柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的电磁裂解水提取工艺优化

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柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的电磁裂解水提取工艺优化Δ


摘 要 目的：建立同时测定柴胡水提液中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d含量的方法，并优化其电磁裂解水提取工艺。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为SB-C18，流动相为乙腈-水（梯度洗脱），柱温为40℃，流速为1.0 mL/min，检测波长为210 nm，进样量为10 μL。在单因素试验基础上，以提取时间、物料粒度、料液比为考察因素，柴胡皂苷a与柴胡皂苷d的总提取率为响应值，采用Box-Behnken响应面法优化其提取工艺，并与超声法和煎煮法进行比较。结果：柴胡皂苷a、柴胡皂苷d检测质量浓度的线性范围分别为 50.70～202.80 μg/mL（r＝0.999 9）、50.50～202.00 μg/mL（r＝0.999 9）；定量限分别为 0.16、0.13 μg/mL，检测限分别为0.05、0.04 μg/mL；精密度、稳定性、重复性的RSD均小于2%；加样回收率分别为98.23%～102.47%（RSD＝1.80%，n＝6）、98.84%～102.06%（RSD＝1.60%，n＝6）。最优提取工艺为以水提取1次，提取时间2.50 min、药材过80目筛、料液比1∶28（g/mL）。3次验证试验结果显示，最优工艺所得柴胡皂苷a与柴胡皂苷d的平均总提取率为8.42 mg/g，高于超声法（8.34 mg/g）和煎煮法（8.06 mg/g），且提取时间更短。结论：所建含量测定方法简便、准确，可用于同时测定柴胡水提液中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量；优化所得电磁裂解水提取的工艺稳定、可行。
关键词 柴胡；柴胡皂苷a；柴胡皂苷d；高效液相色谱法；Box-Behnken响应面法；水提取工艺；含量测定；电磁裂解
柴胡始载于《神农本草经》，为伞形科植物柴胡（Bupleurum chinense DC.）或狭叶柴胡（Bupleurum scorzonerifolium Willd.）的干燥根，被列为上品，是具有一种2 000多年药用历史的传统中药，具有和解退热、疏肝解郁、升举阳气之功效[1-2]。现代药理学研究表明，柴胡具有抗炎、抗病毒、保肝、降血脂、免疫调节等作用[3-5]，临床常用含柴胡的药物有柴胡口服液、柴胡注射液、柴胡片、柴胡滴丸等。柴胡主要含皂苷类、黄酮类、多糖类、挥发油类等成分[6-7]，其中皂苷类成分是其药效物质基础之一，主要成分柴胡皂苷a和柴胡皂苷d也是柴胡含量测定的指标性成分[7-8]。柴胡皂苷常用的提取方法有乙醇回流法、煎煮法、浸渍法、超声法等，虽然这些方法在一定程度上可满足提取要求，但存在能耗高、工艺繁琐、有效成分损失多等缺点[9-11]。电磁裂解提取法是一种新型的提取方法，具有提取时间短、提取效率高、提取产物活性强的优点，并可在常温下进行，避免了不稳定性成分受热分解[12-15]。基于此，本研究以水为提取溶剂，采用电磁裂解仪（见图1）提取了柴胡中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d；参考2015年版《中国药典》（一部）方法[16]采用高效液相色谱法（HPLC）测定了柴胡水提液中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量；通过Box-Behnken响应面法优化其提取工艺，并与超声法和煎煮法进行比较，旨在为柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的提取提供一种新的方法，为制药工业生产中绿色环保、节能减耗提取设备的研发提供参考。

图1 电磁裂解仪
Fig 1 Electromagnetic cracking equipment
注：1、3、4、6.阀门；2.电场处理器；5.粉碎机；7.可变速度循环泵
Note：1，3，4，6.valve；2.electric field processor；5.grinder；7.variable speed circulation pump
1 材料
1.1 仪器
1260型HPLC仪，包括四元梯度泵、可变波长扫描紫外检测器、自动进样器、色谱工作站（美国Agilent公司）；KQ5200DE型超声波清洗器（昆山美美超声仪器有限公司）；电磁裂解仪（长春中医药大学中药药剂实验室自制，专利号：ZL201721353456.1）；L-204型万分之一电子分析天平、AB135-S型十万分之一电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。
1.2 药品与试剂
柴胡皂苷a对照品（批号：P03M9F50593，纯度：≥98%）、柴胡皂苷d对照品（批号：Z08A8L33357，纯度：≥98%）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为超纯水。
1.3 药材
柴胡饮片（批号：171101）购于酒泉市培丰中药材生态种植加工有限公司，经长春中医药大学药学院翁丽丽教授鉴定为柴胡（B.chinense DC.）的干燥根。
2 方法与结果
2.1 柴胡水提液中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量测定
采用HPLC法测定柴胡水提液中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量[16]。
2.1.1 色谱条件色谱柱：SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～50 min，25%A→90%A；50～55 min，90%A）；柱温：40℃；流速：1.0 mL/min；检测波长：210 nm；进样量：10 μL。在该色谱条件下，各成分分离度均大于2.5，理论板数以柴胡皂苷a、柴胡皂苷d计均不低于35 000，阴性溶液对测定无干扰，详见图2。

图2 高效液相色谱图
Fig 2 HPLC chromatograms
2.1.2 混合对照品溶液的制备 取柴胡皂苷a对照品、柴胡皂苷d对照品各适量，精密称定，置于同一25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成柴胡皂苷a、柴胡皂苷d质量浓度分别为202.80、202.00 μg/mL的混合对照品溶液。
2.1.3 供试品溶液的制备 取药材样品适量，粉碎后过筛（目数参考最优工艺），精密称取300.0 g，置于电磁裂解仪中，按设定的试验条件加入一定比例的水提取，滤过，取滤液3.0 mL，60℃挥干，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，即得。
2.1.4 阴性溶液 以甲醇为阴性溶液。
2.1.5 线性关系考察 分别精密吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液2.5、4.0、5.5、7.0、8.5、10.0 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，即得柴胡皂苷a质量浓度分别为50.70、81.12、111.54、141.96、172.38、202.80 μg/mL，柴胡皂苷 d 质量浓度分别为 50.50、80.80、111.10、141.40、171.70、202.00 μg/mL的系列线性关系工作溶液。取适量，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，以质量浓度（x，μg/mL）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得柴胡皂苷a回归方程为y＝5.694 7x+6.221 4（r＝0.999 9），柴胡皂苷d回归方程为y＝5.766 9x+4.492 9（r＝0.999 9），表明柴胡皂苷a、柴胡皂苷d检测质量浓度的线性范围分别为50.70～202.80、50.50～202.00 μg/mL。
2.1.6 定量限与检测限考察 精密量取“2.1.2”项下混合对照品溶液适量，加甲醇倍比稀释，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，以信噪比10∶1、3∶1分别计算定量限、检测限。结果，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的定量限分别为0.16、0.13 μg/mL，检测限分别为0.05、0.04 μg/mL。
2.1.7 精密度试验 取“2.1.2”项下混合对照品溶液10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d峰面积的RSD分别为0.5%、0.3%（n＝6），表明仪器精密度良好。
2.1.8 稳定性试验 取“2.1.3”项下供试品溶液10 μL，分别于室温下放置0、3、6、12、24 h时按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d峰面积的RSD分别为1.1%、1.0%（n＝5），表明供试品溶液于室温下放置24 h内稳定性良好。
2.1.9 重复性试验 取药材样品粉末，共6份，每份约300.0 g，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并按标准曲线法计算样品中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量。结果，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的平均含量为2.80、3.69 mg/g，RSD分别为0.4%、0.5%（n＝6），表明该方法重复性良好。
2.1.10 加样回收率试验 精密称取已知含量的药材样品粉末，过筛，共6份，每份约150.0 g，分别精密加入一定量的混合对照品溶液1.5 mL（含柴胡皂苷a质量浓度56.64 μg/mL、柴胡皂苷 d 质量浓度 74.53 μg/mL），按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表1。
表1 加样回收率试验结果（n＝6）
Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.1.11 样品含量测定 取药材样品粉末适量，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，平行操作3次，记录峰面积并按标准曲线法计算样品中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量。结果，柴胡皂苷a的含量为2.48～3.64 mg/g、柴胡皂苷d的含量为3.34～4.74 mg/g。
2.2 柴胡水提液中柴胡皂苷a与柴胡皂苷d总提取率的测定
取药材样品粉末适量，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算柴胡皂苷a与柴胡皂苷d的总提取率（Y）。Y＝（C×n×V）/（L×W）[17]，式中C为柴胡皂苷a、柴胡皂苷d质量浓度之和，n为稀释体积，V为提取液总体积，L为供试品溶液体积，W为样品质量。
2.3 单因素试验
2.3.1 提取次数对柴胡皂苷a与柴胡皂苷d总提取率（以下简称“总提取率”）的影响 取药材样品粉末，共5份，每份约300.0 g，以水为提取溶剂，在提取时间3 min，料液比1∶25（g/mL），样品过60目筛条件下，考察不同提取次数（1、2、3、4、5次）对总提取率的影响，结果见图3A。由图3A可见，随着提取次数的增加，虽然在提取3次时总提取率为最高，但与其余几次比较无明显差异，综合考虑节能、省时、经济等因素，故选择提取次数为1次。其原因可能为柴胡皂苷a、柴胡皂苷d在提取1次时已基本被提取出来，此时再增加提取次数，总提取率增加不明显。
2.3.2 提取时间对总提取率的影响 取药材样品粉末，共5份，每份约300.0 g，以水为提取溶剂，在提取次数1次，料液比1∶25（g/mL），样品过60目筛条件下，考察不同提取时间（1、2、3、4、5 min）对总提取率的影响，结果见图3B。由图3B可见，随着提取时间的增加，总提取率呈先增加后降低的趋势，当提取时间为2 min时，总提取率最高，故选择提取时间范围为1～3 min。其原因可能与随着提取时间延长，其他杂质溶出导致溶液总浓度增加，使柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的溶出传质阻力增加，且还与细胞内外有效成分含量达到动态平衡、浓度差推动力减弱到最低有关。
2.3.3 物料粒度对总提取率的影响 取药材样品粉末，共5份，每份约300.0 g，以水为提取溶剂，在提取次数1次，料液比1∶25（g/mL），提取时间2 min条件下，考察不同物料粒度（过40、60、80、100、120目筛）对总提取率的影响，结果见图3C。由图3C可见，随着物料粒度的增加，总提取率呈先增加后降低的趋势，当物料粒度过80目筛时，总提取率最高，故选择物料粒度范围为过60～100目筛。其原因可能为物料粒度超过80目筛后，随着粉碎粒度增加，杂质溶出增多，从而影响柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的溶出。
2.3.4 料液比对总提取率的影响 取药材样品粉末，共5份，每份约300.0 g，以水为提取溶剂，在提取次数1次，提取时间2 min，样品过80目筛条件下，考察不同料液比（1∶5、1∶15、1∶25、1∶35、1∶45，g/mL）对总提取率的影响，结果见图3D。由图3D可见，随着料液比的增加，总提取率呈先增加后降低的趋势，当料液比为1∶25（g/mL）时，总提取率最高，故选择料液比范围为1∶15～1∶35（g/mL）。其原因可能为过多的溶剂会溶解更多的杂质，从而导致总提取率降低。

图3 单因素试验结果
Fig 3 Results of single factor tests
表2 因素与水平
Tab 2 Factors and levels

表3 试验方案设计与结果
Tab 3 Design and results of Box-Behnken

表4 方差分析结果
Tab 4 Results of variance analysis

2.4 提取工艺优化
2.4.1 试验设计与结果 在单因素试验基础上，以提取时间（A）、物料粒度（B）、料液比（C）为考察因素，以总提取率（Y）为响应值，采用3因素3水平设计试验。因素与水平见表2，试验设计方案与结果见表3、方差分析结果见表4。
2.4.2 模型方程建立 采用Design-Expert 8.06软件对表2数据进行二次多元拟合回归。结果，二次多元回归方程为Y＝8.32+0.49A+0.07B+0.50C－0.01AB－0.13AC－0.04BC－0.71A2－0.54B2－0.70C2[R2＝0.997 1，校正系数（R2Adj）＝0.993 4]，P＜0.0001，表明方程拟合极显著；拟合方程的R2为0.997 1，表明响应值的变化有99.71%来自于所选变量；失拟项P值为0.130 1（＞0.05），表明模型误差较小，可用于预测总提取率。由方差分析结果可知，3个因素对总提取率影响的顺序从大到小为C＞A＞B；A、C、A2、B2、C2影响极显著，B、AB、BC影响不显著。
2.4.3 响应面分析 采用Design-Expert 8.06软件，以提取时间（A）、物料粒度（B）、料液比（C）为考察因素，以总提取率为响应值，绘制响应面和等高线图，详见图4。由图4可知，因素A与C交互作用较为显著，因素A与B、因素B与C交互作用不显著。

图4 各因素对总提取率影响的响应面和等高线图
Fig 4 Response surface and contour plots of the effects of each factor on total extraction rate
2.4.4 最优提取条件的确定及验证试验 基于Design-Expert 8.06软件优化得到最佳提取工艺为提取时间2.31 min、物料粒度过80.99目筛、料液比1∶28.27（g/mL），总提取率预测值为8.48 mg/g。考虑到试验的可操作性，最终最优提取工艺确定为提取时间2.50 min、过80目筛、料液比1∶28（g/mL）。3次验证试验结果显示，在此工艺条件下，平均总提取率为8.42 mg/g（RSD＝1.2%），预测值与实际值接近，表明模型优化的结果合理、可靠。
2.5 不同提取方法的比较
参考相关文献[18-19]，将上述最优提取工艺与超声法、煎煮法进行比较，各方法均平行操作3次，结果见表5。由表5可见，电磁裂解法可明显缩短提取时间，且平均总提取率最高。
3 讨论
表5 不同提取方法平均总提取率比较
Tab 5 Comparison of average total extraction rates of different extraction methods

本研究采用HPLC法测定了以电磁裂解法提取的柴胡水提液中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量，该方法精密度、稳定性、重复性均较好，可用于同时测定柴胡水提液中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量。采用单因素试验对影响柴胡皂苷a和柴胡皂苷d提取的4个因素即提取次数、提取时间、物料粒度、料液比进行优化。综合考虑单因素试验结果及节能、省时、经济等因素，确定提取次数为1次，仅对其余3个因素通过Box-Behnken响应面法进行优化，得到最优提取工艺为提取时间2.50 min、过80目筛、料液比1∶28（g/mL）。验证试验得总提取率为8.42 mg/g。与超声法和煎煮法相比，电磁裂解法提取的总提取率最高，提取时间最短。
柴胡皂苷a和柴胡皂苷d属于柴胡药材中的原生皂苷类成分，其结构不稳定，在煎煮过程中分别易降解为柴胡皂苷b1和柴胡皂苷b2[20-21]。而电磁裂解提取可有效避免柴胡皂苷a和柴胡皂苷d受热分解，其高效、节能等特点可为柴胡的工业化提取提供新思路，并为其合理应用及开发提供参考。
综上所述，本研究所建含量测定方法简便、准确，可用于同时测定柴胡水提液中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量；所得优化工艺稳定、可行。
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