黑灵芝多糖对丙烯酰胺致大鼠肝脏氧化 损伤的保护作用

奥鹏网院作业

黑灵芝多糖对丙烯酰胺致大鼠肝脏氧化 损伤的保护作用
江国勇，雷艾彤，杨 莹，余 强，谢建华，陈 奕*
（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）
摘 要：目的：研究黑灵芝多糖（Ganoderma atrum polysaccharides，PSG）对丙烯酰胺（acrylamide，AA）诱导大鼠肝脏氧化损伤的保护作用。方法：60 只雄性SD大鼠随机分成6 组，每组10 只，分别为正常组（等体积生理盐水）、模型组（20 mg/kg mb AA溶液）、阳性组（200 mg/kg mb N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）） 和PSG低、中、高剂量组（50、100、200 mg/kg mb）。各给药组给予相应剂量药物0.5 h后，口腔灌胃AA溶液，连续30 d。肝组织经苏木素-伊红染色，观察病理情况；测定血清谷丙转氨酶（alanine transaminase，ALT）、谷草转氨酶（aspartateaminotransferase，AST）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活力、甘油三酯（triglyceroles，TG） 浓度、白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-10质量浓度；同时检测肝组织匀浆中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力。结果：PSG处理能显著改善AA导致血清AST、ALT、ALP活力，TG浓度和IL-1β质量浓度的显著升高及IL-10质量浓度的显著下降（P＜0.05），肝脏组织中SOD、CAT、 GSH-Px活力的显著下降和MDA含量的显著升高（P＜0.05），以及肝组织的病理性损伤。结论：PSG对AA诱导的大鼠肝脏损伤具有显著保护作用。
关键词：黑灵芝多糖；丙烯酰胺；氧化损伤；肝脏损伤
丙烯酰胺（acrylamide，AA）是一种应用广泛的工业化学品，同时还普遍存在于炸、烘、烤等高温食品中，与人类生活环境密切相关[1-3]。然而，AA具有多种生理毒性，已被国际癌症研究机构列为“可能人类致癌物”（2A类）[4]。由于AA是一种水溶性小分子物质，渗透性强，人体可通过消化道、呼吸道、皮肤黏膜等多种途径接触并吸收AA，在消化过程中可以快速分布于全身的组织中造成毒性[5]。肝脏是AA毒性的靶器官之一，研究表明AA能诱导肝细胞产生过量活性氧（reactive oxygen species，ROS），消耗解毒过程中的重要物质谷胱甘肽（glutathione，GSH）并引起脂质过氧化（丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量增高），引起肝细胞氧化损伤[6-8]。
以往对AA的研究主要集中在其形成抑制方面，尤其是在热加工过程中如何采取各种措施以降低食品中AA的含量，然而，中西方饮食习惯导致人体无法避免地长期暴露在低水平AA环境下。因此如何削弱AA体内毒性，寻找可拮抗AA毒性的天然产物，构建人类AA毒性防护的第二道屏障具有重要意义。近年来大量研究表明，多种植物来源天然产物对生物来源的ROS具有显著的清除和抑制作用。Gedik[9]和Shrivastava[10]等研究发现，藏红花素和橙皮素处理AA染毒的大鼠后，抗氧化酶活力得到显著提升，炎症缓解，一定程度上缓解了AA毒性。Alturfan等[11]研究发现白藜芦醇对AA致大鼠氧化应激和DNA氧化损伤起到保护作用。大型植物真菌黑灵芝（Ganoderma atrum）在我国作为药食同源食品已有2 000多年历史，然而关于黑灵芝来源的天然产物对于AA体内毒性的抑制作用尚无报道。本课题组的前期研究[12-13]报道了一种从黑灵芝子实体中分离出的黑灵芝多糖（Ganoderma atrum polysaccharides，PSG），对其结构表征发现，PSG的主要水溶性成分PSG-1是一种由酸性1,3-糖苷键连接支链、1,6-糖苷键连接β-Glcp主链的杂多糖-蛋白质复合物，其分子质量为1 013 kDa，由葡萄糖、甘露糖、半乳糖和半乳糖醛酸以物质的量比为4.91∶1∶1.28∶0.71组成。众多体内外研究表明PSG具有抗氧化防御能力，能够改善过氧化氢诱导的氧化应激，在清除自由基功能方面尤其突出[14-16]。
本课题组最近一项研究[17]表明，PSG能通过改善IEC-6细胞氧化应激和线粒体凋亡途径有效抑制AA毒性，然而到目前为止，关于PSG对AA诱导的肝脏损伤是否具有保护作用鲜见报道。因此，本研究旨在探讨PSG对AA诱导大鼠肝脏氧化损伤的保护作用，以期为PSG的充分应用与深度开发提供一定的理论依据，同时为AA膳食防治提供指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑灵芝购于江西赣州灵芝基地。清洁级雄性SD大鼠（体 质量160～180 g，生产许可证号：SCXK（湘）2016-0002，使用许可证号：SYXK（赣）2005-0001）购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。
AA（纯度＞99.9%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙转氨酶（alanine transaminase，ALT）、甘油三酯（triglyceroles，TG）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒 南京建成生物工程研究所；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、BCA蛋白浓度试剂盒 上海碧云天生物科技有限公司；白细胞介素（interleukin，IL）-1β、 I L-1 0 酶联免疫吸附测定试剂盒 武汉博士德 公司；其余试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
3K15高速台式离心机 德国Sigma公司；3001全波长扫描式多功能读数仪（多功能酶标仪） 美国Thermo公司；A10超纯水仪 美国Millipore公司；2HWY-2102生化培养箱 上海森信实验仪器公司；KZ-II组织破 碎仪 武汉塞维尔生物科技有限公司；AL104型电子 天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 PSG的提取制备
黑灵芝子实体经粉碎机反复粉粹处理至粉状细微颗粒，用体积分数95%乙醇溶液浸泡24 h后，采用改良的热水浸提醇沉法提取PSG。将浸提液旋蒸浓缩至原体积1/5，采用Sevag法脱蛋白处理，脱蛋白后依次用自来水透析2 d、蒸馏水透析1 d、超纯水透析1 d，再用体积分数95%乙醇溶液沉淀，沉淀物分别用无水乙醇、丙酮、无水乙醚各洗涤2 次，浓缩，冷冻干燥，得到精制PSG。
1.3.2 AA诱导大鼠肝损伤模型的建立
选取健康雄性SD大鼠60 只，体质量160～180 g，于12 h明暗交替条件下适应1 周。随机分为6 组，每组10 只：1）正常组：等体积的生理盐水；2）模型组：20 mg/kg mb AA溶液；3）阳性对照组：200 mg/kg mb N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）；4）PSG低、中、高剂量组：PSG 50、100、200 mg/kg mb。各给药组在给予相应药物0.5 h后，口腔灌胃AA水溶液，连续30 d。最后1 次给药后，禁食不禁水18 h处死，进行相关指标测定。
1.3.3 大鼠一般情况观察
实验期间观察大鼠的精神状态、行为、毛发光泽度、有无死亡情况等，拍照并记录。
1.3.4 肝脏病理检测
取大鼠肝脏部分右叶（后续测定取肝脏左叶相应部位），生理盐水清洗，滤纸吸干，于体积分数10%中性福尔马林溶液中固定，石蜡包埋，切片，苏木素-伊红（hematoxylineosin，HE）染色，光镜下观察组织切片并拍照。
1.3.5 肝功能指标测定
采用眼球取血法，室温放置2 h，待血清分层后于4 000 r/min、4 ℃下冷冻离心10 min，吸取上层血清部分，－80 ℃条件下保存备用。按照检测试剂盒步骤测定血清ALT、AST、ALP活力和TG浓度。
1.3.6 肝脏氧化指标测定
称取100 mg肝脏组织加入900 μL生理盐水制备肝脏组织匀浆液，于8 000 r/min、4 ℃下离心15 min，吸取上清液，根据检测试剂盒步骤测定SOD、CAT、GSH-Px活力和MDA含量。
1.3.7 免疫指标测定
采用1.3.5节所制血清样品，按照检测试剂盒步骤测定血清IL-Iβ、IL-10质量浓度。
1.4 数据处理与分析
采用SPSS 16.0软件进行数据分析，所有实验均重复3 次， 结果以平均值±标准差表示；采用Graph Pad Prism 6 软件作图；采用单因素方差分析和Tukey’s多因素t检验进行方差分析，P＜0.05表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 大鼠一般情况观察及死亡率
在AA造模期间，各组大鼠均未出现中毒死亡。AA染毒第20天，模型组大鼠开始出现抱团嗜睡、后肢瘫痪并容易被激怒的现象，且毛发凸起失去光泽（图1B），表明灌胃AA第20天AA的蓄积毒性作用开始体现。

图 1 AA造模期间大鼠一般情况
Fig. 1 General conditions of normal and AA-treated rats
2.2 PSG对AA致大鼠肝脏组织病理变化的影响

图 2 PSG对AA致大鼠肝脏损伤的组织病理变化影响 （HE染色）（200×）
Fig. 2 Effect of Ganoderma atrum polysaccharides on AA-induced hist opathological changes in rats (HE staining) (200 ×)
由图2可知：正常组肝脏组织结构正常，肝细胞以中央静脉为中心，向四周呈发散性排列，细胞排列致密，肝细胞索排列规律，无充血和炎性细胞浸润，核仁清晰（图2A）；模型组肝索断裂，细胞质大量丢失，空泡严重，且细胞核固缩较严重，出现炎症细胞浸润 （图2B）；相对于模型组，阳性对照组和PSG低剂量组肝索恢复，核仁清晰，排列整齐，空泡化现象基本缓解，仅有少量细胞质丢失（图2C、D）；PSG中、高剂量组基本接近于正常组（图2E、F）。上述结果表明，AA染毒使大鼠肝细胞核固缩，细胞质丢失，导致肝细胞坏死，从而损伤肝脏组织；而PSG和阳性药物干预处理后，肝细胞组织形态趋于正常，提示PSG对AA致大鼠肝脏损伤具有较好的保护作用。
2.3 PSG对AA致大鼠肝脏功能损伤的影响

图 3 PSG对AA致大鼠肝功能损伤的影响
Fig. 3 Effect of Ganoderma atrum polysaccharides on liver function injury induced by AA in rats
由图3可知，与正常组相比，模型组大鼠血清中AST、ALT、ALP活力均极显著升高（P＜0.01），TG浓度显著升高（P＜0.05）。与模型组相比，NAC处理后，阳性对照组大鼠血清中AST活力和TG浓度得到一定程度降低，但不显著，ALT和ALP活力显著降低（P＜0.05）。与模型组相比，低、中、高剂量PSG处理后，大鼠AST、ALT、ALP活力和TG浓度均极显著降低（P＜0.01），降低程度远大于阳性对照组。结果表明，AA染毒后各项肝功能指标显示大鼠肝脏受到损伤，同时PSG对AA致大鼠肝损伤具有显著的保护作用，且其效果远远优于NAC。
2.4 PSG对AA致大鼠肝脏氧化损伤的影响
氧化应激是肝脏损伤的重要机制之一。体内自由基代谢的平衡主要通过抗氧化系统维持，主要包括SOD、GSH-Px、CAT等，MDA是脂质过氧化物降解的主要产物，MDA的含量也能间接反映机体细胞受自由基攻击的严重程度[18]。
表 1 PSG对AA致大鼠肝脏氧化损伤的影响
Table 1 Effect of Ganoderma atrum polysaccharides on oxidative damage of rat liver induced by AA

由表1可知，模型组大鼠中MDA含量极显著高于正常组（P＜0.01），NAC和低、中、高剂量PSG均能够极显著降低大鼠体内MDA含量（P＜0.01）。灌胃AA后，肝组织抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活力均极显著降低（P＜0.01），而NAC和不同剂量PSG处理均能不同程度地提升抗氧化酶活力，且PSG尤其是高剂量时，其提升抗氧化酶活力的能力远大于NAC。结果提示，PSG能够维持大鼠体内抗氧化系统，提高抗氧化酶活力，同时降低脂质过氧化，从而缓解AA导致的大鼠肝脏损伤。
2.5 PSG对AA致大鼠肝脏损伤中血清炎症因子水平的影响


图 4 PSG对AA致大鼠肝脏损伤中血清炎症因子IL-1β（A）、IL-10（B）质量浓度的影响
Fig. 4 Effect of Ganoderma atrum polysaccharides on serum IL-1β (A) and IL-10 (B) levels in rats with AA-induced liver injury
炎症细胞因子参与炎症反应，在众多炎症细胞因子中，起主要作用为IL-1β、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子等。由图4可知，与正常组相比，模型组大鼠中血清IL-1β质量浓度极显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，阳性对照组和PSG处理组大鼠体内IL-1β质量浓度均显著降低（P＜0.01，P＜0.05）。与模型组相比，中、高剂量PSG能够极显著提高血清IL-10质量浓度（P＜0.01）。以上结果表明，灌胃不同剂量的PSG均可以有效缓解AA导致的炎症反应，抑制AA诱导的大鼠肝组织中促炎细胞因子IL-1β的表达，并提高抗炎因子IL-10水平，从而达到对肝脏的保护作用。
3 讨 论
AA对人类健康造成潜在的重大风险，包括致突变性、遗传毒性、致癌性[19]。肝脏是主要的解毒代谢器官，因此也成为AA的主要靶器官之一。本实验结果表明，AA处理后，大鼠血清AST、ALT和ALP活力 （P＜0.01）及TG浓度（P＜0.05）显著或极显著增加。ALT和AST是动物体内2 种重要的转氨酶，正常情况下在血清中很少，但当肝脏发生损伤时，肝细胞结构受到一定破坏，AST、ALT就会漏出至血液，因此血清中AST、ALT活力变化可以作为肝脏受到损害时的一种应答反应[20-21]。 肝脏受损时胆汁循环受阻，ALP活力升高，同时导致机体对游离脂肪酸的利用减少，血液中游离脂肪酸水平升高，导致血清中TG浓度升高，因此血清中TG浓度也间接反映了肝脏受损程度[22]。氧化应激是AA损伤的主要机制之一[2]。Jiang Guoyong等[17]的研究结果提示，在IEC-6细胞模型中，AA能刺激IEC-6细胞产生过量ROS。Ghorbel等[1]发现不同剂量的AA可诱导破坏肝细胞中促氧化剂和抗氧化剂平衡而引起氧化损伤。机体接触AA后会通过酶与非酶系统产生ROS。当ROS增多至超过机体清除自由基能力时，机体内抗氧化系统就会失衡，从而发生氧化损伤。Luo等[23]研究发现AA及其代谢物（缩水甘油酰胺）能与GSH结合形成共轭异构体，AA给药后体内GSH水平降低。在氧化应激状态下，GSH消耗可能会导致脂质过氧化。MDA是脂质过氧化的主要产物。MDA水平升高提示机体可能发生了氧化损伤，机体抗氧化系统平衡遭到破坏[24]。当机体氧化应激第一道防线被突破，过多的ROS开始攻击DNA生物大分子，引起DNA损伤。氧化应激通过核因子κB激活产生炎症因子并发生炎症 反应[25]。因此本研究采用自由基清除能力突出的PSG干预AA毒性作用，并进行肝脏组织病理观察，测定血清AST、ALT、ALP活力、TG浓度等肝脏功能指标，机体氧化与抗氧化系统状态，及相关免疫因子评价AA诱导的肝脏损伤情况。肝损伤组织病理学特征表明，与模型组大鼠相比，PSG处理缓解了AA诱导的肝细胞损伤。AA可以促进自由基产生并诱导肝组织损伤[26]。动物造模后各项肝功能指标均与正常组差异显著（P＜0.01、P＜0.05），提示肝损伤模型成功。进一步评价机体氧化/抗氧化系统发现，AA处理后机体内产生过量ROS，抗氧化系统紊乱，主要表现为抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px）活力极显著降低（P＜0.01）和脂质过氧化产物（MDA）含量极显著升高（P＜0.01），最终导致肝脏发生氧化损伤，这与Yu Rongmin等[27]的研究结果相一致。在氧化损伤情况下，ROS攻击生物大分子并促使机体产生炎症因子。本实验中，AA处理后大鼠体内促炎因子IL-1β质量浓度极显著上升（P＜0.01）。
PSG良好的生物功能与其化学结构密不可分。本课题组前期研究中，PSG具有良好的体外抗氧化活性，这可能主要归因于其中的酚类和蛋白质成分[28]。文献[29]报道，真菌提取物中常见的酚类化合物，如酚酸类、酚类衍生物具有良好的抗氧化活性。酚类物质的抗氧化活性可认为是氢在氧化反应中充当了H－或者电子供体的角色，最终终止氧化电子反应链[30]。另外，抗氧化活性多肽或蛋白中典型的氨基酸包括亲核含硫氨基酸、芳香族氨基酸、咪唑氨基酸等组分也在PSG中发现[12]。进一步探讨其与免疫活性的关系发现，PSG免疫活性与其蛋白质、总酚、中性糖含量均无明显关系，但与糖醛酸含量呈现线性关系，其中酸性β-(1→3,1→6)-葡聚糖结构对PSG发挥免疫活性具有关键性作用。
4 结 论
综上所述，作为天然活性产物来源，PSG可以提高AA诱导肝损伤大鼠体内抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px） 活力，降低促炎因子（IL-1β）、提高抗炎因子（IL-10）质量浓度，一定程度地恢复肝脏功能和修复组织病理损伤。PSG对AA诱导的大鼠肝脏损伤具有保护作用，作用机制可能与其酚类蛋白成分的抗氧化作用和酸性β-(1→3,1→6)葡聚糖结构的免疫调节有关。上述研究对于治疗或早期预防AA毒性具有重要的理论意义和实践价值，也能为膳食营养提供科学指导和实验依据，同时也为以PSG为原料的高附加值产品的开发提供积极的影响。
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Protective Effect of Ganoderma atrum Polysaccharides against Acrylamide-Induced Liver Injury in Rats
JIANG Guoyong, LEI Aitong, YANG Ying, YU Qiang, XIE Jianhua, CHEN Yi*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)
Abstract: Purpose: This study aimed to investigate the protective effect of Ganoderma atrum polysaccharides (PSG) on acrylamide (AA)-induced liver injury in rats. Methods: A total of 60 SD male rats were randomly divided into 6 groups of 10 each: normal control, model (20 mg/kg mb of AA), positive control (N-acetyl-L-cysteine, NAC; at 200 mg/kg mb) and low-, medium and high-dose PSG treatment groups (at doses of 50, 100 and 200 mg/kg mb). The rats in the normal control group were given normal saline at the same volume as the corresponding drugs for the other groups. Starting from half an hour after the administration, the AA aqueous solution was orally administered for 30 continuous days. Pathological observation of liver tissues was performed by hematoxylin and eosin (HE) staining. The activities of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) and alkaline phosphatase (ALP) and the concentrations of triglyceride (TG) and interleukin (IL-1β and IL-10) in serum were measured. Then, the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GSH-Px) and the content of MDA in liver tissue homogenate were measured. Results: AA significantly increased AST, ALT and ALP activity as well as TG and IL-1β concentration, and decreased IL-10 levels in serum (P < 0.05); significantly reduced the activity of SOD and CAT and GSH-Px and increased MDA content in liver tissue (P < 0.05); and caused pathological liver injury. PSG obviously attenuated all these negative effects. Conclusion: Ganoderma atrum polysaccharides can have a significant protective effect on acrylamide-induced liver injury.
Keywords: Ganoderma atrum polysaccharides; acrylamide; oxidative damage; liver injury
收稿日期：2019-06-23
基金项目：国家自然科学基金地区科学基金项目（21866021）；江西省自然科学基金青年重点项目（20171ACB21015）；江西省青年科学家（井冈山之星）培养对象资助项目（20142BCB23005）；2018年江西省研究生创新专项资金项目（YC2018-S010）
第一作者简介：江国勇（1993ü ）（ORCID: 0000-0003-3718-2816），男，硕士研究生，研究方向为食品营养与安全。E-mail: 811769750@qq.com
*通信作者简介：陈奕（1982ü ）（ORCID: 0000-0002-3644-8718），女，教授，博士，研究方向为食品化学与分析、食品营养与安全、食品质量与安全。E-mail: chenyi-417@163.com
DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190623-269
中图分类号：R931.6
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2020）01-0121-06
引文格式：
江国勇, 雷艾彤, 杨莹, 等. 黑灵芝多糖对丙烯酰胺致大鼠肝脏氧化损伤的保护作用[J]. 食品科学, 2020, 41(1): 121-126. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190623-269. http://www.spkx.net.cn
JIANG Guoyong, LEI Aitong, YANG Ying, et al. Protective effect of Ganoderma atrum polysaccharides against acrylamide-induced liver injury in rats[J]. Food Science, 2020, 41(1): 121-126. (in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190623-269. http://www.spkx.net.cn