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姜黄素与白首乌蛋白以及大豆分离蛋白相互作用的比较

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发表于 2021-2-10 11:19:11 | 显示全部楼层 |阅读模式
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姜黄素与白首乌蛋白以及大豆分离蛋白相互作用的比较姜黄素与白首乌蛋白以及大豆分离蛋白相互作用的比较
邢永娜1,冯 进2,李春阳1,2,*
(1.哈尔滨商业大学食品科学与工程学院,黑龙江 哈尔滨 150076;2.江苏省农业科学研究院农产品加工研究所,江苏 南京 210000)
摘 要:通过稳态荧光光谱、傅里叶变换红外光谱(Fourier-transform infrared spectroscopy,FTIR)、远紫外圆二色谱、差示扫描量热和动态光散射分析等系统研究姜黄素(curcumin,Cur)与白首乌蛋白(Cynanchum auriculatum Royle ex Wigh protein,CAP)以及大豆分离蛋白(soy protein isolate,SPI)的相互作用,并进一步比较了2 种蛋白质对Cur稳定性的提高效果。结果表明,Cur可以通过静态方式淬灭CAP与SPI的内源荧光。Cur与2 种蛋白质的复合是一个吉布斯自由能减少的自发以应,主要由疏水相互作用驱动。与CAP相比,Cur与SPI的结合能力更强。FTIR分析表明,除疏水相互作用,氢键也可能参与了复合物的形成。Cur结合导致CAP中α-螺旋结构的减少以及其他3 种二级结构的增加,并且降低CAP的热稳定性。与SPI相比,Cur-SPI复合物中α-螺旋与β-转角的含量均减少,其热稳定性有所升高。CAP与SPI分别与Cur形成直径为159.98 nm和244.34 nm的纳米颗粒。2 种蛋白质均能显著提高Cur在40 ℃和90 ℃条件下的热稳定性,其中SPI的保护效果更好。
关键词: 白首乌蛋白;大豆分离蛋白;姜黄素;相互作用;热稳定性
姜黄素(curcumin,Cur)是姜黄、郁金等姜科植物根茎中最主要的生物活性成分之一,是一种脂溶性多酚[1],具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等功效[2]。Cur遇光容易分解、不耐热、溶出速率慢,在肠道的碱性环境中不稳定,难以被机体吸收,因此限制了Cur的生物利用度[3],从而极大限制了Cur在食品工业中的应用及其活性功能的体内发挥[4]。为克服上述缺陷,研究者构建了一系列蛋白质纳米颗粒用于Cur的荷载与稳态化调控。其中,大豆分离蛋白(soy protein isolate,SPI)来源广泛、价格低廉,并且具备良好的表面活性与自主装性质,受到广大研究者的青睐。陈飞平[5]研究发现,SPI纳米颗粒中疏水区域的数量与疏水程度是影响SPI与Cur结合的重要因素。SPI荷载可以显著提高Cur的热稳定性和消化过程中的胶束化率。同时,Cur的结合也改变了SPI纳米颗粒的粒度分布和电位,并促进蛋白质酶解,从而提高其营养属性。Tapal等[6]证明Cur主要通过疏水相互作用与SPI纳米颗粒结合。与游离Cur相比,纳米Cur的水溶性、胃肠道稳定性、紫外稳定性以及抗氧化活性均得到显著提高。
白首乌是江苏省滨海县传统的地产植物,该地区产量占全国总产量的95%,具有重要的经济价值和社会效益[7]。在深加工过程中,白首乌经淀粉提取后所产生的废渣和黄浆水一般作为废液丢弃。这样不仅导致环境污染,而且造成白首乌蛋白(Cynanchum auriculatum Royle ex Wight protein,CAP)、白首乌多糖等天然资源的浪费。本课题组在前期研究发现,CAP的pH稳定性与SPI基本一致。另外,CAP的乳化性和起泡性均强于SPI,表明其具备良好的加工特性[8]。因此,探索CAP在Cur等活性因子递送方面的潜力,不仅有助于为食品工业中微/纳米递送体系的构建提供天然新壁材,又能促进江苏省特色白首乌资源的充分开发利用,带动相关产业的健康可持续发展。
本实验首先通过稳态荧光光谱研究Cur与SPI、CAP相互作用的类型和热力学特征,采用傅里叶变换红外光谱(Fourier-transform infrared spectroscopy,FTIR)分析了Cur与2 种蛋白质相互作用的主要作用力,并结合远紫外圆二色光谱(circular dichroism,CD)和差示扫描量热(differential scanning calorimetry,DSC)法监测Cur对2 种蛋白质二级结构、三级结构的影响。在此基础上,采用加速实验比较2 种纳米颗粒对Cur热稳定性的提高效果。本研究结果可为CAP在食品工业中的应用提供一定理论参考。
1 材料与方法1.1 材料与试剂
CAP由实验室自制;SPI(纯度≥90%) 上海源叶生物科技有限公司;Cur(纯度≥65%;总姜黄色素纯度≥80%)、Na2HPO4、NaH2PO4 阿拉丁试剂(上海)有限公司;二甲基亚砜 天津市科密欧化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
FDU-1200真空冷冻干燥机 东京理化器械株式会社;8400全自动凯氏定氮仪 丹麦福斯分析仪器公司;F4600UV-5500型荧光分光光度计 日本日立公司;紫外-可见分光光度计 上海元析仪器有限公司;DK-8D电热恒温水槽 上海精宏实验设备有限公司;Nano-ZS90型纳米粒度仪 英国Malvern Instruments公司;85-2A型磁力搅拌器 上海司乐仪器有限公司;Nicolet FTIR仪 美国Thermo公司;Q20 DSC仪 美国TA公司;J-1500 CD仪 日本Jasco公司。
1.3 方法
1.3.1 CAP提取
选取新鲜的白首乌块根,清洗表面后,切成薄片,40 ℃烘干,用干燥机粉碎并过100 目筛。按照料液比1∶10(g/mL)加入去离子水,并用1.5 mol/L的NaOH溶液将提取液调至pH 9.0,室温下用磁力搅拌器搅拌提取2 h,5 000 r/min离心20 min后收集上清液。重复提取2 次,合并上清液,使用1.5 mol/L HCl溶液将上清液调至pH 4.0,静置30 min,离心收集沉淀,并用去离子水以复洗涤,真空冷冻后即得到CAP。采用凯氏定氮法检测其中蛋白质质量分数为63.23%。
[28][33][36] Elvidge C. D., Ziskin D., Baugh K. E. et al., “A fifteen year record of global natural gas flaring derived from satellite data”, Energies, Vol. 2, No. 3 (2009), pp. 595-622.
1.3.2 稳态荧光检测
分别用pH 7.0的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)配制质量浓度为10 mg/mL的SPI、CAP储备液,充分溶解后过滤备用。用二甲基亚砜配制质量浓度为20 mg/mL的Cur储存液。将蛋白质溶液用PBS稀释至2 mg/mL,在磁力搅拌条件下将Cur储存液缓慢滴入使其最终浓度分别达1.4×10-5、2.8×10-5、6×10-5、11.2×10-5、22.4×10-5、44.8×10-5 mol/L。设定激发波长为278 nm,扫描波长范围为300~450 nm。分别在35、42、49 ℃条件下收集蛋白质的内源荧光光谱。
1.3.3 FTIR分析
分别取CAP、SPI、Cur粉末以及Cur-CAP、Cur-SPI复合物冻干粉与KBr均匀混合研磨后制成透明薄片(样品质量分数为1%)进行FTIR扫描。扫描波数为500~4 000 cm-1,扫描次数为32 次,分辨率为4 cm-1。
1.3.4 CD分析
无人机遥感技术在获取到地面的相关遥感数据后,可以根据DOM以及红外信息对于图形进行拼接以及矫正,对于灾情进行更加准确和全面的掌握。遥感技术不仅能够检测地质灾害的表面信息,还可以通过这些数据信息对于地质灾害的体形,位置,程度进行自动分析并统计记录。根据系统自带的GIS软件对于该类数据进行叠加,自动计算出地质灾害可能造成的经济损失以及人员伤亡情况,同时也能根据此次地质灾害对未来该区域可能会发生的地质灾害进行预测和评估[5]。全方面多角度的对地质灾害近况进行较为精准的评估,这也是无人机遥感技术在地质灾害检测中的应用之一。
将CAP、SPI溶液和Cur-CAP、Cur-SPI复合物溶液采用PBS适当稀释后,置于光程为1 mm的样品池中。设定扫描温度为25 ℃、扫描速率为50 nm/min,在190~250 nm波长范围内重复扫描8 次记录样品的图谱,采用PBS溶液为空白对照。
1.3.5 DSC分析
称取3~5 mg样品放置在铝盒中压紧实密封,并用同样条件处理的密封铝盒作空白对照,升温速率10 ℃/min,温度范围为20~200 ℃,干燥氮气流速为50 mL/min,采用自带软件分析热力学参数。
1.3.6 水动力学直径(DZ)与Zeta电位分析
采用动态光散射测定蛋白质和Cur-蛋白质复合物的DZ、多分散指数(polydispersity index,PDI)以及Zeta电位。将样品置于激光粒度仪中,使用He/Ne激光器(λ=633 nm),测试前在25 ℃条件下平衡120 s,每次测试至少扫描10 次,测试3 次取平均值。
1.3.7 Cur热稳定性分析
分别将游离Cur、CAP复合Cur以及SPI复合Cur溶液分别在40 ℃和90 ℃水浴条件下孵育120 min,每间隔30 min取少量样品与氯仿混合萃取其中Cur,萃取2 次后合并萃取液,用乙醇适当稀释,通过419 nm波长处的吸光度计算Cur剩余质量分数,Cur保留率(R)计算公式如下:
   
式中:C为不同时间样品中的Cur质量分数;C0为Cur的初始质量分数。
1.4 数据分析
数据用 ±s的形式表示,使用SPSS 18.0进行方差分析,采用ANOVA法进行显著性检验,P<0.05,差异显著。
2 结果与分析2.1 稳态荧光光谱分析
蛋白质的内源性荧光主要来自于色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等氨基酸残基[9]。如图1所示,278 nm激发波长条件下,CAP在325 nm波长左右产生荧光发射峰,而SPI在340 nm波长左右产生荧光发射峰。该结果表明,SPI中的荧光氨基酸残基所处的微环境疏水性更强。随着Cur浓度的增高,CAP和SPI的荧光强度逐渐降低并且发射峰的位置发生变化,表明两者之间发生了强烈的相互作用。Cur可以通过动态和静态的方式淬灭蛋白质分子的内源荧光[10],淬灭方式可以通过Stern-Volmer方程进行分析[11]:
   
式中:F0和F分别为添加和不添加淬灭剂时蛋白质的内源荧光强度;KSV为Stern-Volmer淬灭常数;Kq为分子淬灭常数;τ0为不添加淬灭剂时荧光物质的平均寿命(对于蛋白质等生物大分子,荧光寿命一般为10-8 s)。
首先,注重培养学生提取历史信息的能力。提取历史信息是阅读史料最基本的目的,教师想要确保历史教学的效率,就需要对学生提取历史信息的能力进行培养。在史料教学中,教师应该对学生进行适当引导,让学生能够结合历史知识对史料进行全面理解,通过讨论分析总结出历史结论。
高碳盘条钢是生产高强度、低松弛预应力混凝土结构用钢丝和钢绞线的主要原料,主要应用于铁路、公路、跨海大桥、大型建筑、水利等领域,它具有抗拉强度高、断后伸长率好、松弛值低、应力损失小和耐疲劳性能优良等特点。在高碳钢盘条中,YL82B是市场需求大、生产数量较多的钢种,其主要规格为φ6.5~φ12.5mm。
     
图1 激发波长278 nm条件下不同浓度Cur对CAP(A)和SPI(B)荧光发射光谱的影响
Fig. 1 Effects of different concentrations of Cur on the fluorescence spectra of CAP (A) and SPI (B)

如图2所示,对于Cur-CAP和Cur-SPI相互作用,Stern-Volmer方程的线性拟合度较高(R2>0.9)(表1),表明Cur可以均匀地结合在蛋白质的疏水荧光位点[12]。在35、42、49 ℃条件下,Cur对CAP内源荧光的KSV分别为4.851×103、4.676×103、4.277×103 L/mol;对SPI内源荧光的KSV分别为7.914×103、7.134×103和6.971×103 L/mol。由此可知,Cur对SPI的KSV高于CAP,且均随着温度的升高而减少。进一步计算得到Cur对2 种蛋白质的Kq均高于1011 L/(mol·s),高出Kq的最大值(2×1010 L/(mol·s))一个数量级[12]。因此,Cur与CAP和SPI 2 种蛋白质的结合是一个静态淬灭的过程,即Cur与2 种蛋白质在基态时形成了不发光的复合物。对于静态复合物,温度的升高往往导致其稳定性的下降,从而导致荧光淬灭程度的降低和KSV的下降[13]。静态淬灭现象是多酚类化合物与蛋白质结合的常见方式,在花青素-牛血清蛋白[13]、儿茶素-牛血清蛋白[14]以及白藜芦醇-SPI相互作用的研究中均有报道[15]。
直流电通过三相逆变器输出三相交流电,经滤波后流向电网,三相电网电压平衡时,根据基尔霍夫电压定律,在两相静止坐标系下,三相并网逆变器的数学模型可以表示为
     
图2 不同温度条件下Cur与CAP(A)和SPI(B)相互作用的Stern-Volmer曲线
Fig. 2 Stern-Volmer plots for Cur-CAP (A) and Cur-SPI (B)interaction at different temperatures

表1 不同温度条件下Cur与CAP和SPI结合的Stern-Volmer的KSV和Kq
Table 1 Stern-Volmer constant KSV and biomolecular quenching constant Kq for Cur-CAP and Cur-SPI interaction at different temperatures
     
复合物 T/℃ Stern-Volmer方程 KSV/(L/mol) (L/(mol·s)) R2 Kq/Cur-CAP 35 F0/F=1.299+4.851×103C(Cur) 4.851×103 4.851×1011 0.901 42 F0/F=1.190+4.676×103C(Cur) 4.676×103 4.676×1011 0.978 49 F0/F=1.167+4.277×103C(Cur) 4.277×103 4.277×1011 0.985 Cur-SPI 35 F0/F=2.125+7.914×103C(Cur) 7.914×103 7.914×1011 0.960 42 F0/F=1.986+7.134×103C(Cur) 7.134×103 7.134×1011 0.964 49 F0/F=1.726+6.971×103C(Cur) 6.971×103 6.971×1011 0.985

对于静态淬灭,研究者多采用双对数Stern-Volmer模型来研究小分子与蛋白质的结合常数Kb和结合位点数n[16]:
   
如图3所示,在不同温度条件下,Cur与2 种蛋白质相互作用的双倒数Stern-Volmer曲线的线性拟合度较高(R2>0.94)。因此,Kb和n可以通过拟合直线与y轴的交点和斜率确定。在35、42、49 ℃条件下,Cur与CAP的结合常数分别为7.620×103、8.786×103、9.508×103 L/mol,而Cur与SPI的结合常数分别为8.382×103、9.183×103、9.931×103 L/mol(表2)。由此可知,Cur与2 种蛋白质的结合常数均随温度的升高而增加,并且相同温度下Cur与SPI的结合常数高于CAP。Cur与CAP或者SPI相互作用的结合位点数接近于1,表明两者之间形成了一个结合位点。
综上所述,随着目前经济社会的变化,房地产企业投资的风险逐渐引起了投资者的注意,对投资风险的防范同时变成了重中之重,本文总结了房地产项目投资各阶段可能存在的风险因素,并提出具体防范措施方案,最大限度地预防、降低、回避、转移房地产项目投资风险。
     
图3 不同温度条件下Cur与CAP(A)和SPI(B)相互作用的双倒数Stern-Volmer曲线
Fig. 3 Double reciprocal Stern-Volmer plots for Cur-CAP (A) and Cur-SPI (B) interaction at different temperatures

表2 不同温度条件下Cur与CAP和SPI的Kb和n
Table 2 Binding constant Kb and numbers of binding sites n for Cur-CAP and Cur-SPI interaction at different temperatures
     
复合物 T/℃ Stern-Volmer双对数方程 Kb/(L/mol) n R2 Cur-CAP 35 lg[(F0-F)/F]=3.882+0.964 lgC(Cur) 7.620×103 0.964 0.942 42 lg[(F0-F)/F]=3.944+0.986 lgC(Cur) 8.786×103 0.986 0.956 49 lg[(F0-F)/F]=3.978+1.002 lgC(Cur) 9.508×103 1.002 0.991 Cur-SPI 35 lg[(F0-F)/F]=3.923+0.881 lgC(Cur) 8.382×103 0.881 0.973 42 lg[(F0-F)/F]=3.963+0.916 lgC(Cur) 9.183×103 0.916 0.982 49 lg[(F0-F)/F]=3.997+0.947 lgC(Cur) 9.931×103 0.947 0.947

在此基础上,进一步结合热力学方程计算Cur与蛋白质结合的吉布斯自由能(ΔG)、焓变(ΔH)和熵变(ΔS)等热力学参数:ΔH>0、ΔS>0,主要表现为疏水作用力;ΔH<0、ΔS<0,主要表现为氢键和范德华力;ΔH<0、ΔS>0,主要表现为静电作用力[17]:
此外,在卒中教学科研方面,还研发了卒中数据中心。目前正在实现卒中患者画像功能,提供标准化、多维度的全生命周期的卒中科研分析数据,并针对卒中现病史和影像报告做了自然语言处理,为卒中科研提供跟多维度数据。
吻合棘(KS)是指腰椎相邻2个棘突相互靠近碰撞引起下腰痛,腰椎过伸时症状加重的一种疾病[1]。本院2016年收治1例L4,5 KS并L5右侧峡部裂及近横向脊椎隐裂致L5右侧形成浮动半椎板的病例,现将诊疗过程报告如下。
   
式中:K1和K2分别对应不同温度下的结合常数/(L/mol);T1和T 2分别对应不同的实验温度/K;R为理想气体常数8.314(J/mol·K)。
如表3所示,Cur与CAP或SPI相互作用ΔH与ΔS均大于0,表明两者的结合过程是吸热的,主要靠两者之间的疏水相互作用驱动。在此过程中,水分子和以离子的释放导致体系混乱程度的增加。另外,两者的结合是一个吉布斯自由能降低的自发以应(ΔG<0)。ΔG绝对值越高,表明结合作用越强。因此,在相同温度下,Cur与SPI的结合能力高于其与CAP的结合能力,与前面的研究结果一致。同样,Ying Ming等[18]发现,Cur与胃蛋白酶结合的ΔH与ΔS均大于0。然而,Ali等[19]研究表明,Cur与α-2-巨球蛋白相互作用的是由焓变与熵变共同驱动的结果,表明除疏水相互作用外,两者的复合还有可能伴随氢键的生成。因此,Cur与蛋白质的相互作用与蛋白质的理化性质有密切的关系。
表3 不同温度下Cur与CAP和SPI结合的热力学参数
Table 3 Thermodynamic parameters for Cur-CAP and Cur-SPI interaction
     
复合物 T/℃ ΔH/(kJ/mol) ΔG/(kJ/mol) TΔS/(kJ/mol)Cur-CAP 35 16.466 -22.889 39.355 42 16.466 -23.782 40.248 49 16.466 -24.522 40.988 Cur-SPI 35 10.516 -23.133 33.649 42 10.516 -23.897 34.413 49 10.516 -24.638 35.154

2.2 FTIR分析     
图4 CAP、SPI、Cur以及2 种蛋白质的Cur复合物的FTIR图谱
Fig. 4 FTIR spectra of CAP, SPI, Cur, Cur-CAP and Cur-SPI complexes
A. CAP、Cur以及CAP-Cur;B. SPI、Cur以及SPI-Cur。图6同。

FTIR可以测定不同状态、不同浓度及不同环境中蛋白质和多肽,是目前研究生物大分子结构功能关系的有效手段[20]。如图4所示,CAP在3 257.66(酰胺A带,代表N—H伸缩振动和氢键)、1 636.79(酰胺I带,代表C=O伸缩振动)、1 508.54 cm-1(酰胺II带,代表C—N伸缩振动和N—H弯曲振动)有明显红外吸收[21]。Cur的特征吸收峰主要在3 501.98(酚羟基O—H伸缩振动、1 601.82(C=C伸缩振动)、1 511.23(C—C—C面内弯曲振动)、995.56(苯环C—H面外振动)、425.79 cm-1(C—C—C伸缩振动、C—OH面内弯曲振动等)[22]。Cur中代表C=C伸缩振动的特征吸收峰(1 601.82 cm-1)可以在Cur-CAP中检测到,代表苯环C—H面外振动的特征吸收峰(995.56 cm-1)可以在Cur-SPI中检测到,表明Cur通过非共价键与2 种蛋白有效结合形成复合物。与CAP相比,Cur-CAP复合物的酰胺I带吸收峰发生了蓝移(从1 636.79 cm-1位移至1 625.22 cm-1),而酰胺II带吸收峰发生了红移(从1 508.54 cm-1位移至1 512.49 cm-1)。同时,与Cur复合后,CAP在酰胺I带和酰胺II带的吸收峰型变尖锐。以上结果证明,CAP与Cur之间发生了强烈的疏水相互作用,这与稳态荧光分数据相吻合[23]。另外,Cur-CAP复合物的酰胺A带吸收峰也发生了蓝移(从3 257.66 cm-1位移至3 250.91 cm-1),表明氢键相互作用也参与了该复合物的形成。与CAP相似,SPI在于Cur结合后酰胺A带、酰胺I带、酰胺II带吸收峰的位置均发生了明显变化。唯一不同的是,Cur-SPI复合物中的酰胺II带吸收峰也发生了蓝移,表明氢键和疏水相互作用同样是Cur与SPI结合的主要结合力。Zhou Mingyong等[24]报道,Cur复合可以显著改变低密度脂蛋白/果胶纳米凝胶酰胺A、I和II带的位置和吸收强度。
《综合英语》系列教材中的文本涉及不同的文学体裁,汇集了不同作家的作品,属于文学作品的范畴。而教材的特质也决定了《综合英语》教材文本实用教学的特点。笔者站在读者接受理论的角度,以读者接受文论相关的概念理论作为依据,分析了《综合英语》系列教材文本的特点。
2.3 远紫外CD分析
远紫外CD图谱(190~250 nm)主要以映Cur结合对2 种蛋白质二级结构的影响。如图5A所示,CAP在210 nm左右波长处存在明显的负吸收峰,而Cur的加入导致了CAP负吸收峰的红移与强度的减弱,表明其二级结构发生了显著变化。通过Dichroweb在线分析,发现CAP中含有21.63% α-螺旋、30.20% β-折叠、21.22% β-转角以及26.95%无规卷曲[25]。与CAP相比,Cur-CAP复合物中α-螺旋的含量显著减少,并且伴随着其他3 种二级结构含量的增加。SPI的二级结构组成为:23.62% α-螺旋、25.91% β-折叠、23.42% β-转角以及27.05%无规卷曲。Cur复合导致SPI中α-螺旋和β-转角含量的降低以及β-折叠和无规卷曲结构的增加。前面报道中,研究人员发现,Cur结合可以导致胃蛋白酶中有序α-螺旋和β-折叠含量的降低以及β-转角和无规卷曲含量的增加[18]。另外,Li等[26]报道,Cur对蛋白质结构的影响与pH有关,酸性条件下,Cur结合不会明显改变β-乳球蛋白的二级结构,而中性条件下,Cur会显著提高β-乳球蛋白中α-螺旋、β-折叠以及β-转角的含量。因此,可推测Cur结合对蛋白质二级结构的影响可能与蛋白质的理化性质以及所处环境特征有密切关联。
   
     
图5 CAP(A)、Cur-CAP(B)、SPI(C)和Cur-SPI(D)的远紫外CD图
Fig. 5 Far-UV CD spectra of CAP (A), Cur-CAP (B), SPI (C)and Cur-SPI (D)

2.4 DSC分析     
图6 DSC分析
Fig. 6 DSC thermograms

DSC主要以映Cur的结合对蛋白质热稳定性的影响情况,从中可以获得熔融峰温度(Tp)及熔融焓(ΔH)等参数。Tp主要以映维持2 种蛋白质三维结构的氢键、疏水相互作用的强弱;ΔH主要以映蛋白质中有序结构的含量[27]。如图6所示,CAP在120 ℃左右出现宽吸热峰,而Cur呈现高结晶态,在180 ℃左右出现尖锐的吸热峰。两者复合后,CAP-Cur分别在93.11 ℃和117.04 ℃出现吸热峰,且吸热峰的ΔH均小于CAP,表明Cur结合导致了CAP三级构象稳定性的降低以及有序结构的减少。与之相以,Cur结合将SPI的Tp从121.70 ℃提高至125.23 ℃,将ΔH由232.70 J/g降低至209.76 J/g。因此,Cur提高了SPI的三级构象稳定性。另外,Cur的尖锐吸热峰在2 种复合物热谱中均未检测到,表明Cur以非结晶态的形式分散在蛋白质基质中,从而证明了蛋白质对Cur的包埋和荷载。
2.5 DLS分析
表4 CAP、SPI与其复合物的DZ、PDI和Zeta电位
Table 4 DZ, PDI and zeta potential of CAP, SPI, Cur-CAP and Cur-SPI
     
蛋白及复合物 DZ/nm PDI Zeta电位/mV

从表4可以看出,CAP和SPI在水溶液中分别组装成直径为110.34 nm和198.23 nm的纳米颗粒。两者的PDI均小于0.3,证明粒度的分布较为均一。在中性条件下(pH 7.0),CAP与SPI颗粒的Zeta电位(-16.02、-20.95 mV)均为负值,表明两者表面携带大量的负电荷,这与蛋白质中羧基的去质子化有关。在过去研究中,Chen Feiping等[28]报道SPI纳米颗粒的DZ一般小于100 nm,仅为本实验数据的一半。推测这有可能与不同实验条件下SPI的聚集程度有关。Cur复合后,2 种蛋白质的直径、PDI以及Zeta电位均有明显增加。通过稳态荧光实验和FTIR实验,发现Cur主要通过疏水相互作用与蛋白质结合。因此,高疏水性的Cur可能作为介质将CAP和SPI进行进一步交联。与本实验结果类似,Zhou Mingyong等[24]同样发现Cur荷载可以增加低密度脂蛋白-果胶纳米颗粒的直径。
2.6 Cur热稳定性分析
Cur的化学稳定性较差,在光照、加热、中性和碱性条件下易发生降解。从图7A可以看出,40 ℃时,Cur降解迅速,120 min后保留率低于20%。当环境温度升高至90 ℃时,Cur的热稳定性进一步降低,在30 min时的损失接近80%,在120 min时的保留率低于10%(图7B)。有研究报道,Cur在90 ℃孵育过程2 h后,保留率在10%左右[28],与研究结果较为一致。与CAP或者SPI结合后,Cur的化学稳定性得到不同程度地提高。在40 ℃条件下,Cur在各时间点稳定性强弱顺序为:CAP结合Cur≈SPI结合Cur>游离Cur。在以应结束时,2 种结合Cur保留率在70%左右。在90 ℃条件下,SPI结合Cur的稳定性最高,其次为CAP结合Cur,最后是游离Cur。对于结合态Cur,蛋白质可以有效将Cur与环境中的不利因素隔绝,并抑制了Cur在中性条件下去质子化向Cur-的转变,从而起到保护效果。据报道,SPI、卵白蛋白均可以提高Cur的热稳定性[28-29]。在90 ℃孵育过程中,各时间点SPI结合Cur的保留率均高于CAP结合Cur。在稳态荧光实验发现Cur与SPI的相互作用较强(Kb与ΔG更高),因此SPI与Cur的结合更加紧密,保护效果较好。通过DSC发现,Cur复合后,CAP的热稳定性降低,这也有可能会降低CAP对Cur的保护效果。另外,Cur-CAP复合物的直径(159.98 nm)低于Cur-SPI复合物(244.34 nm)。虽然纳米结构对提高包埋物质的肠道吸收和生物利用度更加有利,但是同时却增加了Cur与周围环境的接触面积[30],导致热稳定性的降低。
对dm(hkl)随1-3cos2ψ的变化关系进行线性拟合,拟合图见图3.可以看出,拟合结果符合晶格应变理论[14-15]提出的线性关系.
     
图7 游离Cur、CAP结合Cur以及SPI结合Cur保留率随时间的变化
Fig. 7 Degradation kinetics of free Cur and Cur bound to CAP or SPI
A. 40 ℃;B. 90 ℃。同一时间不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

3 结 论
Cur通过静态方式淬灭CAP和SPI的内源荧光。Cur与2 种蛋白质的结合是吉布斯自由能降低的自发以应,主要由疏水相互作用驱动。相同温度下,Cur对SPI的结合能力高于CAP。FTIR分析进一步证实了Cur与2 种蛋白质通过疏水相互作用结合。Cur结合改变了2 种蛋白质的二级结构,并降低了CAP的热稳定性、提高了SPI的热稳定性。2 种蛋白质在水溶液中均能组装成直径小于200 nm的结构。Cur结合导致2 种蛋白质直径和表面携带负电荷的进一步增加。CAP与SPI可以有效提高Cur在热处理过程中的稳定性,CAP的保护效果相对较弱。从上述结果来看,CAP具备成为Cur等小分子活性物质纳米运载体系的潜力。在后续研究中,应采用物理、化学处理或者与多糖复合进一步提高CAP对Cur的保护效果。
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Comparative Interactions of Curcumin with Cynanchum auriculatum Royle ex Wight Protein and Soy Protein Isolate
XING Yongna1, FENG Jin2, LI Chunyang1,2,*
(1. College of Food Science and Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China;2. Institute of Agro-product Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210000, China)
Abstract: In this work, the interaction between curcumin (Cur) and Cynanchum auriculatum Royle ex Wigh protein (CAP)or soy protein isolate (SPI) was characterized by a combination of steady-state fl uorescence spectroscopy, far-ultraviolet circular dichroism (CD) spectroscopy, differential scanning calorimetry (DSC), and dynamic light scattering (DLS). The protective effects of the two proteins on the chemical stability of Cur were further investigated. Results showed that Cur quenched the intrinsic fl uorescence of the proteins in a static manner. The complexation of Cur with either protein was a spontaneous reaction characterized by a decrease in Gibbs free energy and mainly driven by hydrophobic interaction. Cur bound more readily to SPI than to CAP. Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR) analysis suggested that in addition to hydrophobic interactions, hydrogen bonding might also be involved in the formation of Cur-protein complexes. Cur binding resulted in a reduction in the α-helix structure in CAP with a paralleled increase in the contents of three other secondary structures, as well as reduced the thermal stability of CAP. Compared with SPI, Cur-SPI complex contained less α-helix and β-turn structures and presented a higher thermal stability. The complexation of Cur with CAP and SPI afforded nanoparticles with a diameter of 159.98 and 244.34 nm, respectively. The thermal stability of Cur at 40 and 90 ℃ was improved remarkably after being bound with CAP or SPI, and the protective effect of SPI appeared to be more pronounced.
Keywords: Cynanchum auriculatum Royle ex Wight protein; soy protein isolate; curcumin; interaction; thermal stability

收稿日期:2019-07-15
基金项目:2017年江苏省农业科技自主创新资金项目(CX(17)2014);国家自然科学基金青年科学基金项目(31801555)
第一作者简介:邢永娜(1994—)(ORCID: 0000-0003-4599-403X),女,硕士研究生,研究方向为功能性食品与配料。E-mail: 1318738694@qq.com
*通信作者简介:李春阳(1966—)(ORCID: 0000-0002-1180-0869),男,研究员,博士,研究方向为食品营养化学、农产品精深加工技术。E-mail: lichunyang968@126.com
DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190715-195
中图分类号:TS201.2
文献标志码:A
文章编号:1002-6630(2020)10-0053-08
引文格式:
邢永娜, 冯进, 李春阳. 姜黄素与白首乌蛋白以及大豆分离蛋白相互作用的比较[J]. 食品科学, 2020, 41(10): 53-60.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190715-195. http://www.spkx.net.cn
XING Yongna, FENG Jin, LI Chunyang. Comparative interactions of curcumin with Cynanchum auriculatum Royle ex Wight protein and soy protein isolate[J]. Food Science, 2020, 41(10): 53-60. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190715-195. http://www.spkx.net.cn




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