18:0), phosphatidylinositol(20:0/22:2(13Z,16Z)) and sphingomyelin (d16:1/25:0, d18:1/24:0). The preventive effect of PSE was exerted on NAFLD probably through correcting high-fat diet-induced disturbance of the glycerophospholipid and lipid metabolism pathways.
Keywords: phytosterol esters; non-alcoholic fatty liver disease; serum small-molecule metabolites; ultra performance liquid chromatography-quadrupole-tandem with time-of-fight mass spectrometry
引文格式：2018-10-16
基金项目：上海市卫计委青年项目（201640256）；巴斯夫Newtrition亚洲研究基金项目（14H100000490）
第一作者简介：欧阳鹏凌（1994—）（ORCID: 0000-0002-0492-7802），女，硕士，研究方向为食品营养。E-mail: 346816702@qq.com
*通信作者简介：宋立华（1970—）（ORCID: 0000-0002-7299-5719），女，副研究员，博士，研究方向为食品营养与慢性病预防。E-mail: lihuas@sjtu.edu.cn
DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181016-164
中图分类号 TS201.4
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2020）03-0127-11
引文格式：欧阳鹏凌, 管玘, 曲丹, 等. 植物甾醇酯对非酒精性脂肪肝大鼠部分血清代谢物的影响[J]. 食品科学, 2020, 41(3):127-137. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181016-164. http://www.spkx.net.cn
OUYANG Pengling, GUAN Qi, QU Dan, et al. Effect of phytosterol esters on selected serum metabolites of rats with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)[J]. Food Science, 2020, 41(3): 127-137. (in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181016-164. http://www.spkx.net.cn