具有抑制HT-29细胞增殖及益生功能乳酸杆菌的筛选

奥鹏网院作业

具有抑制HT-29细胞增殖及益生功能乳酸杆菌的筛选具有抑制HT-29细胞增殖及益生功能乳酸杆菌的筛选

岳莹雪，闫芬芬，李柏良，宋 月，史佳鹭，关嘉琦，霍贵成*

（东北农业大学 乳品科学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030）

摘 要：以15 株乳酸杆菌为实验菌株，研究其抑制HT-29细胞增殖效果，初筛选抑制效果较好的8 株菌进行黏附HT-29细胞实验和抗氧化能力实验。结果表明：抑制HT-29细胞增殖效果较好的8 株菌抑制率为10.02%～15.63%；对HT-29细胞的黏附率为3.9%～19.1%。抗氧化能力实验结果显示活菌悬液、菌体细胞破碎液、菌体发酵上清液还原能力为23.43～271.76 μmol/L的L-半胱氨酸盐酸盐量，DPPH自由基清除率为10.89%～50.42%，羟自由基清除率为7.46%～33.16%，超氧阴离子自由基清除率为17.64%～46.13%，脂质抗氧化能力为10.45%～51.91%。经主成分分析表明嗜酸乳杆菌KLDS1.0901综合性能最佳，嗜酸乳杆菌KLDS1.1003其次。模拟胃肠道的实验结果显示上述2 株菌具有较好的耐受胃肠液能力，经过模拟胃肠道后活菌数可在108 CFU/mL以上，存活率可达50%。总体上嗜酸乳杆菌KLDS1.0901和KLDS1.1003具有较高的抑制HT-29细胞增殖能力和良好的益生功能，其中嗜酸乳杆菌KLDS1.0901更佳。

关键词：乳酸杆菌；抑制；黏附；抗氧化；耐受性

结直肠癌是第三大常见的癌症，全世界每年诊断出超过一百万例[1]。根据全球结直肠癌死亡率和发病率趋势的调查，到2030年，预计结直肠癌疾病将增加60%，达到220多万新病例和110万人死亡[2]。高脂肪饮食、肥胖、饮酒、胃肠道慢性炎症和慢性便秘被认为是发生结直肠癌的主要原因。尽管基于手术的多学科治疗（化疗、放疗和单克隆抗体）大大提高了结直肠癌患者的生存率，但晚期患者5 a内的生存率仅为10%左右[3]。目前，大多数针对癌症的化疗药物通过诱导细胞凋亡发挥其作用[4]。但这些化疗药物有不容忽视的副作用，例如化疗引起的黏膜炎和放疗引起的腹泻，这些药物损害了肠黏膜并改变了吸水能力[5]。大量研究集中在结肠癌的机制上，结肠癌的有效预防和治疗已成为医学研究的焦点[6]。

乳酸菌对人体健康的潜在益处包括刺激免疫系统、平衡肠道菌群、降低血清胆固醇及降低肿瘤风险等[7]。乳酸菌抗癌作用的潜在机制可能为改变宿主肠道微生物群的种类或数量、提高宿主的免疫应激、抑制肿瘤生长、控制潜在有害细菌生长、产生抗肿瘤或抗诱变的代谢物等[8]。乳酸菌的活菌体具有激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的功能，诱导结肠癌细胞凋亡并且可抑制Caco-2细胞[9]以及HT-29细胞[10]增殖。研究表明，副干酪乳杆菌M5的活菌体在体外可发挥免疫调节作用[11]和抗结肠癌功能[12]。Cindy等[13]研究发现，嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌能够增加结直肠癌细胞系（LS513）的细胞凋亡诱导，表明这些乳酸菌可能具有抗癌活性。

生物氧化是生命有机体的重要生理过程，为生命提供能量的同时产生活性氧。研究表明一些疾病如癌症、动脉粥样硬化及心血管疾病等都与体内活性氧的产生有关，但抗氧化防御系统不能完全有效地抵御或修复氧化带来的损伤[14]。氧化DNA损伤诱导是某些药物诱发癌症癌变的初步反应，而乳酸菌可以有效地减少氧化DNA损伤所造成的癌症[15]。研究表明，口服乳酸菌及其代谢产物降低了活性氧族积累的风险，也降解了超氧化物阴离子和过氧化氢[16]。体外实验表明，植物乳杆菌MA2可耐受高达2.0 mmol/L的过氧化氢，其发酵物（发酵上清液、完整细胞和无细胞提取物）具有较强的还原能力、脂质过氧化抑制能力、Fe2＋螯合能力以及各种自由基清除能力。另外，发酵上清液和细胞匀浆均显示出谷胱甘肽过氧化物酶活性和超氧化物歧化酶活性[17]。

本实验以传统发酵乳制品中分离出的15 株乳酸杆菌为研究对象，以具有良好黏附性能和益生功能的商业菌株LGG作为对照，对乳酸杆菌抑制HT-29细胞增殖、黏附性及其抗氧化性进行研究。筛选出高抑制率乳酸杆菌，再通过主成分分析的方法筛选出高黏附性以及良好抗氧化性的乳酸杆菌，并对筛选出的菌株进行模拟胃肠道耐受性评价，以期为乳酸菌功能食品的开发提供参考。

1 材料与方法1.1 材料与试剂

15 株乳酸杆菌由东北农业大学乳品科学教育部重点实验室工业微生物菌种保藏中心提供，鼠李糖乳杆菌LGG ATCC 53103用作参考菌株，并已通过16S rRNA基因测序鉴定。

那年，记得是深秋，父亲搭车进城来看我们，带来了田里新收的大米和一袋面条。“没上农药化肥，专门留了二分地给自己种的，只用农家肥，无污染，保证绿色环保有机，让孙女吃些，好长身体。”父亲放下粮袋，笑着说。我掂量了一下，大米有五十来斤，面条有三十多斤。鼓鼓囊囊两大麻袋，不知他老人家一路怎么颠簸过来的。老家到这个城市有近一百华里路，父亲也是快八十岁的老人了。看着父亲一头的白发和驼下去的脊背，我没有说什么，心里一阵阵温热和酸楚。

人体结肠腺癌细胞系HT-29细胞株 青旗（上海）生物技术发展有限公司；MULTICELL胎牛血清 维森特生物技术（南京）有限公司；高糖DMEM培养基 美国HyClone公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒 美国APExBIO公司；青霉素-链霉素双抗溶液、胰蛋白酶-EDTA 美国Gibco公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶、1,1-苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、邻二氮菲、半胱氨酸、抗坏血酸、叔丁醇、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚 北京博奥拓达科技有限公司；硫酸亚铁、双氧水、无水乙醇、三氯化铁、铁氰化钾 北京奥博星生物技术有限责任公司；磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS） 赛默飞世尔科技公司；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA） 湖北广奥生物科技有限公司；MRS培养基采用参考文献[18]的方法制备。

1.2 仪器与设备

Heal Force型细胞培养箱 力康医疗生物科技控股有限公司；DMLB型光学显微镜 德国徕卡显微镜与系统公司；LDZF-50KB-II立式蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；680型酶标仪 美国Bio-Rad公司；CJ-2D超净工作台、电热恒温水浴锅 天津泰斯特仪器有限公司；DHP-927型电热恒温培养箱 上海一恒科技有限公司；JY-92-IIN超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；台式冷冻高速离心机 美国Sigma公司；DU800紫外-可见分光光度计 美国Beckman公司。

聆听是欣赏音乐的最基本手段，学生通过对音乐作品细致聆听，可以形成有效学习体验。欣赏音乐时的聆听，不是随意的听听音乐，而是在教师指导下的音乐内质情感内涵的挖掘，进而帮助学生形成音乐欣赏能力。欣赏音乐的聆听，需要学生能够用心去听，用心去感受，只有与音乐形成某种程度的共鸣，这样的聆听欣赏才会见到效果。聆听是欣赏音乐的最基本手段，教师要对聆听方式、聆听感知作出对应设计，以提升学生欣赏音乐的有效性。

1.3 方法

1.3.1 乳酸杆菌的培养

所用供试乳酸杆菌以2%（V/V）的接种量接种于MRS肉汤培养基中，37 ℃恒温培养箱培养，连续传代3 次，其中第3代培养18 h以恢复菌种活力，并调整菌液为各实验所需浓度。

1.3.2 HT-29细胞的培养

从液氮罐中取出HT-29细胞，将冻存管迅速置于37 ℃水浴中复苏细胞。离心收集细胞，加入4 mL高糖DMEM培养液（含体积分数10%的热灭活胎牛血清、1%青霉素-链霉素），置于37 ℃、5% CO2条件下培养，每隔1～2 d更换培养液，待细胞生长状况良好时（70%～80%融合），按实验所需浓度接种于96 孔板或12 孔板进行实验。

1.3.3 CCK-8法检测乳酸杆菌对HT-29细胞的增殖抑制作用

隔代照料孙子女对中老年人心理健康的影响研究..................................................................................................................................................王亚迪（47）

参照CCK-8试剂盒说明书略作修改。具体为当培养瓶中的HT-29细胞达到70%～80%融合后，弃去旧的培养液，PBS清洗3 次，用1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA进行消化，2 min左右后吹散均匀。1 000 r/min离心5 min，弃掉上清液，用含双抗DMEM培养液调整细胞浓度为104 个/mL，每孔100 μL细胞悬液接种于96 孔培养板，待96 孔板中的细胞完全贴壁，去掉旧培养液，PBS清洗3 次后加入200 μL不含双抗的高糖DMEM菌悬液，以活菌体与细胞感染比为10∶1做乳酸杆菌对结肠癌HT-29细胞增殖抑制的影响实验。同时设置空白对照组，每组设置5 个重复孔。乳酸杆菌（活菌体）105 CFU/mL作用HT-29细胞48 h后去掉旧培养液，PBS清洗3 次，每孔加110 μL混合液（100 μL无双抗DMEM培养液＋10 μL CCK-8），随后在细胞培养箱中孵育1～2 h，用酶标仪在450 nm波长处测OD值。抑制率按式（1）计算：

   

1.3.4 乳酸杆菌对HT-29细胞的黏附性实验

采用占萌等[19]的方法，并稍作改动。将HT-29细胞以105细胞/孔的浓度接种至12 孔板中，孔中培养液1～2 d更换一次，待细胞贴壁完全后，继续培养约5 d，细胞铺满孔板时进行实验。在进行实验的前一天，向孔板中更换不含双抗的高糖DMEM培养液。添加乳酸杆菌之前，用无菌PBS洗涤孔板中单层细胞3 次，再向每个孔中加入500 μL浓度为109 CFU/mL（V0）的乳酸杆菌。将12 孔板转移至37 ℃、5% CO2培养箱中，培养2 h后用PBS洗涤12 孔板中每孔的单层细胞3 次以上，除游离的、未附着的细菌细胞。然后向每孔中加入250 μL 0.25%胰蛋白酶-EDTA孵育5 min；再加入250 μL含血清高糖DMEM培养液终止消化。收集每孔内溶液并分别进行10 倍梯度稀释，采用平板菌落计数法检测培养后菌株的活菌数（V1）。黏附率按式（2）计算：

张仲平双手按着曾真的双肩，严肃地对她说：“听着，情况紧急，现在真的很危险，你在车里等我，把车门锁上，我要去看看情况。”

   

1.3.5 乳酸杆菌抗氧化能力的测定

1.3.5.1 供试样品的制备

本文在现有文献的基础上，构建了理论框架与相应假设，通过三个实验来检验不同沟通方式对顾客感知心流体验有无影响及其具体的内在机制。研究结论将对互联网企业如何更好地服务于用户之间的沟通提供实践指导和理论依据。

将活化好的乳酸杆菌8 000 r/min离心10 min，收集上清液，0.22 μm滤膜过滤，即为菌体发酵上清液。离心后的沉淀用PBS冲洗2 遍，8 000 r/min离心10 min，收集菌体，重悬于PBS中调整菌体浓度为109 CFU/mL，即为活菌悬液。

细胞破碎液的制备：将菌悬液置于冰浴中，超声破碎菌体细胞（超声条件：800 W，超声3 s，停5 s，持续15 min），显微镜下观察无完整菌体，8 000 r/min离心10 min，收集上清液，即为菌体细胞破碎液。

1.3.5.2 溶液还原性的测定

参照Lin等[20]的方法，并有适当改动。取0.5 mL样品加入0.5 mL 1%的铁氰化钾和0.5 mL的PBS（pH 7.2）混匀后，于50℃放置20 min，快速冷却，加入0.5 mL 10%的TCA溶液，6 000 r/min离心10 min，取上清液1 mL加入1 mL的0.1%的三氯化铁溶液混匀，静置10 min，700 nm波长处测OD值。设置不同剂量的半胱氨酸组作为标准，将样品的OD值，换算为标准组的剂量（μmol/L）。重复实验3 次，取平均值。

1.3.5.3 DPPH自由基清除能力的测定

在1 mL供试样品中加入0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液1 mL，振荡混匀，再在室温条件下避光反应30 min，6 000 r/min离心10 min，取上清液，517 nm波长处测定样品OD值[20]。空白为用1 mL无水乙醇取代1 mL DPPH反应；对照为PBS取代样品反应，每组重复3 次，取平均值。按照式（3）计算DPPH自由基清除率：

   

1.3.5.4 羟自由基清除能力的测定

在反应体系中加入1 mL 2.5 mmol/L的邻菲罗啉溶液，1 mL PBS和1 mL各供试样品充分混匀，再加入1 mL 2.5 mmol/L的硫酸亚铁溶液，充分混匀，再加入1 mL 20 mmol/L的过氧化氢溶液，37 ℃水浴1.5 h，在536 nm波长处测定样品OD值[21]。空白为1 mL去离子水替代1 mL样品反应；对照为1 mL去离子水替代1 mL过氧化氢反应，每组重复3 次，取平均值。按照式（4）计算羟自由基清除率：

   

1.3.5.5 超氧阴离子自由基清除能力的测定

在2.8 mL pH 8.2的0.05 mol/L Tris-HCl中加入0.1 mL 0.05 mol/L的邻苯三酚溶液、0.1 mL各样品，充分混匀，室温条件下避光反应4 min，加入1 mL 8 mol/L盐酸终止反应，于320 nm波长处测OD值[17]。空白为去离子水代替样品反应。按照式（5）计算超氧阴离子自由基清除率：

   

1.3.5.6 脂质抗氧化能力的测定

在反应体系中加入1 mL亚油酸乳化液、0.5 mL的PBS、0.2 mL 0.01%的FeSO4溶液和抗坏血酸溶液，再加入0.5 mL样品溶液，旋涡混匀1 min，37 ℃避光反应12 h，再次混匀；取2 mL反应液加入0.2 mL 0.4%的三氯乙酸溶液、2 mL 0.8%的硫代巴比妥酸溶液以及0.2 mL 0.4%的2,6-二叔丁基对甲苯酚溶液，混匀，沸水浴下反应30 min，冷却后加入2 mL氯仿，3 000 r/min离心10 min取上清液，在532 nm波长处测OD值[21]。空白为用0.5 mL PBS替代样品。脂质抗氧化能力按式（6）计算：

项目单位应于项目结题前完成项目任务的执行，并于项目结题后三个工作日内向中心报送结项报告；结项报告包括项目执行情况、实施效果、自我评估、宣传情况及经费使用情况等内容；结项报告需经区县（自治县）民政局审核并盖章；由重庆市婚管中心组织专家评审团赴项目单位进行结项评估。

   

1.3.6 主成分分析

突变操作产生的栖息地与原栖息地差异巨大，可随机产生一个新栖息地Hm替换原栖息地H，即M(λ,μ):H←Hm。

筛选出8 株具有抑制HT-29细胞增殖的乳酸杆菌，然后对HT-29细胞进行黏附实验，同时对菌株抗氧化能力实验进行进一步筛选，最后对乳酸杆菌对HT-29细胞黏附性以及抗氧化能力指标进行主成分分析，以期筛选出性能最优的益生菌。

1.3.7 模拟胃肠道实验

1.3.7.1 模拟胃液和胰液的配制

模拟胃液的配制：胃蛋白酶（1∶10 000）用灭菌（121 ℃，20 min）的PBS（pH 7.2）溶解配制成质量浓度3 mg/mL的胃蛋白酶溶液。用1 mol/L盐酸溶液调节至pH 3.0，经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后备用。模拟胰液的配制：胰蛋白酶（1∶1 500）用灭菌（121 ℃，20 min）的PBS（pH 7.2）溶解配制成质量浓度为1 mg/mL溶液，并用1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH 7.0后，经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后备用[22]。

1.3.7.2 模拟胃肠液耐受性实验

（二）准确把握任务中的知识宽度。数学教师需在探究任务当中对教材知识进行体现，并且为对初中生的知识面进行拓展，对其数学思维进行发散，数学教师还需在探究任务当中融入课外知识，以此来对初中生总体学习需求加以满足，促使其学习质量进行提高。比如，探究“把三角形面积进行四等分”的若干方法之时，假设按照类分能够分为两种，首先进行二等分，之后在进行一次二等分，或者直接进行四等分。此时数学教师可引导初中生进行探究，寻找一种最佳解决方法，之后发散学生思维，让其根据三角形的等分经验来对矩形面积的四等分的方法加以探究，这样能够对学生的知识面加以有效拓展。

参照Nazzaro等[23]的方法并作修改，取5 mL活化好的嗜酸乳杆菌KLDS1.0901、KLDS1.1003菌液离心（8 000 r/min，4 ℃，10 min）收集菌体，用pH 7.2的灭菌PBS洗涤2 次再次离心收集菌体，然后在37 ℃、pH 3的人工胃液中孵育0、1、2、3 h，采用平板菌落计数法计算活菌数量[24]。

同上，离心回收（8 000 r/min，4 ℃，10 min）在37 ℃人工胃液中孵育3 h的菌体，用pH 7.2的灭菌PBS洗涤2 次再次收集菌体，然后在37℃、pH 7的人工肠液中孵育0 、1、2、3 h，采用活菌计数法计算活菌数量。

“行胜于言”这四字它所表达的意思有两层，一方面，“行胜言”是说“做比说强”，鼓励我们要踏实、要实干；另一方面，“行胜于言”是说不能只埋头苦干，还要会“说”，要会表达。总之告诫我们行动是精髓，也是我们能否实现目标的关键，在做人做事方面都要务实。

1.4 数据统计与分析

应用SPSS 16.0进行数据处理、显著性分析和主成分分析，Origin 8.5进行绘图分析。

2 结果与分析2.1 抑制HT-29细胞乳酸杆菌的筛选

16 株菌对HT-29细胞均表现出一定的抑制效果，且对HT-29细胞的抑制作用差别显著（2.78%～15.63%，P＜0.05），如表1所示。其中嗜酸乳杆菌KLDS1.1003、KLDS1.0901、KLDS1.0902和植物乳杆菌KLDS1.0386、KLDS1.0318、KLDS1.0344、KLDS1.0317、1-2的抑制活性均高于参考菌株LGG，分别为15.63%、15.00%、12.70%、12.52%、11.90%、11.81%、11.57%和10.02%，并显著高于其他菌株。鼠李糖乳杆菌KLDS1.0205和5，植物乳杆菌1-5、2-2、4-4、4-5和8-6的抑制率均低于参考菌株LGG。Wang Shumei等[12]初筛乳酸杆菌时，在乳酸杆菌与HT-29细胞感染比10∶1、48 h的条件下筛选出具有抑制HT-29细胞增殖的乳酸杆菌，抑制率为5%～32%，其中多数为百分之十几，与本研究结果一致。高锦锦[25]利用不同浓度嗜酸乳杆菌与HT-29细胞作用，在与本实验相同的条件时即可达到抑制HT-29细胞增殖的显著效果。而LGG对结肠癌有潜在的保护作用并且可诱导细胞凋亡和减轻炎症[26]。因此，筛选8 株高于参考菌株的乳酸杆菌进行黏附HT-29细胞以及抗氧化功能的实验。

表 1 乳酸杆菌对HT-29细胞的抑制率
Table 1 Inhibition rates of Lactobacillus against proliferation of HT-29 cells

     

注：字母不同表示差异显著（P＜0.05）。

菌株编号 抑制率/%L. acidophilus KLDS1.0901 15.00±1.5ab L. acidophilus KLDS1.0902 12.70±2.09bc L. acidophilus KLDS1.1003 15.63±2.61a L. plantarum KLDS1.0317 11.57±1.17c L. plantarum KLDS1.0318 11.90±1.27c L. plantarum KLDS1.0344 11.81±1.09c L. plantarum KLDS1.0386 12.52±1.67bc L. plantarum 1-2 10.02±0.55cd L. rhamnosus LGG 8.40±1.00de L. rhamnosus KLDS1.0205 7.26±1.89e L. rhamnosus 5 2.78±2.12f L. plantarum 1-5 7.20±1.60e L. plantarum 2-2 6.06±0.64e L. plantarum 4-4 7.00±0.87e L. plantarum 4-5 6.63±1.26e L. plantarum 8-6 5.69±0.89e

2.2 乳酸杆菌对HT-29细胞的黏附能力

黏附性强弱是益生菌筛选过程中的首要指标，较强的肠道黏附能力能让乳酸杆菌在肠道停留更长的时间，是后续发挥益生功能的前提条件[27]。乳酸杆菌与HT-29细胞作用后黏附能力如图1所示。9 株乳酸杆菌活菌体对HT-29细胞的黏附率差别显著（3.9%～19.1%，P＜0.05）。参照菌株LGG对HT-29细胞的黏附率为6.1%。其中黏附率依次为嗜酸乳杆菌KLDS1.0901＞植物乳杆菌KLDS1.0318＞植物乳杆菌KLDS1.0386＞植物乳杆菌KLDS1.0344，明显高于其他菌株并高于参照菌株LGG，分别为19.10%、17.00%、13.80%和10.39%。其他菌株黏附率较低均不足6%。本实验中，嗜酸乳杆菌KLDS1.0901与植物乳杆菌KLDS1.0318的黏附率较高且高于参照菌株。同时，9 株乳酸杆菌对细胞的黏附能力存在菌种差异性的同时也存在菌株差异性。实验所用乳酸杆菌可以黏附的原因可能是脂磷壁酸、表层蛋白、菌毛、肽聚糖以及脂多糖等这些可以与肠道细胞表面的受体进行特异性结合的黏附素[28]。

     

图 1 乳酸杆菌对HT-29细胞的黏附率
Fig. 1 Adhesion rates of 9 strains of Lactobacillus to HT-29 cells

2.3 乳酸杆菌抗氧化能力

2.3.1 还原性

日前，上海市某游乐园对儿童购票“限高”的新闻引发舆论关注。一位10岁小女孩由于身高超过了1.4米的“儿童票身高上限”，被游乐园要求购买成人票。孩子家长认为，以身高定票价既不公平也不合理，要求对方以年龄界定儿童票。园方则表示，儿童一般没有身份证，其实际年龄不容易快速直观地认定，若按年龄销售儿童票，需要验票工作人员一一查验核对儿童的户口簿或学生证明等身份证件，影响人群快速通行，造成拥堵甚至安全隐患。

乳酸杆菌的还原能力以半胱氨酸还原标准曲线计算，如图2所示。结果表明9 株乳酸杆菌均具有一定还原能力，范围为23.43～271.76 μmol/L的L-半胱氨酸盐酸盐量，且每种样品均具有显著差异（P＜0.05）。其中活菌悬液还原能力最高的为嗜酸乳杆菌KLDS1.0901（170.84 μmol/L），其次为嗜酸乳杆菌KLDS1.1003（161.11 μmol/L），其他菌株均在50 μmol/L以上。嗜酸乳杆菌KLDS1.1003与嗜酸乳杆菌KLDS1.0902菌体细胞破碎液的还原能力较强分别为193.51、175.69 μmol/L。其他菌株均在20 μmol/L以上。在菌体发酵上清液的还原能力中较强的为LGG（271.76 μmol/L）与嗜酸乳杆菌KLDS1.0901（246.16 μmol/L），其他菌株均在70 μmol/L以上。由实验结果推断，不同属及同属不同的菌株具有还原能力的活性物质含量不同。还原能力一般为菌体发酵上清液＞活菌悬液＞菌体细胞破碎液，其中LGG菌体发酵上清液还原能力最佳。

     

图 2 乳酸杆菌的还原能力
Fig. 2 Reducing capacity of live cell suspensions, lysates and culture supernatants of nine strains of Lactobacillus

2.3.2 DPPH自由基清除能力

如图3所示，9 株乳酸杆菌清除DPPH自由基范围为10.89%～50.42%。活菌悬液清除能力最强的为嗜酸乳杆菌KLDS1.1003（44.35%）且与其他菌株差异显著（P＜0.05），其他菌株均在19%以上。同时嗜酸乳杆菌KLDS1.0901细胞破碎液清除率较强为27.34%，与植物乳杆菌KLDS1.0344和LGG无显著差异（P＞0.05），与其他6 菌株差异显著（P＜0.05），其他菌株均在10%以上。在菌体发酵上清液中清除能力较强的为鼠李糖乳杆菌LGG（50.42%），与其他菌株差异显著（P＜0.05），其他菌株均在27%以上。乳酸杆菌清除DPPH自由基能力多数为菌体发酵上清液大于活菌悬液，而菌体细胞破碎液的清除能力最差，说明各菌株的DPPH自由基清除能力很可能主要存在于胞外代谢产物中。本实验结果嗜酸乳杆菌KLDS1.1003活菌悬液DPPH自由基清除率为44.10%。Son等[29]从韩国泡菜中分离出的植物乳杆菌SC61的DPPH自由基清除活性为51.06%，与本实验结果相似。

     

图 3 乳酸杆菌DPPH自由基清除能力
Fig. 3 DPPH free radical scavenging activities of live cell suspensions,lysates and culture supernatants of nine strains of Lactobacillus

2.3.3 羟自由基清除能力

如图4所示，9 株乳酸杆菌清除羟自由基范围为7.46%～33.16%。活菌悬液清除能力较强的为植物乳杆菌KLDS1.0317（33.16%）、植物乳杆菌1-2（28.45%），与其他菌株具有显著差异（P＜0.05），其他菌株均在10%以上。植物乳杆菌KLDS1.0318、KLDS1.0386、KLDS1.0344、KLDS1.0317和LGG的菌体细胞破碎液清除率与其他菌株差异显著（P＜0.05），最高的为植物乳杆菌KLDS1.0318（26.77%），其他菌株均在17%以上。在菌体发酵上清液中清除能力最强的为植物乳杆菌KLDS1.0318（10.65%），与部分菌株具有显著差异（P＜0.05），其他菌株均在8%以上。乳酸杆菌活菌悬液清除羟自由基能力多数大于菌体细胞破碎液，最低的为菌体发酵上清液，说明这几株菌的羟自由基清除活性成分主要存在于其胞内成分和完整菌体中。Tang Wei等[17]发现植物乳杆菌MA2清除羟自由基率依次为：完整细胞（（58.52±0.90）%）＞菌体细胞破碎液（（30.82±0.40）%）＞发酵上清液（（1.27±2.43）%）。与本实验3 种供试样品清除能力一致。

     

图 4 乳酸杆菌羟自由基清除能力
Fig. 4 DPPH free radical scavenging activities of live cell suspensions,lysates and culture supernatants of nine stains of Lactobacillus

2.3.4 超氧阴离子自由基清除能力

     

图 5 乳酸杆菌超氧阴离子自由基清除能力
Fig. 5 Superoxide anion radical scavenging activities of live cell suspensions, lysates and culture supernatants of Lactobacillus

如图5所示，9 株乳酸杆菌超氧阴离子自由基清除率范围为17.64%～46.13%。活菌悬液清除能力较强的为LGG（46.13%）、植物乳杆菌KLDS1.0344（33.61%），两者差异显著（P＜0.05），其他菌株均在17%以上。嗜酸乳杆菌KLDS1.0901的菌体细胞破碎液清除率较强为42.32%，且与其他菌株差异显著（P＜0.05）。其他菌株均在33%以上。在菌体发酵上清液中清除能力较强的为植物乳杆菌KLDS1.0318（26.53%）与植物乳杆菌KLDS1.0344（26.19%），这两株不具有显著差异（P＞0.05），但与其他菌株差异显著（P＜0.05），其他菌株均在16%以上。本实验乳酸杆菌超氧阴离子自由基清除能力整体上为菌体细胞破碎液＞活菌悬液＞菌体发酵上清液，说明几株菌清除超氧阴离子自由基的活性物质大部分存在于胞内。李晓军等[30]发现菌株La5、菌株La8、保加利亚乳杆菌NQ2508以及长双歧杆菌NQ1501对超氧阴离子自由基的清除率均在20.00%以上，其中La5最高为22.29%，而本实验植物乳杆菌KLDS1.0344活菌悬液清除率为33.61%，相比较高于菌株La5。

2.3.5 乳酸杆菌脂质抗氧化能力

     

图 6 乳酸杆菌脂质抗氧化能力
Fig. 6 Anti-lipid oxidation capacities of live cell suspensions, lysates and culture supernatants of nine strains of Lactobacillus

如图6所示，9 株乳酸杆菌脂质抗氧化能力范围为10.45%～51.91%。活菌悬液清除能力较强的为植物乳杆菌KLDS1.0901（50.98%）和植物乳杆菌1-2（45.42%），其他菌株均在21%以上且每株菌之间都具有显著差异（P＜0.05）。植物乳杆菌KLDS1.0318与LGG的菌体细胞破碎液清除率较强，分别为51.96%和47.71%，且与其他菌株差异显著（P＜0.05），其他菌株均在10%以上。在菌体发酵上清液中清除能力较强的为植物乳杆菌1-2（32.97%)与其他菌株差异显著（P＜0.05），其他菌株均在22%以上。9 株乳酸杆菌脂质抗氧化能力在活菌悬液与菌体细胞破碎液中因菌株不同而强弱不同，但菌体发酵上清液为三者中最低，推断3 种物质脂质抗氧化能力因菌株而异。而乳酸杆菌抗氧化性能可能是因其不同且相对独立的抗氧化机制所致。

2.4 主成分分析

图7A为各个特性在各主成分中占的载荷分布图。成分1和2共占总变量的53.48%，第1主成分解释为活菌悬液还原性、活菌悬液DPPH自由基清除能力、破碎液DPPH自由基清除能力、上清液DPPH自由基清除能力、活菌悬液羟自由基清除能力、上清液超氧阴离子自由基清除能力、活菌悬液脂质抗氧化能力及上清液脂质抗氧化能力；第2主成分解释为破碎液还原性、上清液还原性、上清液DPPH自由基清除能力、破碎液羟自由基清除能力、活菌悬液超氧阴离子自由基清除能力、破碎液脂质抗氧化能力和黏附性。

图7B展示了所选益生菌的分布，根据图7B和表2可以看出，嗜酸乳杆菌KLDS1.0901的综合得分最高为2.48，高于对照菌株，其次为嗜酸乳杆菌KLDS1.1003得分为0.88，明显高于其他菌株，嗜酸乳杆菌KLDS1.0902的综合得分最低。该结果表明嗜酸乳杆菌 KLDS1.0901及嗜酸乳杆菌KLDS1.1003是8 株中具有良好黏附性以及抗氧化特性的益生菌。

     

图 7 因子载荷图（A）和因子得分图（B）
Fig. 7 Factor loading (A) and factor score plots (B)

表 2 各菌株因子得分
Table 2 Analysis of factor scores for each strain

     

菌株 得分第1主成分 第2主成分 总得分L. acidophilus KLDS1.0901 3.42 1.35 2.48 L. acidophilus KLDS1.0902 0.17 -3.93 -1.71 L. acidophilus KLDS1.1003 2.88 -1.51 0.88 L. plantarum KLDS1.0317 -2.19 -0.47 -1.40 L. plantarum KLDS1.0318 -2.07 1.38 -0.50 L. plantarum KLDS1.0344 -1.44 0.70 -0.46 L. plantarum KLDS1.0386 -1.53 1.24 -0.26 L. plantarum 1-2 -0.88 -1.22 -1.04 L. rhamnosus LGG 1.64 2.48 2.03

2.5 乳酸杆菌胃肠液耐受性

最后筛选出2 株益生功能较好的菌株，对其在模拟胃肠液中的耐受性进行实验。人体胃液的pH值不断变化，通常保持在pH 3.0左右，通过胃部的时间大约在1～2 h[31]，本实验选取胃液pH 3.0。肠液pH值通常为7.6左右，本实验选取pH 7.0。2 株乳酸杆菌在模拟胃肠液中的耐受性如图8所示。嗜酸乳杆菌KLDS1.0901与KLDS1.1003在pH 3.0的模拟胃液中3 h后活菌数虽略有下降，但均可达108 CFU/mL以上。经过模拟胃液耐受后再经过pH 7.0的模拟肠液3 h后活菌数同样有一定程度下降，但仍然可达108 CFU/mL以上。而乳酸杆菌发挥益生作用的菌体浓度一般为106～109 CFU/mL[14]。Matias等[32]研究嗜酸乳杆菌La5可以抵抗体外胃肠道检测，存活率显著，成活率超过50%。而本实验2 株乳酸杆菌经过模拟胃液3 h再经过模拟肠液3 h后菌体浓度都保持在108 CFU/mL，其成活率也可达50%，可发挥益生作用，因此具有较好的胃肠液耐受性。

主体间性课堂中课堂教学主体从单项传输走向多极主体互动；主体间性的课堂教学过程从认知活动走向交往活动，把传统的“以教定学”转变为“以学定教、教学相长”，把教学过程看做是师生共同发展的双向交往的过程。

     

图 8 嗜酸乳杆菌KLDS1.0901（A）和嗜酸乳杆菌KLDS1.1003（B）模拟胃肠液耐受性
Fig. 8 Stimulated gastrointestinal tolerance of L. acidophilus KLDS1.0901 (A) and L. acidophilus KLDS1.1003 (B)

3 结 论

本实验以15 株实验室保藏菌株为研究对象，以乳酸杆菌对HT-29细胞增殖的抑制、黏附以及抗氧化作用为筛选指标，筛选出对结肠癌细胞具有抑制效果的益生菌。初筛8 株对HT-29细胞具有抑制效果的乳酸杆菌。随后的乳酸杆菌抗氧化实验结果显示，乳酸杆菌活菌悬液、菌体细胞破碎液及菌体发酵上清液均具有一定抗氧化性，但不同抗氧化实验三者效果不同，并且不同菌株对HT-29细胞的黏附率也有所不同。主成分分析对黏附性以及抗氧化性进行综合评估，结果表明嗜酸乳杆菌KLDS1.0901的得分最高，嗜酸乳杆菌KLDS1.1003次之，且2 株菌具有良好的耐受性和抑制人体结肠腺癌细胞系HT-29细胞能力。

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Screening of Lactobacillus for Inhibitory Effects on HT-29 Cell Proliferationand Probiotic Properties

YUE Yingxue, YAN Fenfen, LI Bailiang, SONG Yue, SHI Jialu, GUAN Jiaqi, HUO Guicheng*
(Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Abstract: In this experiment, 15 strains of Lactobacillus were studied for their inhibition on HT-29 cell proliferation, and 8 of these were found to have strong inhibition effect and they were texted for their adhesion to HT-29 cells and antioxidant capacity. The results showed that the inhibition rates of the selected strains against the proliferation of HT-29 cells ranged from 10.02% to 15.63%, and the adhesion rates to HT-29 cells ranged from 3.9% to 19.1%. The reducing capacity of the live bacterial suspensions, cell lysates, and fermentation supernatants were 23.43–271.76 μmol/L L-cysteine hydrochloride,and the scavenging rates against 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), hydroxyl and superoxide anion radicals were 10.89%–50.42%, 7.46%–33.16%, and 17.64%–46.13%, respectively, and the inhibition rate against lipid oxidation were 10.45%–51.91%. Principal component analysis showed that L. acidophilus KLDS1.0901 had the best comprehensive performance, followed by L. acidophilus KLDS1.1003. The two strains had good tolerance to simulated gastrointestinal fluids. After digestion, the viable count could still be above 108 CFU/mL, and the survival rate was 50%. In general,L. acidophilus KLDS1.0901 and KLDS1.1003 had a strong ability to inhibit HT-29 cell proliferation and possessed good probiotic properties with L. acidophilus KLDS1.0901 being more effective.

Keywords: Lactobacillus; inhibition; adhesion; antioxidant; tolerance

收稿日期：2019-03-10

基金项目：“十三五”国家重点研发计划重点专项（2017YFD0400303）

第一作者简介：岳莹雪（1993—）（ORCID: 0000-0003-1554-5823），女，硕士研究生，研究方向为食品科学。E-mail: 852471506@qq.com

*通信作者简介：霍贵成（1958—）（ORCID: 0000-0003-3744-3529），男，教授，博士，研究方向为食品微生物与生物技术。E-mail: guichenghuo@126.com

DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190310-119

中图分类号：TS201.3

文献标志码：A

文章编号：1002-6630（2020）08-0108-08

引文格式：

岳莹雪, 闫芬芬, 李柏良, 等. 具有抑制HT-29细胞增殖及益生功能乳酸杆菌的筛选[J]. 食品科学, 2020, 41(8):108-115. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190310-119. http://www.spkx.net.cn

屋盖的施工通常是从斜屋檐开始，首先围着屋面来回浇筑，对混凝土进行拍实，然后铺设上一排0.9m大小的模板，接着继续浇筑混凝土，确保没有浇筑空隙，再次铺设模板，反复进行浇筑混凝土并拍实，一直到屋盖完全浇筑好。

YUE Yingxue, YAN Fenfen, LI Bailiang, et al. Screening of Lactobacillus for inhibitory effects on HT-29 cell proliferationand probiotic properties[J]. Food Science, 2020, 41(8): 108-115. (in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190310-119. http://www.spkx.net.cn

AS是一种复杂的慢性进行性疾病，是患者死亡的主要原因之一[11]。临床研究证实，二甲双胍具有血管保护作用，可降低心血管事件的发生率和病死率[12]。AS是T2DM患者最常见的并发症，血管内皮受损可进一步加剧AS恶化程度，而由此引发的心血管事件也是导致T2DM患者死亡的首要原因[13]。血管平滑肌细胞的增殖和迁移在AS发生、发展进程中发挥着重要的作用。有研究报道，二甲双胍可活化5′-腺苷单磷酸激活的蛋白激酶（AMPK），后者可通过抑制p53和干扰素γ诱导蛋白16（IFI16）来阻止动脉平滑肌细胞的增殖和迁移，从而干扰血管的重构、减缓AS的进程[14]。