意大利蜜蜂幼虫肠道在球囊菌侵染前期的差异表达microRNA及...
意大利蜜蜂幼虫肠道在球囊菌侵染前期的差异表达microRNA及其调控网络
摘要：【目的】微小RNA（microRNA，miRNA）是一类重要的基因表达调控因子，可影响宿主与病原间的互作过程。蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）是一种特异性侵染蜜蜂幼虫的致死性真菌病原。本研究旨在对意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica，简称意蜂）幼虫肠道在球囊菌胁迫前期的差异表达miRNA（differentially expressed miRNA，DEmiRNA）及其靶基因进行深入分析，在miRNA组学水平探究意蜂幼虫在球囊菌侵染前期的胁迫应答，并通过构建显著DEmiRNA的调控网络筛选出与宿主应答相关的关键miRNA。【方法】利用small RNA-seq（sRNA-seq）技术对正常及球囊菌侵染的意蜂4日龄幼虫肠道（AmCK和AmT）进行高通量测序，首先对原始数据进行质控和评估，随后将过滤后的数据与西方蜜蜂（Apis mellifera）参考基因组进行比对；将比对上的序列标签（tags）注释到miRBase数据库，得出已知miRNA的表达量；通过TPM（tags per million）算法对各样本中miRNA的表达量进行归一化处理，以|log2 fold change|≥1且P≤0.05作为标准筛选得到显著DEmiRNA；利用TargetFinder 软件预测显著DEmiRNA的靶基因，并对其进行GO和KEGG代谢通路（pathway）富集分析。利用Cytoscape软件对miRNA-mRNA调控网络进行可视化。最后，利用茎环反转录PCR（Stem-loop RT-PCR）和荧光定量PCR（qPCR）验证测序数据的可靠性。【结果】AmCK和AmT样品的测序分别得到13 553 302和10 777 534条原始读段（raw reads），经严格过滤后得到的有效读段（clean reads）数分别为13 186 921和10 480 913条。各样品的生物学重复间的Pearson相关性系数分别在0.9822和0.9508以上。共有10个显著DEmiRNA，包括4个上调miRNA和6个下调miRNA。显著DEmiRNA在AmT的整体表达水平低于AmCK。10个显著DEmiRNA可靶向结合3 788个靶基因，其中上调miRNA的1 240个靶基因可注释到GO数据库中的39个GO条目，主要富集在结合、细胞进程、代谢进程和应激反应等；下调miRNA的749个靶基因可注释到34个GO条目，主要富集在细胞进程、结合、代谢进程和应激反应等。KEGG数据库注释结果显示，上调miRNA和下调miRNA的靶基因分别注释到95和66条代谢通路，富集基因数最多的分别是Wnt信号通路、Hippo信号通路、光传导以及内吞作用、磷脂酰肌醇信号系统、嘌呤代谢。对于上调和下调miRNA，分别有31和52个靶基因注释到内吞作用，15和7个靶基因注释到泛素介导的蛋白水解，11和5个靶基因注释到Jak-STAT信号通路，1和3个靶基因注释到MAPK信号通路。显著DEmiRNA与靶mRNA之间形成复杂的调控网络，7个显著DEmiRNA靶向结合96个与Wnt信号通路相关的mRNA，8个显著DEmiRNA靶向结合55个与内吞作用相关的mRNA。Stem-loop RT-PCR和qPCR结果验证了测序数据的可靠性。【结论】对意蜂幼虫肠道在球囊菌侵染前期的DEmiRNA及其靶基因进行预测和分析，并构建和分析了DEmiRNA-mRNA调控网络，研究结果提供了宿主miRNA的表达谱和差异表达信息，揭示了DEmiRNA通过调控细胞生命活动、新陈代谢以及部分细胞和体液免疫等生物学过程参与宿主的胁迫应答。miR-4331-y、miR-4968-y、miR-8440-y、novel-m0023-5p和novel-m0025-3p共同参与了宿主的Wnt信号通路和内吞作用的调控，可作为白垩病治疗的潜在分子靶标。
关键词：意大利蜜蜂；幼虫肠道；发育；差异表达微小RNA；调控网络
0 引言
【研究意义】意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica，简称意蜂）是我国养蜂生产中的主要蜂种，在农业生产和生态保护等方面具有重要价值。白垩病是蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）特异性侵染蜜蜂幼虫而引起的致死性真菌病害，对养蜂生产造成巨大损失。蜜蜂幼虫食入被球囊菌孢子污染的食物，孢子进入中肠后开始低水平萌发，到了预蛹期随着中肠和后肠的连通，孢子进入后肠后在氧气的刺激下剧烈萌发，同时菌丝大量生长并陆续穿透肠壁和体壁，从而导致幼虫死亡。目前，有关蜜蜂幼虫响应球囊菌胁迫应答及分子调控机制的研究报道较少。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长度约为18—25个核苷酸的非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA），通过与其靶基因3′ UTR（untranslated region）特异性结合，降解或抑制mRNA的蛋白质翻译过程。作为基因表达的关键调控因子，miRNA可广泛参与细胞增殖与分化、生长发育、细胞凋亡和抗病毒等生物学过程。近年来，较多的研究结果表明miRNA参与对昆虫及其病原互作的调控。因此，解析蜜蜂幼虫在球囊菌侵染前期的miRNA表达谱，深入研究差异表达miRNA（differentially expressed miRNA，DEmiRNA）及其调控网络，可为宿主响应球囊菌胁迫的分子调控及宿主-病原互作机制提供必要基础，也能为宿主的关键调控miRNA的筛选和功能研究提供重要的信息和线索。【前人研究进展】ZHANG等研究发现，携带登革病毒（DENV）的埃及伊蚊（Aedes aegypti）被沃尔巴克氏体（Wolbachia）侵染后，aae-miR-2940可特异性表达，并显著抑制了与登革病毒复制相关的DNA甲基化转移酶基因（AaDnmt2）的表达；李盛杰研究发现，果蝇（Drosophila melanogaster）被革兰氏阳性菌藤黄微球菌（Micrococcus luteus）侵染后，其miR-310家族和miR-958可通过抑制Toll信号通路产生的抗菌肽分子Drosomycin的表达而影响宿主的免疫应答。但相比于果蝇和蚊类等模式昆虫，蜜蜂与病原互作相关的miRNA研究较为滞后。LOURENÇO等利用革兰氏阴性菌粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）和M. luteus侵染意蜂工蜂，发现miRNA可通过参与体液免疫中Toll、Imd、JNK以及Jak-STAT信号通路的调控，促进抗菌肽与黑化反应的激活来应对细菌的侵染；HUANG等研究发现，东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）可能通过影响西方蜜蜂（Apis mellifera）代谢调控相关的miRNA表达促进自身的快速繁殖。笔者所在课题组前期已通过二代测序技术对球囊菌侵染的中华蜜蜂（Apis cerana cerana，简称中蜂）和意蜂4日龄幼虫肠道进行转录组分析，在mRNA组学水平解析了病原在侵染前期与宿主间的互作。然而，蜜蜂幼虫在球囊菌侵染过程的miRNA表达谱仍然缺失，miRNA在蜜蜂幼虫的胁迫应答中的作用仍未可知。【本研究切入点】此前的相关研究主要集中在球囊菌侵染后期，即6日龄幼虫到预蛹的过渡期，有关球囊菌侵染前期的研究还非常滞后。球囊菌在侵染前期已经开始出现低水平的孢子萌发和菌丝生长，必然伴随着复杂的基因表达和ncRNA调控。miRNA作为关键的转录后调控因子在昆虫的免疫防御过程中发挥关键的作用。本研究利用small RNA-seq（sRNA-seq）技术对正常及球囊菌胁迫的意蜂4日龄幼虫肠道进行高通量测序，对宿主miRNA的表达谱、显著DEmiRNA及其调控网络进行探究，并筛选免疫防御相关的关键miRNA。【拟解决的关键问题】通过深入分析显著DEmiRNA及其调控网络，在miRNA组学水平解析意蜂幼虫在球囊菌侵染前期的胁迫应答，揭示显著DEmiRNA在宿主-病原互作中的作用，为解析意蜂幼虫-球囊菌的互作机制打下基础。
1 材料与方法
试验于2017年9月至2018年7月在福建农林大学蜂学学院蜜蜂保护实验室完成。
1.1 供试生物材料
供试意蜂幼虫取自福建农林大学蜂学学院教学蜂场。
1.2 意蜂幼虫人工饲养及样品测序
参照前期研究建立的方法活化球囊菌、纯化孢子以及人工饲养意蜂幼虫，配制含球囊菌孢子的饲料（终浓度为1×107个孢子/mL），饲喂处理组3日龄幼虫，24 h后待含孢子饲料被食尽，饲喂不含球囊菌的正常饲料；对照组幼虫饲喂不含孢子的正常饲料。肠道是球囊菌与意蜂幼虫互作的主要部位，因此选择幼虫肠道作为测序材料。分别解剖上述对照组和处理组4日龄幼虫肠道组织，剖取的幼虫肠道每9只放于1个RNA-Free的EP管中，液氮速冻后保存在-80℃的超低温冰箱。进行3次生物学重复。对照组的3个生物学重复分别为AmCK-1、AmCK-2和AmCK-3；处理组的3个生物学重复分别为AmT-1、AmT-2和AmT-3。委托广州基迪奥生物科技有限公司对上述6个肠道样品进行单端测序，测序平台为Illumina MiSeq。首先，利用Trizol法从意蜂幼虫肠道样本中提取total RNA，琼脂糖凝胶电泳切胶选择18—30 nt的片段，连接3′端接头，连接产物以15%变性PAGE胶电泳分离，切胶选择36—44 nt的目的条带；将上述回收产物连接5′端接头，进而对两侧带有接头的small RNA样本进行RT-PCR，反转录产物以3.5%琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收140—160 bp区域的目的条带，回收产物即为终文库，建好的文库上机测序。原始数据已上传NCBI SRA数据库，BioProject号：PRJNA408312。
1.3 测序数据的质控及DEmiRNA的预测
参照前期研究建立的方法对测序数据进行质控和定位，并将得到miRNA的非注释标签序列（unannotated tags）。通过Bowit软件将非注释标签序列与西方蜜蜂的参考基因组（assembly Amel 4.5）序列进行比对，得到相关tags在参考基因组上的位置信息，即为mapped tags。利用miRDeep2软件将mapped tags与miRBase数据库中已知miRNA前体序列进行比对，从而鉴定已知miRNA的表达。并通过TPM（tags per million）算法对各样本中miRNA的表达量进行归一化处理。利用R软件计算各样品之间的相关性系数。以|log2 fold change|≥1且P≤0.05为筛选显著DEmiRNA的标准。
1.4 显著DEmiRNA靶基因预测及分析
利用TargetFinder软件对显著DEmiRNA的靶基因进行预测，并通过BLAST软件将预测的靶基因序列与Gene Ontology和KEGG数据库比对。将显著DEmiRNA的靶基因分别按照分子功能、细胞组分、生物学进程进行分类，并利用基迪奥OmicShare云平台（http://www.omicshare.com/tools/Home/Index/index. html）对靶基因进行KEGG pathway富集分析。最后，根据DEmiRNA与mRNA的靶向结合关系，利用Cytoscape软件构建miRNA-mRNA的调控网络。
1.5 DEmiRNA的茎环实时荧光定量PCR（Stem-loop RT-qPCR）验证
通过Stem-loop RT-qPCR检测4个随机选取的miRNA（novel-m0031-3p、novel-m0034-5p、miR-3793-x和ame-miR-6000a-5p）在AmCK和AmT中的表达情况，以验证sRNA-seq数据的可靠性。根据所选miRNA的序列，参照CHEN等的方法，利用DNAMAN软件（Lynnon Biosoft公司，美国）设计特异性的Stem-loop引物、上游引物和通用的反向引物，委托上海生工生物工程有限公司进行引物合成。选择snRNA U6作为内参。利用RNA抽提试剂盒（Axygen公司，美国）分别提取AmCK和AmT的总RNA，利用Stem-loop引物进行反转录得到相应的cDNA作为模板进行PCR和qPCR。常规PCR体系为50 μL，包括PCR mix（TaKaRa公司，日本）25 μL、无菌水17.5 μL、正、反向引物及cDNA模板各2.5 μL。反应程序如下：95℃ 5 min，95℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min，34个循环，72℃ 5 min。随后利用1.8%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR的产物。qPCR反应体系（20 μL）：SYBR Green Dye 10 μL，正、反向引物各1 μL，cDNA模板1 μL，Rox 0.44 μL，DEPC水补至20 μL。在ABI 7500荧光定量PCR仪（ABI公司，美国）中进行反应，反应条件：95℃ 1 min，95℃ 15 s，49—60℃ 60 s，共40个循环，熔解曲线默认系统程序。所选miRNA的相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。每个反应进行3次生物学重复和3次技术重复。最后利用GraphPad Prism 5软件进行qPCR结果的检验及绘图。本研究使用的引物序列信息详见表1。
表1 本研究使用的引物
Table 1 Primers used in this study
2 结果
2.1 意蜂幼虫肠道的测序数据的质控与评估
为整体验证测序数据的准确性，从所有显著差异表达和非显著差异表达的740个miRNA中随机挑选2个非显著差异表达miRNA（novel-m0031-3p和novel-m0034-5p）和2个显著差异miRNA（miR-3793-x和ame-miR-6000a-5p）进行Stem-loopRT-PCR验证，电泳结果显示上述miRNA在AmCK和AmT中均可扩增出符合预期的目的条带（图6-A）。进一步对上述4个DEmiRNA进行qPCR检测，结果显示它们的表达水平的变化趋势与sRNA-seq数据中的变化趋势一致（图6-B、6-C、6-D、6-E），证实了测序结果的可靠性。
2.2 意蜂幼虫肠道的DEmiRNA分析
AmCK vs AmT比较组中显著差异和非显著差异miRNA数为740个。其中，10个miRNA为显著性差异表达，包含4个上调miRNA和6个下调miRNA；显著DEmiRNA中包括3个novel miRNA和7个已知miRNA（表3）。表达谱分析结果显示，DEmiRNA的差异变化幅度差别明显（图1-A），DEmiRNA在AmT中的整体表达水平低于AmCK（图1-B）。
表2 sRNA-seq数据总览
Table 2 Overview of sRNA-seq data
A：DEmiRNA的表达量聚类Expression clustering of DEmiRNAs；B：不同样品中DEmiRNA的表达量比较Comparison of DEmiRNAs expression in different samples
图1 AmCK vs AmT中DEmiRNA的表达谱
Fig. 1 Expression profile of DEmiRNAs in AmCK vs AmT comparison group
表3 AmCK vs AmT 中DEmiRNA的信息统计
Table 3 Summary of DEmiRNAs information in AmCK vs AmT comparison group
2.3 意蜂幼虫肠道DEmiRNA的靶基因预测及功能注释
对于AmCK vs AmT中的显著DEmiRNA，共预测出3 788个靶基因。GO数据库注释结果显示，上调miRNA的1 240个靶基因共涉及39个GO 条目（term），富集靶基因数最多的分别是结合（733个）、细胞进程（698个）、代谢进程（580个）、单组织进程（576个）、催化活性（439个）、细胞膜（387个）、细胞膜组件（380个）、细胞（286个）、细胞组件（286个）、定位（245个）等（图2-A）；下调miRNA的749个靶基因可注释到34个GO条目，富集靶基因数最多的分别是细胞进程（533个）、结合（517个）、代谢进程（394个）、单组织进程（373个）、催化活性（240个）、细胞膜（227个）、细胞膜组件（226个）、细胞（216个）、细胞组件（216个）、细胞器（192个）等（图2-B）。进一步分析发现，对于上调和下调miRNA，分别有204和113个靶基因注释到应激反应，说明显著DEmiRNA参与宿主对球囊菌的胁迫应答的调控。
对显著DEmiRNA的靶基因进行KEGG数据库注释，结果显示上调miRNA的靶基因可注释到95条代谢通路（pathway），其中富集数最多的分别是Wnt信号通路（112个）、Hippo信号通路（62个）、光传导（55个）、嘌呤代谢（48个）、Hedgehog信号通路（43个）、神经活性的配体-受体相互作用（19个）、昼夜节律（41个）、寿命调节途径（35个）、氨基糖与核苷酸糖代谢（32个）和内吞作用（31个）（图3-A）；下调miRNA的靶基因注释到66条代谢通路，其中富集数最多的分别是内吞作用（52个）、磷脂酰肌醇信号系统（30个）、嘌呤代谢（28个）、磷酸肌醇代谢（25个）、Notch信号通路（20个）、神经活性的配体-受体相互作用（19个）、叶酸合成（18个）、背腹轴的形成（14个）、Wnt信号通路（13个）和mRNA监视通路（12个）（图3-B）。进一步分析结果显示，在细胞免疫相关通路中，对于上调和下调的miRNA，分别有31和52个靶基因注释到内吞作用，15和7个靶基因注释到泛素介导的蛋白水解；在体液免疫相关通路中，对于上调和下调的miRNA，分别有11和5个靶基因注释到Jak-STAT信号通路，有1和3个靶基因注释到MAPK信号通路。
2.4 意蜂幼虫肠道DEmiRNA的调控网络构建及分析
筛选具有KEGG数据库注释的靶基因，并分别构建上调miRNA和下调miRNA与靶基因的调控网络，结果显示显著DEmiRNA位于调控网络的中心，其中4个上调miRNA可结合499个靶基因（图4-A），277个靶基因可被6个下调miRNA调控（图4-B），DEmiRNA与靶基因之间形成复杂的调控网络。其中，上调miRNA中的miR-8440-y结合靶基因最多，达到419个（图4-A）；下调miRNA中的novel-m0034-3p可结合149个靶基因（图4-B）。
提取注释到Wnt信号通路、内吞作用的靶基因，构建它们与相关显著DEmiRNA的调控网络，分析结果显示7个显著DEmiRNA结合96个注释到Wnt信号通路的靶基因，二者形成1个较大和3个较小的调控网络，其中结合靶基因数由多到少分别为miR-8440-y（78个）、miR-3793-x（27个）、miR-4968-y（9个）、miR-7085-x（5个）、novel-m0025-3p（3个）、novel-m0023-5p（2个）和miR-4331-y（1个）（图5-A）；8个显著DEmiRNA结合55个注释到内吞作用的靶基因，二者形成1个较大的和2个较小的调控网络，其中miR-8440-y、novel-m0034-3p、ame-miR-6000a- 5p、novel-m0025-3p、novel-m0023-5p、miR-4968-y、miR-4331-y和miR-971-y结合的靶基因数分别为26、26、12、10、5、2、1和1个（图5-B）。进一步分析发现，miR-4331-y、miR-4968-y、miR-8440-y、novel-m0023-5p和novel-m0025-3p共同了参与上述2条代谢通路调控，而miR-3793-x和miR-7085-x仅参与对Wnt信号通路的调控，ame-miR-6000a-5p、miR-971-y和novel-m0034-3p仅涉及对内吞作用的调控（图5-A、5-B）。
2.5 意蜂幼虫肠道DEmiRNA的Stem-loop RT-PCR和qPCR验证
良好生态环境是实现中华民族永续发展的内在要求，是增进民生福祉的优先领域。为深入学习贯彻习近平新时代中国特色社会主义思想和党的十九大精神，决胜全面建成小康社会，全面加强生态环境保护。
A：上调miRNA的靶基因Target genes of up-regulated miRNAs；B：下调miRNA的靶基因Target genes of down-regulated miRNAs
图2 AmCK vs AmT中显著DEmiRNA的靶基因的GO数据库注释
Fig. 2 GO database annotation of significant DEmiRNA’ target genes in AmCK vs AmT comparison group
A：上调miRNA的靶基因Target genes of up-regulated miRNAs；B：下调miRNA的靶基因Target genes of down-regulated miRNAs
图3 AmCK vs AmT中DEmiRNA的靶基因的KEGG数据库注释
Fig. 3 KEGG database annotation of significant DEmiRNA’ target genes in AmCK vs AmT comparison group
3 讨论
球囊菌是一种特异性侵染蜜蜂幼虫肠道的真菌病原，能严重影响成年蜜蜂的数量和蜂群的生产力，造成较大的经济损失。miRNA作为一种转录后调控的关键因子，通过调节宿主相关免疫信号通路，改变宿主基因的表达而影响病原复制，而在宿主与病原间的互作中扮演着特殊角色。笔者所在课题组前期已在mRNA组学水平全面解析意蜂及中蜂幼虫与球囊菌间的互作。然而在ncRNA组学层面，至今还没有二者互作的相关研究报道。本研究利用sRNA-seq技术对正常及球囊菌侵染的意蜂4日龄幼虫肠道进行测序，预测出4个上调miRNA和6个下调miRNA，DEmiRNA在AmCK中的表达水平总体高于AmT（图1-B），表明宿主在球囊菌侵染前期，通过下调相关miRNA的表达水平降低其对相应靶基因的抑制作用，从而响应对病原的应答。
3.1 球囊菌胁迫可影响与蜜蜂幼虫肠道发育、代谢和免疫相关的miRNA的表达水平
球囊菌在侵染意蜂幼虫的前期，孢子处于低水平的萌发状态，幼虫并不表现出明显的白垩病症状，但宿主与病原之间存在复杂的互作。Hippo信号通路参与D. melanogaster肠道干细胞的增殖调控，并通过与Wnt、Notch等信号通路共同作用影响D. melanogaster的器官大小。郭睿等研究发现，意蜂工蜂中肠内的长链非编码RNA和环状RNA均可通过间接调控Hippo信号通路上的富集基因，影响蜜蜂肠道的发育过程。此外，该信号通路也被证明与蜜蜂的级型分化和卵巢发育状态密切相关。本研究中，对于意蜂幼虫肠道的上调miRNA的靶基因，富集在Hippo信号通路的数量（62个），远高于下调miRNA的靶基因富集在该通路上的数量（6个），表明球囊菌在侵染前期通过调控Hippo信号通路对宿主的肠道发育产生影响。郝向伟研究发现，家蚕（Bombyx mori）被大肠杆菌（Escherichia coli）和苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）侵染后，其肠道的BmHh表达量显著上调，作者推测Hedgehog信号通路可能参与肠干细胞的增殖和分化以及肠道损伤后的修复。本研究发现，对于富集在Hedgehog信号通路的靶基因，上调miRNA的靶基因数（43个）远多于下调miRNA的靶基因数（1个），说明多数该通路上的基因受到抑制，表明Hedgehog信号通路对不同的病原微生物存在应答差异。本研究还发现，对于上调miRNA的靶基因，富集在昼夜节律（41个）、嘌呤代谢（48个）、氨基糖与核苷酸糖代谢（32个）和嘧啶代谢（5个）等代谢通路上的数量均高于下调miRNA的靶基因富集在上述通路上的数量。HUANG等研究发现，东方蜜蜂微孢子虫感染西方蜜蜂的前6 d内，宿主的17个DEmiRNA主要参与调控嘌呤代谢、嘧啶代谢和氧化磷酸化等9条代谢通路，作者推测这与N. ceranae通过改变宿主的代谢以促进其更快速的繁殖机制有关。本研究表明在球囊菌侵染前期，意蜂幼虫肠道的部分生命活动、新陈代谢受到病原的抑制，推测球囊菌通过调节宿主的上述生物学过程为自身的孢子萌发创造有利条件。
A：上调miRNA的调控网络Regulation networks of up-regulated miRNAs； B：下调miRNA的调控网络Regulation networks of down-regulated miRNAs。绿色圆形代表靶基因，红色三角代表miRNA Green circles indicate target genes, red triangles indicate miRNAs
图4 意蜂幼虫肠道的DEmiRNA的调控网络
Fig. 4 Regulation networks of DEmiRNAs in A. m. ligustica larval gut
A： Wnt信号通路相关DEmiRNA的调控网络Regulation networks of DEmiRNAs related to Wnt signaling pathway； B：内吞作用相关DEmiRNA的调控网络Regulation networks of DEmiRNAs related to endocytosis。绿色圆形代表靶基因，红色三角代表miRNA Green circles indicate target genes, red triangles indicate miRNAs
图5 意蜂幼虫肠道的Wnt信号通路和内吞作用相关显著DEmiRNA的调控网络
Fig. 5 Regulation networks of significant DEmiRNAs associated with Wnt signaling pathway and endocytosis in A. m. ligustica larval gut
图6 DEmiRNA的Stem-loop RT-PCR（A）和qPCR验证（B—E）
Fig. 6 Stem-loop RT-PCR (A) and qPCR confirmation (B-E) of DEmiRNAs
Wnt信号通路广泛参与昆虫的细胞增殖、组织分化、器官形成等过程。该通路还可通过与TGF-beta、Hippo、Notch、MAPK、FoxO等信号通路的共同作用而参与蜂王卵巢激活和产卵过程。本研究中，共有7个显著DEmiRNA（miR-8440-y、miR-3793-x和miR-4968-y等）的96个靶基因注释到Wnt信号通路，表明球囊菌侵染会影响宿主的Wnt信号通路基因的表达。此外，有研究表明Wnt信号通路参与了人类的先天免疫反应，例如SMITH等发现miR-34家族对Hela细胞内的Wnt/β-catenin信号通路具有抑制作用，并表现出强烈的抗黄病毒作用；乔莹发现被隐核虫（Cryptocaryon irritans）感染的大黄鱼（Larimichthys crocea）体内miR-466-x、miR-1895-y和miR-8485-y等miRNA广泛参与了对Wnt和Jak-STAT信号通路以及内吞作用和溶酶体等免疫通路的调控。本研究中，miR-4331-y、miR-4968-y、miR-8440-y、novel-m0023-5p和novel-m0025-3p均参与了对Wnt信号通路和内吞作用的调控，表明它们通过调控上述免疫通路对意蜂幼虫肠道的免疫应答进行调节。
3.2 miR-4331-y作为潜在的分子靶标参与宿主与病原复杂的互作过程
miRNA在物种间具有高度的保守性、表达时序性和组织特异性。郭睿等对意蜂幼虫肠道发育过程中miRNA的表达谱进行分析，发现miR-4331-y仅在4和5日龄幼虫肠道内差异表达，并间接调控富集在Wnt、FoxO、TGF-beta、Notch和Jak-STAT等信号通路上的靶基因。ZHAO等研究发现，猪肾细胞（PK-15）被传染性肠胃炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）侵染后，其miR-4331的表达量显著上调，并通过靶向结合RB1作用于p38 MAPK信号通路，从而调控TGEV诱导的PK-15线粒体损伤。此外，在患有H1N1流感病毒的病人以及感染低致病性H5N3流感病毒的鸡的体内，均发现miR-204的表达显著提高。由于病原种类、侵染机制以及检测时间点的差异，不同宿主的同源miRNA在响应病原侵染过程中，其表达量变化趋势可能并不完全一致。例如ZHANG等发现甲型H1N1病毒（SIV-H1N1/2009）可通过抑制新生猪气管细胞（NPTr）中ssc-miR-204和ssc-miR-4331的表达促进自身在细胞内的复制；ssc-miR-204和ssc-miR-4331可抑制病毒的HA表面糖蛋白和NS1干扰素拮抗剂蛋白的表达，从而对病毒的复制进行负调控。本研究中，miR-4331-y的表达量在球囊菌胁迫后呈显著下调，并通过对靶基因的调控同时参与对内吞作用、吞噬体、Jak-STAT和Wnt信号通路等免疫通路的间接调控，表明宿主在球囊菌侵染前期通过下调miR-4331-y的表达水平降低对靶基因的抑制作用，从而激活相关免疫通路，以响应球囊菌的胁迫；球囊菌也可能抑制宿主肠道内miR-4331-y的表达量，以利于孢子的萌发。未来可通过合成相应的miRNA mimic和miRNA inhibitor对miR-4331-y进行过表达和敲减，从而深入研究其在宿主的胁迫应答中的作用。
3.3 意蜂幼虫肠道响应球囊菌胁迫前期过程中mRNA与miRNA组学比较
为探究不同蜂种的蜜蜂幼虫在球囊菌侵染前期的应答及与病原间的互作，笔者课题组曾对正常及球囊菌胁迫的意蜂和中蜂4日龄幼虫肠道进行转录组测序和分析，发现意蜂幼虫的差异表达基因涉及代谢进程、免疫系统进程和应激反应等19个功能分类，并有5个角质层蛋白基因和2个抗菌肽编码基因表达水平下调，进而在mRNA组学水平解析了宿主的胁迫应答。昆虫肠道围食膜是抵御经口摄入病原的重要物理屏障，角质层蛋白作为围食膜的主要成分之一，在保护肠道健康过程中发挥重要作用。本研究发现，上调miRNA中的miR-8440-y靶向结合2个角质层蛋白编码基因，表明球囊菌可通过提高宿主的miR-8440-y的表达水平降低角质层蛋白编码基因的水平，以利于球囊菌的萌发和侵染过程，这与此前的研究结果一致。
4 结论
在miRNA组学水平对意蜂幼虫肠道在球囊菌侵染前期的胁迫应答及宿主-病原互作进行研究，结果表明显著DEmiRNA可通过调控细胞生命活动、新陈代谢和部分细胞和体液免疫等生物学过程参与宿主的胁迫应答。其中miR-4331-y、miR-8440-y、miR-4968-y、novel-m0023-5p和novel-m0025-3p共同参与了宿主的Wnt信号通路和内吞作用的调控，且miR-8440-y结合靶基因的数量最多。筛选出的关键miRNA可用于后续的功能研究，有望为白垩病治疗提供潜在的分子靶标。
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