《粮油检验 谷物及制品脂肪酸值的测定》编制说明

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《粮油检验 谷物及制品脂肪酸值的测定》编制说明

1 项目来源
《粮油检验 谷物及制品脂肪酸值的测定》国家标准项目，于2019年由云南昆明国家粮食质量监测站（昆明市粮油饲料产品质量检验中心）提出，经国家粮食和物资储备局标准化管理委员会审核，于2020年3月国家标准化管理委员会立项批准，并下达标准立项计划《国家标准化管理委员会关于下达2020年第一批推荐性国家标准计划的通知》（国标委发〔2020〕14号），标准立项编号20201388-T-449。
2 项目背景
脂肪酸值是衡量游离脂肪酸含量的指标，根据脂肪酸值的变化可以判断粮食的劣变程度。粮食中，含有酸性物质，在粮食劣变的过程中，会促进酸性物质增加，包括脂肪酸、磷酸、酸性磷酸盐、氨基酸、乙酸、乳酸等。在粮食劣变过程中，脂肪酸的增加速度要比其它酸性物质快，且在劣变初期，即有显著增高。脂肪酸作为粮食劣变的灵敏指标，常被用于判断粮食的品质变化，在粮食储存中是衡量粮食陈化过程的指标，是稻谷和玉米宜存 、轻度不宜存、重度不宜存的最重要检测参数，在粮食贸易、加工中，则是评价粮食食用品质的主要检测项目。因此，脂肪酸值是各粮食检验检测机构重要的检检项目，还是粮食承储企业监测储粮品质变化、粉类粮食加工企业控制面粉品质质量的必检项目。
在我国，上世纪80年代就把脂肪酸值作为粮食储存品质判定指标、小麦粉质量控制品质指标。因此，也相继研发了多项脂肪酸测定方法，在国际上，也有测定脂肪酸值的国际标准。目前，检测谷物及其制品脂肪酸值的国家标准和行业标准有7个，其中6个标准属于粮食行业制定的标准，包括GB/T 20569-2006《稻谷储存品质判定规则 附录A》、GB/T 20570-2015《玉米储存品质判定规则 附录A》、GB/T 15684-2015《谷物研磨制品 脂肪酸值的测定》、GB/T 5510-2011《粮油检验 粮食、油料脂肪酸值测定》、GB/T 29405-2012《粮油检验 谷物及制品脂肪酸值测定 仪器法》、LS/T 6105-201.2《粮油检验 谷物及制品脂肪酸值的测定 自动滴定分析仪法》，此外还有国际标准ISO 7305:2019《谷物碾磨制品.脂肪酸值的测定》。这些方法分为两类：手工滴定法和仪器滴定法。不论是哪一类方法，不同方法之间数据的一致性、可比性、可靠性、准确性难于判断，给标准使用者带来困扰，标准难于推广使用，有的标准因此成为僵尸标准、冗余标准，不能在粮食脂肪酸值检测工作中发挥作用。
GB/T 20569、GB/T 20570、GB/T 15684、GB/T 5510以手工滴定法为主，但由于提取溶济、滴定体系的不同，不同方法之间不互通，检测数据不一致，即使是用相同的手工滴定方法，由于粮食样品提取液干扰因素多，往往比较混浊或带有颜色，同时脂肪酸是弱酸 ,在提取液中 H+ 浓度低 ,滴定接近终点时突变不明显 ,另外由于乳白色的胶状物浓度较高而掩盖指示剂产生的红色, 使滴定终点滞后 ,终点判定比较困难，造成测定结果偏高 ,终点判定的一致性始终是无法突破的难点，尽管粮食检验工作者们采取了各种控制滴定速度和判定滴定终点的方法，但这些方法都不能普及和推广，或多或少形成了脂肪酸值测定终点判定各说各有理、各行其是、各自为政的局面。不同实验室间、不同检测人员之间由于认知的不同，对颜色敏感程度的不同，对色差变化的观察是不一致的，使得滴定终点难以把握，同一样品因检验者的不同检测结果可能差异很大。即使是相同的检测人员，由于样品提取液干扰因素的存在，准确判定终点也有难度。GB/T 29405、LS/T 6105引入了仪器法，其中电位滴定法采用电位突跃的方法，对于粮食脂肪酸值测定的复杂体系不一定适用，且方法建立条件不明确，使用者难于掌握；光度滴定法，由于滴定体系的不同，其测定结果与人工滴定法不一致；图像分析滴定仪法，通过图像分析技术识别滴定液颜色的变化来判定滴定终点，当达到终点时控制滴定仪停止，该方法的准确性很大程度上依赖于计算机技术和识别、控制软件的设计，可测定的样液范围具有一定的局限性。因此，现行脂肪酸值测定方法，不同测定方法之间的可比性不强，不同方法测定结果之间可能存在较大差异,影响了标准方法的使用。
粮食脂肪酸值测定的仪器法，近十年来，在致力于粮食检测事业的企业的推动下发展迅速，新的产品不断涌现，在检测数据的重复性、再现性，测定效率、测定准确性、操作简便性方面都取得了很大进步。但现行仪器滴定法不同标准、不同方法间不相通，数据的一致性不能保证，同时有的仪器方法不够严谨，使脂肪酸值仪器测定方法的使用和普及受到很大制约。粮食脂肪酸值的测定仍然停留在手工滴定，效率低、重复性差、稳定性差，不同检测机构、不同储粮企业、不同人员之间测定结果偏差较大。
归纳起来，主要问题就是：一是标准重复交叉现象较严重；二是各检测方法之间差异较大，没有明显的关联性和可比较性，用不同的测定方法甚至同一种测定方法检测结果可能差异很大，没有统一的评价依据可以遵循；三是仪器法的优势没有发挥出来，各机构主要采用手工滴定法进行脂肪酸值测定，虽然有的标准已经包括了仪器检测方法，或专门制定了仪器测定法，但是由于各方法间不关联、不一致、可比较性不强等原因，这些方法并没有真正被接受和使用；四是缺乏兼顾准确、快速、高效、包容的方法，方便粮食收购入库验质检查的脂肪酸值测定方法。造成这些问题的主要原因：
一是不同的提取溶剂和不同的滴定体系造成不同测定方法测定结果存在偏差。表1～表5为不同提取溶剂、不同滴定体系测定结果之间的比较。表1为95%乙醇提取法（GB/T 15684）与无水乙醇提取法（GB/T 20569、GB/T  20570）的测定结果比较，提取溶剂和滴定体系都不同，8个样品无水乙醇提取法比95%乙醇提取法平均低8.01mg/100g；表2为95%乙醇提取法（GB/T 15684）与苯提取法（GB/T 5510）的测定结果比较，提取溶剂和滴定体系都不同，8个样品苯提取法（GB/T 5510）比95%乙醇提取法平均低10.32mg/100g；表3为在95%乙醇提取液中加入25 ml苯进行滴定，与苯提取法（GB/T 5510）测定结果进行比较，即不同提取溶剂、相同滴定体系的测定结果比较，8个样品苯提取法（GB/T 5510）比95%乙醇提取法平均低17.32mg/100g；表4为用无水乙醇提取，但滴定体系分别为无水乙醇与水混合滴定体系（GB/T 20569、GB/T  20570）、无水乙醇与95%乙醇混合滴定体系（GB/T 29405）的测定结果比较，即相同提取溶剂、不同滴定体系的测定结果比较，8个样品无水乙醇与水混合滴定体系比无水乙醇与95%乙醇混合滴定体系平均低5.59mg/100g；表5为无水乙醇提取法（GB/T 20569、GB/T  20570）与苯提取法（GB/T 5510）的测定结果比较，即不同提取溶剂、不同滴定体系的测定结果比较，两者无显著性差异，这一结果是不同游离脂肪酸在不同有机溶剂中的溶解性不同和不同的滴定体系交互作用造成的；表6 为在无水乙醇提取溶液中加入0.04%酚酞指示剂25 ml滴定，与苯提取法的测定结果比较，即不同提取溶剂、准相同滴定体系的测定结果比较，8个样品苯提取法（GB/T 5510）比无水乙醇提取加入0.04%酚酞指示剂25 ml滴定平均低9.32mg/100g，与表5 比较，显然，改变滴定体系，测定结果的差异变化非常显著。
以上研究结果表明，不同提取溶剂、不同滴定体系都可能导致测定结果的显著差异。
表1  95%乙醇提取法与无水乙醇提取法
的测定结果比较
编号        无水乙醇提取法/mg.100g-1        95%乙醇提取法，/mg.100g-1        差值di        平均值d        标准偏差sd        td        t0.05,7
1        13.4         20.8         -7.4         -8.01         1.971        11.494        2.364 6
2        17.4         24.0         -6.6                                
3        26.0         31.4         -5.4                                
4        30.3         40.0         -9.7                                
5        39.2         46.8         -7.6                                
6        55.7         66.2         -10.5                                
7        73.1         83.6         -10.5                                
8        100.9         107.3         -6.4                                

表2  95%乙醇提取法与苯提取法的测定结果比较
编号        苯提取法/mg.100g-1        95%乙醇提取法/mg.100g-1        差值di        平均值d        标准偏差sd        td        t0.05,7
1        14.8         20.8         -6.0         -10.32         3.529        8.274        2.3646
2        18.3         24.0         -5.7                                
3        24.5         31.4         -6.9                                
4        28.8         40.0         -11.2                                
5        34.5         46.8         -12.3                                
6        53.1         66.2         -13.1                                
7        69.6         83.6         -14.0                                
8        93.9         107.3         -13.4                                

表3  95%乙醇提取液中加入25ml苯滴定与苯提取法的
测定结果比较
编号        苯提取法/mg.100g-1        95%乙醇提取液加苯滴定/mg.100g-1        差值di        平均值d        标准偏差sd        td        t0.05,7
1        15.7         22.7         -7.0         -17.32         6.077        8.061         2.364 6
2        21.8         36.4         -14.6                                
3        24.1         38.1         -14.0                                
4        31.2         50.8         -19.6                                
5        44.5         58.9         -14.4                                
6        51.9         73.3         -21.4                                
7        64.9         85.6         -20.7                                
8        91.0         117.9         -26.9                                

表4 无水乙醇与95%乙醇混合滴定体系与无水乙醇与水
混合滴定体系的测定结果比较
编号        无水乙醇与水混合滴定体系/mg.100g-1        无水乙醇与95%乙醇混合滴定体系/mg.100g-1        差值di        平均值d        标准偏差sd        td        t0.05,7
1        13.8         18.7         -4.9         -5.59         2.373        6.663         2.364 6
2        20.6        27.1        -6.5                               
3        26.3        31.6        -5.3                               
4        36.8        42.2        -5.4                               
5        47.4        52.2        -4.8                               
6        60.0        61.0        -1.0                               
7        69.2        77.1        -7.9                               
8        100.9        109.8        -8.9                               

表5  无水乙醇提取法与苯提取法的测定结果比较
编号        苯提取法/mg.100g-1        无水乙醇提取法/mg.100g-1        差值di        平均值d        标准偏差sd        td        t0.05,7
1        14.8         13.4         1.4         -1.34         1.698        2.232         2.364 6
2        18.3         17.4         0.9                                
3        24.5         26.0         -1.5                                
4        28.8         30.3         -1.5                                
5        37.8         39.2         -1.4                                
6        53.1         55.7         -2.6                                
7        69.6         73.1         -3.5                                
8        98.4         100.9         -2.5                                

表6  无水乙醇提取液中加入0.04%的酚酞
指示剂25ml与苯提取法的测定结果比较
编号        苯提取法/mg.100g-1        无水乙醇提取液加0.04%酚酞/mg.100g-1        差值di        平均值d        标准偏差sd        td        t0.05,7
1        15.7         18.7         -3.0         -9.32         4.827        5.461         2.364 6
2        21.8         27.1         -5.3                                
3        24.1         31.6         -7.5                                
4        31.2         42.2         -11.0                                
5        44.5         52.2         -7.7                                
6        51.9         61.0         -9.1                                
7        64.9         77.1         -12.2                                
8        91.0         109.8         -18.8                                

二是测定过程易受测定条件的影响，如环境温度、提取方式、提取时间、样品粉碎方式、粉碎细度、样品放置时间、以及滴定操作方法等的影响，同时粮食本身的固有颜色，使提取液带有不同的颜色，干扰了滴定终点的准确判断，导致脂肪酸值测定结果出现偏差。
优化、整合现行脂肪酸值测定方法，统一脂肪酸值的测定标准，建立一个具有相互关联关系的准确测定粮食脂肪酸值的方法，各测定方法具有较高的精密度、重复性、稳定性、再现性，不仅能够更为客观、准确的反映粮食中的脂肪酸值，测定结果的准确性、再现性、一致性、可比较性更强，还能够兼顾不同对象的使用需求，这对确保粮食质量安全具有非常重要的现实意义。
1.能够合理的针对我国粮食检验需求的实际,解决目前储粮过程中脂肪酸值很难准确测定和各个机构脂肪酸值测定结果准确性、一致性、可比较性不强的问题，为我国储粮品质评价体系提供更为科学、准确的脂肪酸值测定方法。
2.统一全国各检验机构脂肪酸值测定结果的一致性、可比较性，为开展全国性的粮食库存检查活动、检测能力评价活动等实施粮食交叉检验、检验能力比对考核提供统一的评价尺度，避免由于检测方法的不一致、检测经验的不同而造成的检验结果差异。
    3.通过整合修订现行标准，有利于减少标准交叉矛盾重复，有利于粮食方法标准体系结构进一步优化，保证标准精干高效。
4.通过引入更为快速高效的检测方法，可以在粮食收购入库验质检验中检测脂肪酸值，使入库粮食品质更有保障。
3 标准优化整合的原则
选择粮食检测机构、粮食承储企业、粮食行政管理部门在历次库存检查中被广泛采用、接受度、认可度都很高的粮食脂肪酸值测定方法GB/T  20569-2006 《稻谷储存品质判定规则 附录A》、GB/T  20570-2015 《玉米储存品质判定规则附录A》作为基准参考方法，在此基础上，完善手工滴定法、开发研究自动电位滴定仪法、光度滴定仪法等。一是方法的开发以脂肪酸值测定结果的延续性和传承性为根本，确保不破坏已被普遍公认的粮食脂肪酸值测定及评价体系，以便使包括稻谷储存品质判定、玉米储存品质判定、小麦粉等粮食及其制品的产品标准、储存品质判定标准都能保持现行有效，评价体系保持不变。二是建立不同方法之间的数据链，研究手工滴定、电位滴定、光度滴定、图像分析滴定等不同方法之间的数据传递链，保持不同测定方法结果的一致性。三是关注方法的精密度、重复性、稳定性、再现性、准确性、包容性，新制定的方法要有更高的测定结果稳定性、准确性，方法要有更宽泛的可选择性，能够适用不同类型、不同层次的检测机构、企业使用标准。四是注重检测方法的经济性、操作简便性、检测效率，使用者勿需大量的经济投入就能选择准确、便捷、高效、适合自身实际的方法，大多数人经过简单的训练就能熟练掌握操作方法。五是注重方法的环保性，尽可能不用有毒有害试剂。
4主要工作过程
目前脂肪酸值的测定方法除了前述标准方法外，还有色谱法、漫反射傅里叶变换红外光谱法、近红外漫反射光谱法等。但色谱法、光谱法或仪器价格昂贵，或对操作人员要求较高，或受化学计量学方法建立的数据库光谱特征与测定成分含量之间数学模型稳定性的影响，进入实际推广使用还需大量的研究工作。脂肪酸值作为粮食储存品质判定、小麦粉等粮食及加工品品质指标，在粮食检验检测工作及粮食储存、粮食加工等具有非常重要的地位，也是非常常见的检测指标，方法应当既有利于在粮食专业检验机构中使用，也要便于广大粮食存储、加工等企业选用，使脂肪酸值可以成为粮食及其制品主要的内控检验指标。
因此，本标准制修订项目组在对现行标准及相关文献进行比较研究、并在大量科学实验的基础上，提出4个脂肪酸值的测定方法，即自动电位滴定仪法、百里香酚蓝指示剂手工滴定法、百里香酚蓝指示剂自动光度滴定仪法、酚酞指示剂图像分析滴定仪法。
4.1现行脂肪酸值测定方法比较与分析
4.1.1稻谷、玉米脂肪酸值测定
现行稻谷、玉米储存品质判定，脂肪酸值的测定以GB/T 20569、GB/T 20570的手工滴定法为基础，方法以无水乙醇为提取溶剂，以乙醇、水混合体系为基本滴定体系。这是被普遍公认和采用的方法，整合优化后的方法将以此为基础方法，保持了现行稻谷、玉米的储存品质判定规则不受影响。
4.1.2小麦及小麦粉脂肪酸值测定
我国小麦粉评价体系以苯法测定的脂肪酸值为评价依据，即以GB/T 5510的测定值为评价依据。GB/T 15684虽等同采用国际标准ISO 7305编制，但因与GB/T 5510的提取溶剂、滴定体系不同，其测定值与GB/T 5510差异较大，见表2，在相关产品的评价体系中也未引用GB/T 15684，即该方法并未进入我国粉类产品的评价体系。因此，本标准仍然以苯法，即以GB/T 5510的测定值为基础进行方法修订。苯毒性较大，影响检测人员身体健康，破坏环境安全，为此进行了一系列科学实验研究，寻找苯法的替代方法。实验表明，以无水乙醇为提取溶剂，以乙醇、水混合体系为滴定体系的测定值与苯法的测定值不存在显著性差异，见表5。因此，小麦及其粉类粮食脂肪酸值的测定经整合优化后，以无水乙醇为提取溶剂，以乙醇、水混合体系为滴定体系，统一到了与稻谷、玉米的测定方法一致。
4.1.3 GB/T 29405与LS/T 6105
GB/T 29405与LS/T 6105，为仪器法，前者包含百里香酚蓝指示剂光度滴定法、电位滴定法两个方法，后者为图像采集分析滴定法。
（1）百里香酚蓝指示剂光度滴定法。采用无水乙醇为提取溶剂，无水乙醇、N，N-二甲基甲酰胺、95%乙醇混合体系为滴定体系，由于滴定体系的不同，其测定值与GB/T 20569、GB/T 20570存在非常显著的差异，见表7。使用该方法应进行进一步的优化、研究，以消除滴定体系造成的影响。
表7  GB/T 29405光度滴定法与GB/T 20569测定结果比较
编号        无水乙醇与水混合滴定体系/mg.100g-1        无水乙醇、N，N-二甲基甲酰胺、95乙醇混合滴定体系/mg.100g-1        差值di        平均值d        标准偏差sd        td        t0.05,14
1        17.1         29.9         -12.8         -13.03         1.057        47.744         2.144 8
2        15.8         29.6         -13.8                                
3        15.8         29.3         -13.5                                
4        14.2         28.4         -14.2                                
5        17.7         30.9         -13.2                                
6        22.7         36.6         -13.9                                
7        21.9         36.4         -14.5                                
8        29.6        41.6        -12.0                                
9        31.8        44.3        -12.5                                
10        34.7        45.1        -10.4                                
11        32.5        44.4        -11.9                                
12        26.2        39.4        -13.2                                
13        27.9        40.8        -12.9                                
14        27.2        41.1        -13.9                                
15        24.4        37.1        -12.7                                
（2）电位滴定仪法。GB/T 29405中的电位滴定法比较宽泛，标准使用者难于依据标准建立有效、准确的测定方法，标准的指导性不强。该方法应进一步开展深入细致的研究，使方法适用于粮食脂肪酸值的测定。
（3）图像分析滴定仪法。该方法以无水乙醇为提取溶剂，以乙醇、水混合体系为滴定体系，与现行手工滴定法一致。但该方法的准确性除分析设备的技术性能外，还依赖于图像数据的采集处理技术和计算机软件设计，因此，该方法需进一步研究优化，以确保测定结果与手工滴定法的一致性。
4.1.4其他
关于采用国际标准的可行性。国际标准ISO 7305:2019《谷物碾磨制品.脂肪酸值的测定》，该标准以95%乙醇为提取溶剂和滴定体系，提取溶剂和滴定体系与我国现行产品标准评价体系中采用的脂肪酸值测定方法不同，测定结果的差异较大，见表1、表2。因此，该国际标准与我国现行产品评价体系不相容，不适用于在我国现行产品评价体系下使用，故本标准不予采用。
关于油料的脂肪酸值测定。GB/T 5510第二法为油料脂肪酸值测定方法，在油料评价体系中并未采用脂肪酸值进行评价，一般采用酸价评价油料质量，本部分属冗余部分，因此，本标准删除了油料脂肪酸值测定部分。
关于采用比色法、电导滴定法、近红外法等测定粮食脂肪酸值的可行性。相关的研究表明，这些方法在现阶段尚不成熟，暂不纳入标准。
4.2 优化、整合后脂肪酸值测定方法的基本构成
4.2.1百里香酚蓝指示剂手工滴定法
该方法与GB/T 20569、GB/T 20570的手工滴定法基本一致，以无水乙醇为提取溶剂，以乙醇、水混合体系为滴定体系。与现行标准方法的主要不同之处，一是用水溶剂标准滴定溶液替代原方法的95%乙醇溶剂标准滴定溶液，简化了标准溶液的配制程序，测定更为简便，并提高了测定结果的准确性、稳定性；二是用三级水替代原方法的无CO2的蒸馏水，简化了操作，提高了效率；三是用百里香酚蓝指示剂替代原方法的酚酞指示剂，滴定过程样液从黄色变为微蓝色，降低了样液原有颜色对滴定过程的干扰，滴定终点判断更加容易，检测者更易掌握终点判定技术，并且能检测红色、紫色等深颜色粮食的脂肪酸值，拓展了手工滴定法的样品适用范围。
4.2.2自动电位滴定仪法
在深入细致的分析研究和大量实践经验的基础上提出自动电位“模拟”手工滴定法，样品处理、脂肪酸提取、滴定体系与手工滴定法相同，自动电位滴定仪仅作为滴定终端，滴定过程和终点判定方法与手工滴定法一致，从方法原理上保证了测定结果与手工滴定法的一致性。
方法以无水乙醇为提取溶剂、以水溶剂标准滴定溶液为标准滴定溶液、以三级水为测定用水、以乙醇、水混合体系为滴定体系，样品处理、脂肪酸提取、滴定体系与手工滴定法相同，采用SET-pH模式进行滴定，即预设终点滴定模式滴定，达到预先设置的终点pH值自动电位滴定仪即停止。终点pH值的设置“模拟”手工滴定，以百里香酚蓝作为指示剂，把空白液滴定至微蓝色30 S不消失时的pH值设定为终点pH值，样液测定时亦加入百里香酚蓝指示剂显色判断，作为终点的辅助判断和对方法可靠性的监测。此方法检验结果和手工滴定法完全一致，但消除了手工滴定方法对粮食样品的混浊、样液原有的颜色对终点判定的影响，终点的判断完全不受“颜色”的干扰。完全解决了手工滴定方法由于样品溶液干扰因素的存在而带来的终点判断的困难，因检测人员的经验、视觉差异等带来的不确定性，且与空白滴定的终点保持一致，测定结果更加稳定、可靠、准确，检测结果的重复性、再现性、准确性更有保障。该方法来源于手工滴定法，但优于手工滴定法，具有更高的准确性和测定稳定性，适用范围更为广泛。
4.2.3百里香酚蓝指示剂自动光度滴定仪法
该方法以无水乙醇为提取溶剂、95%乙醇溶剂标准滴定溶液为标准滴定溶液、无水乙醇、95%乙醇混合体系为滴定体系，样品处理与手工滴定法相同。为了消除滴定体系对测定结果的影响，在方法研究中引入滴定体系校正的概念。大量实验表明，经过滴定体系校正后，测定结果与手工滴定法、自动电位滴定仪法一致。该方法要求仪器应当具备内置滴定体系校正功能。
4.2.4酚酞指示剂图像分析滴定仪法
方法以无水乙醇为提取溶剂、以水溶剂标准滴定溶液为标准滴定溶液、以三级水为测定用水、以乙醇、水混合体系为滴定体系，样品处理、脂肪酸提取、滴定体系与手工滴定法相同。该方法以图像分析滴定仪作为滴定终端，从仪器设计原理上就是以手工滴定法为基础进行开发研究，基于图像识别、分析技术实现对滴定过程的控制，终点判定和停止。其核心是图像数据的采集、分析处理技术和计算机软件设计。
经过优化整合后的标准，一是统一了稻谷、玉米、小麦（粉）的脂肪酸值测定方法，整合了方法，简化了标准；二是废弃了苯法，方法更安全、更环保；三是手工滴定法终点更易判定，准确性更好；四是各方法测定结果一致，并与现行产品标准的评价体系结果一致，保持了现行粮食及其产品的脂肪酸值评价体系不变，实现测定方法与评价体系的无缝对接。
4.3脂肪酸值测定影响因素研究
关于脂肪酸值测定的影响因素前人已做过很多研究，包括样品的粉碎方式、粉碎样品的细度、粉碎样品的放置时间、环境温度、脂肪酸提取时间、滤液静置时间、标准溶液、测定用水、二氧化碳、终点判定、指示剂等，很多研究成果已应用在现行标准中，本次整合、优化、修订直接引用这些已经比较成熟的研究成果，在此，不一一赘述。本说明仅对前人未研究或未深入研究过的往复式振荡器振幅、指示剂、测定用水、标准溶液、脂肪酸提取方式、提取时间、提取液分离方法等因素对粮食脂肪酸值测定的影响开展进一步研究，提出优化方法。
4.3.1振荡器的振幅对脂肪酸值测定的影响
选择稻谷、玉米、小麦粉样品各8份，分别用振幅为30mm、20mm，振荡频率为100次/min的不同振荡器提取脂肪酸，比较脂肪酸值测定结果，见表8。
表8  30mm振幅与20mm振幅的振荡器粮食脂肪酸值测定结果比较
编号        品名        振幅30mm mg.100g-1        振幅20mm mg.100g-1        差值di        平均值d        标准偏差sd        td        t0.05,23
1        玉米        48.10        47.22        0.88         0.72         0.403         8.753        2.068 7
2        玉米        57.28        56.52        0.76                                
3        玉米        64.20        63.36        0.84                                
4        玉米        63.00        61.86        1.14                                
5        玉米        74.19        73.17        1.02                                
6        玉米        29.04        28.34        0.70                                
7        玉米        26.86        26.65        0.21                                
8        玉米        32.52        31.47        1.05                                
9        小麦粉        8.98        8.44        0.54                                
10        小麦粉        17.68        17.33        0.35                                
11        小麦粉        11.11        10.97        0.14                                
12        小麦粉        13.24        12.87        0.37                                
13        小麦粉        21.13        21.01        0.12                                
14        小麦粉        18.57        17.92        0.65                                
15        小麦粉        68.04        66.48        1.56                                
16        小麦粉        42.49        41.70        0.79                                
17        稻谷        11.78        11.60        0.18                                
18        稻谷        22.50        22.18        0.32                                
19        稻谷        17.03        16.15        0.88                                
20        稻谷        24.76        23.76        1.00                                
21        稻谷        26.20        25.34        0.86                                
22        稻谷        15.76        15.39        0.37                                
23        稻谷        22.33        20.87        1.46                                
24        稻谷        30.17        29.13        1.04                                

表7表明，选用不同振幅的振荡器，相同的提取时间，测定值存在显著性差异。因此，在标准中，应当明确规定振荡器的振幅。据于现实中以20mm振幅的振荡器使用较为广泛，标准中拟采用20mm振幅的往复式振荡器。
4.3.2百里香酚蓝指示剂与酚酞指示剂测定结果比较
现行标准方法以酚酞作为指示剂测定脂肪酸值，由于滴定液为有机弱酸，用强碱滴定弱酸突变不明显，又因粮食本身色素的影响，以“微红”判定终点，往往滴定过量；在实际操作中，通常以“色差”来判定终点，但因不同操作者对颜色的敏感度差异，对“色差”变化的观察也不一致，造成不同操作者甚至同一操作者，对同一样品的测定误差较大，脂肪酸值测定“终点判定难”是不争的事实。为此，我们寻求使用不同的指示剂测定脂肪酸值。用强碱滴定脂肪酸，滴定突跃范围pH值在8.0～9.7。酞酚的变色范围8.0～10.0，由无色变为浅红色；百里香酚蓝的变色范围8.6～9.6，由黄色变为蓝色，变色范围都在强碱滴定脂肪酸的突跃范围内。因此，可以用百里香酚蓝代替酞酚作为指示剂滴定脂肪酸。颜色从黄色变为微蓝色，变化明显，易于观察，解决了用酚酞指示剂“终点判定难”的问题，同时用百里香酚蓝作为指示剂还可以测定黑米稻、紫米稻、红米稻、红玉米、黑玉米等“有色”粮食的脂肪酸值。表9、表10为不同指示剂的测定结果比较。
表9  百里香酚蓝指示剂与酚酞指示剂测定粮食脂肪酸值结果比较
编号        品名        百里香酚蓝指示剂滴定法
mg.100g-1        酚酞指示剂滴定法
mg.100g-1        差值di        平均值d        标准偏差sd        td        t0.05,23
1        稻谷        25.93         25.81         0.12         0.32         1.001         1.566        2.068 7
2        稻谷        26.77         27.84         -1.07                                
3        稻谷        31.31         30.95         0.36                                
4        稻谷        27.86         28.01         -0.15                                
5        稻谷        11.05         10.89         0.16                                
6        稻谷        13.40         14.27         -0.87                                
7        稻谷        20.43         19.65         0.78                                
8        稻谷        35.40         33.49         1.91                                
9        玉米        29.72         30.77         -1.05                                
10        玉米        41.99         40.22         1.77                                
11        玉米        39.54         38.52         1.02                                
12        玉米        36.13         36.50         -0.37                                
13        玉米        38.79         40.02         -1.23                                
14        玉米        55.54         55.52         0.02                                
15        玉米        28.15         26.83         1.32                                
16        玉米        52.27         51.38         0.89                                
17        小麦粉        17.74         18.19         -0.45                                
18        小麦粉        25.39         24.93         0.46                                
19        小麦粉        37.05         37.06         -0.01                                
20        小麦粉        61.76         59.44         2.32                                
21        小麦粉        27.84         28.59         -0.75                                
22        小麦粉        32.92         32.96         -0.04                                
23        小麦粉        40.45         39.31         1.14                                
24        小麦粉        58.69         57.26         1.43                                

表10  百里香酚蓝指示剂手工滴定法与电位滴定法测定“有色”
粮食脂肪酸值结果比较
编号        品名        百里香酚蓝指示剂手工滴定
mg.100g-1        电位滴定法
mg.100g-1        差值di        平均值d        标准偏差sd        td        t0.05,7
1        紫米稻        13.74         13.69         0.05         -0.08         0.564         0.401        2.364 6
2        红玉米        30.98         30.38         0.60                                
3        红米稻        18.98         19.84         -0.86                                
4        红米稻        23.24         23.00         0.24                                
5        红米稻        21.00         21.05         -0.05                                
6        红米稻        31.19         30.64         0.55                                
7        红米稻        21.43         21.75         -0.32                                
8        黑米稻        32.81         33.65         -0.84                                

表9、表10表明，使用百里香酚蓝指示剂与酚酞指示剂测定粮食脂肪酸值，结果一致，不存在显著性差异，且采用百里香酚蓝指示剂测定范围更为广泛。因此，本标准拟采用百里香酚蓝作为指示剂。
4.3.3不同测定用水测定结果比较
现行标准方法，脂肪酸值测定用水为现制不含二氧化碳的蒸馏水，操作繁琐，冷却水用时长，影响测定效率。比较用现制不含CO2的蒸馏水、10天前制备的密闭存放的不含CO2的蒸馏水、三级水测定结果，以判断不同水质对测定值的影响，结果见表11、表12。
表11  密闭存放的不含CO2蒸馏水与现制不含CO2的蒸馏水
测定粮食脂肪酸值结果比较
编号        品名        密闭不含CO2蒸馏水mg.100g-1        现制不含CO2蒸馏水mg.100g-1        差值di        平均值d        标准偏差sd        td        t0.05,8
1        小麦粉        16.95         16.71         0.24         -0.02         0.233         0.258        2.306 0
2        小麦粉        24.06         24.14         -0.08                                
3        小麦粉        57.19         57.45         -0.26                                
4        稻谷        21.67         21.93         -0.26                                
5        稻谷        35.87         36.04         -0.17                                
6        稻谷        31.05         30.68         0.37                                
7        玉米        67.44         67.23         0.21                                
8        玉米        32.74         32.83         -0.09                                
9        玉米        39.00         39.14         -0.14                                

表12  三级水与现制不含CO2的蒸馏水测定粮食脂肪酸值结果比较
编号        品名        三级水mg.100g-1        现制不含CO2蒸馏水mg.100g-1        差值di        平均值d        标准偏差sd        td        t0.05,8
1        小麦粉        16.52         16.71         -0.19         0.28         0.438         1.918         2.306 0
2        小麦粉        24.67         24.14         0.53                                
3        小麦粉        58.11         57.45         0.66                                
4        稻谷        22.11         21.93         0.18                                
5        稻谷        36.41         36.04         0.37                                
6        稻谷        30.41         30.68         -0.27                                
7        玉米        68.21         67.23         0.98                                
8        玉米        33.30         32.83         0.47                                
9        玉米        38.91         39.14         -0.23                                

表11、表12表明，三者结果一致，不存在显著性差异。因此，本标准选用三级水作为测定用水，以提高检测效率、降低制备水的成本，并便于基层粮库、化验室使用标准。
4.3.4水溶剂与95%乙醇溶剂氢氧化钾标准滴定溶液测定结果比较
现行脂肪酸值测定方法采用95%乙醇溶剂氢氧化钾标准溶液作为滴定标准溶液。乙醇溶剂标准溶液稳定性较差，为寻找可替代的标准滴定溶液，对水溶剂氢氧化钾标准滴定溶液与95%乙醇溶剂氢氧化钾标准滴定溶液从结果的一致性、标准溶液的长期稳定性、短期稳定性三个方面进行了比较。见表13～表16、图1。
表13  水溶剂与95%乙醇溶剂氢氧化钾标准滴定溶液
测定粮食脂肪酸值结果比较
编号        品名        水溶剂标准溶液mg.100g-1        95%乙醇溶剂标准溶液mg.100g-1        差值di        平均值d        标准偏差sd        td        t0.05,11
1        稻谷        19.70         20.95         -1.25         -0.073         0.526         0.481        2.201 0
2        稻谷        11.07         11.30         -0.23                                
3        稻谷        11.65         11.64         0.01                                
4        稻谷        11.62         11.41         0.21                                
5        玉米        33.82         33.53         0.29                                
6        小麦粉        36.02         35.95         0.07                                
7        小麦粉        17.17         17.38         -0.21                                
8        玉米        30.65         30.92         -0.27                                
9        玉米        60.76         60.58         0.18                                
10        玉米        39.77         38.95         0.82                                
11        小麦粉        22.61         22.40         0.21                                
12        小麦粉        54.79         55.49         -0.70                                

表14  1个月前配制与现配制的水溶剂氢氧化钾
标准滴定溶液测定粮食脂肪酸值结果比较
编号        品名        1月前配标准溶液mg.100g-1        现配制标准溶液mg.100g-1        差值di        平均值d        标准偏差sd        td        t0.05,7
1        小麦粉        16.93         16.43         0.50         0.30         0.475         1.786        2.364 6
2        小麦粉        35.05         34.05         1.00                                
3        小麦粉        26.24         26.47         -0.23                                
4        小麦粉        59.00         58.49         0.51                                
5        稻谷        15.18         14.45         0.73                                
6        稻谷        14.84         14.88         -0.04                                
7        玉米        31.34         31.69         -0.35                                
8        玉米        59.94         59.68         0.26                                

表15  1个月前配制与现配制的95%乙醇溶剂氢氧化钾
标准滴定溶液测定粮食脂肪酸值结果比较
编号        品名        1月前配标准溶液mg.100g-1        现配制标准溶液mg.100g-1        差值di        平均值d        标准偏差sd        td        t0.05,7
1        玉米        37.08         35.26         1.82         2.69         1.998         3.808        2.364 6
2        玉米        74.43         67.46         6.97                                
3        小麦粉        18.43         16.19         2.24                                
4        小麦粉        36.98         34.33         2.65                                
5        稻谷        22.80         18.96         3.84                                
6        稻谷        20.04         18.41         1.63                                
7        稻谷        12.03         9.98         2.05                                
8        稻谷        11.55         11.27         0.28                                

表16  半敞口放置的水溶剂和95%乙醇溶剂标准滴定溶液
不同放置时间测定结果与对照组比较变化情况
放置时间，h        0.01mol/L的水溶剂氢氧化钾标准滴定溶液        0.01mol/L的95%乙醇溶剂氢氧化钾标准滴定溶液
        试验组mg.100g-1        对照组mg.100g-1        差值di        试验组mg.100g-1        对照组mg.100g-1        差值di
0        41.23         41.40         -0.17         41.06         40.39         0.67
1        42.35         41.57         0.78         41.18         40.12         1.06
2        43.07         41.23         1.84         43.69         40.11         3.58
3        42.74         40.79         1.95         45.81         40.34         5.47
4        44.58         40.95         3.63         49.66         40.28         9.38
5        45.53         41.23         4.30         54.62         40.34         14.28


图1  半敞口放置的水溶剂和95%乙醇溶剂标准滴定溶液
不同放置时间测定结果与对照组比较变化关系图
表13～表16、图1表明，采用水溶剂氢氧化钾标准滴定溶液与95%乙醇溶剂氢氧化钾标准滴定溶液测定脂肪酸值之间不存在显著性差异，水溶剂氢氧化钾标准滴定溶液的长期稳定性和短期稳定性都远优于95%乙醇溶剂氢氧化钾标准滴定溶液。在室温下密闭放置的1个月前配制的水溶剂氢氧化钾标准滴定溶液没有显著变化，而密闭放置的1个月前配制的95%乙醇溶剂氢氧化钾标准滴定溶液浓度已显著降低；半敞口放置的水溶剂和95%乙醇溶剂标准滴定溶液随着放置时间的延长，浓度逐渐降低，而后者的下降速度远高一前者。因此，本标准主要选择水溶剂氢氧化钾标准溶液作为滴定标准溶液，同时要求标准溶液从试剂瓶倾出后应立即盖紧瓶塞。
4.3.5不同提取方式脂肪酸提取时间的确定及一致性研究
脂肪酸的提取率对检测结果有着重要的影响。目前标准方法采用的提取方式主要为往复式振荡器提取法，这一提取方法已普遍应用于粮食检测机构、粮食仓储企业中。同时，磁力搅拌器提取法也逐步开始出现并被使用，此外，还有回旋式振荡器提取法。标准研究组对往复式振荡器提取法、磁力搅拌器提取法的提取时间及一致性进行了深入研究。
以特定的提取设备、在一定的振荡频率（搅拌速度）和一定的环境温度下，随着提取时间的增加，脂肪酸的分离提取量也逐渐增加，所测定的脂肪酸值也越来越大。由于待测样品脂肪酸值测定的是游离脂肪酸和一些可测定的高级脂肪酸，而脂肪的分解是一个动态平衡的过程，随着脂肪酸提取时间的延长，动态平衡被打破，脂肪会进一步分解，高级脂肪酸也会进一步断键，因而随着提取时间的延长，会不断建立新的动态平衡关系。基于这种动态平衡理论，在一定的提取条件下，通过改变提取时间，测定不同提取时间下样品的脂肪酸值，绘制提取时间与脂肪酸值的变化关系图，随着提取时间的增加，脂肪酸值也增加，逐渐达到动态平衡状态，如果继续增加提取时间，会破坏平衡关系，使脂肪酸值继续增加。当提取时间达到一定值后，游离脂肪酸的分离提取基本完全，脂肪酸值的增加明显缓慢，这一时间即为脂肪酸最佳提取时间，并把该时间确定为脂肪酸的提取时间。
选择3份不同脂肪酸值梯度水平的样品，以无水乙醇作为提取溶剂，往复式振荡器（或磁力搅拌器）作为提取设备，往复式振荡器振幅20mm，振荡频率100次/min(或磁力搅拌器搅拌速度1 200次/min)，称取研磨好的混匀试样10.00g，在室温下（15℃～25℃）改变提取时间振荡（或搅拌）提取样品中的脂肪酸，测定脂肪酸值。以提取时间为横坐标、脂肪酸值为纵坐标，绘制脂肪酸值随提取时间的变化曲线，以脂肪酸值增加明显变缓慢的时间为该样品的最佳提取时间，综合分析3份样品的提取时间变化规律确定该类粮食脂肪酸提取的最佳时间。结果见图2～图7。

图2 往复式振荡器提取法：稻谷脂肪酸值提取率随提取时间变化关系图

图3 往复式振荡器提取法：玉米脂肪酸值提取率随提取时间变化关系图

图4 往复式振荡器提取法：小麦粉脂肪酸值提取率随提取时间变化关系图

图5 磁力搅拌器提取法：稻谷脂肪酸值提取率随提取时间变化关系图

图6 磁力搅拌器提取法：玉米脂肪酸值提取率随提取时间变化关系图

图7 磁力搅拌器提取法：小麦粉脂肪酸值提取率随提取时间变化关系图
从图中不难看出，稻谷、玉米、小麦粉的最佳提取时间，采用往复式振荡器提取法提取时分别为10 min，30 min，40 min；采用磁力搅拌器提取法提取时分别为8 min，25 min，30 min。因此，本标准拟保留往复式振荡器提取法，增加磁力搅拌方法提取法作为脂肪酸的提取方法。
4.3.6不同提取液分离方法的一致性研究
样品提取液的分离方法传统方法为滤纸过滤法，该方法分离效率低，GB/T 15684-2015采用离心分离法，以离心加速度为2 000 g的离心机离心5 min，取上清液为测定液。经过改进，以离心加速度为4 000 g的离心机离心3 min，可以提高效率。以玉米样品的测定为例，选择10个玉米样品以相同的方法提取脂肪酸，分别以离心分离方法和滤纸过滤法分离提取液，测得两组数据，发现20对检测结果绝对值之差均小于2mg/100g，在国标方法规定的双试验允差范围内。采用配对T检验，考察两种分离方法测定结果的一致性，见表17。
表17  离心分离法与滤纸过滤法分离样液结果比较
编号        离心分离法mg.100g-1        滤纸过滤法mg.100g-1        差值di        均值d        标准偏差sd        td        t0.05,9
1        40.30         40.00         0.30         0.490         0.747         2.117         2.262 2
2        41.00         40.20         0.80                                
3        61.20         59.80         1.40                                
4        48.90         48.70         0.20                                
5        51.30         51.60         -0.30                                
6        74.00         73.00         1.00                                
7        62.10         61.40         0.70                                
8        36.30         36.70         -0.40                                
9        46.10         46.50         -0.40                                
10        63.90         62.20         1.70                                

表17显示，两种分离方法测定结果不存在显著性差异，结果一致，样液分离可以使用离心分法。综合分析GB/T 15684采用的离心分离法，拟采用离心加速度为2 000 g～4 000 g的离心机离心5～3  min，取上清液为测定液。
因此，本标准拟提供滤纸过滤法、离心法分离法分离提取液。
4.4脂肪酸值测定方法研究
4.4.1百里香酚蓝指示剂手工滴定法
分别用百里香酚蓝指示剂、三级水、水溶剂氢氧化钾标准滴定溶液代替现行国标方法中的酚酞指示剂、现制不含CO2蒸馏水、95%乙醇溶剂氢氧化钾标准滴定溶液测定稻谷、玉米、小麦粉的脂肪酸值进行比较，结果无显著性差异。见表18。
表18  优化后与优化前的脂肪酸值测定方法
测定结果比较
编号        品名        优化后的测定值mg.100g-1        优化前的测定值mg.100g-1        差值di        平均值d        标准偏差sd        td        t0.05,8
1        稻谷        20.04         21.27         -1.23         -0.04        1.142         0.105        2.306 0
2        玉米        42.62         41.08         1.54                                
3        玉米        30.49         29.44         1.05                                
4        玉米        59.06         61.28         -2.22                                
5        玉米        31.20         30.92         0.28                                
6        稻谷        27.96         28.27         -0.31                                
7        稻谷        17.95         17.35         0.60                                
8        小麦粉        20.31         20.37         -0.06                                
9        小麦粉        40.34         40.32         0.02                                

    因此，新修订的方法以百里香酚蓝作为指示剂、三级水作为实验用水、水溶剂氢氧化钾标准溶液作为滴定标准溶液，滴定终点更易判断，提高了标准滴定溶液的稳定性，简化了实验过程，提高了工作效率，增加了方法的适用范围。
4.4.2自动电位滴定仪法
从方法精密度、重复性、稳定性、再现性、适用性等多个维度考察自动电位滴定仪测定粮食脂肪酸值，研究以百里香酚蓝为指示剂建立自动电位滴定仪法的可行性，并与手工滴定法比较，考察两种方法的一致性。
（1）方法精密度。从空白精密度、样品精密度两个方面进行考察，数据显示，方法具有非常好的精密度。评价数据见表19、表20。
表19  自动电位滴定仪法脂肪酸值测定
空白精密度实验分析表

滴定体积/mL        平均体积        极差        标准偏差        相对标准偏差/%
0.330         0.347        0.04        0.015         4.3
0.346                                
0.366                                
0.354                                
0.370                                
0.344                                
0.336                                
0.332                                

表20 自动电位滴定仪法稻谷脂肪酸值测定精密度实验
χ2分布检验评价表
测定次数/n        测定值/mg.100g-1        平均值        标准偏差s        χ2        χ20.95(7)        极差        CrR95(8)
1        11.98        12.07        0.334        1.532        14.067 1        1.04        3.071
2        12.12                                               
3        12.41                                               
4        12.06                                               
5        11.95                                               
6        11.77                                               
7        11.61                                               
8        12.65                                               
    表19、20显示，空白滴定变异系数小，样品8次重复测定的χ2分布值1.532，远小于在95%置信概率下的查表值χ20.95(7)=14.067 1，极差1.04也远小于现行标准规定的8次重复测定的重复性临界极差CrR95(8)=3.071。
（2）方法重复性。对170份稻谷样品进行的平行实验显示，误差0.0～1.71 mgKOH/100 g，符合现行国标方法规定的平行实验误差不大于2.0 mg/100 g的要求，其中：153份样品误差在1.0 mgKOH/100g以内，占90%；17份样品误差在1.0 ～2.0mgKOH/100g，占10%。该批量重复性实验结果表明，自动电位滴定仪法测定脂肪酸值，重复性优异，测定范围宽。结果评价见表21。
表21 自动电位滴定仪法脂肪酸值测定重复性实验结果表
编号        测定值/( mg/100g)         平均值        绝对误差        编号        测定值/( mg/100g)        平均值        绝对误差
1        27.78         27.81         0.06         86        17.92         17.82         0.21
        27.84                                 17.71                
2        28.24         28.12         0.24         87        16.91         17.11         0.40
        28.00                                 17.31                
3        27.74         28.41         1.33         88        18.83         18.81         0.05
        29.07                                 18.78                
4        34.63         34.98         0.70         89        18.14         18.08         0.13
        35.33                                 18.01                
5        24.57         24.93         0.72         90        16.88         17.00         0.24
        25.29                                 17.12                
6        24.40         24.45         0.10         91        18.34         18.50         0.32
        24.50                                 18.66                
7        24.52         24.56         0.08         92        16.67         16.63         0.08
        24.60                                 16.59                
8        25.07         25.15         0.16         93        18.36         18.33         0.06
        25.23                                 18.30                
9        23.41         23.75         0.67         94        20.12         20.10         0.05
        24.08                                 20.07                
10        34.13         34.16         0.05         95        17.96         18.44         0.96
        34.18                                 18.92                
11        35.59         34.98         1.22         96        22.44         22.20         0.48
        34.37                                 21.96                
12        31.98         32.18         0.40         97        19.42         19.84         0.83
        32.38                                 20.25                
13        33.73         34.24         1.01         98        15.58         15.76         0.35
        34.74                                 15.93                
14        27.20         27.73         1.05         99        23.88         24.16         0.56
        28.25                                 24.44                
15        26.03         26.26         0.46         100        16.51         16.53         0.03
        26.49                                 16.54                
16        26.78         26.70         0.16         101        15.66         15.53         0.26
        26.62                                 15.40                
17        28.60         28.74         0.27         102        21.48         21.56         0.16
        28.87                                 21.64                
18        29.61         29.77         0.32         103        16.31         16.42         0.22
        29.93                                 16.53                
19        10.14         10.37         0.45         104        19.80         19.75         0.11
        10.59                                 19.69                
20        11.11         11.14         0.06         105        23.72         23.77         0.10
        11.17                                 23.82                
21        10.39         10.01         0.77         106        16.20         16.31         0.21
        9.62                                 16.41                
22        10.34         9.69         1.31         107        20.84         20.87         0.05
        9.03                                 20.89                
23        27.74         27.49         0.51         108        17.14         17.05         0.19
        27.23                                 16.95                
24        24.40         24.45         0.10         109        10.44         10.07         0.75
        24.50                                 9.69                
25        28.24         28.12         0.24         110        10.22         10.41         0.38
        28.00                                 10.60                
26        10.09         10.34         0.49         111        9.58         9.90         0.64
        10.58                                 10.22                
27        11.66         11.84         0.35         112        15.54         15.93         0.78
        12.01                                 16.32                
28        11.01         10.85         0.32         113        13.86         13.84         0.05
        10.69                                 13.81                
29        11.49         11.33         0.32         114        15.31         15.32         0.02
        11.17                                 15.33                
30        11.14         10.66         0.96         115        11.62         11.72         0.19
        10.18                                 11.81                
31        15.14         16.00         1.71         116        11.82         11.86         0.08
        16.85                                 11.90                
32        8.95         9.74         1.57         117        12.60         12.59         0.02
        10.52                                 12.58                
33        10.67         10.94         0.54         118        15.42         15.19         0.47
        11.21                                 14.95                
34        11.81         11.76         0.11         119        10.40         10.44         0.08
        11.70                                 10.48                
35        24.55         24.87         0.64         120        11.73         11.84         0.21
        25.19                                 11.94                
36        24.95         25.26         0.61         121        17.32         17.43         0.21
        25.56                                 17.53                
37        24.20         24.47         0.54         122        20.64         20.58         0.13
        24.74                                 20.51                
38        22.17         22.40         0.46         123        21.45         21.44         0.02
        22.63                                 21.43                
39        24.01         24.47         0.91         124        24.31         23.90         0.83
        24.92                                 23.48                
40        29.60         29.91         0.61         125        18.88         18.95         0.13
        30.21                                 19.01                
41        29.83         29.98         0.29         126        15.64         15.39         0.51
        30.12                                 15.13                
42        27.90         27.56         0.69         127        10.96         10.89         0.14
        27.21                                 10.82                
43        28.24         28.12         0.24         128        18.06         17.71         0.70
        28.00                                 17.36                
44        24.83         25.48         1.30         129        22.39         22.67         0.56
        26.13                                 22.95                
45        30.60         30.71         0.22         130        20.29         20.67         0.75
        30.82                                 21.04                
46        25.55         25.67         0.24         131        17.39         17.59         0.40
        25.79                                 17.79                
47        36.20         36.00         0.40         132        17.34         18.00         1.31
        35.80                                 18.65                
48        29.63         29.71         0.16         133        16.88         17.59         1.41
        29.79                                 18.29                
49        26.09         26.35         0.51         134        18.50         18.54         0.08
        26.60                                 18.58                
50        28.81         29.21         0.80         135        19.69         19.59         0.21
        29.61                                 19.48                
51        27.19         26.83         0.72         136        22.19         22.18         0.03
        26.47                                 22.16                
52        27.48         27.75         0.53         137        20.10         20.08         0.05
        28.01                                 20.05                
53        28.51         28.56         0.10         138        18.46         18.53         0.14
        28.61                                 18.60                
54        28.75         28.77         0.03         139        19.64         19.91         0.53
        28.78                                 20.17                
55        32.01         32.08         0.13         140        11.29         10.86         0.86
        32.14                                 10.43                
56        29.00         29.26         0.51         141        23.27         22.60         1.34
        29.51                                 21.93                
57        33.61         33.61         0.00         142        30.34         30.60         0.51
        33.61                                 30.85                
58        11.63         12.38         1.50         143        24.71         24.81         0.19
        13.13                                 24.90                
59        26.48         26.67         0.37         144        10.99         10.78         0.43
        26.85                                 10.56                
60        27.77         27.75         0.05         145        11.63         11.49         0.29
        27.72                                 11.34                
61        30.04         30.06         0.03         146        11.51         11.67         0.32
        30.07                                 11.83                
62        29.40         28.84         1.12         147        8.75         9.08         0.65
        28.28                                 9.40                
63        11.98         11.90         0.16         148        14.72         14.54         0.37
        11.82                                 14.35                
64        11.11         10.95         0.32         149        25.61         25.24         0.75
        10.79                                 24.86                
65        10.60         10.62         0.03         150        25.66         25.61         0.10
        10.63                                 25.56                
66        10.35         10.57         0.43         151        12.08         12.24         0.32
        10.78                                 12.40                
67        11.58         11.22         0.72         152        16.49         15.96         1.07
        10.86                                 15.42                
68        10.81         10.94         0.26         153        16.42         16.35         0.14
        11.07                                 16.28                
69        11.54         11.53         0.03         154        8.49         8.43         0.13
        11.51                                 8.36                
70        11.00         11.03         0.06         155        13.31         12.86         0.91
        11.06                                 12.40                
71        11.06         11.03         0.06         156        8.28         8.42         0.27
        11.00                                 8.55                
72        29.15         29.29         0.27         157        11.10         11.78         1.35
        29.42                                 12.45                
73        24.24         24.44         0.40         158        18.47         18.37         0.21
        24.64                                 18.26                
74        23.89         24.13         0.47         159        8.31         9.11         1.60
        24.36                                 9.91                
75        30.17         30.26         0.18         160        22.06         22.10         0.08
        30.35                                 22.14                
76        29.56         29.52         0.08         161        18.86         19.27         0.82
        29.48                                 19.68                
77        27.05         27.47         0.83         162        15.54         15.54         0.00
        27.88                                 15.54                
78        33.97         33.85         0.24         163        14.91         15.31         0.80
        33.73                                 15.71                
79        32.30         32.19         0.22         164        21.63         21.43         0.40
        32.08                                 21.23                
80        30.35         30.36         0.02         165        22.62         22.37         0.51
        30.37                                 22.11                
81        12.63         12.19         0.88         166        22.54         22.50         0.08
        11.75                                 22.46                
82        32.65         32.63         0.05         167        13.91         13.81         0.21
        32.60                                 13.70                
83        18.49         19.02         1.05         168        20.01         19.84         0.35
        19.54                                 19.66                
84        17.36         17.24         0.24         169        8.73         8.92         0.37
        17.12                                 9.10                
85        16.22         16.63         0.81         170        6.89         6.85         0.08
        17.03                                 6.81                

（3）方法稳定性。取3份不同水平脂肪酸值含量的稻谷样品分别混合均匀，各分成5份，置于冷藏箱中，每次取1份进行脂肪酸值测定，在7天时间内进行5次独立测定，进行χ2分布检验，按现行标准的重复性要求进行评价，结果表明，稳定性复合现行标准的重复性实验要求。评价结果见表22。
表22  自动电位滴定仪法脂肪酸值测定
稳定性实验结果评价表
序号        脂肪酸值/( mg/100g)
        1号样        2号样        3号样
1        12.1        35        22.6
2        11.0        36.1        22.4
3        12.1        35.1        22.6
4        11.2        36.6        23.8
5        11.6        35.3        22.3
极差        1.1        1.6        1.5
CrR95(5)        2.785        2.785        2.785
平均值/mg.100g-1        11.6         35.6         22.7
标准偏差s        0.505         0.698         0.607
χ2        2.001         3.821         2.887
χ20.95(4)        9.487 7        9.487 7        9.487 7
表22显示，5组不同时间独立测定的结果满足现行标准规定的重复性要求，3个样品的5组测定结果的χ2计算值，小于在95%置信概率下的查表值9.487 7，极差也小于现行标准规定的5次重复测定的重复性临界极差2.785。
（4）方法再现性。通过比对实验考察自动电位滴定仪法测定脂肪酸值的再现性。6家实验室用不同品牌、不同型号的自动电位滴定仪对3组稻谷样品进行的比对实验，进行χ2分布检验，按现行标准的重复性要求进行评价，结果表明，再现性符合现行标准的重复性实验要求。比对评价结果见表23。
表23  自动电位滴定仪法脂肪酸值测定
比对实验结果评价表
实验室编号        脂肪酸值/( mg/100g)
        1号样        2号样        3号样
1        28.0         19.5         11.6
2        28.6         21.0         12.0
3        28.8         19.7         12.2
4        27.1         18.7         11.0
5        27.2         18.2         10.0
6        27.7         19.3         10.2
极差        1.7         2.8         2.2
CrR95(6)        2.856        2.856        2.856
平均值/mg.100g-1        27.9        19.4        11.2
标准偏差s        0.704         0.959         0.924
χ2        4.865         9.023         4.273
χ20.95(5)        11.0705        11.0705        11.0705

表23显示，不同实验室间的测定值满足现行标准规定的重复性要求，3个样品的6组测定结果的χ2计算值，小于在95%置信概率下的查表值11.070 5，极差也小于现行标准规定的6次重复测定的重复性临界极差2.856。
（5）方法准确性，与手工滴定法的一致性考察。选择脂肪酸值水平大约在10～45 mg/100g的稻谷样品12份，采用相同的样品处理方法提取样液，分别以人工和自动电位仪作为滴定终端，测定出两组脂肪酸值，采用配对T检验，考察自动电位滴定仪法与手工滴定法的测定结果之间是否存在显著性差异，配对T检验结果表明，两者无显著性差异，结果一致。分析详情见表24。
表24  自动电位滴定仪法与手工滴定法配对T检验结果分析表
样品编号        手工滴定法/mg.100g-1        电位滴定法/mg.100g-1        差值di        平均值d        标准偏差sd        td        t0.05,11
1        29.50         27.74         1.76         0.40         1.048         1.322        2.201
2        14.52         14.06         0.46                                
3        15.00         15.26         -0.26                                
4        10.89         11.46         -0.57                                
5        16.13         16.11         0.02                                
6        28.20         26.80         1.40                                
7        19.73         18.86         0.87                                
8        26.74         26.28         0.46                                
9        44.74         42.28         2.46                                
10        36.50         36.79         -0.29                                
11        32.62         33.35         -0.73                                
12        27.72         28.54         -0.82                                

（6）方法适用性。用同样的方法对玉米、小麦粉等粮食样品进行了脂肪酸值测定，表明自动电位滴定仪法测定脂肪酸值适用范围广泛，既适用于常见粮食品种稻谷、玉米、小麦粉等的脂肪酸值测定，由于终点的判定不依赖于颜色的变化，所以也适用于其他“有色”粮食的脂肪酸值测定。以玉米、小麦粉的精密度实验结果来分析方法的广泛适用性。同样采用χ2分布检验，结果分析见表25、表26。
表25自动电位滴定仪法玉米脂肪酸值测定精密度实验结果
测定次数/n        测定值/mg.100g-1        平均值        标准偏差s        χ2        χ20.95(7)        极差        CrR95(8)
1        50.79        50.52         0.351         1.695         14.067 1        1.21        3.071
2        50.35                                               
3        50.4                                               
4        49.95                                               
5        51.16                                               
6        50.42                                               
7        50.58                                               
8        50.53                                               

表26自动电位滴定仪法小麦粉脂肪酸值测定精密度实验结果
测定次数/n        测定值/mg.100g-1        平均值        标准偏差s        χ2        χ20.95(7)        极差        CrR95(8)
1        27.02        26.93         0.511         3.591         14.067 1        1.35        3.071
2        27.73                                               
3        26.83                                               
4        26.49                                               
5        27.63                                               
6        26.51                                               
7        26.38                                               
8        26.83                                               

表25、26显示，稻谷、玉米8次重复测定结果满足现行标准规定的重复性要求，χ2计算值1.695、3.591，远小于在95%置信概率下的查表值14.067 1，极差1.21、1.35也远小于现行标准规定的8次测定的重复性临界极差3.071。
（7）百里香酚蓝指示剂在电位滴定法中的适用性。分别以酚酞作为监测指示剂建立的自动电位滴定仪法、百里香酚蓝作为监测指示剂建立的自动电位滴定仪法、百里香酚蓝指示剂手工滴定法对18个样品进行脂肪酸值测定，得到3组数据，对这3组数据采用配对T检验两两进行一致性分析，考察三者之间是否存在显著性差异。三者无显著性差异，结果一致。分析详情见表27、28、29。
表27 以酚酞指示剂建立的自动电位滴定仪法与以百里香酚蓝指示剂
建立的自动电位滴定仪法测定脂肪酸值结果比较
编号        品名        百里香酚蓝指示剂自动电位滴定法
mg.100g-1        酚酞指示剂自动电位滴定法
mg.100g-1        差值di        平均值d        标准偏差sd        td        t0.05,17
1        玉米        97.75         97.50         0.25         -0.35         0.927         1.602        2.109 8
2        玉米        74.21         73.48         0.73                                
3        玉米        68.22         67.90         0.32                                
4        稻谷        36.15         37.44         -1.29                                
5        稻谷        22.73         23.02         -0.29                                
6        稻谷        40.04         39.83         0.21                                
7        小麦粉        23.76         23.79         -0.03                                
8        小麦粉        35.08         35.59         -0.51                                
9        小麦粉        45.02         46.28         -1.26                                
10        紫谷        13.57         13.41         0.16                                
11        红谷        18.65         19.38         -0.73                                
12        紫米        94.33         97.07         -2.74                                
13        红谷        23.43         23.13         0.30                                
14        红谷        21.92         21.73         0.19                                
15        稻谷        32.09         33.46         -1.37                                
16        稻谷        15.22         14.05         1.17                                
17        小麦粉        70.38         71.07         -0.69                                
18        玉米        39.08         39.87         -0.79                                

表28 以酚酞指示剂建立的自动电位滴定仪法与百里香酚蓝指示剂
手工滴定法测定脂肪酸值结果比较
编号        品名        酚酞指示剂自动电位滴定法
mg.100g-1        百里香酚蓝指示剂手工滴定法
mg.100g-1        差值di        平均值d        标准偏差sd        td        t0.05,17
1        玉米        97.50        98.63        -1.13        0.35        1.601        0.927        2.109 8
2        玉米        73.48        73.24        0.24                               
3        玉米        67.90        67.46        0.44                               
4        稻谷        37.44        35.47        1.97                               
5        稻谷        23.02        24.66        -1.64                               
6        稻谷        39.83        38.48        1.35                               
7        小麦粉        23.79        23.57        0.22                               
8        小麦粉        35.59        35.64        -0.05                               
9        小麦粉        46.28        45.42        0.86                               
10        紫谷        13.41        12.42        0.99                               
11        红谷        19.38        20.58        -1.20                               
12        紫米        97.07        91.60        5.47                               
13        红谷        23.13        23.35        -0.22                               
14        红谷        21.73        22.50        -0.77                               
15        稻谷        33.46        33.15        0.31                               
16        稻谷        14.05        15.06        -1.01                               
17        小麦粉        71.07        71.50        -0.43                               
18        玉米        39.87        39.01        0.86                               

表29 以百里香酚蓝指示剂建立的自动电位滴定仪法与百里香酚蓝指示剂
手工滴定法测定脂肪酸值结果比较

编号        品名        百里香酚蓝指示剂电位滴定法
mg.100g-1        百里香酚蓝指示剂手工滴定法
mg.100g-1        差值di        平均值d        标准偏差sd        td        t0.05,17
1        玉米        97.75         98.63         -0.88         -0.01         1.205         0.035        2.109 8
2        玉米        74.21         73.24         0.97                                
3        玉米        68.22         67.46         0.76                                
4        稻谷        36.15         35.47         0.68                                
5        稻谷        22.73         24.66         -1.93                                
6        稻谷        40.04         38.48         1.56                                
7        小麦粉        23.76         23.57         0.19                                
8        小麦粉        35.08         35.64         -0.56                                
9        小麦粉        45.02         45.42         -0.40                                
10        紫谷        13.57         12.42         1.15                                
11        红谷        18.65         20.58         -1.93                                
12        紫米        94.33         91.60         2.73                                
13        红谷        23.43         23.35         0.08                                
14        红谷        21.92         22.50         -0.58                                
15        稻谷        32.09         33.15         -1.06                                
16        稻谷        15.22         15.06         0.16                                
17        小麦粉        70.38         71.50         -1.12                                
18        玉米        39.08         39.01         0.07                                

表27显示，以酚酞和以百里香酚蓝为指示剂建立的自动电位滴定仪法测定脂肪酸值，在95%置信概率下，配对T检验的计算值td=1.602﹤t0.05,17=2.109 8，表明两种方法的测定结果之间不存在显著性差异；表28显示，以酚酞为指示剂建立的自动电位滴定仪法测定脂肪酸值与百里香酚蓝指示剂手工滴定法测定脂肪酸值，在95%置信概率下，配对T检验的计算值td=0.927﹤t0.05,17=2.109 8，表明两种方法的测定结果之间不存在显著性差异；表29显示，以百里香酚蓝为指示剂建立的自动电位滴定仪法测定脂肪酸值与百里香酚蓝指示剂手工滴定法测定脂肪酸值，在95%置信概率下，配对T检验的计算值td=0.035﹤t0.05,17=2.109 8，表明两种方法的测定结果之间不存在显著性差异。即以酚酞为指示剂建立的自动电位滴定仪法、以百里香酚蓝为指示剂建立的自动电位滴定仪法、百里香酚蓝指示剂手工滴定法测定脂肪酸值，结果一致，可以使用百里香酚蓝为指示剂建立自动电位滴定仪法。
自动电位滴定仪法从滴定模式、仪器滴定条件设置、滴定过程全过程采用百里香酚蓝指示剂进行监测，仪器仅作为滴定终端，确保了测定结果与手工滴定法“一致”。方法精密度、重复性、稳定性、再现性、适用性、准确性实验等6项方法评价指标的测试分析结果表明，自动电位滴定仪法与手工滴定法不存在显著性差异，精密度、重复性符合现行标准方法要求，再现性和稳定性实验结果符合现行标准方法重复性要求，测定结果与手工滴定法一致，方法具有更高的精密度、稳定性、准确性，测定不受特定仪器、特定实验室以及人为因素的影响，能满足稻谷、玉米、小麦粉等粮食的脂肪酸值测定要求。
4.4.3 百里香酚蓝指示剂自动光度滴定仪法
从方法精密度、重复性、稳定性、再现性、适用性等多个维度研究自动光度滴定仪法，并与自动电位滴定仪法进行比较，考察不同方法之间的一致性。
（1）方法精密度。从空白精密度、样品精密度两个方面进行考察，数据显示，方法具有良好的精密度。评价数据见表30、表31。
表30 自动光度滴定仪法脂肪酸值测定
空白精密度实验分析表
滴定体积（mL）        平均体积（mL）        极差（mL）        标准偏差        相对标准偏差（%）
0.443         0.453         0.136         0.043         9.583
0.398                                
0.410                                
0.480                                
0.477                                
0.440                                
0.534                                
0.440                                

表31 自动光度滴定仪法稻谷脂肪酸值测定精密度实验
χ2分布检验评价表
测定次数        测定值/mg.100g-1        平均值/mg.100g-1        标准偏差s        χ2        χ20.95(7)        极差        CrR95(8)
1        26.28         25.50         0.538        3.974        14.067 1        1.57         3.071
2        25.40                                                
3        25.08                                                
4        25.90                                                
5        24.71                                                
6        25.53                                                
7        26.02                                                
8        25.08                                                

表30、31显示，空白滴定变异系数小于10，样品8次重复测定的χ2分布值3.974，远小于在95%置信概率下的查表值χ20.95(7)=14.067 1，极差1.57也远小于现行标准规定的8次重复测定的重复性临界极差CrR95(8)=3.071。
（2）方法重复性。对160份稻谷样品进行的平行实验显示，误差0.0～1.91 mgKOH/100 g，符合现行标准方法规定的平行实验误差不大于2.0 mg/100 g的要求，其中：129份样品误差在1.0 mgKOH/100g以内，占80.6%；31份样品误差在1.0 ～2.0mgKOH/100g，占19.4%。该批量重复性实验结果表明，自动光度滴定仪法测定脂肪酸值，重复性符合现行标准方法规定，测定范围宽。结果评价见表32。
表32 自动光度滴定仪法脂肪酸值测定重复性实验结果表
编号        测定值
/mg.100g-1        平均值
/mg.100g-1        差值        编号        测定值
/mg.100g-1        平均值
/mg.100g-1        差值
1        28.53        28.9        0.83         81        17.27        17.1        0.43
        29.36                                16.84               
2        28.03        28.6        1.11         82        19.45        18.8        1.30
        29.14                                18.15               
3        28.62        28.9        0.62         83        17.42        17.5        0.26
        29.24                                17.68               
4        36.12        35.4        1.41         84        17.44        17.6        0.34
        34.71                                17.78               
5        23.92        24        0.15         85        20.62        20.2        0.85
        24.07                                19.77               
6        22.17        22.6        0.96         86        17.15        16.9        0.60
        23.13                                16.55               
7        23.07        23        0.21         87        19.1        19.1        0.00
        22.86                                19.1               
8        25.39        25.2        0.47         88        20.28        20.5        0.40
        24.92                                20.68               
9        25.29        25.2        0.20         89        18.37        18.3        0.20
        25.09                                18.17               
10        31.96        32.3        0.60         90        20.67        20.7        0.00
        32.56                                20.67               
11        31.96        32.7        1.48         91        19.9        20.1        0.38
        33.44                                20.28               
12        33.78        33.6        0.26         92        22.21        22        0.39
        33.52                                21.82               
13        28.02        28.4        0.82         93        16.29        16.1        0.30
        28.84                                15.99               
14        27.23        27.2        0.12         94        14.9        15.4        1.06
        27.11                                15.96               
15        28.4        27.6        1.54         95        16.9        16.6        0.56
        26.86                                16.34               
16        31        31        0.00         96        18.9        18.6        0.57
        31                                18.33               
17        30.03        30.9        1.79         97        22.02        21.5        0.96
        31.82                                21.06               
18        9.44        9.5        0.18         98        16.92        16.8        0.32
        9.62                                16.6               
19        9.21        9.3        0.27         99        19.88        19.7        0.29
        9.48                                19.59               
20        9.41        9.5        0.18         100        16.55        16.8        0.47
        9.59                                17.02               
21        27.84        27.5        0.72         101        9.34        9.4        0.20
        27.12                                9.54               
22        23.21        23.9        1.31         102        8.97        9.2        0.47
        24.52                                9.44               
23        27.49        27.3        0.35         103        9.15        9.2        0.04
        27.14                                9.19               
24        10.94        10.8        0.32         104        17.36        17.5        0.28
        10.62                                17.64               
25        10.05        10.5        0.93         105        16.22        16.4        0.33
        10.98                                16.55               
26        9.41        9.4        0.02         106        15.28        15.9        1.18
        9.43                                16.46               
27        9.16        9.5        0.66         107        11.7        12.1        0.85
        9.82                                12.55               
28        10.69        10.5        0.44         108        11.77        11.9        0.28
        10.25                                12.05               
29        14.45        14.5        0.08         109        11.65        11.9        0.50
        14.53                                12.15               
30        11.33        11.5        0.32         110        12.77        13.1        0.59
        11.65                                13.36               
31        11.62        11        1.20         111        10.6        10.9        0.60
        10.42                                11.2               
32        11.67        11.9        0.54         112        11.41        11.3        0.14
        12.21                                11.27               
33        28.18        27.3        1.83         113        17.85        18.3        0.92
        26.35                                18.77               
34        26.45        26.9        0.87         114        20.14        20.4        0.43
        27.32                                20.57               
35        25.66        25.6        0.03         115        20.11        20.7        1.22
        25.63                                21.33               
36        23.36        23.2        0.24         116        21.96        22.3        0.60
        23.12                                22.56               
37        24.62        24.2        0.78         117        18.54        18.5        0.05
        23.84                                18.49               
38        26.87        27.8        1.87         118        17.29        16.3        1.91
        28.74                                15.38               
39        32.31        31.5        1.57         119        12.66        12.3        0.76
        30.74                                11.9               
40        28        27.7        0.55         120        17.04        17.4        0.70
        27.45                                17.74               
41        29.36        29.6        0.51         121        22.15        21.9        0.54
        29.87                                21.61               
42        25.57        25.5        0.05         122        20.77        21.1        0.69
        25.52                                21.46               
43        28.41        28        0.89         123        19.32        18.9        0.81
        27.52                                18.51               
44        26.03        26.2        0.28         124        19.25        19.7        0.88
        26.31                                20.13               
45        35.03        35.3        0.58         125        18.65        18.2        0.85
        35.61                                17.8               
46        30.22        30        0.39         126        19.98        20.3        0.57
        29.83                                20.55               
47        24.8        25.4        1.17         127        19.4        19.1        0.62
        25.97                                18.78               
48        27.35        27.2        0.30         128        22.03        21.8        0.47
        27.05                                21.56               
49        25.08        25.2        0.15         129        20.29        20.6        0.60
        25.23                                20.89               
50        26.15        26.5        0.60         130        19.2        19.3        0.25
        26.75                                19.45               
51        27.97        27.8        0.39         131        20.62        21.3        1.29
        27.58                                21.91               
52        29.02        28.2        1.68         132        10.24        9.9        0.68
        27.34                                9.56               
53        31.23        30.9        0.73         133        23.47        23        0.86
        30.5                                22.61               
54        28.21        28.8        1.18         134        29.97        29.6        0.83
        29.39                                29.14               
55        33.49        32.8        1.35         135        23.52        23.6        0.23
        32.14                                23.75               
56        25.65        25.9        0.58         136        11.46        10.7        1.61
        26.23                                9.85               
57        28.74        28.8        0.17         137        11.16        10.9        0.56
        28.91                                10.6               
58        28.88        28.2        1.13         138        10.64        10.7        0.13
        27.75                                10.77               
59        11.28        11.5        0.50         139        8.43        8.7        0.61
        11.78                                9.04               
60        9.25        8.9        0.74         140        13.88        13.8        0.12
        8.51                                13.76               
61        9.22        9.1        0.32         141        23.59        24.1        1.07
        8.9                                24.66               
62        9.6        9.8        0.32         142        25.88        25.5        0.67
        9.92                                25.21               
63        9.59        9.4        0.31         143        11.9        11.8        0.16
        9.28                                11.74               
64        9.92        9.4        1.06         144        15.27        15.4        0.17
        8.86                                15.44               
65        9.54        9.2        0.58         145        8.17        7.9        0.46
        8.96                                7.71               
66        9.63        9.8        0.42         146        13.14        12.8        0.73
        10.05                                12.41               
67        9.86        9.8        0.14         147        8.57        8.4        0.24
        9.72                                8.33               
68        24.05        23.4        1.26         148        13.59        14        0.88
        22.79                                14.47               
69        29.89        29        1.82         149        17.14        17.2        0.20
        28.07                                17.34               
70        30.04        29.7        0.66         150        8.37        8.2        0.29
        29.38                                8.08               
71        24.49        25.4        1.91         151        22.99        22.6        0.83
        26.4                                22.16               
72        32.67        32        1.37         152        18.51        18.6        0.11
        31.3                                18.62               
73        31.4        31.1        0.61         153        15.48        15.3        0.34
        30.79                                15.14               
74        29.53        30.5        1.88         154        15.84        15.7        0.25
        31.41                                15.59               
75        13.3        13.3        0.07         155        20.67        21.2        0.99
        13.23                                21.66               
76        30.71        29.9        1.58         156        21.15        21.2        0.08
        29.13                                21.23               
77        20.54        20.1        0.84         157        21.46        21.6        0.37
        19.7                                21.83               
78        17.23        17.4        0.35         158        20.22        20.4        0.31
        17.58                                20.53               
79        16.13        16.3        0.32         159        7.61        7.9        0.58
        16.45                                8.19               
80        19.81        19.3        0.94         160        5.62        6.1        1.01
        18.87                                6.63               

（3）方法稳定性。取1份样品混合均匀，分成8份，置于冷藏箱中，每次取1份进行脂肪酸值测定， 10天时间内进行的8次独立测定，进行χ2分布检验，按现行标准的重复性要求进行评价，结果表明，稳定性复合现行标准的重复性实验要求。评价结果见表33。
表33  自动光度滴定仪法稻谷脂肪酸值测定
稳定性实验结果评价表
测定次数        测定值/mg.100g-1        平均值/mg.100g-1        标准偏差s        χ2        χ20.95(7)        极差        CrR95(8)
1        23.42         23.11         0.588        4.747        14.067 1        2.00         3.071
2        22.71                                                
3        23.36                                                
4        22.11                                                
5        22.99                                                
6        23.31                                                
7        24.11                                                
8        22.89                                                

（4）方法再现性。通过比对实验考察自动光度滴定仪法测定脂肪酸值的再现性。15个实验室用15台自动光度滴定仪对4组稻谷样品进行独立测定，采用χ2分布检验，按现行标准的重复性要求进行评价，结果表明，再现性符合现行标准的重复性实验要求。比对评价结果见表34。
表34  自动光度滴定仪法稻谷脂肪酸值测定比对实验结果评价表
设备编号        脂肪酸值/( mg/100g)
        1号稻谷        2号稻谷        3号稻谷        4号稻谷
1        17.0         22.1         25.7         37.3
2        18.0         22.8         25.5         38.0
3        16.6         21.5         24.9         37.0
4        18.4         23.1         26.6         38.8
5        15.6         22.7         25.5         37.4
6        16.0         23.5         23.9         36.3
7        18.2         23.4         26.0         38.5
8        17.9         21.1         26.2         38.6
9        17.8         22.8         25.9         38.2
10        17.6         21.8         25.4         38.0
11        17.3         23.6         26.6         38.1
12        18.5         23.2         26.5         39.1
13        17.6         23.0         25.9         37.4
14        17.5         23.4         25.8         38.1
15        17.7         22.9         25.2         36.7
极差        2.9         2.5         2.7         2.8
CrR95(15)        3.429        3.429        3.429        3.429
平均值        17.4         22.7         25.7         37.8
标准偏差s        0.836         0.763         0.707         0.797
χ2        19.179         15.985         13.710         17.445
χ20.95(14)        23.684 8        23.684 8        23.684 8        23.684 8

（5）方法准确性，与自动电位滴定仪法的一致性考察。对101份稻谷样品，分别用自动电位仪法和自动光度滴定仪法测定出两组脂肪酸值，采用配对T检验，考察自动电位滴定仪法与手工滴定法的测定结果之间是否存在显著性差异，配对T检验结果表明，两者无显著性差异，结果一致。分析结果见表35。
表35  自动光度滴定仪法与自动电位滴定仪法配对T检验结果分析表
序号        电位滴定法        全自动光度滴定法        方法差di        序号        电位滴定法        全自动光度滴定法        方法差di
1        27.8         28.9         -1.1         54        17.4        18.3        -0.9
2        28.1         28.6         -0.5         55        20.6        20.4        0.2
3        28.4         28.9         -0.5         56        21.4        20.7        0.7
4        35.0         35.4         -0.4         57        23.9        22.3        1.6
5        24.9         24.0         0.9         58        18.9        18.5        0.4
6        24.5         22.6         1.9         59        15.4        16.3        -0.9
7        24.6         23.0         1.6         60        10.9        12.3        -1.4
8        25.1         25.2         -0.1         61        17.7        17.4        0.3
9        23.7         25.2         -1.5         62        22.7        21.9        0.8
10        34.2         32.3         1.9         63        20.7        21.1        -0.4
11        35.0         32.7         2.3         64        17.6        18.9        -1.3
12        32.2         33.6         -1.4         65        18        19.7        -1.7
13        27.7         28.4         -0.7         66        17.6        18.2        -0.6
14        26.3         27.2         -0.9         67        18.5        20.3        -1.8
15        26.7         27.6         -0.9         68        19.6        19.1        0.5
16        28.7         31.0         -2.3         69        22.2        21.8        0.4
17        29.8         30.9         -1.1         70        20.1        20.6        -0.5
18        11.1         9.5         1.6         71        18.5        19.3        -0.8
19        10.0         9.3         0.7         72        19.9        21.3        -1.4
20        9.7         9.5         0.2         73        10.9        9.9        1
21        27.5         27.5         0.0         74        22.6        23        -0.4
22        24.5         23.9         0.6         75        30.6        29.6        1
23        28.1         27.3         0.8         76        24.8        23.6        1.2
24        10.3         10.8         -0.5         77        10.8        10.7        0.1
25        11.8         10.5         1.3         78        11.5        10.9        0.6
26        10.8         9.4         1.4         79        11.7        10.7        1
27        11.3         9.5         1.8         80        9.1        8.7        0.4
28        10.7         10.5         0.2         81        14.5        13.8        0.7
29        16.0         14.5         1.5         82        25.2        24.1        1.1
30        9.7         11.5         -1.8         83        25.6        25.5        0.1
31        10.9         11.0         -0.1         84        12.2        11.8        0.4
32        19.8         20.1         -0.3         85        16.3        15.4        0.9
33        24.2         22.0         2.2         86        8.4        7.9        0.5
34        16.5         16.1         0.4         87        12.8        12.8        0
35        15.5         15.4         0.1         88        8.4        8.4        0
36        16.4         16.6         -0.2         89        11.8        14        -2.2
37        19.7         18.6         1.1         90        18.4        17.2        1.2
38        23.8         21.5         2.3         91        9.1        8.2        0.9
39        16.3         16.8         -0.5         92        22.1        22.6        -0.5
40        20.9         19.7         1.2         93        19.3        18.6        0.7
41        17.0         16.8         0.2         94        15.5        15.3        0.2
42        10.10         9.40         0.70         95        15.3        15.7        -0.4
43        10.4         9.2         1.2         96        21.4        21.2        0.2
44        9.9         9.2         0.7         97        22.4        21.2        1.2
45        15.9         17.5         -1.6         98        22.5        21.6        0.9
46        13.8         16.4         -2.6         99        19.8        20.4        -0.6
47        15.3         15.9         -0.6         100        8.9        7.9        1
48        11.7         12.1         -0.4         101        6.8        6.1        0.7
49        11.9         11.9         0.0         平均值d        0.16
50        12.6         11.9         0.7         标准偏差sd        1.069
51        15.0         13.1         1.9         td        1.532
52        10.4         10.9         -0.5         t0.05,100        1.984
53        11.8         11.3         0.5         　        　        　        　

（6）方法适用性。以玉米、小麦粉的重复性和准确性实验结果来分析方法的广泛适用性。
精密度实验。分别选择玉米样品、小麦粉样品各1份进行8次重复测定，对测定结果实施χ2分布检验，测定结果及分析见表36、表37。
表36 玉米脂肪酸值测定精密度实验结果分析表
测定次数        测定值mg/100g        平均值mg/00g        标准偏差s        χ2        χ20.95(7)        极差        CrR95(8)
1        31.95        32.53         0.628         5.415         14.067 1        1.52        3.071
2        33.19                                               
3        33.42                                               
4        32.24                                               
5        32.17                                               
6        31.9                                               
7        33.19                                               
8        32.14                                               

表37 小麦粉脂肪酸值测定精密度实验结果分析表
测定次数        测定值mg/100g        平均值mg/100g        标准偏差s        χ2        χ20.95(7)        极差        CrR95(8)
1        39.17        39.24         0.625         5.364         14.067 1        1.97        3.071
2        39.17                                               
3        37.82                                               
4        39.52                                               
5        39.15                                               
6        39.55                                               
7        39.79                                               
8        39.71                                               

表36、表37显示，玉米、小麦粉的计算χ2值分别为5.415、5.364，远小于在95%置信概率下的查表值χ20.95(7)=14.067 1；极差分别为1.52、1.97，远小于现行标准规定的8次重复测定的重复性临界极差3.071。表明，全自动光度滴定法测定玉米、小麦粉的脂肪酸值的精密度符合现行标准的重复性要求。
准确性实验。分别选择玉米样品、小麦粉样品各12份，以全自动光度滴定仪法和自动电位滴定仪法各测得12组脂肪酸值，采用配对T检验，考察全自动光度滴定仪法和自动电位滴定仪法的测定结果之间是否存在显著性差异。脂肪酸值测定值及配对T检验结果见表38、表39。
表38 玉米全自动光度滴定仪法与自动电位滴定仪法
测定结果比较      mg/100g
样品编号        电位滴定法        全自动光度滴定法        差值di        平均值d        标准偏差sd        td        t0.05,11
1        31.39         31.38         0.01         -0.36         2.223         0.561         2.201 0
2        47.94         49.65         -1.71                                
3        41.89         41.41         0.49                                
4        38.79         40.05         -1.26                                
5        65.34         68.65         -3.30                                
6        40.63         41.80         -1.16                                
7        48.70         49.93         -1.24                                
8        63.26         62.62         0.63                                
9        33.07         32.22         0.86                                
10        50.97         46.48         4.49                                
11        34.19         37.88         -3.70                                
12        40.08         38.53         1.55                                

表39 小麦粉全自动光度滴定仪法与自动电位滴定仪法
测定结果比较     mg/100g
编号        电位滴定法        全自动光度滴定法        差值di        平均值d        标准偏差sd        td        t0.05,11
1         16.50         15.69         0.81         0.016         0.701         0.079 1         2.201 0
2         18.71         18.24         0.47                                
3         27.79         27.51         0.27                                
4         32.05         31.36         0.69                                
5         39.84         40.14         -0.30                                
6         58.30         57.83         0.47                                
7         103.85         105.31         -1.46                                
8         28.24         28.32         -0.08                                
9         24.00         23.60         0.39                                
10         56.60         57.57         -0.97                                
11         57.65         58.29         -0.64                                
12         23.17         23.03         0.14                                

表38、表39显示，在95%置信概率下，玉米、小麦粉配对T检验的计算值td分别为0.561、0.0791，远小于查表值t0.05,11=2.201 0。表明，全自动光度滴定仪法测定玉米、小麦粉的脂肪酸值与电位滴定仪法测定结果之间不存在显著性差异，全自动光度滴定仪法与自动电位滴定仪法测定结果一致。
再现性实验。15个实验室用15台自动光度滴定仪对4组玉米样品进行独立测定，采用χ2分布检验，按现行标准的重复性要求进行评价，结果表明，玉米样品的再现性符合现行标准的重复性实验要求。比对评价结果见表40。
表40 自动光度滴定仪法稻谷脂肪酸值测定比对实验结果评价表
设备编号        脂肪酸值/( mg/100g)
        1号玉米        2号玉米        3号玉米        4号玉米
1        36.5         41.2         53.9         66.5
2        35.8         43.5         54.1         65.3
3        36.1         43.1         54.0         66.2
4        37.1         43.2         54.0         65.4
5        37.7         42.9         53.8         67.9
6        37.7         42.5         55.4         66.6
7        36.5         42.1         54.0         65.3
8        37.0         43.6         54.0         66.3
9        36.9         43.0         54.3         66.7
10        37.5         44.2         55.7         67.4
11        36.8         43.8         56.1         68.0
12        37.5         43.6         54.7         67.4
13        37.1         43.2         55.3         66.3
14        36.9         44.0         55.1         67.2
15        36.7         43.5         54.9         66.4
极差        1.9         3.0         2.3         2.7
平均值        36.9         43.2         54.6         66.6
标准偏差s        0.554         0.771         0.749         0.866
χ2        8.443         16.312         15.387         20.615
χ20.95(14)        23.684 8        23.684 8        23.684 8        23.684 8

方法精密度、重复性、稳定性、再现性、适用性、准确性实验等6项方法评价指标的测试分析结果表明，全自动光度滴定仪法与自动电位滴定仪法不存在显著性差异，精密度符合现行标准方法要求，再现性和稳定性实验结果符合现行标准方法重复性要求。方法适用于稻谷、玉米、小麦粉等粮食的脂肪酸值测定，测定结果与自动电位滴定仪法一致，方法稳定可靠，能满足稻谷、玉米、小麦粉等粮食的脂肪酸值测定要求。
4.4.4 酚酞指示剂图像分析滴定仪法
从精密度、稳定性、一致性、准确性四个方面考察图像分析滴定仪法，并考察了使用水溶剂标准滴定溶液替代95%乙醇溶剂标准滴定溶液的可行性。
    （1）方法精密度。选择稻谷、玉米样品，分别进行6次重复性试验，检测结果采用χ2分布检验，考察图像分析滴定仪法测定稻谷、玉米脂肪酸值结果重复性是否符合现行标准方法的重复性要求，分析结果见表41、42。
表41 图像分析滴定仪法稻谷脂肪酸值测定精密度实验
χ2分布检验评价表
测定次数/n        测定值/mg.100g-1        平均值/mg.100g-1        标准偏差s        χ2        χ20.95(5)        极差        CrR95(6)
1        33.56         34.21        0.599        3.519        11.070 5        1.74        2.856
2        33.78                                                
3        34.21                                                
4        35.30                                                
5        34.21                                                
6        34.21                                                

表42 图像分析滴定仪法玉米脂肪酸值测定精密度实验
χ2分布检验评价表
测定次数/n        测定值/mg.100g-1        平均值/mg.100g-1        标准偏差s        χ2        χ20.95(5)        极差        CrR95(6)
1        67.14         68.26        0.689        4.656        11.070 5        1.94        2.856
2        67.79                                                
3        68.44                                                
4        68.66                                                
5        68.44                                                
6        69.08                                                

表41、42显示，稻谷、玉米6次重复测定的χ2分布值3.519、4.656，远小于在95%置信概率下的查表值χ20.95(5)=11.070 5，极差1.74、1.94也远小于现行标准规定的6次重复测定的重复性临界极差CrR95(6)=2.856，即图像分析滴定仪法的精密度符合现行标准方法的重复性要求。
（2）方法稳定性。选择3个样品，每隔1小时测定一次脂肪酸值，考察方法的稳定性。对同一样品液连续测定12次，得到3组数据，采用χ2检验，分析结果表明方法的稳定性符合现行标准的重复性要求，分析结果见表43。
表43 图像分析滴定仪法测定脂肪酸值稳定性实验
χ2分布检验评价表
序号        脂肪酸值/mg.100g-1
        1号样        2号样        3号样
1        53.17         31.34         36.48
2        53.17         31.34         35.10
3        53.63         30.95         35.56
4        52.59         32.11         36.82
5        52.30         30.49         36.71
6        52.36         30.61         36.25
7        52.36         31.18         35.44
8        52.82         32.22         34.64
9        52.82         31.64         35.33
10        52.36         30.80         36.94
11        53.05         30.95         36.59
12        53.74         31.18         36.25
极差        1.33         1.62         1.72
CrR95(12)        3.284         3.284         3.284
平均值        52.97         31.25         36.13
标准偏差s        0.499         0.541         0.761
Χ2        5.373         6.315         12.496
Χ20.95(11)        19.6751        19.6751        19.6751

（3）方法一致性。以3台滴定仪对样品的同一提取液测定脂肪酸值，分别测定11个样品的脂肪酸值，滴定仪间的极差在0.21～1.60之间，即不同滴定仪间的偏差不大于现行标准方法的平行试验允许误差，详见表44。
表44 图像分析滴定仪法测定脂肪酸值方法一致性评价表
序号        品名        滴定仪1测定值mg.100g-1        滴定仪2测定值mg.100g-1        滴定仪3测定值mg.100g-1        极差
1        稻谷1        22.36         20.91         21.93         1.45
2        稻谷2        13.45         14.32         13.82         0.87
3        稻谷3        20.00         19.81         18.51         1.49
4        稻谷4        32.61         31.01         32.07         1.60
5        稻谷5        40.20         40.91         41.08         0.88
6        玉米1        54.36         54.35         53.45         0.91
7        玉米2        49.36         50.12         49.95         0.76
8        玉米3        41.10         40.69         40.36         0.74
9        玉米4        76.92         76.85         77.93         1.08
10        大米        11.97         11.51         11.98         0.47
11        玉米粉        5.69         5.80         5.59         0.21

（4）方法准确性。选择6个样品，分别用图像分析仪法与手工滴定法测定脂肪酸值，采用采用配对T检验，考察图像分析仪法的测定结果与手工滴定法的测定结果之间是否存在显著性差异，分析结果见表45。
表45 图像分析仪法与手工滴定法脂肪酸值测定结果比较
序号        品名        图像分析仪法mg.100g-1        手工滴定法mg.100g-1        差值di        均值d        标准偏差sd        td        t0.05,5
1        稻谷        20.19         19.17         1.02         0.45         0.573         1.924         2.570 6
2        稻谷        33.47         32.39         1.08                                
3        稻谷        34.98         34.91         0.07                                
4        玉米        38.21         37.44         0.77                                
5        玉米        68.77         68.92         -0.15                                
6        玉米        100.61         100.72         -0.11                                
上表显示，两种方法无显著性差异，结果一致。
（5）水溶剂标准滴定溶液替代95%乙醇溶剂标准滴定溶液的可行性。使用图像分析仪法分别用水溶剂标准滴定溶液和95%乙醇溶剂标准滴定溶液测定稻谷、玉米的脂肪酸值，考察测定结果之间是否存在显著性差异，测定级分析结果见表46。
表46 水溶剂与95%乙醇溶剂氢氧化钾标准滴定溶液测定结果比较
编号        品名        水溶剂标准滴定溶液mg.100g-1        乙醇溶剂标准滴定溶液mg.100g-1        差值di        均值d        标准偏差sd        td        t0.05,9
1        稻谷        19.10         18.30         0.80         -0.51         0.749         2.153         2.262 2
2        稻谷        18.90         19.10         -0.20                                
3        稻谷        23.70         25.00         -1.30                                
4        稻谷        26.30         28.00         -1.70                                
5        稻谷        28.00         28.70         -0.70                                
6        玉米        44.10         43.90         0.20                                
7        玉米        45.90         45.90         0.00                                
8        玉米        50.20         51.30         -1.10                                
9        玉米        54.30         55.00         -0.70                                
10        玉米        57.40         57.80         -0.40                                
上表显示，使用两种标准滴定溶液测定脂肪酸值，结果之间不存在显著性差异，即图像分析仪法可以用水溶剂标准滴定溶液替代95%乙醇溶剂标准滴定溶液测定脂肪酸值。
方法精密度、稳定性、一致性、准确性等评价指标的测试分析结果表明，酚酞指示剂图像分析滴定仪法与手工滴定法之间不存在显著性差异，精密度符合现行标准方法要求，稳定性实验结果符合现行标准方法重复性要求，方法具有良好的一致性，水溶剂标准滴定溶液与95%乙醇溶剂标准滴定溶液的测定比较显示，用水溶剂标准滴定溶液替代95%乙醇溶剂标准滴定溶液是可行的，方法能满足稻谷、玉米等粮食的脂肪酸值测定要求。
5 其他需要说明的问题
无

《粮油检验 谷物及制品脂肪酸值的测定》国家标准起草组
                       2020年7月