大黄真伪鉴定与质量控制方法研究进展

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大黄真伪鉴定与质量控制方法研究进展Δ

摘 要 目的：为大黄的临床用药安全、真伪鉴别提供参考。方法：以“大黄”“唐古特大黄”“掌叶大黄”“药用大黄”“大黄属”“酸模属”“鉴 定”“质量 控制”“质量 评价”“安全 性评价”“Rhei Radix et Rhizoma”“Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.”“Rheum palmatum L.”“Rheum officinale Baill.”“Rheum”“Rumex”“Rhubarb”“Identification”“Quality control”“Quality evaluation”“Safety evaluation”等为关键词，在中国知网、万方数据、维普网、ScienceDirect、PubMed、Web of Science等数据库中单独或组合查询1999年1月－2019年1月发表的相关文献，对大黄的真伪鉴定、质量控制与评价方法作一综述。结果与结论：共检索到相关文献4 223篇，其中有效文献57篇。大黄真伪鉴定方法主要有性状鉴别、显微鉴别、薄层色谱鉴别、分子鉴别等方法，性状、显微、薄层色谱鉴别方法均具有简便、快速、不依赖仪器设备、成本低廉等优点，其不足之处在于性状鉴别和显微鉴别结果客观性偏弱，薄层色谱鉴别对掺伪样品的鉴别能力较弱；分子鉴别虽技术水平高、准确性及客观性强、适用性广，但如何降低其检测成本、简化操作是亟须解决的问题；质量控制方法主要有光谱测定技术、色谱及色谱-质谱联用技术、毛细管电泳技术、一测多评技术、指纹图谱技术、免疫检测技术等，色谱法、色谱-质谱联用法、毛细管电泳技术、一测多评技术、免疫检测法等均是以1种或少数几种中药有效成分为出发点而建立的质量评价方法，方法准确可靠、科学性强，但较光谱法和指纹图谱法等以成分群或药材整体来评价药材质量的方法则略显片面；安全性评价主要包括电感耦合技术测定重金属含量，以气相色谱法测定农药残留。
关键词 大黄；鉴定；质量控制；质量评价；安全性评价
大黄（Rhei Radix et Rhizoma）为蓼科植物掌叶大黄（Rheum palmatum L.）、唐古特大黄（R.tanguticum Maxim.ex Balf.）或药用大黄（R.officinale Baill.）的干燥根和根茎，是我国传统四大中药之一。大黄具有泻下、抗菌、抗炎、降脂、保肝、利胆、利尿、抗凝血、抗氧化、抗肿瘤、预防慢性肾衰竭、治疗肥胖性疾病等多种药理作用，临床应用十分广泛[1]。
大黄具有重要的药用价值和经济价值，市场流通量大，且属于出口较多的大宗药材之一。但由于大黄为多基源植物，且与同属和酸模属多种植物在性状及显微特征上较为相似，致使当前市场上大黄的品种混乱且有部分伪品出现。此外，大黄多为人工栽培，栽培环境差异、生长年限不同、原植物品种不同等多种因素亦导致其质量参差不齐[2]。大黄主要含有蒽醌类、蒽酮类、鞣质类、二苯乙烯类、苯丁酮类、有机酸类及多糖类等多种化学成分[3]，其中我国药典以蒽醌类成分总量作为大黄质量评价指标，而日本药典及韩国药典则以番泻苷A作为质量评价指标性成分[4-6]。大黄国际间的质量评价标准不一致，给大黄药材的国际贸易带来较多不便。为此，本研究以“大黄”“唐古特大黄”“掌叶大黄”“药用大黄”“大黄属”“酸模属”“鉴定”“质量控制”“质量评价”“安全性评价”“Rhei Radix et Rhizoma”“Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.”“Rheum palmatum L.”“Rheum officinale Baill.”“Rheum”“Rumex”“Rhubarb”“Identification”“Quality control”“Quality evaluation”“Safety evaluation”等为关键词，在中国知网、万方数据、维普网、ScienceDirect、PubMed、Web of Science等数据库中单独或组合查询1999年1月－2019年1月发表的相关文献。结果，共检索到相关文献4 223篇，其中有效文献57篇。现对大黄的真伪鉴定、质量控制与评价方法作一综述，旨在为大黄的临床用药安全、真伪鉴别提供参考。
1 真伪鉴定
大黄为多来源药用植物，包括掌叶大黄、药用大黄和唐古特大黄。除此三者之外，蓼科大黄属及酸模属多种植物与大黄相似，在个别地区存在被误用的情况，其中包括蓼科植物如河套大黄（R.hotaoense C.Y.Cheng et Kao）、华北大黄（R.franzenbachii Munt.）、藏边大黄（R.emodii Wall.）和疏枝大黄（R.spiciforme Royle）以及酸模属植物如尼泊尔酸模（Rumex nepalensis S.）、羊蹄（R.japonicas Houtt.）、巴天酸模（R.patientis L.）、齿果酸模（R.dentatus L.）、长刺酸模（R.maritimus L.）、钝叶酸模（R.obtusifolius L.）等，以上10种植物的干燥根及根茎均为伪品大黄[7-8]。对于大黄及其伪品可通过性状鉴别、显微鉴别、薄层色谱（TLC）鉴别及分子鉴别等手段进行鉴定。
1.1 性状鉴别
性状鉴别是对药材的多种外在特征进行直接观察，以区分药材真伪优劣。3种正品大黄和10种常见伪品大黄在性状上的区别[9-11]见表1。由表1可见，大黄与伪品大黄在表面颜色、有无星点及气味强弱等方面均具有一定差异：正品大黄表面呈黄棕色至红棕色，断面呈淡红棕色或黄棕色，根茎髓部有星点、具清香气味；而伪品大黄表面颜色较深，多为黄灰色、棕灰色或棕褐色，断面无星点，香气微弱。性状鉴别具有简便易行、鉴别快速的特点，但准确率及客观性不佳；再者因栽培地区气候、水文、地形等自然环境因素、原植物种类及栽培技术的不同，大黄的性状也存在一定差异，给性状鉴别增加了一定难度[12]。
表1 大黄及其常见伪品的性状鉴别特征

表2 大黄及其常见伪品的显微鉴别特征

1.2 显微鉴别
显微鉴别是采用显微镜观察中药材内部组织构造、细胞及细胞内含物的形态特征来鉴定中药材的方法，相对简便、快速。大量学者采用显微鉴别的方法对正品大黄和伪品大黄进行了鉴别[7-12]，本研究就上述10种常见的伪品大黄和3种正品大黄的显微特征进行了总结与对比，详见表2。
此外，丁宁等[13]将草酸钙簇晶棱角（晶瓣外缘角）的角度值作为中药显微鉴定的新参数进行研究，其采用显微观察和拍摄技术获取中药大黄的草酸钙簇晶图像，并测量其簇晶棱角的角度值，统计分析结果显示，大黄的草酸钙簇晶棱角的平均角度值为63.04，与其他药材的簇晶角度有显著性差异（P＜0.05），可作为大黄显微鉴定新的参考依据。
1.3 TLC鉴别
TLC是进行中药鉴定的一种常用方法和重要技术，准确性和专属性较强。2015年版《中国药典》（一部）收录了以土大黄苷为鉴别指标的TLC鉴别方法，展开剂为石油醚（30～60Ⅱ）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1，V/V/V）的上层溶液[3]。为获得更好的检测效果，尚磊[14]以土大黄苷为检测指标，对提取溶剂、提取方法、薄层展开剂进行了优化，最终确定提取溶剂为甲醇，以超声波提取作为供试品溶液制备方法、以苯-甲酸乙酯-甲酸-甲醇（30∶10∶0.1∶15，V/V/V/V）为展开剂，用于河套大黄和华北大黄2种伪品与正品大黄饮片的区分，效果较好；该研究还对10批市售大黄饮片进行了检测，结果发现其中50%有土大黄苷成分，说明市售药材伪品较多。
1.4 分子鉴定
随着分子生物学的快速发展，分子标记技术已成为中药学研究的一项新的技术手段。DNA分子标记技术是目前中药分子鉴定的主要形式，为中药四大鉴定（基源鉴定、性状鉴别、显微鉴别和理化鉴别）方法的重要补充。
费凌云[15]采用ITS2碱基序列对中药大黄及其易混伪品（土大黄、虎杖）原植物进行鉴定，通过对3种药材rDNA中ITS2碱基序列的扩增及分析，成功区分了大黄与土大黄、虎杖。费烨等[16]采用matK基因序列分析技术对高山大黄进行了分子鉴定研究，结果表明高山大黄（R.nobile Hook.f.et Thoms）matK基因序列的特异性位点与掌叶组和波叶组大黄存在显著差异。张晓芹等[17]通过对大黄正品基源及常用混淆品药材matK基因序列的差异分析，总结了大黄正品基源与混淆品的基因型对应规律，成功鉴别了混淆品与正品的基源，实现了对大黄药材基源品种的鉴定。姬可平等[18]对大黄种子DNA中rRNA基因内转录间隔区进行了扩增和测序，其应用rRNA基因间隔区碱基序列分析成功实现了对大黄的鉴定。
2 质量控制
2015年版《中国药典》（一部）采用高效液相色谱（HPLC）法，以5种蒽醌类成分的总量（不得少于1.5%）及游离蒽醌的总量（不得少于0.20%）作为含量测定指标用于中药大黄的质量控制[3]。日本药典与韩国药典亦采用HPLC法，区别在于以“番泻苷A含量不得低于0.25%”作为大黄质量控制标准。除HPLC法之外，光谱测定技术[如紫外分光光度法、荧光光谱法、近红外光谱（NIR）法]、色谱及色谱-质谱联用技术（如HPLC-MS）、毛细管电泳技术（CE）、一测多评技术（QAMS）、指纹图谱技术、免疫检测技术等也被广泛应用于大黄的质量控制。
2.1 紫外分光光度法
在中药成分的含量测定研究中，光谱法具有专属性强、灵敏、准确、快速等优势。比色法是大黄中总蒽醌、鞣质和多糖含量测定的常用方法之一。魏江存等[19]以大黄素为对照品，1%醋酸镁甲醇溶液为显色剂，用紫外分光光度法对生大黄和醋大黄中总蒽醌的含量进行了测定，揭示了大黄炮制前后总蒽醌的含量变化。郭东艳等[20]采用紫外分光光度法测定了大黄炮制前后（即生药与炭药）的鞣质含量，以磷钼钨为显色剂，干酪素为鞣质吸附剂，没食子酸为对照品，在760 nm波长处测定其吸光度，计算鞣质含量。结果表明，与生药相比，炮制后鞣质含量均有不同程度的降低，该法适用于大黄及其炮制品中鞣质含量的测定。对于大黄中多糖含量的测定，何杏等[21]采用水提醇沉法提取大黄多糖，以葡萄糖为对照品，提取物以硫酸-苯酚显色后用紫外分光光度计测定吸光度，可实现对大黄中多糖的快速、准确定量分析。
2.2 荧光光谱法
大黄中的蒽醌类、鞣质类、芦荟苷类等物质多具有荧光特性，可采用荧光分光光度法对其进行含量测定。于建玉等[22]分别测定了大黄酸和大黄素的荧光光谱，结果表明荧光光谱可准确、清晰地对大黄成分进行测定，测定结果可作为药材评价的参考。李申丽[23]研究了大黄酚、大黄素甲醚的荧光光谱，建立了直接用溶液荧光法测定大黄中芦荟大黄素的分析方法，更为快速、便捷。
2.3 NIR法
NIR技术是近年来新兴的一种绿色分析技术，具有高效、简便、无损、环保等优点。耿炤等[24]通过声光可调滤光器-NIR仪对大黄乙醇提取液比重（密度）及大黄素含量进行在线分析，并采用偏最小二乘法分别建立了NIR与含量、比重（密度）的校正模型。结果，其建立的大黄乙醇提取液NIR校正模型，完成1次比重和含量的测定只需2 min，大大缩短了测定时间。于晓辉等[25]采用NIR和径向基函数神经网络对大黄样品中4类有效成分（蒽醌及其单糖苷类、水溶性蒽苷类、芪苷类、鞣质）的含量进行了定量预测，结果表明该法作为中药材复杂体系中化学组分定量测定的方法，可同时对多种组分进行检测。范积平等[26]通过HPLC法测定了3个不同产地大黄中大黄素、大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素的含量，用41个样品建立了NIR法校正方程，并预测了大黄样品中各上述活性成分的含量，结果其建立的大黄蒽醌类化合物含量测定方法可实现对大黄指标性成分含量的定量分析，且简便、快速。
2.4 HPLC法
HPLC法具有灵敏度、准确度、精密度和自动化程序高、重现性好的特点，是近年来大黄分析研究中应用最广泛的检测方法。刘远平等[27]采用HPLC法对四川、陕西、云南三地产药用大黄中大黄素、大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚等5种游离蒽醌类成分的含量进行测定，以评价不同产地药用大黄的质量。结果，四川产药用大黄的大黄酸、大黄酚和芦荟大黄素的含量比云南与陕西的高，云南产的芦荟大黄素与大黄素的含量较高，该法可为大黄药材在实际生产和临床应用中的选择提供参考。
程小丽等[28]采用Agilent Zorbax SB-C18色谱柱，以0.05%磷酸-水-乙腈为流动相梯度洗脱、柱温40Ⅱ、检测波长280 nm、检测时间100 min为色谱条件，建立了反相高效液相色谱-二级管阵列检测器（RP-HPLC-DAD）法以同时测定大黄中9种有效成分含量的方法，其中包括5种游离蒽醌类成分、番泻苷A和B、没食子酸及儿茶素等。该方法重复性好、结果准确，为以蒽醌类成分和番泻苷A为指标的大黄质量评价方法提供了新的手段。
2.5 液-质联用（LC-MS）法
LC-MS是一种以液相色谱作为分离系统、质谱作为检测系统的分析技术，具有高灵敏度、高选择性、高稳定性及高通量的特点，特别适合于中药复杂成分及其代谢物的定性定量分析。蒋海强等[29]采用HPLC-MS技术对大黄的主要化学成分进行了分离鉴定与结构解析，结果共鉴别出25种化学成分，主要是鞣质类、蒽醌及其苷类化合物，表明HPLC-MS法可作为中药大黄化学成分的鉴定方法。王晴等[30]采用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MSE）结合诊断离子过滤法对掌叶大黄中的酚类成分进行了快速分析鉴定，结果共鉴定出63个成分，其中包括36个简单酚酸类化合物、8个类黄酮类化合物和19个鞣质类化合物，其中6个为潜在的新化合物，进一步完善了大黄的药效物质基础信息。
2.6 CE法
CE法拥有电泳和色谱技术的双重优点，且具有分离快速、效率高、进样体积小、灵敏性高、成本低等特点。曾雪等[31]采用CE法分离测定了大黄提取物中大黄素、大黄酚和大黄酸的含量，通过加入β-环糊精和调节缓冲溶液pH实现了更高的分离效率，且分析速度更快。郑文捷等[32]通过对待测组分电泳迁移行为的研究以及对待测物质分离影响因素如酸度、缓冲液浓度、聚丙烯酰胺浓度等的考察，首次建立了一种同时分离测定大黄药材及青海野生大黄茶中3种主要活性蒽醌成分大黄素、芦荟大黄素、大黄酸含量的胶束毛细管电泳方法，该法简单、快速、准确、重现性好，对于中药大黄及其冲剂中有效成分的分析和质量控制具有重要的实用价值。刘训红等[33]采用胶束电动毛细管色谱（MEKC）-DAD分离并同时测定了不同产地10批大黄及其炮制品中大黄素、大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素及大黄素甲醚的含量，该方法简单、准确，重现性好，可用于大黄饮片内在质量的评价和控制。
2.7 指纹图谱研究
中药的化学成分多样，单一或少数几个指标性成分的检测往往难以反映中药的整体质量和疗效。中药指纹图谱具有系统性、重现性和特征性等特点，能够较全面反映中药品质，现已成为国际公认的中药鉴定和质量控制的有效手段[34]。常见的指纹图谱方法为色谱指纹图谱，如HPLC指纹图谱、UPLC指纹图谱、MEKC指纹图谱、微乳电动毛细管色谱（MEEKC）指纹图谱。色谱法可使各成分的色谱峰得到有效分离，可较为全面地检测其多种成分在中药材中分布的全貌，且操作简单易行、结果准确，是目前报道的大黄指纹图谱的主要研究方法[35-42]。光谱指纹图谱包括红外光谱（IR）[43]和NIR[44-45]指纹图谱。其中，IR具有操作简便、快速无损及样品制备简单等优点，目前已广泛用于中药的定性鉴别和定量研究。电化学法如洛索夫-扎鲍京斯基化学振荡技术可用于大黄电化学指纹图谱，方法简便、可靠、快速、直观，可对不同来源大黄进行定性分析[46-47]。随着科学技术的进步以及研究的深入，各种技术的产生和应用为大黄指纹图谱的研究方法拓宽了道路，各指纹图谱的特点及应用举例详见表3。
表3 大黄指纹图谱研究

2.8 QAMS法
HPLC定量检测蒽醌类成分的分析方法多采用外标法进行分析，近年来QAMS法作为适用于中药多成分、多功效作用评价的新模式和新方法，已经越来越多地被应用于中药质量控制研究中，成为其定量评价的重要手段[48]。QAMS是利用中药有效成分之间的内在函数和比例关系，通过测定一个成分（对照品易得到）而实现多个成分（对照品难以得到或供应）的同步测定的多指标质量评价模式。QAMS是在外标法、内标法及校正因子法等分析方法的基础上发展起来的，适用于对照品不稳定或对照品成本高、制备难度大的中药材多成分质量控制，具有简单、快捷、操作成本低的优点[48]。谭玉柱等[49]采用基于QAMS的HPLC法对大黄地上部位提取物中的大黄素、大黄酚、芦荟大黄素和大黄素甲醚的含量进行测定，建立了大黄素与大黄酚、芦荟大黄素和大黄素甲醚的相对校正因子（RCF），通过测定大黄素的含量，再以RCF计算大黄酚、芦荟大黄素和大黄素甲醚的含量，并与外标法进行比较。结果，两种方法所得4种成分的含量无显著性差异（P＞0.05），表明QAMS可用于大黄地上部位提取物的质量控制。
李树翠等[50]采用QAMS法对大黄及其提取物和制剂中5种蒽醌类成分的含量进行同步测定，分别以芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚为内参物，计算大黄及其制剂中其余4种成分的含量，比较5个内参物的适用性。最终确定以大黄素作为内参物，建立其与另外4种成分的RCF；通过测定大黄素的含量，计算其余4种成分的含量，并与外标法测定结果比较，并利用相对误差来评价QAMS方法的准确度。结果，两种测定结果之间无显著性差异（P＞0.05），表明QAMS可用于大黄及其制剂中蒽醌类成分的质量评价。
2.9 免疫检测技术
近年来，免疫检测技术作为一种快速检测中药材的有效手段逐渐被应用于中药领域研究。免疫检测技术是一种利用抗原与抗体的特异性结合反应与其他显色反应相结合的定性定量检测技术，具有简便快捷、灵敏性高、特异性强、检测快速、仪器依赖性低、高通量等优点[51]。张波等[52]建立了大黄药材中大黄酸的酶联免疫吸附测定（ELISA）法，该法通过采用碳二亚胺法活化大黄酸，将其分别与牛血清白蛋白及鸡卵清白蛋白偶联制备免疫抗原及包被抗原，用免疫原免疫Bal b/c雌性小鼠制备抗血清，再利用包被抗原和抗血清建立的ELISA检测方法。该法灵敏度（IC50）达 185.82 μg/L，检测范围（IC20～IC80）为 21.99～1 569.99 μg/L。Zhang Y 等[53]以大黄酸与牛血清白蛋白的偶联物为免疫抗原，通过免疫母鸡后，从鸡蛋中分离抗体，利用量子点标记抗体后，制备了检测大黄酸的免疫层析试纸，并利用试纸条读取器建立了定量检测大黄酸的检测方法，该方法检测限为98.2 ng/mL，检测范围为80～5 000 ng/mL，为大黄药材中大黄酸的快速检测提供了有效手段。
3 安全性评价
药材质量低劣是影响中药现代化的“瓶颈”，而国际市场对无污染、绿色药材的需求，需要研究者从中药材的规范化种植入手，严格把控药材的加工运输过程，以最大程度降低外源性有害物质污染的概率。为了保证中药的用药安全，除了需要注意药材真伪和有效成分含量等问题外，对于外源性有害物质的检测与控制，如重金属超标、农药残留也是国际上十分关注的问题。
3.1 重金属检测
中药材的重金属含量控制也是保障中药质量的重要途径。目前，对大黄中重金属检测的方法主要有电感耦合等离子体质谱法、原子荧光光谱法或原子吸收光谱法。王珺等[54]采用电感耦合等离子体质谱法对20批松潘地产大黄药材中的铅、镉、汞、铜、砷等5种重金属元素含量进行测定，以评价该地区大黄药材的安全性。结果，20批大黄样品中，5种重金属元素含量均低于国家限量标准。周萍等[55]采用原子荧光光谱法测定甘肃不同产地大黄中铅、镉、砷、汞等4种重金属的含量。结果，不同产地大黄中重金属元素的含量有一定差异，但其含量均未超出国家限量标准。
3.2 农药残留检测
由于中药资源的复杂化，一些药材因不规范种植或土壤被污染而可能导致其农药残留超限，因此有必要制定合理的大黄药材中农药残留量的检测限量，以对大黄药材中农药残留量进行控制。庞作正等[56]采用顶空气相色谱法测定大黄中代森锰锌农药残留量，结果4批不同产地的大黄残留量均不超过药品中农药最大残留量的国家标准，且检测方法简便、快速、灵敏度高。欧阳晓玫等[57]采用气相色谱法测定包括大黄在内的甘肃五大宗药材中的农药残留量，结果五大宗药材中有机氯类农药残留量均符合规定。
4 结语
大黄为常用大宗药材之一，保障大黄的货真质优对大黄的临床应用及其国际贸易具有十分重要的意义。通过本综述可知：性状鉴别、显微鉴别、TLC鉴别及分子鉴别可有效实现正品大黄及其伪品的真伪鉴别，性状、显微、TLC鉴别方法均具有简便、快速、不依赖仪器设备、成本低廉等优点，其不足之处在于性状鉴别和显微鉴别结果客观性偏弱，TLC鉴别对掺伪样品的鉴别能力较弱；分子鉴别虽技术水平高、准确性及客观性强、适用性广，但如何降低其检测成本、简化操作是亟须解决的问题。性状鉴别、显微鉴别、TLC鉴别更适用于中药材交易的现场鉴别，而分子鉴别则更多应用于大黄及其混伪品的植物基源鉴定。
光谱法、色谱法、色谱-质谱联用法、CE法、指纹图谱法、QAMS法、免疫检测法等方法可以实现对大黄的质量控制与品质优劣评价；色谱法、色谱-质谱联用法、CE法、QAMS法、免疫检测法等均是以1种或少数几种中药有效成分为出发点而建立的质量评价方法，方法准确可靠、科学性强，但较光谱法和指纹图谱法等以成分群或药材整体来评价药材质量的方法则略显片面。此外，电感耦合法及气相色谱法可以分别用于大黄重金属及农药残留的安全性评价。
综上，大黄真伪优劣鉴别及质量评价方法众多，对大黄的质量保障提供了有力支撑。但对于大黄国际标准不统一的问题，笔者认为，以蒽醌类成分总量以及番泻苷A含量两类成分共同为指标性成分用于大黄质量控制更为全面，且现有报道的HPLC法可以实现对上述两种成分的同时测定。另外，随着国家大力发展中医药事业，中药的国民认可度正不断提升，中药的消费量及使用率不断提高，因此，建立适用于普通大众的简便易懂的中药鉴定与评价方法以及便于中药贸易交流的中药现场鉴定技术均具有重要的实用价值，亦是今后大黄鉴定与评价方法的研究方向。
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