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沙棘果油棕榈油酸提取物的富集及改善胰岛素抵抗活性沙棘果油棕榈油酸提取物的富集及改善胰岛素抵抗活性 高 山，王嘉佳，胡高爽* （河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018） 摘 要：运用尿素包埋-分子蒸馏复合法提取沙棘果油中的棕榈油酸，在单因素试验的基础上采用响应面分析法优化提取工艺参数，并利用气相色谱法对产物脂肪酸组成进行分析。通过高浓度胰岛素诱导HepG2细胞建立胰岛素抵抗模型，探索沙棘果油提取物改善胰岛素抵抗活性。结果表明，尿素包埋和分子蒸馏两步法提取沙棘果油中的棕榈油酸最佳条件为：尿素包埋法，尿素与底物比1.98∶1（g/g）、溶剂与尿素比4.03∶1（mL/g）、包埋时间12.15 h；分子蒸馏法，进料速率0.84 mL/min、刮膜速率116.02 r/min，蒸馏温度99.75 ℃。采用气相色谱检测棕榈油酸含量，结果表明在最佳优化条件下棕榈油酸质量分数显著提高，达到72.19%（模型预测值为68.02%），证明所建立的方法可用于沙棘果油中棕榈油酸的富集和纯化；体外实验表明沙棘果油中棕榈油酸提取物浓度达到100 μmol/L时可以明显改善糖原合成水平，达到200 μmol/L时可以显著性缓解胰岛素抵抗导致的葡萄糖消耗量降低现象，证明沙棘果油棕榈油酸提取物具有改善胰岛素抵抗的功能。 关键词： 沙棘果油棕榈油酸；提取；响应面分析；胰岛素抵抗 棕榈油酸是一种16碳的单不饱和脂肪酸，双键位于碳端的第7个碳原子上（16∶1 n-7）[1]。棕榈油酸难溶于水，易溶于碱溶液和乙醚、氯仿、正己烷、乙酸乙酯等有机溶液，在常温下为无色透明液体，且具有较好的稳定性[2]。已有研究表明棕榈油酸可以缓解多种代谢疾病如肥胖、高血脂、高血糖和炎症等[3-9]。鉴于其良好的稳定性和调控代谢能力，开发棕榈油酸产品有很好的经济价值。目前，棕榈油酸主要来源于鱼油等海产品。但由于国际上禁捕鲸鱼和渔业资源匮乏，棕榈油酸来源受到限制，难以满足市场的需求[1]。因此，寻找富含棕榈油酸的植物并加以提取可以较好的弥补棕榈油酸产量的不足。Badami等[3]通过研究多种植物的脂肪酸组成，发现澳洲坚果籽油中棕榈油酸含量较高，约为30%。昆士兰果油和沙棘果油中含量也很多，分别在17%和30%左右[2]。有报道猫儿屎（Decaisnea insignis）籽油中棕榈油酸的质量分数可达55.9%，以及植物猫爪（Dolichandra unguis）中其质量分数约64%[1]。在这些植物中，沙棘在我国分布最广，最具开发潜力。沙棘（Hippophae rhamnoides Linn.）是我国西部地区最具代表性的经济作物之一，具有极好的抗逆性，被广泛应用于防风固沙和防治水土流失[5]。以沙棘果油为原材料提取棕榈油酸可以拓展棕榈油酸的来源，也为沙棘的高值化利用提供参考。 目前关于沙棘果油棕榈油酸提取方法的报道较少，奇拉达等[10]应用CO2超临界萃取法从沙棘果油中提取棕榈油酸，产物中棕榈油酸质量分数可达55.24%。张泽生等[11]应用分子蒸馏法富集沙棘果油中的棕榈油酸，其最高纯度达到51.9%。本研究在上述背景下以沙棘果油为原料，建立了一种高效的沙棘果油中棕榈油酸的提取方法-尿素包埋和分子蒸馏复合法，大大提高了沙棘果油中棕榈油酸的提取效率。此外，已有研究表明，棕榈油酸具有干预胰岛素抵抗的效果。Kurotani等[12]以高鱼类饮食的日本人为研究对象，研究了多种脂肪酸（包括硬脂酸、棕榈油酸和亚麻油酸等）对东方人体质的2型糖尿病胰岛素抗性的影响，结果表明血清中高水平的硬脂酸、棕榈油酸和亚麻油酸，以及低水平的血清胆固醇酯，都会减轻胰岛素抵抗，缓解糖尿病症状。Souza等[9]研究了棕榈油酸对α亚型过氧化物酶体增殖剂激活受体（peroxisome proliferators-activated receptors-α，PPAR-α）代谢途径的影响，发现棕榈油酸可以通过影响PPAR-α关键蛋白减轻胰岛素抗性。Bergman等[13]对1型糖尿病患者的脂肪细胞和血液进行研究，发现棕榈油酸可以影响多种血糖代谢关键酶类，进而调节患者的胰岛素分泌。然而，对棕榈油酸降血糖功能性的评价还不全面，尤其是对富含棕榈油酸的天然产物的降糖功能性评价还少有研究。本研究对沙棘果油提取物在细胞水平缓解胰岛素抵抗的功能进行评价，初步探索其在降糖功能产品中的应用前景。 1 材料与方法1.1 材料与试剂沙棘果油由内蒙古鄂尔多斯高原圣果公司提供，是将沙棘果汁加工过程中分离出的沙棘果毛油，通过去杂、脱胶、脱酸、脱水、脱色、脱过氧化物等工序制得。所采用的沙棘品种为肋果沙棘，其中棕榈油酸质量分数约为30%。脂肪酸甲酯标准品 美国Sigma公司；氢氧化钾、95%乙醇、无水硫酸铜、硫酸、盐酸、乙醚、石油醚、正己烷等均为分析纯。 综上所述，通过遥感+无人机+人工智能+大数据+手机APP的数字化技术应用，形成了一套切实有效的绿色矿山地质灾害监测方法。 按照SA指数的25%、50%、75%分位数，将公司面临的融资约束分为4个等级。统计所有公司在观测年度内的等级变化情况，计算每个企业最高等级与最低等级的跨度。跨度为0级的企业占企业总数的44.37%，跨度为1级的企业占比50.29%，跨度超过1级的企业占比5.34%。统计结果显示噪音较少，企业融资约束程度并没有发生频繁变化，SA指数分类结果稳定。 1.2 仪器与设备7890A气相色谱仪 安捷伦科技（中国）有限公司；RE3000A型旋转蒸发器、SHZ-III循环水真空泵 亚荣生化仪器厂；KDL-1短程分子蒸馏器 德国UIC公司。 1.3 方法1.3.1 沙棘果油的皂化和酸化 沙棘果油的酸价较高，需进行皂化和酸化处理[11]，工艺条件如下：取适量沙棘果油样品，配制成沙棘果油与95%乙醇料液比1∶2（g/mL）和沙棘果油与与KOH质量比1.1∶1混合溶液并置于平底烧瓶中。将烧瓶置于80 ℃水浴中回流以应2 h。然后，加适量蒸馏水，旋转蒸发回收混合体系中的乙醇。加入6 mol/L盐酸调节混合液至pH 2～3，将混合液转移至分液漏斗，静置待其分层。取上层有机层，用5% NaCl溶液洗涤有机层至中性，并使用无水硫酸钠对所得油状物进行干燥；抽滤除去硫酸钠后，得到沙棘果油混合脂肪酸[14-16]。 以国内法院吸引国际案件，英国伦敦商事法院就有先例。英国伦敦商事法院就是一个国内法院，该法院并未就与本国无实质联系的案件设置特别规则，但仍有大量的与英国无实质联系的案件当事人选择伦敦商事法院作为管辖法院。据统计，伦敦商事法院有超过四分之三的当事人是外国人。[注]参见 Man Yip, “The Resolution of Disputes before the Singapore International Commercial Court, ”p.445.且迪拜、卡塔尔、阿布扎比国际商事法院的设置无一不是效仿英国司法制度。因此，国内商事法庭的构建对中国建立国际商事法庭的作用不容忽视。 1.3.2 尿素包埋-分子蒸馏复合法提取沙棘果油中的棕榈油酸 1.3.2.1 尿素包埋法 其次，培育新要素。包括培育信息技术、智能制造技术和新能源技术等新技术；培育专业人才、市场人才和管理人才等新人才；提供和吸收各种新知识；开拓各种新的融资形式和渠道等。 尿素和95%乙醇按一定比例混合，在一定温度下搅拌回流，待尿素全部溶解后，将一定量的游离脂肪酸加入体系，继续搅拌加热，直到混合体系完全澄清。此后，室温条件下将混合体系包合结晶一定时间后，迅速抽滤；滤液部分经由旋转蒸发器除去乙醇，采用正己烷萃取分离油层，置于分液漏斗中待其分层，取正己烷层旋转蒸发回收正己烷，剩余油状物即为目标产物[17-20]。本研究采用单因素试验对尿素包埋过程中不同包埋时间（6、12、18、24、30 h），不同尿素与底物比（1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1、3∶1、3.5∶1（g/g））和不同的溶剂与尿素比（1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1（mL/g））等因素的最优区间进行筛选，并通过响应面设计对工艺参数进行优化以得到最佳工艺条件。 1.3.2.2 分子蒸馏法 经过尿素包埋法后，大分子质量的长链多不饱和脂肪酸成为影响棕榈油酸纯度的主要杂质。因此可以采用分子蒸馏法进一步分离不同分子质量的脂肪酸分子。同理，本研究采用单因素试验对分子蒸馏过程中蒸馏温度（90、100、110、120、130 ℃）、转子转速（100、120、140、160、180 r/min）和进料速率（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min）等因素的最优区间进行筛选，并通过响应面设计对工艺参数进行优化得到最优工艺条件。 1.3.3 气相色谱分析 1.3.3.1 游离脂肪酸的甲酯化 脂肪酸的沸点较高，在进行气相色谱法测定时对器材的要求较高，而且高温下容易导致脂肪酸氧化裂解，在分析过程中出现损失，影响分析结果。因此在进行气相分析之前，需要对游离脂肪酸进行甲酯化处理，以降低沸点，降低检测中的损失，提高稳定性[21-24]。具体操作过程如下： 取200 μL游离脂肪酸样品和2 mL 硫酸-甲醇溶液（4 mL硫酸溶于甲醇中，用甲醇定容至100 mL）置于10 mL具塞试管中充分混合。将此体系于75 ℃水浴中加热1 h，使其充分甲酯化。随后，加入2 mL正己烷以及5 mL蒸馏水，充分混匀萃取其中的甲酯化脂肪酸，无水硫酸钠干燥有机层，过0.22 μmol/L有机滤膜，贮存于样品瓶中待测。 1.3.3.2 气相色谱条件 当前因各行各业都在进行着深度的信息化革命，以此基本形成了大数据格局。同时大数据还已广泛应用于各个领域，这为企业建立大数据审计模式提供了条件，这既是对传统审计工作模式的重大突破，也是对当今深度变化着的大数据时代审计环境的积极响应。 气相色谱柱：HP-88（100 m×0.25 mm，0.2 μm）；进样口温度250 ℃；检测器温度270 ℃；流速1 mL/min；分流比30∶1；进样量5 μL；升温程序：柱温首先设置为140 ℃，之后以5 ℃/min的速率升温至200 ℃，保持1 min之后再以2 ℃/min的速率升温至230 ℃；氮气流量25 mL/min，氢气和空气的流量分别为40 mL/min和450 mL/min。 1.3.4 沙棘棕榈油酸提取物改善胰岛素抵抗活性分析 从小额诉讼程序的救济而言，大陆法国家或地区一般禁止上诉或限制上诉，但仍保留一定的救济空间，如日本允许当事人对小额判决提出异议，德国小额裁判中如果存在重大法律问题，可以经法官许可上诉，并保留当事人向宪法法院投诉的特别途径。在我国台湾地区，小额程序原则上实行一审终审，但允许当事人在存在严重违法和适用法律不当的情况下提起上诉(第436条之24)。 实验中HepG2细胞采用标准细胞培养条件（5%质量分数的CO2和37 ℃）进行培养。所使用的培养基配方为89% DMEM高糖培养液、10%灭活的胎牛血清和1%青霉素-链霉素混合溶液。 随后对胰岛素作用浓度和时间进行优化。首先将HepG2细胞转移至96 孔板中，细胞贴壁后将培养基更换为含有不同浓度胰岛素（10-5、10-6、10-7、10-8、10-9 mol/L）的无血清培养基，并设立正常对照组。培养一定时间后，将培养基更换为无酚红无血清培养基，培养24 h。检测各实验孔葡萄糖含量，并以无细胞培养液的葡萄糖含量为参照计算葡萄糖消耗量。葡萄糖消耗量最小组所对应的胰岛素浓度即为最佳作用浓度。同理对作用时间进行优化，待细胞贴壁后将培养基更换为含有最佳浓度胰岛素的无血清培养液，分别处理24、36、48 h。后更换无酚红无血清培养基培养24 h。测定各组葡萄糖消耗量，葡萄糖消耗量最小组对应的时间即为最佳作用时间。预实验结果表明，最佳作用浓度为10-6 mol/L，最佳作用时间为36 h。 以最佳条件建立胰岛素抵抗模型，设置正常组（不进行胰岛素建模）、模型组（经过胰岛素建模不使用药物处理）和剂量组（经不同浓度沙棘棕榈油酸提取物处理，所设剂量分别为400、200、100、50 μmol/L）。药物处理24 h，检测各孔葡萄糖消耗量，评价沙棘棕榈油酸提取物改善胰岛素抵抗的功能机制。另外，收集处理后的各组细胞，使用糖原测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）对不同组细胞的糖原含量进行测定。 然而，1977年中国恢复高考制度却给这个家带来了巨大的改变。陈老师的姐姐哥哥在高考恢复后相继考上了高中专，成了全县凤毛麟角的“天之骄子”。父母的欣慰与骄傲、周围人的艳羡，姐姐哥哥全新的人生都深深触动了他的心。 清华老校长梅贻琦生前曾告戒黉门学子：（你们）“要有勇气去做一个平凡的人,不要去追求轰轰烈烈。”这样的话语,现在几乎已经没有人会这样说了,我们的时代似乎也已经抛弃了这样的说法。人生能有几回搏？！在这样的语境下,我们的孩子从学龄起就被熏陶“不能输在起跑线上”,提倡“生当做人杰,死亦为鬼雄”，人生就是要追求“轰轰烈烈”。以至使一些人还来不及去享受人生的乐趣就走向了生命的终点。 1.4 数据处理采用SPSS 18.0统计软件和Excel 2013软件进行统计学分析，数据均用 ±s表示，组间比较采用方差分析。P＜0.05，差异显著。 2 结果与分析2.1 尿素包埋-分子蒸馏复合法工艺优化2.1.1 尿素包埋法 尿素具有特殊的空间结构，在结晶过程中能够形成一定空间体积的腔体，包合空间体积较小的饱和脂肪酸，并形成较为稳定的结晶，从液体中析出，而不易被尿素包裹的部分留在液体中[25]。本研究以沙棘果油皂化得到的沙棘果油混合脂肪酸为原材料，采用尿素包埋法分离沙棘果油混合脂肪酸中空间体积较小的饱和脂肪酸，提高棕榈油酸的纯度[26]。 通过单因素试验先对尿素包埋过程中包埋时间、尿素与底物比例和溶剂与尿素比例等因素的最优区间进行筛选。以产品得率（所得沙棘果油提取物与原料的重量比）和棕榈油酸含量（所得沙棘果油提取物中含有棕榈油酸的量）两个响应值衡量提取效果。如图1所示，时间会影响结晶状态，尿素会首先形成大块结晶，再形成小块细碎结晶，最后形成结块。不同的结晶状态会影响抽滤时所得溶液的体积，从而影响产品得率。本实验中，在第12小时产品得率和棕榈油酸含量达到最高。尿素与底物比例影响包埋过程中包埋物的数量，少量的尿素不能完成饱和脂肪酸的包埋，使得产品中含有饱和脂肪酸残留物；而过量的尿素除了会包埋饱和脂肪酸外还会包埋一定量的目标产物棕榈油酸，影响产物的棕榈油酸含量和产品的产率。本实验中，得率先上升后下降，在尿素与底物比为2∶1时达到最大，而棕榈油酸含量在尿素与底物比2.5∶1时达到最大。溶剂与尿素比例影响尿素的溶解程度，溶剂过少会导致尿素溶解不充分，也会导致尿素析出速率的增加。另外，溶剂量过少也会使得操作中油脂更容易粘于容器壁上，导致得率下降。本实验中，溶剂与尿素比为4∶1时产品得率达到拐点，而棕榈油酸含量变化不大。  图1 尿素包埋时间（A）、尿素与底物比（B）和溶剂与尿素比（C）对提取效率的影响
Fig. 1 Effects of reaction time (A), urea to substrate ratio (B) and solvent to urea ratio (C) on extraction efficiency
在单因素试验的基础上，选取尿素与底物比、溶剂与尿素比和包埋时间为自变量，以棕榈油酸得率为响应值，根据Box-Behnken试验原理，设计3因素3水平响应面分析试验。采用Design-Expert设计软件进行响应面试验设计，并对结果进行方差分析和响应曲面分析，见表1。 根据实验设计结果，采用Design-Expert预测模型，得到尿素包埋工艺对产品得率影响的多项式模型（1）和尿素包埋工艺对棕榈油酸质量分数影响的多项式模型（2）如下： 
表1 尿素包埋工艺的响应面试验设计及结果
Table 1 Box-Behnken design in terms of coded and experimental data with response variables  试验号 A时间/h B尿素与底物比（g/g）R2棕榈油酸质量分数/%C溶剂与尿素比（mL/g）R1产品提取得率/%
由表2可知，模型（1）和模型（2）的R2值分别为0.98和0.96，  值为0.96和0.92，均趋近于1，这表明模型的适应性良好，非常拟合实验设计。另外，模型的P值均小于0.01，表明模型非常显著，可以进行本设计的优化。而两个模型的失拟项均不显著（P＞0.05），表明大部分的实验结果都可以拟合多项式。在式（1）中A、B、C、AB、A2、B2和C2系数较大，对响应值的影响大，说明3 个因素均对尿素包埋产物的得率有显著影响。在式（2）中A、B、C和A2系数较大，这表明3 个因素中包埋时间对棕榈油酸含量的影响相对较大 [27-28] 。 （6）依托漳河信息化建设加快发展水务科技。漳河工程管理局在水利信息化建设基础上，成立湖北省楚禹水务科技有限公司，已具备电子与智能化工程专业承包、信息系统集成及服务两个二级资质和水资源论证、涉密信息系统集成乙级资质。公司研发的CYDSM-2000系列硬件设备已获国家质检总局颁发的全国工业产品生产许可证及安全生产许可证，通过软件企业及软件产品的“双软认证”并获得六项国家版权局注册的软件著作权登记证书。 应用本多项式模型对最优工艺组合进行预测，发现产品得率最大化时的工艺条件为尿素与底物比1.78∶1（g/g）、溶剂与尿素比4.44∶1（mL/g）、尿素包埋时间12.53 h，预测的产品得率为57.43%。最大化棕榈油酸含量的最佳工艺条件为尿素与底物比2.47∶1（g/g）、溶剂与尿素比3.16∶1（mL/g）、尿素包埋时间12.93 h，预测的棕榈油酸质量分数为58.52%。综合考虑产品得率和棕榈油酸含量，优化得到的最佳生产工艺为尿素与底物比1.98∶1（g/g）、溶剂与尿素比4.03∶1（mL/g）、尿素包埋时间12.15 h，优化得到的产品得率为56.71%、棕榈油酸质量分数为57.04%。 作为云南省持续打造的澜湄合作展会品牌，目前，澜湄合作博览会已被云南省商务厅列为与澜湄国家开展会展产业合作的重要项目，并被中国贸促会列入“一省一展”重点项目打造计划。作为澜湄合作博览会重要配套活动，2018澜湄合作滇池论坛在搭建新型国家级经贸促进平台的同时，充分展示近年澜湄合作成果，为中国与越老缅柬泰多双边合作提供经贸交流的渠道和机会，开创澜湄国家经贸合作的新格局。 如图2所示，尿素与底物比的降低、溶剂与尿素比的升高和尿素包埋时间的减短，使得产品得率得到增加。尿素包埋时间12 h以上、尿素与底物比2.5∶1（g/g）、溶剂与尿素比4∶1（mL/g）条件下，棕榈油酸含量达到最大。这可能是因为随着尿素与底物比的增加，越来越多的饱和脂肪酸被移除。与此同时，单不饱和脂肪酸包括目标产物棕榈油酸也被去除。因此，尿素与底物比升高使得产品产量上升，棕榈油酸含量下降；而包埋过程在12 h左右完全结束，所以在12 h后棕榈油酸含量变化不大。 
 图2 尿素包埋法不同因素对提取效率影响的响应面
Fig. 2 Response surface plots showing the interactive effects of reaction time, urea-to-substrate ratio and solvent-to-urea ratio on extraction efficiency
表2 尿素包埋工艺响应面模型方差分析
Table 2 Analysis of variance of the effect of urea complexation conditions on extraction efficiency  响应值 参数 平方和 自由度 均方值 F值 P值产品得率模型 326.03 9.00 36.23 49.99 ＜0.000 1失拟项 4.20 3.00 1.40 6.44 0.051 9误差 0.87 4.00 0.22 R2 0.98 R2 Adj 0.96棕榈油酸质量分数模型 102.01 9.00 11.33 21.22 0.000 3失拟项 2.31 3.00 0.77 2.15 0.237 2误差 1.43 4.00 0.36 R2 0.96 R2 Adj 0.92
2.1.2 分子蒸馏法 经由尿素包埋纯化，所得产物中棕榈油酸的含量得到较大的提高。通过检测尿素包埋产物，发现其中的饱和脂肪酸基本被去除，大分子质量的长链多不饱和脂肪酸成为影响棕榈油酸纯度主要杂质。分子蒸馏是一种根据热运动程度和分子质量大小的不同而分离脂肪酸分子的方法。因此本研究选取分子蒸馏方法再次对尿素包埋法处理后的样品进行纯化，实验采用KDL-1短程分子蒸馏器对沙棘果油混合脂肪酸进行分离，仪器的真空度为0.1 Pa。 
 图3 蒸馏温度（A）、转子转速（B）和进料速率（C）对提取效率的影响
Fig. 3 Effects of distillation temperature (A), casting rate (B) and feeding rate (C) on yield and purity of POA
表3 分子蒸馏工艺的响应面试验设计及结果
Table 3 Box-Behnken design in terms of coded and experimental data with response variables  试验号 A蒸馏温度/℃B转子转速/（r/min）C进料速率/（mL/min）R1产品得率/%R2棕榈油酸质量分数/%
通过单因素试验先对分子蒸馏过程中蒸馏温度、转子转速和进料速率的最优区间进行筛选。同样以产品得率（所得沙棘果油提取物与原料的质量比）和棕榈油酸含量（所得沙棘果油提取物中含有棕榈油酸的量）2 个响应值衡量提取效果。如图3所示，蒸馏温度是对分子蒸馏工艺影响最大的因素，在特定的温度下，分子质量小热运动剧烈的分子具有长的分子自由程，从而实现与其他组分的分离。本实验中，产品得率随着温度的上升不断上升，这是因为温度升高使得分子热运动剧烈，导致得率的上升。但是，蒸馏温度120 ℃以上时，棕榈油酸含量急剧下降，可能是因为分子质量相对大的物质也被分离出来，导致棕榈油酸相对含量下降。所以120 ℃为最适温度。转子转速影响分子蒸馏过程中涂膜的效率，较高的转速使得脂肪酸分子充分且均匀的受热，有利于组分的溢出。本实验中，转子转速达到120 r/min时，产品产率得到较大提升，所以120 r/min转速可能达到了涂膜最大效率；而棕榈油酸含量受转子转速影响非常微弱。进料速率和转子转速类似，影响分子蒸馏设备对原材料的利用效率。本实验中，进料速率超过1.5 mL/min时产品产率大量下降，这是因为过高进料速率使得样品在蒸馏设备中的停留时间简短，很多分子来不及溢出至收集设备，导致目标产物不能充分分离。棕榈油酸含量受进料速率的影响也较小。 同样在单因素试验的基础上，以蒸馏温度、转子转速、进料速率为自变量，以棕榈油酸得率为响应值，根据Box-Behnken试验原理，设计3因素3水平响应面分析试验，对蒸馏温度、转子转速和进料速率3 个条件进行进一步优化，采用Design-Expert设计软件进行响应面试验规划，并对试验结果进行方差分析和响应曲面分析。响应面试验设计及结果见表3。根据试验设计结果，采用Design-Expert预测模型，得到分子蒸馏工艺对产品得率影响的多项式模型（3）和分子蒸馏工艺对棕榈油酸含量影响的多项式模型（4）多项式如下： 
由表4可知，模型（3）模型（4）的R2值分别为0.97和0.97，  值分别为0.94和0.95，均趋近于1。同理，两个模型的P值均小于0.01，模型的失拟项均不显著（P＞0.05），表明模型适应性良好，可以进行本设计的优化。在多项式（3）中A、B、A2、B2是较显著项，对模型（3）影响最大，表明分子蒸馏温度和转子转速是影响产品得率的最大因素。在多项式（4）中A、C、A2和C2是显著项，这表明分子蒸馏温度和进料速率对棕榈油酸含量的影响最大。 表4 分子蒸馏工艺响应面模型方差分析
Table 4 ANOVA of the effect of molecular distillation parameters on yield and purity of POA  响应值 参数 平方和 自由度 均方值 F值 P值产品得率模型 195.23 7.00 27.89 36.91 ＜0.000 1失拟项 5.26 5.00 1.05 2.73 0.175 9误差 1.54 4.00 0.39 R2 0.97 R2 Adj 0.94棕榈油酸质量分数模型 326.03 9.00 36.23 49.99 ＜0.000 1失拟项 4.20 3.00 1.40 6.44 0.051 9误差 0.87 4.00 0.22 R2 0.97 R2 Adj 0.95
响应面分析如图4所示，得到最大化产品得率的工艺条件为进料速率0.91 mL/min、转子转速109.07 r/min、分子蒸馏温度109.91 ℃，产品得率为27.89%。最大化棕榈油酸含量的工艺条件为进料速率1.35 mL/min、转子转速112.16 r/min、分子蒸馏温度92.07 ℃，棕榈油酸质量分数为70.57%。综合考虑产品得率和棕榈油酸含量，优化得到的最佳生产工艺为进料速率0.84 mL/min、转子转速116.02 r/min、分子蒸馏温度99.75 ℃，产品产率为24.67%，棕榈油酸质量分数为68.02%。 
 图4 分子蒸馏不同因素对提取效率影响的响应面图
Fig. 4 Response surface plots showing the interactive effects of molecular distillation parameters on yield and purity of POA
2.2 预测值验证实验对各优化条件进行验证，采用尿素与底物比2∶1（g/g）、溶剂与尿素比4∶1（mL/g）、尿素包埋时间12 h验证尿素包埋；此条件下产品得率为56.90%（模型预测值为56.71%）、棕榈油酸质量分数为58.27%（模型预测值为57.04%）。同理对分子蒸馏进行验证，采用条件进料速率1 mL/min、转子转速120 r/min、分子蒸馏温度100 ℃，此条件下产品得率为26.89%（模型预测值为24.67%）、棕榈油酸质量分数为72.19%（模型预测值为68.02%）。所有实际检测结果与预测值相比误差小于5%，说明此模型优化合理，适合应用与实际生产。 2.3 气相色谱分析为了检测产品中的棕榈油酸含量，采用气相色谱对提取物棕榈油酸的含量进行分析。将0.010 0、0.005 0、0.003 3、0.002 5、0.001 7 g/mL的棕榈油酸标准溶液依次进样。分别以棕榈油酸溶液的峰面积、浓度分别作为横、纵坐标绘制标准曲线，计算得出标准曲线的回归方程为y＝4×106x-4 205.8（R2＝0.996 1）。最后测得经尿素包埋-分子蒸馏复合法处理后产物中棕榈油酸的质量分数能够达到70%左右，证明本研究所提出的方法能够有效富集沙棘果油中的棕榈油酸。 2.4 沙棘棕榈油酸提取物改善胰岛素抵抗活性研究 图5 沙棘棕榈油酸提取物对胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响
Fig. 5 Effect of sea buckthorn palmitoleic acid extract on glycogen content of HepG2 cells with insulin resistance
采用浓度为10-6 mol/L的胰岛素诱导HepG2细胞24 h建立胰岛素抵抗模型。如图5所示，模型组和正常组相比葡萄糖消耗量极显著性降低（P＜0.01），根据先前的研究[29-30]，说明胰岛素抵抗诱导成功。设置正常组、模型组和剂量组。药物处理24 h，检测各孔葡萄糖消耗量，结果表明当沙棘棕榈油酸提取物浓度为200 μmol/L和400 μmol/L时，培养液中的葡萄糖消耗量与模型组相比显著上升（P＜0.05）。说明沙棘棕榈油酸提取物浓度达到200 μmol/L以上时，可提高胰岛素抵抗HepG2细胞的葡萄糖消耗量，表现出缓解胰岛素抵抗的性能。  图6 沙棘棕榈油酸提取物对胰岛素抵抗HepG2细胞糖原含量的影响
Fig. 6 Effect of sea buckthorn palmitoleic acid extract on glucose level of HepG2 cells with insulin resistance
收集各组细胞，进行糖原含量测定（图6）。结果表明，当沙棘棕榈油酸提取物浓度为100、200、400 μmol/L时，细胞糖原含量与模型组相比显著上升（P＜0.05）。说明沙棘棕榈油酸提取物浓度达到100 μmol/L以上时，可显著改善糖原合成能力，缓解胰岛素抵抗，该研究结果可以为棕榈油酸血糖调节进一步的研究提供借鉴。 3 结 论本实验建立了一种尿素包埋-分子蒸馏相结合的方法提取沙棘果油中的棕榈油酸。在单因素试验的基础上通过响应面分析法得到最佳的提取工艺为：尿素包埋法，尿素与底物比1.98∶1（g/g）、溶剂与尿素比4.03∶1（mL/g）、尿素包埋时间12.15 h；分子蒸馏法，进料速率0.84 mL/min、转子转速116.02 r/min、分子蒸馏温度99.75 ℃。在最优工艺下的产品得率为26.89%（模型预测值为24.67%），产品中棕榈油酸产品为72.19%（模型预测值为68.02%）。沙棘棕榈油酸提取物在浓度大于200 μmol/L明显缓解胰岛素抵抗HepG2细胞的糖摄取量，在100 μmol/L时表现出改善糖原水平的功能。 参考文献： [1] WU Y, LI R, HILDEBRAND D F. Biosynthesis and metabolic engineering of palmitoleate production, an important contributor to human health and sustainable industry[J]. Progress in Lipid Research,2012, 51(4): 340-349. DOI:10.1016/j.plipres.2012.05.001. [2] 张泽生, 高山, 郭擎, 等. 棕榈油酸的研究现状及展望[J]. 中国食品添加剂, 2016(9): 198-202. DOI:10.3969/j.issn.1006-2513.2016.09.026. [3] BADAMI R C, PATIL K B. Structure and occurrence of unusual fatty acids in minor seed oils[J]. Progress in lipid research, 1980, 19(3):119-153. 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Optimizing the Extraction and Enrichment of Plamitoleic Acid from Sea Buckthorn Fruit Oil and Evaluating Its Effect on Alleviating Insulin Resistance GAO Shan, WANG Jiajia, HU Gaoshuang*
(College of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China) Abstract: The extraction of plamitoleic acid (POA) from sea buckthorn fruit oil (SBFO) by urea complexation followed by molecular distillation was optimized using a combination of one-factor-at-a-time method and response surface methodology,and the fatty acid composition of the product was analyzed by gas chromatography (GC). Then, an insulin resistance model was established in HepG2 cells treated with high concentration of insulin and was used to explore the ability of the extract to improve insulin resistance. The results showed that the optimal extraction conditions were as follows: ratio of urea to substrate 1.98:1 (g/g),ratio of solvent to urea 4.03:1 (mL/g), and reaction time 12.15 h for urea complexation; feeding rate 0.84 mL/min,scraping rate 116.02 r/min, and distillation temperature 99.75 ℃ for molecular distillation. The results of GC analysis showed that the plamitoleic acid content was significantly increased up to 72.19% (predicted value of 68.02%) under these optimal conditions, indicating that the established method could be used for the enrichment and purification of POA from SBFO. In vitro experiments showed that the palmitoleic acid at 100 mol/L could significantly improve the level of glycogen synthesis, and alleviate the decrease of glucose consumption caused by insulin resistance at 200 mol/L, proving that a certain dose of sea buckthorn plamitoleic acid could alleviate insulin resistance. Keywords: plamitoleic acid from sea buckthorn fruit oil; extraction; response surface methodology; insulin resistance
收稿日期：2019-04-29 基金项目：河北科技大学博士科研基金项目（81/1181288；81/1181289）；河北科技大学PT基金项目（82/1182218） DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190429-381 中图分类号：TS225.6 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2020）10-0272-09 引文格式： 高山, 王嘉佳, 胡高爽. 沙棘果油棕榈油酸提取物的富集及改善胰岛素抵抗活性[J]. 食品科学, 2020, 41(10): 272-280.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190429-381. http://www.spkx.net.cnGAO Shan, WANG Jiajia, HU Gaoshuang. Optimizing the extraction and enrichment of plamitoleic acid from sea buckthorn fruit oil and evaluating its effect on alleviating insulin resistance[J]. Food Science, 2020, 41(10): 272-280.(in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190429-381. http://www.spkx.net.cn综合英语课堂中设立的演讲活动是一种以学生为中心的言语教学活动。它以主题内容为基础，突破传统纯语言形式的操练模式，起到了引发学生能动思维的效果，给学生提供了用英语交流的平台，增强了学生的自信心及交流意识，提高了学生的思辨能力和综合运用英语的能力。[5]通过演讲活动，学生逐渐形成了对竞争与合作的正确认识。
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发表于 2021-2-10 10:42:10
