酒酒球菌（Oenococcus oeni）耐酸突变株苹果酸-乳酸发酵能力...

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酒酒球菌（Oenococcus oeni）耐酸突变株苹果酸-乳酸发酵能力分析酒酒球菌（Oenococcus oeni）耐酸突变株苹果酸-乳酸发酵能力分析

谢昉书1，文向圆1，刘树文1,2,3,*

（1.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西省葡萄与葡萄酒工程技术研究中心，陕西 杨凌 712100；3.陕西省合阳葡萄试验示范站，陕西 渭南 715300）

摘 要：目的：研究酒酒球菌（Oenococcus oeni）耐酸突变菌株的抗胁迫能力和苹果酸-乳酸发酵能力，为耐酸突变菌株开发为商业发酵剂提供参考。方法：以采用离子注入诱变，分离纯化后筛选出耐酸突变菌株b1为研究对象，酒酒球菌SX-1b和商业菌株31-DH为对照，探究单因素胁迫环境、复合因素胁迫条件及模拟酒环境对菌株b1生长能力、L-苹果酸降解速率和β-葡萄糖苷酶活性的影响，评价菌株b1的苹果酸-乳酸发酵能力。结果：单因素试验结果显示，当pH 3.0、乙醇体积分数14%、L-苹果酸质量浓度3 g/L时，菌株b1的L-苹果酸降解速率和β-葡萄糖苷酶活性均高于其余菌株；正交试验进一步确定各因素对菌株生长能力、L-苹果酸降解速率和β-葡萄糖苷酶活性的影响程度为：pH值＞乙醇体积分数＞L-苹果酸质量浓度；当模拟酒的乙醇体积分数为14%时，菌株b1的累积L-苹果酸降解量为1.493 2 g/L，分别为SX-1b与31-DH的1.41 倍和1.26 倍，且菌株b1的β-葡萄糖苷酶活性最高。结论：耐酸突变菌株b1表现出良好抗胁迫能力和苹果酸-乳酸发酵能力。因此，菌株 b1具有成为商业发酵剂的潜能。

关键词：酒酒球菌；生长能力；降酸；β-葡萄糖苷酶；苹果酸-乳酸发酵

苹果酸-乳酸发酵可以降低葡萄酒的酸度和色度，增加细菌学稳定性及改善葡萄酒的香气，因此，它是酿造优质葡萄酒的必需工艺环节[1]。在乙醇发酵结束之后葡萄酒的生境极其恶劣和复杂，低pH值、高乙醇体积分数和高SO2等均会抑制乳酸菌的生长和代谢，而酒酒球菌可以适应这种环境[2]，因此，它成为苹果酸-乳酸发酵过程中重要的菌种[3-5]。

在苹果酸-乳酸发酵过程中，酒酒球菌可以将葡萄酒中具有酸涩感的L-苹果酸分解为L-乳酸，使葡萄酒更加柔和圆润。Bronwen等[6]研究发现，低pH值和高乙醇含量对植物乳杆菌的降酸能力起到抑制作用。葡萄酒的香气是衡量葡萄酒品质最为重要的指标之一[7]。萜烯类化合物具有浓郁的香味，是构成葡萄酒香气的主要物质，其主要以无味的糖苷结合态存在于葡萄酒中[6,8]。糖苷酶可以酶解香气前体物质以增加葡萄酒香气的复杂性，其中β-葡萄糖苷酶是改善葡萄酒香气的关键酶[9]。乳酸菌特别是酒酒球菌具有较高的β-葡萄糖苷酶活性，可以促进香气前体物的分解，对增加葡萄酒香气复杂性具有重要意义[10-13]。酒酒球菌对葡萄酒感官品质的影响具有菌株差异性[14-15]，低pH值、高乙醇体积分数、高SO2环境都会对酒酒球菌的糖苷酶活性产生影响。因此，酒酒球菌在葡萄酒生境中的抗胁迫能力及糖苷酶的活性，直接影响苹果酸-乳酸发酵的启动、完成及葡萄酒的感官品质[16]。目前研究多是针对胁迫环境对酒酒球菌的降酸能力或β-葡萄糖苷酶活性的影响，但从酒酒球菌的生长能力、降酸能力和β-葡萄糖苷酶活性3 个方面评价其苹果酸-乳酸发酵能力的研究鲜少报道。

本研究通过分析单因素胁迫环境（pH值、乙醇体积分数和L-苹果酸）、复合因素胁迫环境和模拟酒环境对耐酸突变菌株[17]的生长能力、降酸能力和β-葡萄糖苷酶活性的影响，旨在全面评价耐酸突变菌株苹果酸-乳酸发酵的能力，为耐酸突变菌株成为商业发酵剂提供技术支撑。

1 材料与方法1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

苏轼“以诗为词”的词学理论是建立在“诗词同源”基础之上的，“清诗绝俗，甚典而丽。搜研物情，刮发幽翳，微词宛转，盖诗之裔”［3］。词为诗之苗裔，苏轼重点强调的是词如诗的主观抒情性、个性化的色彩，用以淡化词之媚俗，展现文人士大夫刚健清雅的精神境界，这就打破了词为艳科的藩篱，摆脱了音律对词的束缚，从而改革词风，扩大词境，促进词之雅化，提高词之品格。古往今来的论者，对“以诗为词”的褒扬者，其在自己所处时代的历史境遇内，皆是以诗词的相通之处——诗词均出自于《诗》、《骚》、古乐府，都能吟咏性情，皆可作为察政观俗的工具，词可寓诗人的句法［4］50为基点，进而对苏轼“以诗为词”理论的进行发扬。

酒酒球菌SX-1b[18]、商业菌株31-DH[19]保藏于西北农林科技大学葡萄酒学院；陈其玲等[17]对SX-1b进行离子注入诱变，经过分离纯化后筛选出的耐酸突变菌株b1。

1.1.2 培养基与试剂

ATB液体培养基（1 L）：葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g， MnSO4·4H2O 0.05 g，盐酸半胱氨酸 0.5 g，番茄汁250 mL，pH 4.8。

模拟酒培养基（1 L）：无水乙醇100 mL（培养基乙醇体积分数10%），葡萄汁10 g，L-苹果酸3 g，D-葡萄糖2 g，D-果糖2 g，CaCl2 0.13 g，KCl 0.45 g，(NH4)2SO4 1 g，CH3COONa 2 g，KH2PO4 0.6 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4 0.05 g，酵母浸粉4 g， pH 3.4。110 ℃灭菌10 min，待模拟酒培养基温度降至常温水平再添加100 mL无水乙醇。

对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，p-NPG） 美国Sigma公司；L-苹果酸检测试剂盒 爱尔兰Megazyme公司；其他均为分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-1超净工作台 中国苏州安泰空气技术有限公司；SX-500高压蒸汽灭菌锅 日本Tomy公司；SHP-250生化培养箱 上海森信实验仪器有限公司；Cary60紫外分光光度计 安捷伦科技（中国）有限公司；Orion Star A111 pH计 美国Thermo Scientif i c公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的生长能力

1.3.1.1 菌株生长曲线绘制

将菌株于ATB液体培养基中26 ℃静置培养，活化2 次后以4%的接种量接种于单因素胁迫培养基中培养，绘制菌株生长曲线。

1.3.1.2 菌株生长量的测定

将菌株于ATB液体培养基中26 ℃静置培养，活化2 次后以4%接种量接种于正交条件的培养基中，测定OD600 nm，在26 ℃静置培养120 h后再次测定OD600 nm，以两次测定的差值（ΔOD600 nm）衡量实验菌株的生长。

信息技术为课堂教学也带来了创新型的革命，微课在学习中为课堂教学提供了有效的学习资源。但是，微课在课堂中的运用时机是否能够很好地把握，是否能够在课堂中高效地学习，仍然是微课教学所面临的主要问题和困难。加强课堂内学生自学微课环节的组织，让每一位学生在有效时间内认真观看微课内容，否则自学就流于形式[2]。

1.3.2 L-苹果酸含量的测定

按照L-苹果酸检测试剂盒的方法进行测定。

1.3.3 β-葡萄糖苷酶样品制备及活性测定

取对数生长中期（OD600 nm=1.0）菌液各1 mL，9 000 r/min离心10 min收集菌体，加入0.85% NaCl溶液洗涤2 次，并悬浮于0.5 mL 0.85% NaCl溶液。

情境教学是由著名教育学家李吉林于20世纪80年代初提出并实践的教学方法，其具体是指在课堂上利用恰当的情境调动学生的积极情绪，强调兴趣的培养，让学生变被动为主动的学习方法。情景教学提倡通过观察，不断积累形象，让学生在实际感受中获得认知，发展智力，可广泛应用于儿童教育的各个领域。

β-葡萄糖苷酶活力测定参照Barbagallo等[20]的方法并略作修改。反应体系（3 mL）：在上述的悬浮液中加入0.5 mL的柠檬酸磷酸缓冲液和p-NPG混合液（pH 5.0，p-NPG浓度5 mmol/L），于37 ℃反应1 h，立即加入2 mL的1.0 mol/L Na2CO3溶液终止反应。10 000 r/min离心20 min，取上清液并使用全波长酶标仪测定400 nm波长处的吸光度。空白样品是使用0.85% NaCl缓冲溶液代替菌悬浮液，其他处理与样品相同。菌体干质量的计算如下式所示：

   

式中：A600 nm为菌液在600 nm波长处的吸光度；2.616 8为固定系数。

β-葡萄糖苷酶活力定义为以p-NPG为底物，每克菌体（干质量）每分钟水解该底物生成对硝基苯酚（p-nitrophenol，p-NP）的量（μmol/（g·min））。标准曲线由不同浓度（10～60 μmol/L）p-NP溶液在400 nm波长处比色获得。回归方程为y=0.008 6x+0.002 7，R2=0.999 4，线性关系良好，满足实验需求。

1.3.4 单因素胁迫环境对菌株抗胁迫能力的影响

1.3.4.1 pH值的影响

两夫妻淘汰了我在店内加点的小菜，偏偏那也是儿子们很喜欢的一样食材。“抱歉，菜单来不及画掉。这种食物大热天容易坏，我们不进货了，改为冻豆腐可以吗？”老板问。

将3 g/L的L-苹果酸添加到ATB液体培养基，并将培养基的pH值分别调节为3.0、3.2、3.4、3.6和3.8。以4%接种量接种于不同pH值的液体培养基中，测定生长曲线、L-苹果酸含量及β-葡萄糖苷酶活性。

1.3.4.2 乙醇体积分数的影响

将3 g/L的L-苹果酸添加到ATB液体培养基，并使培养基的乙醇体积分数分别为8%、10%、12%和14%，pH值为4.8，以4%接种量接种于含有不同乙醇体积分数的液体培养基中，测定生长曲线、L-苹果酸含量及β-葡萄糖苷酶活性。乙醇体积分数8%接近葡萄酒最低值7%，葡萄酒乙醇体积分数一般为10%～14%。

1.3.4.3 L-苹果酸的影响

将1、2、3、4 g/L的L-苹果酸分别添加到ATB液体培养基，pH值为4.8，以4%接种量接种于含有不同L-苹果酸质量浓度的液体培养基中，测定生长曲线、L-苹果酸含量及β-葡萄糖苷酶活性。

1.3.5 复合因素胁迫环境对菌株抗胁迫能力的影响

葡萄酒的高酸和高乙醇体积分数环境对酒酒球菌的生长和苹果酸-乳酸发酵具抑制作用，L-苹果酸是葡萄酒中重要的有机酸，对酒酒球菌的生长和降酸能力具有影响，因此，选择pH值、乙醇体积分数和L-苹果酸作为正交试验因素，采用L9（34）正交试验设计，确定正交试验因素影响程度及最优组合。

1.3.6 模拟酒环境下菌株的苹果酸-乳酸发酵能力

按照1.1.2节配制模拟酒培养基，并使模拟酒培养基的乙醇体积分数分别为10%、12%和14%，pH值为3.4，以4%接种量接种于模拟酒中，培养到一定时期，按照1.3.3节方法测定β-葡萄糖苷酶活性，并且每天按照1.3.2节方法测定L-苹果酸的含量。

1.4 数据处理

采用SPSS 20.0分析软件（上海卡贝信息技术有限公司）对实验结果进行分析。

2 结果与分析2.1 单因素胁迫环境对菌株抗胁迫能力的影响

2.1.1 pH值对菌株抗胁迫能力的影响

2.1.1.1 pH值对菌株生长能力的影响

     

图1 菌株SX-1b（a）、耐酸突变株b1（b）和商业菌株31-DH（c）在不同pH值条件下的生长曲线
Fig.1 Growth curves of SX-1b (a), b1 (b) and 31-DH (c) under different pH values

由图1可知，菌株SX-1b、b1和31-DH在稳定期的生长量随着pH值降低而降低，当pH值为3.0时，b1的生长量高于SX-1b和31-DH。在不同pH值条件下菌株的生长曲线可为之后L-苹果酸降解速率的测定提供时间依据。结果表明，pH值对菌株的生长具有抑制作用。但菌株b1在低pH值（3.0）下具有较强的生长能力。Tourdot-Maréchal等[21]研究发现，当pH值为3.2时，酒酒球菌的生长受到严重抑制。葡萄酒的pH值一般为3.0～3.4，酒酒球菌能否在葡萄酒的高酸环境中生长繁殖对苹果酸-乳酸发酵的启动具有重要意义。经过研究发现，低pH值将会引起酒酒球菌细胞膜结构和成分的变化，使菌株的生长受到抑制[22-23]，但陈其玲等[17]采用离子注入诱变，分离纯化后获得的菌株b1表现出良好的抗酸胁迫能力，这有可能是离子注入诱变使与细胞膜结构有关的基因发生突变。

2.1.1.2 pH值对菌株L-苹果酸降解速率的影响

     

图2 pH值对L-苹果酸降解速率的影响
Fig.2 Effect of pH on the degradation rate of L-malic acid

将菌株接种于不同培养基培养120 h，测定L-苹果酸含量。当菌株的培养时间相同时，菌株的L-苹果酸降解量越高则其L-苹果酸降解速率越高。因此，以菌株在120 h时苹果酸的降解量表示L-苹果酸降解速率。由图2可知，菌株SX-1b、b1和31-DH的L-苹果酸降解量随着pH值降低而降低，即低pH值对菌株L-苹果酸降解速率具有抑制作用。当pH值为3.0时，b1保持较高的苹果酸降解量，为1.978 6 g/L，是SX-1b的1.34 倍，是31-DH的1.18 倍。

苹果酸乳酸酶是苹果酸-乳酸发酵过程中的关键酶[24]，因此，其活性将会影响菌株L-苹果酸降解速率。研究发现，对于发酵速率较快的菌株，其苹果酸乳酸酶基因（mleA）的转录水平较高[25]。经过离子注入诱变，SX-1b的mleA可能发生突变，从而影响苹果酸乳酸酶活性和mleA的表达。

2.1.1.3 pH值对菌株β-葡萄糖苷酶活性的影响

     

图3 pH值对β-葡萄糖苷酶活性的影响
Fig.3 Effect of pH on β-glycosidase activity

以p-NPG为底物，在37 ℃条件下反应1 h，测定菌株SX-1b、b1和31-DH的β-葡萄糖苷酶活性。由图3可知，在不同pH值条件下，菌株SX-1b、b1和31-DH均具有β-葡萄糖苷酶活性，且β-葡萄糖苷酶活性具有菌株差异性，这与之前的研究结果基本一致[26-27]。菌株β-葡萄糖苷酶活性随着pH值降低而降低。当pH 3.0时，SX-1b和31-DH的β-葡萄糖苷酶活性受到强抑制作用，但b1受到的抑制作用较小，β-葡萄糖苷酶活性为8.610 0 μmol/（g·min），是SX-1b的6.64 倍，是31-DH的1.62 倍，这与陈其玲等[17]的研究基本一致。当pH 3.8时，SX-1b保持较高的β-葡萄糖苷酶活性。

大部分酒酒球菌β-葡萄糖苷酶的最适pH值为5.0[28]，当pH值降到3.5时，β-葡萄糖苷酶活性急剧降低[20]，且Michlmayr等[29]研究发现，在葡萄酒pH值（3.0～4.0）条件下，短乳杆菌β-葡萄糖苷酶活性很低，由此可知低pH值对菌株的β-葡萄糖苷酶具有抑制作用[20]。与杨芮等[28]研究结果相比较，菌株b1在低pH值条件下保持较高的β-葡萄糖苷酶活性。

2.1.2 乙醇体积分数对菌株抗胁迫能力的影响

2.1.2.1 乙醇体积分数对菌株生长能力的影响

     

图4 菌株SX-1b（a）、耐酸突变株b1（b）和商业菌株31-DH（c）在不同乙醇体积分数下的生长曲线
Fig.4 Growth curves of SX-1b (a), b1 (b) and 31-DH (c) at different alcohol concentrations

由图4可知，菌株SX-1b、b1和31-DH在稳定期的生长量随着乙醇体积分数增加而降低，即乙醇对各菌株的生长均具有强抑制作用。当乙醇体积分数为14%时，在稳定期生长量最高的为菌株b1。

2.1.2.2 乙醇体积分数对菌株L-苹果酸降解速率的影响

     

图5 乙醇体积分数对L-苹果酸降解速率的影响
Fig.5 Effect of alcohol concentration on the degradation rate of L-malic acid

由图5可知，菌株SX-1b、b1和31-DH的L-苹果酸降解量随着乙醇体积分数增加而降低，即乙醇对菌株L-苹果酸降解速率具有抑制作用。但b1的L-苹果酸降解量均高于其余菌株。当乙醇体积分数为14% 时，菌株b1的L-苹果酸降解量为1.717 7 g/L，分别是SX-1b和31-DH的1.36 倍和1.05 倍。

Miller等[30]研究发现，乙醇对植物乳杆菌mleA的表达具有抑制作用。Wang等[24]研究发现，当乙醇体积分数大于4% 时，随着乙醇体积分数的增加，酒酒球菌SD-2a的苹果酸乳酸酶活性显著降低。经过离子注入诱变，SX-1b的mleA发生突变，可能提高了菌株mleA的表达和苹果酸乳酸酶的活性。

2.1.2.3 乙醇体积分数对菌株β-葡萄糖苷酶活性的影响

     

图6 乙醇体积分数对β-葡萄糖苷酶活性的影响
Fig.6 Effect of alcohol concentration on β-glycosidase activity

由图6可知，菌株SX-1b、b1和31-DH的β-葡萄糖苷酶活性随着乙醇体积分数增加显著降低，这与之前的研究结果一致[20]。葡萄酒的乙醇体积分数一般为12%～14%，在该条件下，菌株b1保持较高的β-葡萄糖苷酶活性。当乙醇体积分数为14%时，β-葡萄糖苷酶活性最高的为菌株b1（1.597 5 μmol/（g·min）），分别是SX-1b和31-DH的1.09 倍和1.07 倍。

2.1.3 L-苹果酸对菌株抗胁迫能力的影响

2.1.3.1 L-苹果酸对菌株生长能力的影响

     

图7 菌株SX-1b（a）、耐酸突变株b1（b）和商业菌株31-DH（c）在不同L-苹果酸质量浓度下的生长曲线
Fig.7 Growth curves of SX-1b (a), b1 (b) and 31-DH (c) under different concentrations of L-malic acid

由图7可知，菌株SX-1b、b1和31-DH在稳定期的生长量随着L-苹果酸质量浓度增加而降低。当L-苹果酸质量浓度为3 g/L时，菌株b1在稳定期的生长量高于SX-1b和31-DH。

2.1.3.2 L-苹果酸对菌株L-苹果酸降解速率的影响

     

图8 L-苹果酸质量浓度对L-苹果酸降解速率的影响
Fig.8 Effect of L-malic acid concentration of on the degradation rate of L-malic acid

由图8可知，菌株SX-1b、b1和31-DH的L-苹果酸降解量随着L-苹果酸质量浓度增加而增加，即L-苹果酸对菌株的L-苹果酸降解速率具有促进作用。葡萄酒中L-苹果酸质量浓度一般为3 g/L，在此质量浓度下，L-苹果酸降解量最高的为菌株b1（2.846 9 g/L），分别是SX-1b和31-DH的1.19 倍和1.12 倍。

2.1.3.3 L-苹果酸对菌株β-葡萄糖苷酶活性的影响

     

图9 L-苹果酸质量浓度对β-葡萄糖苷酶活性的影响
Fig.9 Effect of L-malic acid concentration on β-glycosidase activity

由图9可知，菌株SX-1b、b1和31-DH的β-葡萄糖苷酶活性随着L-苹果酸质量浓度增加而降低。L-苹果酸对SX-1b和31-DH的β-葡萄糖苷酶活性抑制作用较强，对b1的β-葡萄糖苷酶活性抑制作用较小。当L-苹果酸质量浓度小于3 g/L时，菌株SX-1b和31-DH的β-葡萄糖苷酶活性较高，当L-苹果酸质量浓度大于3 g/L时，菌株b1表现出较高的β-葡萄糖苷酶活性。当L-苹果酸质量浓度为3 g/L时，菌株b1的β-葡萄糖苷酶活性高于其余菌株，为6.823 8 μmol/（g·min），分别是SX-1b和31-DH的1.16 倍和1.06 倍。

2.2 复合因素胁迫环境对菌株抗胁迫能力的影响

2.2.1 复合因素胁迫环境对菌株生长能力的影响

表1 正交试验条件对酒酒球菌ΔOD600 nm的影响
Table1 Orthogonal array design with ΔOD600 nm values of three Oenococcus oeni strains

     

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续表1

     

注：同列肩标小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。

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表2 ΔOD600 nm正交试验方差分析结果
Table2 Analysis of variance for the effect of variables on ΔOD600 nm

     

注：*.差异显著（P＜0.05）。下同。

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由表1可知，ΔOD600 nm与单因素胁迫试验结果相差较大。pH值、乙醇体积分数和L-苹果酸对菌株的生长均具有抑制作用，因此，在3个胁迫因素协同作用下，对菌株生长的抑制作用将会显著增强。影响菌株生长因素的主次顺序均为pH值＞乙醇体积分数＞L-苹果酸质量浓度。由K值可以确定最优组合为A3B1C3，即pH 3.8、乙醇体积分数10%、L-苹果酸质量浓度4 g/L。

SPSS 20.0统计软件对试验结果进行方差分析，由表2可知，对于菌株b1，因素A和B有显著性差异（P＜0.05）。对于菌株31-DH，因素A有显著性差异（P＜0.05）。

2.2.2 复合因素胁迫环境对菌株L-苹果酸降解速率的影响

由表3可知，影响菌株SX-1b、b1和31-DH的L-苹果酸降解速率因素的主次顺序均pH值＞乙醇体积分数＞L-苹果酸。由K值可以确定最优组合为A3B1C3，即pH 3.8、乙醇体积分数10%、L-苹果酸质量浓度4 g/L。用SPSS 20.0统计软件对试验结果进行方差分析，由表4可知，因素A、B和C没有显著性差异。

表3 正交试验条件对L-苹果酸降解速率的影响
Table3 Orthogonal array design with L-malic acid degradation rates of three O. oeni strains

     

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表4 L-苹果酸降解速率正交试验方差分析结果
Table4 Analysis of variance for the effect of variables on L-malic acid degradation rate

     

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2.2.3 复合因素胁迫环境对菌株β-葡萄糖苷酶活性的影响

由表5可知，影响菌株SX-1b、b1和31-DH的β-葡萄糖苷酶活性因素的主次顺序均为pH值＞乙醇体积分数＞L-苹果酸质量浓度。由K值可以确定最优组合为A3B1C3，即pH 3.8、乙醇体积分数10%、L-苹果酸质量浓度4 g/L。用SPSS 20.0统计软件对试验结果进行方差分析，由表6可知，对于菌株31-DH，因素A有显著性差异（P＜0.05）。

表5 正交试验条件对β-葡萄糖苷酶活性的影响
Table5 Orthogonal array design with β-glycosidase activity of three O. oeni strains

     

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表6 β-葡萄糖苷酶活性正交试验方差分析结果
Table6 Analysis of variance for the effect of variable on β-glycosidase activity

     

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2.3 模拟酒环境下菌株的苹果酸-乳酸发酵能力

2.3.1 模拟酒环境下菌株的L-苹果酸降解速率

     

图10 模拟酒中乙醇体积分数10%（a）、12%（b）和14%（c）条件下的L-苹果酸降解速率
Fig.10 Effect of alcohol concentration (10% (a), 12% (b) and 14% (c))of model wine on the degradation rate of L-malic acid

为进一步探究菌株b1的苹果酸-乳酸发酵能力，将生长至对数生长期（OD600 nm=1.0）菌株接种于含有不同乙醇体积分数（10%、12%和14%）的模拟酒中，在20 ℃培养12 d，每天测定L-苹果酸含量，以菌株的累积L-苹果酸降解量表示L-苹果酸降解速率。由图10可知，在模拟酒环境中，各菌株均具有L-苹果酸降解能力，随着乙醇体积分数的增加，菌株累积L-苹果降解量显著降低，即菌株L-苹果酸降解速率随着乙醇体积分数增加而降低。由图10c可知，当模拟酒的乙醇体积分数为14%时，菌株SX-1b和31-DH在模拟发酵初期受到严重的抑制作用，菌株b1受到的抑制作用较小，因此，菌株b1可以快速适应高乙醇体积分数的环境；当模拟发酵至第12天时，菌株b1累积L-苹果酸降解量最高，为1.493 2 g/L，分别是菌株SX-1b与31-DH的1.41 倍和1.26 倍。

2.3.2 模拟酒环境下菌株的β-葡萄糖苷酶活性

由图11可知，在模拟酒环境中，随着乙醇体积分数增加，各菌株β-葡萄糖苷酶活性均降低。在不同乙醇体积分数条件下，菌株b1的β-葡萄糖苷酶活性均高于SX-1b。当乙醇体积分数大于12% 时，菌株b1的β-葡萄糖苷酶活性较SX-1b和31-DH高。因此，在高乙醇体积分数的葡萄酒中，b1表现出较高的β-葡萄糖苷酶活性。

     

图11 模拟酒中乙醇体积分数对酒酒球菌β-葡萄糖苷酶活性的影响
Fig.11 Effect of alcohol concentration of model wine on β-glycosidase activity

结果表明，在模拟酒环境中，乙醇对菌株L-苹果酸降解速率和β-葡萄糖苷酶活性均具有抑制作用。当乙醇体积分数为14%时，菌株b1的L-苹果酸降解速率和β-葡萄糖苷酶活性均高于其余菌株，因此，耐酸突变菌株b1具有开发为商业发酵剂的潜能。

目前，在高校的课程设置中，针对大学生职业规划的课程较少，课程教学也相对流于形式。高校在肩负培养学生综合能力的同时，更应关注学生的职业规划和就业指导，帮助学生正确树立就业导向，构建科学的职业生涯规划，逐步改善当下毕业生“高不成，低不就”的就业心态，要将就业指导和职业规划融入日常教学和工作当中。

3 结 论

本研究通过对耐酸突变菌株b1生长能力、L-苹果酸降解速率和β-葡萄糖苷酶活性的研究发现，b1表现出良好抗胁迫能力和苹果酸-乳酸发酵能力，具有成为商业发酵剂的潜能。结果表明低pH值、高乙醇体积分数对菌株的生长能力、L-苹果酸降解速率和β-葡萄糖苷酶活性均具有抑制作用，L-苹果酸对其生长能力和β-葡萄糖苷酶活性具有抑制作用，对L-苹果酸降解速率具有促进作用。当单因素胁迫环境分别为pH 3.0、乙醇体积分数14%和L-苹果酸质量浓度3 g/L时，b1的L-苹果酸降解速率和β-葡萄糖苷酶活性均高于其余菌株。正交试验进一步确定各因素对菌株生长能力、L-苹果酸降解速率和β-葡萄糖苷酶活性的影响程度为：pH值＞乙醇体积分数＞L-苹果酸。当模拟酒的乙醇体积分数为14% 时，菌株b1的累积L-苹果酸降解量为1.493 2 g/L，分别是SX-1b与31-DH的1.41 倍和1.26 倍，且菌株b1的β-葡萄糖苷酶活性高于其余菌株。在后续的研究中，可将菌株b1接种于葡萄酒中进行苹果酸-乳酸发酵，进一步探究其L-苹果酸降解能力及其对葡萄酒香气的影响。

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Malolactic Fermentation Ability of Acid-Tolerant Mutant Strain of Oenococcus oeni

XIE Fangshu1, WEN Xiangyuan1, LIU Shuwen1,2,3,*
(1. College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China;2. Shaanxi Engineering Research Center for Viti-Viniculture, Yangling 712100, China;3. Heyang Experimental and Demonstrational Stations for Grape, Weinan 715300, China)

Abstract: Objective： This study aimed to evaluate the stress resistance and malolactic fermentation ability of an acidtolerance mutant strain of Oenococcus oeni for the purpose of providing a basis for the development of commercial wine fermentation starters. Methods： A acid-tolerant mutant b1, obtained by N+ ion implantation mutagenesis, was tested for the effect of various environmental stress factors and their combinations as well as wine-model conditions on its growth, L-malic acid degradation rate and β-glycosidase activity. Furthermore, we assessed the malolactic fermentation (MLF) ability of mutant b1. Results： The L-malic acid degradation rate and β-glycosidase activity of b1 were higher than those of the other strains under the conditions： pH 3.0, alcohol concentration of 14% and malic acid concentration of 3 g/L. pH had the greatest inf l uence on the growth, L-malic acid degradation rate and β-glycosidase activity of b1, alcohol concentration was in the middle, and L-malic acid concentration was least effective. When the alcohol concentration of the model wine was 14%,the L-malic acid consumption of strain b1 was 1.493 2 g/L, which was 1.41 and 1.26 times as high as that of O. oeni SX-1b and 31-DH, respectively, and it had the highest β-glucosidase activity. Conclusion： Acid-tolerant mutant b1 has good stress resistance and malolactic fermentation ability. Therefore, it has the potential to be used as a commercial starter .

Keywords: Oenococcus oeni; growth; deacidif i cation; β-glycosidase; malolactic fermentation