綦江皱皮木瓜果实有机酸特征性成分鉴定与不同发育期变...
綦江皱皮木瓜果实有机酸特征性成分鉴定与不同发育期变化规律
摘要：【目的】鉴定重庆綦江皱皮木瓜果实有机酸特征性成分，解析果实不同发育期有机酸变化规律，为皱皮木瓜果实发育期有机酸代谢研究提供基础数据。【方法】以重庆綦江皱皮木瓜(‘大罗’木瓜)为研究对象，采用溶剂提取、甲酯化衍生与气相色谱-质谱联用仪检测，进行不同发育期果实有机酸组成及含量测定，药典委2012版中药色谱指纹图谱相似度分析软件进行共有特征性成分峰匹配，SigmaPlot 10.0进行果实发育过程总有机酸、强酸味和弱酸味成分变化规律分析，Simca-P 11.5与SPSS 20.0结合进行果实发育期共有特征性成分PCA分析与HCA聚类。【结果】经甲醇提取、甲酯化衍生、氯仿萃取和GC-MS检测，从綦江皱皮木瓜8个发育期果实中共分离出共有特征性成分41种，包括低碳羧酸10种、长链脂肪酸21种、芳香族有机酸5种、一元酚酸类3种和氨基酸2种，TIC图基线平稳，成分峰分布均匀且分离度高，分离效果好。綦江木瓜从盛花后90 d至果实完熟（160 d）总有机酸含量呈先下降再上升再下降的倒“之”字型，总有机酸与强酸味（r=0.970）、弱酸味成分（r=0.998）极显著正相关；而强酸味成分与低碳羧酸极显著正相关（r=0.999），与一元酚酸显著正相关（r=0.747）；弱酸味成分与长链脂肪酸极显著正相关（r=0.999）。綦江木瓜完熟期检出的强酸味有机酸以苹果酸、乙酰丙酸、柠檬酸为主，累计相对含量占检出总强酸味成分的90%以上；苹果酸在发育期经历了含量下降、略有上升然后再下降的变化过程，呈从盛花后90—120 d逐渐下降，到130 d略有上升，然后再下降的倒“之”字型；柠檬酸与苹果酸变化规律相似，但乙酰丙酸与苹果酸截然相反，总体呈现上升趋势，到盛花后130 d增至最高点，之后略有下降（150 d降至最低），进入完熟期再次升高。相关性分析表明，果实强酸味有机酸总量与苹果酸、柠檬酸呈极显著正相关，但与乙酰丙酸、异柠檬酸和水杨酸弱负相关。弱酸味成分变化规律分析表明，在果实发育期，油酸、亚油酸、棕榈酸和10-羟基-十六烷酸等多数弱酸味成分均经历了迅速下降、缓慢上升再下降的变化过程，而十九烷酸却呈缓慢上升，然后下降再上升的相反过程；相关性分析表明，以油酸、亚油酸等多数弱酸味有机酸与总弱酸味有机酸极显著正相关，与十九烷酸和硬脂酸弱负相关。Simca-P主成分分析表明PC1和PC2分别解释了总变量40.00%和23.20%，样品主成分得分图显示，S1和S2聚为一类，α-酮戊二酸、苹果酸、奎尼酸、莽草酸、棕榈酸、亚油酸对样品此类有机酸组成起决定性作用；S3、S4、S5聚在一起，油酸、10-羟基-十六烷酸对这3个发育期样品起决定性作用；S6和S7聚在一起，丙二酸、乙酰丙酸、异柠檬酸、水杨酸是其主要贡献性成分；S8单独存在，琥珀酸、十九烷酸、二十四烷酸是其主要贡献性成分；该结果与基于SPSS平方欧氏距离的离差平方和聚类分析结果基本一致。【结论】綦江皱皮木瓜属苹果酸型水果，果实发育过程中有机酸的积累模式由盛花后90 d的苹果酸-柠檬酸积累型向完熟期（160 d）乙酰丙酸-苹果酸-柠檬酸积累型转变，酸积累模式的转变在重庆皱皮木瓜果实酸度与风味品质决定中具有重要作用。
关键词：皱皮木瓜；有机酸；气相色谱-质谱联用仪；特征性成分；变化规律
0 引言
【研究意义】皱皮木瓜营养丰富、药效显著，是一种药食兼用型果树资源。中国是皱皮木瓜的起源地和栽培中心，种质资源极为丰富，是全球优质皱皮木瓜主产地。我国皱皮木瓜人工栽培面积超过6.67万公顷，鲜果年产量达3×106 t，并在逐年增加。重庆綦江是中国皱皮木瓜主产区之一，拥有0.67万公顷标准化栽培基地，年产鲜果2×105 t，产品深受市场欢迎。在中国传统医学中皱皮木瓜以药用为主，但其鲜果营养丰富，富含超氧化物歧化酶（SOD）、萜类、黄酮等多种活性成分，是一种开发潜力巨大的保健型水果。但皱皮木瓜鲜食酸味浓重、口感较差，因此高酸是发展皱皮木瓜鲜食产品的主要障碍。有机酸是构成水果风味的重要因子，在果实食用风味中具有决定性作用，多年来一直是果实品质研究领域的重要主题。因此，揭示皱皮木瓜果实有机酸积累规律对探索皱皮木瓜果实高酸积累机制与果实品质改良，具有重要的实践价值。【前人研究进展】皱皮木瓜（Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai.）是蔷薇科（Rosaceae）木瓜属（Chaenomeles Lindl.）多年生落叶小乔木，特色果树资源，全国各地广范分布。刘世尧等采用滴定法测得皱皮木瓜鲜果总酸含量高达6.1%，果汁pH为2.6，果汁可滴定酸含量超过3.57 g/100 mL，仅次于尤力克柠檬（约为4.5 g/100 mL），是苹果亚科典型高酸水果。前人研究结果表明，皱皮木瓜中含有六类有机酸，包括低碳羧酸、长链脂肪酸、芳香族有机酸、五环三萜有机酸、酚酸及氨基酸，其中低碳羧酸和酚酸对果实酸度起决定作用，长链脂肪酸与氨基酸是果实结构组成与能源贮藏物质，五环三萜有机酸是果实活性成分，芳香族有机酸则是成熟果实香气构成物质。近年，通过HPLC法、UPLC法、GCMS法从皱皮木瓜果实中分离鉴定出的有机酸约60余种，主要是苹果酸、柠檬酸、异柠檬酸、a-酮戊二酸、富马酸、奎尼酸、草酸、乌头酸、丙二酸等低碳羧酸，高诚伟等采用甲基化衍生与GCMS检测从云南西双版纳皱皮木瓜中鉴定出有机酸29种，主要有柠苹酸、苯甲酸、羟基丁二酸、棕榈酸和苹果酸以及C9-C18脂肪酸和芳香酸，其中二元酸占41.47%，芳香酸占25.20%；龚复俊等利用相同方法从湖北长阳皱皮木瓜中分离鉴定有机酸27种，主要有苹果酸、柠檬酸、苯甲酸、琥珀酸、a-酮基戊二酸、苯基乳酸、乌头酸、4-氧-庚二酸、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸等，并明确指出皱皮木瓜为苹果酸型水果。果实有机酸代谢是一个复杂的生理过程，揭示果实发育过程有机酸代谢规律可为果实品质改良及果树遗传育种提供理论支撑。果实发育期有机酸代谢在柑橘、梨、杏、李等大宗果树上早已展开，皱皮木瓜作为蔷薇科苹果亚科典型高酸水果，揭示其果实高酸积累规律可为皱皮木瓜果实品质改良奠定依据，也可为丰富苹果亚科果树有机酸代谢路径研究提供参考。【本研究切入点】皱皮木瓜果实有机酸组成复杂且含量较高，受遗传背景、产地环境和发育期等多重因素影响，但当前皱皮木瓜果实有机酸研究尚处在组分鉴定的初级阶段，我国各主产区与主要地方品种皱皮木瓜果实发育期有机酸代谢规律研究尚未开展。【拟解决的关键问题】以我国主产区重庆綦江皱皮木瓜为对象，采用溶济提取、甲酯化衍生与GCMS检测，开展綦江‘大罗’木瓜发育期果实有机酸组成及含量变化规律研究，明确綦江皱皮木瓜果实酸性风味特征性构成因子与发育期有机酸代谢规律，旨在为我国皱皮木瓜果实品质改良提供基础数据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
样果于2017年6月16日至8月26日采自重庆綦江三角镇桐垭村皱皮木瓜标准化栽培基地。按代表性原则，在同一果园内选择生长势中等、生态条件和树型基本一致的5龄以上健康成年植株各5株作为样株，每次每株选典型大小健康外膛果各1枚，合并样果作为1个生物学重复，共重复3次。样果取回、编号并称重后，沿纵轴“X”型切开，留取果实向阳与背阳面部分，除去果核后把果肉和果皮部分切成0.5 cm3小块，混合均匀，称重后立即放入90℃热激处理2 min去酶活，再放入-80℃超低温冰箱保存。整个发育期取样结束后，将全部样品转入45℃恒温鼓风干燥箱烘至恒重，计算烘干率后用小型粉碎机粉碎，过80目筛的果粉干燥器保存备用。材料经西南大学李先源副教授鉴定为皱皮木瓜（Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai.），品种为綦江‘大罗’木瓜（C. speciosa cv. Daluo）。
1.2 试剂与仪器
浓硫酸、甲醇、氯仿、石油醚、无水硫酸钠为分析纯；试验用水为超纯水。994L型双门超低温冰箱（美国Thermo公司），Delta320型pH酸度计（瑞士Mettler-Toledo公司），N-1100S-WD型旋转蒸发仪（EYELA东京理化），DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司），FE-10高速药材粉碎机（浙江温岭市百乐粉碎设备厂），TA2003A型台式离心机（上海哈菲尔分析仪器有限公司），SHB-III型数显恒温水浴锅（郑州长城科工贸有限公司），Molgene 210a型超纯水机（上海摩尔科学仪器有限公司），万分之一电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司），SE-812型氮吹仪（北京帅恩科技有限责任公司），Shimadzu 2010 QP Ultra 气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）、配AOC 2000型三位一体自动进样器，GCMS Real Time Analysis工作站，GCMS Postrun Analysis解析软件，NIST2008、NIST2008（S）质谱库（日本岛津公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 果实采样时期划分 綦江皱皮木瓜每年3月初开花，花期从3月1日至3月31日持续开放30 d左右，盛花期为3月15日。果实从坐果到完熟的总发育期为160 d，包括幼果期（盛花期—盛花后45 d），子房缓慢膨大，经历一次生理落果；膨大前期（盛花后45—90 d），果实缓慢增长；膨大后期（盛花后90—130 d，果实迅速增大）；转色期（盛花后130—160 d），果型和单果重缓慢增加；完熟期（盛花后160 d）等5个主要发育时期，果实完熟60 d以后落叶，然后进入休眠期。本文从皱皮木瓜果实膨大后期（盛花后90 d）开始采样，每隔10 d取样1次，经过转色期直到果实完全成熟（160 d）。其中，果实膨大后期取样5次（采样时间分别是盛花后90、100、110、120和130 d），果实转色期取样3次（盛花后140、150和160 d），共取样8次，分别记作S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8。
1.3.2 果实有机酸甲酯化处理方法 样品分析于2017年9月在南方山地园艺学教育部重点实验室完成，参考刘世尧、高诚伟等方法并稍作改动。精确称取各供试样品粉末0.5 g于25 mL具塞刻度大试管中，分别加入20 mL 硫酸—甲醇（7﹕100），密闭0℃、400 W超声处理30 min，60℃恒温水浴甲酯化衍生处理24 h，冷却至室温，补足蒸发损失甲醇，密闭0℃、400 W超声处理30 min，3 000 r/min离心弃去沉淀。上清液转移到盛有20 mL超纯水的分液漏斗中，混匀，再加入20 mL氯仿，剧烈振荡后静置2 h，收集下相（氯仿层）即得皱皮木瓜果实有机酸甲酯化衍生物提取液，3 g无水硫酸钠干燥过夜后，0.22 µm有机滤膜过滤2 mL至进样瓶，1 µL进样。
1.3.3 果实有机酸GC—MS检测条件 气相色谱条件：色谱柱岛津Rxt-5MS弱极性毛细管色谱柱 （30 m×0.25 mm，0.25 μm），进样时间为2.5 min，34.1 cm·sec-1恒定线速度，进样口温度280℃， 程序升温（起始温度70℃，保持1 min，以10℃·min-1的速率升至290℃并保持10 min），传输线温度 230℃，载气为氦气，载气流速50 mL·min-1，柱流量0.87 mL·min-1，吹扫流量3 mL·min-1，色谱分离时间33 min。
质谱条件：电离方式：电子轰击电离（EI源）；电离能量：70 eV；离子源温度230℃；质量范围（m/z）：30—800 Da；检测器增益1.0×105；采集方式Scan；溶剂延迟时间：2.5 min。样品有机酸衍生物GC—MS检测：供试液经0.25 μm有机滤膜过滤后，液体进样1 μL，不分流进样，质谱检测时间为32.5 min，得到样品有机酸衍生物TIC图。
1.4 数据处理方法
由于工业、农业的发展和城镇建设等原因，浊漳河南源上游排放的工业废水和生活污水总量日趋增多，其污染源主要是一些钢铁、煤炭和后续化产品企业，部分企业偷排偷放严重超标的工业废水和生活污水，致使浊漳河水污染加重，河道生态受损，其自净能力直线下降，浊漳河流域生态系统遭受到严重破坏，污染河水的渗透也造成了地下水的严重污染。浊漳河南源监测断面位于工程建设区下游，该控制断面能较好地反映湿地工程建设前的水质状况。
2 结果
2.1 有机酸甲基化衍生物GC-MS分离鉴定
样品干粉经甲醇超声提取与甲酯化衍生、GC-MS检测，得总离子流色谱图见图1-A（盛花后90 d），质谱溶剂剪切时间2.5 min，检测截止时间为35 min。所得TIC基线较稳定，有机酸衍生物谱峰分布均匀，成分峰基线分离度良好；主要成分峰保留时间RSD均在1%以下，表明仪器精密度良好。本文从綦江皱皮木瓜盛花后90—160 d发育期间的8个果实TIC图（图1-B）匹配得到共有有机酸成分峰41个，说明样品发育期果实有机酸组成稳定。41种共有有机酸分别隶属于低碳羧酸、长链脂肪酸、芳香族有机酸、一元酚酸类和氨基酸，其中低碳羧酸10种，包括草酸、丙二酸、乙酰丙酸、富马酸、a-酮戊二酸、苹果酸、琥珀酸、反式乌头酸、柠檬酸、异柠檬酸；长链脂肪酸21种，包括月桂酸、杜鹃花酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈油酸、棕榈酸、亚油酸、油酸、硬脂酸、山嵛酸、顺-11-二十碳烯酸、花生酸、顺式-5,8,11-二十碳三烯酸、7,10,13-二十碳三烯酸、10,13-二十碳二烯酸、10-羟基-十六烷酸、7-羟基-十八烷酸、十九烷酸、二十四烷酸、9,10-二羟基-十八烷酸、二十一烷酸；芳香族有机酸5种，分别是苯甲酸、DL-扁桃酸、肉桂酸、糠酸、香草酸；匹配奎尼酸、水杨酸、莽草酸等一元酚酸3种，氨基酸2种（L-天冬氨酸、L-苯丙氨酸）。由此可见，经甲醇提取、甲酯衍生化和GCMS检测，皱皮木瓜发育期8个样品检出有机酸种类，以长链脂肪酸和低碳羧酸为主，检出一元酚酸、芳香族羧酸与氨基酸较少。在所有检出成分中（表1），低碳羧酸与一元酚酸是皱皮木瓜果实的主要酸味贡献性成分，长链脂肪酸和氨基酸是果实细胞结构构成物质和能量贮存载体，而芳香族有机酸是果实香味的决定性成分。根据各成分酸度系数差异，检出有机酸又可分为强酸味成分（低碳羧酸和一元酚酸）和弱酸味成分（长链脂肪酸、芳香族有机酸和氨基酸）两大类。可见，GCMS法检出指标数量多，精确度高，对綦江皱皮木瓜发育期果实主要和微量酸性成分均有较好的检出效果。
A：盛花后90 d样品TIC积分图；B：8个发育期样品TIC对照图
A: TIC peak integral of the fruits sampled on the 90th d day after flower-blooming; B: The TIC matching figure of 8 C.speciosa cv. Daluo fruit samples
图1 綦江皱皮木瓜果实有机酸甲基化衍生处理GC-MS总离子流图
Fig. 1 The GC-MS total ion current chromatograms of organic acids methylized derivatives of Chaenomeles speciosa cv. Daluo fruit in Qijiang, Chongqing
2.2 发育期果实有机酸积累动态
从重庆綦江皱皮木瓜果实在盛花后90 d（果实膨大后期）到盛花后160 d（果实完全成熟），以各样品有机酸共有峰面积累加值为指标，在相同供试液提取、甲酯化衍生、仪器检测与总离子流图积分条件下，各共有成分峰面积和变化趋势与各样品总有机酸含量变化规律相一致。由图2-a可知，綦江皱皮木瓜在盛花后90 d，果实有机酸含量很高，但从盛花后90 d至100 d，其果实总有机酸含量突然下降，到盛花后100 d降至最低点；从盛花后100 d开始，果实总有机酸含量又缓慢上升，至盛花后130 d升至最高点，该时间段为果实膨大期的后半程；而到盛花后130 d即进入果实转色期，总有机酸含量再次下降，到盛花后160 d（果实完熟），含量降至最低点。由图2-b可知，在本文所选綦江皱皮木瓜果实发育期，低碳羧酸和长链脂肪酸类成分相对含量较高，占检出有机酸的主体，芳香族有机酸、一元酚酸和氨基酸类成分的占比较少。由图2-c和2-d可知，果实发育期包括低碳羧酸和一元酚酸在内的果实强酸味贡献性成分与包括长链脂肪酸、芳香族有机酸和氨基酸在内的弱酸味贡献性成分，均与总有机酸变化趋势相一致。Pearson相关系数计算结果表明，綦江皱皮木瓜发育期果实总有机酸含量变化趋势与强酸味有机酸含量、弱酸味类成分含量均呈极显著正相关，相关系数分别为0.970和0.998；同时强酸味贡献性成分与低碳羧酸（r=0.999）极显著正相关，与一元酚酸（r=0.747）显著正相关；弱酸味贡献性成分与长链脂肪酸（r=0.999）极显著正相关（表2）。
表1 重庆綦江皱皮木瓜发育期果实共有有机酸检出信息解析表
Table 1 MS analyzing result of organic acids methylized derivatives of 8 C. speciosa fruit samples from Qijiang, Chongqing
表2 发育期皱皮木瓜果实各类有机酸皮尔逊相关性分析（n=8）
Table 2 Pearson’s correlation coefficient between each organic acid types during the fruit developing period of C. speciosa (n=8)
*表示在P≤0.05水平（双尾检验）上显著相关；**表示在P≤0.01水平（双尾检验）上极显著相关；df=6时，α=5%时皮尔逊相关系数临界值为0.707，α=1%时皮尔逊相关系数临界值为0.834。下同
* indicates correlation is significant at P ≤ 0.05 level of two-tailed test. ** indicates correlation is strongly significant at P≤0.01 level of two-tailed test. The Pearson correlation coefficient critical value of two-tailed test is 0.707 when α=5% and 0.834 when α=1% (df=6). The same as below
2.3 果实发育期强酸味成分变化
在綦江皱皮木瓜发育期果实检出有机酸中，低碳羧酸与一元酚酸酸度系数低而酸性强，是皱皮木瓜果实酸性风味主要贡献成分，含量高低对果实酸味强弱具有决定作用，在一定程度上果实发育期各样品强酸味成分峰面积和的差异可反映果实酸度变化规律。本研究结果表明，在綦江皱皮木瓜发育期果实高酸味贡献性成分中，苹果酸占有绝对优势，8个时期样品的平均相对含量达到21.47%，其次是乙酰丙酸（6.56%）、柠檬酸（2.78%）、琥珀酸（0.86%）、草酸（0.72%）、奎尼酸（0.33%）、富马酸（0.23%）、水杨酸（0.23%）、丙二酸（0.21%）、α-酮戊二酸（0.19%）、莽草酸（0.08%）、反式乌头酸（0.07%）、异柠檬酸（0.04%）。綦江皱皮木瓜果实发育过程中，单位鲜果重苹果酸含量从盛花后90 d到果实完熟（160 d）总体呈逐渐下隆趋势，其中在盛花后130 d有一个略升高的峰值出现，与果实总有机酸含量变化趋势基本一致。乙酰丙酸变化规律与苹果酸截然相反，总体呈现上升趋势，到盛花后130 d增至最高点，之后略有下降，到盛花后150 d降至最低，而进入果实完熟期再次升高。柠檬酸也是皱皮木瓜鲜果的重要酸味贡献成分，其相对含量较苹果酸少很多，但其含量变化趋势却与苹果酸相似，二者都是总体递减同时在盛花后130 d有一个升高再下降的转折过程。琥珀酸则表现为下降（盛花后90—120 d），上升（盛花后120 d—130 d），然后下降（盛花后130—140 d）再上升（盛花后140—160 d）的“W”字型变化过程。草酸表现为上升（盛花后90—110 d）、下降（盛花后110—150 d），再上升（盛花后150—160 d）的倒“之”字型变化过程。而一元羧酸类奎尼酸则表现为快速下降（盛花后90—110 d），略有上升（盛花后110—130 d），然后再下降（盛花后130—160 d）的“W”字型变化过程，总体变化趋势则与苹果酸和柠檬酸相一致（图3）。其他检出有机酸代谢前体和中间成分变化规律各不相同。皮尔逊相关性分析结果表明，在皱皮木瓜盛花后90 d到果实成熟过程中各有机酸之间及其与总强酸味成分总含量都存在不同程度的相关性，綦江皱皮木瓜发育期果实强酸味有机酸总量与苹果酸（r=0.960）极显著正相关，与奎尼酸（r=0.8）、莽草酸（r=0.733）、柠檬酸（r=0.813）、α-酮戊二酸（r=0.757）显著正相关，但与乙酰丙酸（r=-0.381）、异柠檬酸（r=-0.292）和水杨酸（r=-0.136）弱负相关（表3）。
表3 果实发育期强酸味成分皮尔逊相关系数分析表（n=8）
Table 3 The Pearson’s correlation analysis table of strong-sour organic acids during the fruit developing period of C. speciosa (n=8)
A：发育期总有机酸含量变化；B：发育期五类检出有机酸平均百分比堆积柱形图；C：发育期强酸味成分含量；D：发育期弱酸性成分含量变化
A: Total organic acids content changing figure during its developing period; B: Percentage stacked column diagram of 5 type organic acids during its developing period; C: strong-sour ingredients content changing figure during its developing period; D: weak-sour ingredients content changing figure during its developing period
图2 皱皮木瓜发育期有机酸组成、总有机酸、强酸味和弱酸味有机酸变化规律
Fig. 2 Organic acids composition, total organic acids, strong and weak-sour organic acid changing law during its fruits developing period
2.4 果实发育期弱酸味成分变化规律
长链脂肪酸、芳香族有机酸和氨基酸类成分酸度系数相对较高，不是果实酸味的主要贡献物质，但却是皱皮木瓜果肉细胞的结构性成分、能量贮存物质和香气风味基础，属弱酸味有机酸。本文从重庆綦江皱皮木瓜全发育期的样品中分离出长链脂肪酸、芳香族有机酸和氨基酸种类分别为21种、5种和2种，占平均检出总有机酸成分峰总面积的68.45%。其中以油酸、亚油酸、棕榈酸和10-羟基-十六烷酸最高，分别占检出有机酸总量的25.136%、12.079%、6.785%和5.420%，相对含量居中的有9,10-二羟基-十八烷酸（2.646%）、二十四烷酸（2.411%）、苯甲酸（2.079%）、十九烷酸（1.666%）、二十一烷酸（1.663%）、10,13-二十碳二烯酸（1.269%）、7-羟基-十八烷酸（1.102%）、花生酸（0.872%）、顺-11-二十碳烯酸（0.532%）、肉桂酸（0.478%）、棕榈油酸（0.447%）。月桂酸、山嵛酸、杜鹃花酸等其他13种检出有机酸相对含量均小于0.3%，属微量成分。在綦江皱皮木瓜发育过程中，果实油酸、亚油酸、棕榈酸和10-羟基-十六烷酸均呈整体下降趋势，盛花后90 d果实油酸含量最高，但到盛花后100 d下降至原来的1/2，后又逐渐升高，至盛花后130 d再次下降，盛花后160 d果实完熟期降至最高含量的14%左右。亚油酸、棕榈酸和10-羟基-十六烷酸相对含量虽有差异，但总体变化趋势相同，即盛花后90 d最高，至盛花后100 d迅速降低，然后逐渐升高，到盛花后120 d可升至90 d含量水平的1/2—2/3，然后再次下降，完熟期（160 d ）降至最低点，约为最高含量水平的1/5（图4）。除硬脂酸外的其他12个微量弱酸性有机酸在果实发育期均具有与上述成分相似的变化规律。这可能与果实完熟期弱酸味成分向酯类等香气成分转化有关。
A：三羧酸循环相关有机酸；B：生长调节剂类有机酸；C：酚酸类有机酸
A: The organic acids related to the TCA cycle; B: Growth regulator organic acids; C: Phenolic organic acids
图3 綦江皱皮木瓜不同发育期强酸味有机酸成分峰面积变化规律
Fig. 3 The component peak area changing laws of the strong-sour organic acid C. speciosa from Qijiang during its fruit developing period
皮尔逊相关性分析结果表明，弱酸性总有机酸含量分别与油酸（r=0.936）、亚油酸（r=0.987）、棕榈酸（r=0.959）、10-羟基-十六烷酸（r=0.902）、二十一烷酸（r=0.896）、7-羟基-十八烷酸（r=0.851），及含量相对较低的花生酸（r=0.955）、顺-11-二十碳烯酸（r=0.934）、7-羟基-十八烷酸（0.851）、DL-扁桃酸（r=0.874）极显著正相关；与9,10-二羟基-十八烷酸（r=0.747）、10,13-二十碳二烯酸（r=0.725），及含量相对较低的杜鹃花酸（r=0.807）、山嵛酸（r=0.819）、香草酸（r=0.781）显著正相关，与十九烷酸弱负相关（表4）。
OA：油酸；9,12-OA：亚油酸；HCA：棕榈；10-HHA：10-羟基-十六烷酸；9,10-DOA：9,10-二羟基-十八烷酸；TA：二十四烷酸；BA：苯甲酸/安息香酸；NA：十九烷酸；HAS：二十一烷酸
OA: 9-Octadecenoic acid; 9,12-OA: 9,12-Octadecadienoic acid; HCA:Hexadecanoic acid; 10-HHA: 10-hydroxy-Hexadecanoic acid; 9,10-DOA: 9,10- dihydroxy-Octadecanoic acid; TA: Tetracosanoic acid; BA: Benzoic acid; NA: Nonadecanoic acid; HSA: Heneicosanoic acid
图4 皱皮木瓜发育期果实弱酸味有机酸成分峰变化趋势图
Fig. 4 The weak-sour organic acid component peak area changing law of C. speciosa fruit of Qijiang during developing period
表4 果实发育期弱酸味成分皮尔逊相关系数分析表（n=8）
Table 4 The Pearson’s correlation analysis table of weak-sour organic acids during the fruit developing period of C. speciosa (n=8)
OA：油酸；9,12-OA：亚油酸；HCA：棕榈酸；10-HHA：10-羟基-十六烷酸；9,10-DOA：9,10-二羟基-十八烷酸；TA：二十四烷酸；BA：苯甲酸；NA：十九烷酸；HSA：二十一烷酸；10,13-EA：10,13-二十碳二烯酸；7-HOA：7-羟基-十八烷酸
OA: 9-Octadecenoic acid; 9,12-OA: 9,12-Octadecadienoic acid; HCA: Hexadecanoic acid; 10-HHA: 10-hydroxy-Hexadecanoic acid; 9,10-DOA: 9,10- dihydroxy-Octadecanoic acid; TA: Tetracosanoic acid; BA: Benzoic acid; NA: Nonadecanoic acid; HSA: Heneicosanoic acid; 10,13-EA: 10,13-Eicosadienoic acid; 7-HOA: 7-hydroxy-Octadecanoic acid
2.5 发育期有机酸组成主成分分析和聚类分析
以全部强酸味有机酸与相对含量在1%以上的弱酸味成分数据为基础，利用Simca-p11.5进行PCA模型拟合，从图5可以看出，主成分PC1和主成分PC2分别解释了总变量40.00%和23.20%的总方差贡献率。根据样品数据的PCA模型，皱皮木瓜发育期果实有机酸组成明显聚成四类：即S1和S2聚为一类，α-酮戊二酸、苹果酸、奎尼酸、莽草酸、棕榈酸、亚油酸对此时期样品有机酸组成具有决定性作用；S3、S4、S5聚在一起，油酸、10-羟基-十六烷酸对这3个发育期样品具有决定性作用；S6和S7聚在一起，丙二酸、乙酰丙酸、异柠檬酸、水杨酸是其主要贡献性成分；S8单独存在，琥珀酸、十九烷酸、二十四烷酸是其主要贡献性成分，对本时期样品具有决定性作用。
以綦江木瓜发育期果实有机酸41种共有特征性成分相对含量数据为基础，利用SPSS20.0系统聚类分析，采用离差平方和法（Ward法）并按平方欧氏距离（Square Euclidean distance）构建聚类分析树（图6）。结果表明，綦江皱皮木瓜从盛花后90 d到160 d果实完全成熟，当聚类距离为5时，8个时期果实有机酸组成可聚为4枝：S1与S2聚为一枝，与S3、S4、S5、S6聚成的第二枝构成并列关系；在第二枝中S4与S5有机酸组成最为相似，二者与S6并列，再与S3构成并列关系；S7为第三枝，S8为第四枝。
3 讨论
3.1 綦江皱皮木瓜发育期果实有机酸类成分鉴定
高诚伟等利用95%乙醇提取、甲基化衍生结合GCMS检测，从云南西双版纳皱皮木瓜中分离出22种有机酸，以柠苹酸最高（20.74%），其次是苯甲酸（16.51%）、2-羟基丁二酸（12.05%）、棕榈酸（7.55%）、4-甲氧基苯甲酸（5.82%）、丁二酸（5.94%）、苹果酸（1.66%）、壬二酸（1.08%）和硬脂酸（0.95%）。龚复俊等通过70%乙醇提取、阴离子柱层析纯化、甲基化衍生结合GCMS检测，从长阳皱皮木瓜中分离出苹果酸（64%）、柠檬酸（30%）、苯甲酸、琥珀酸、α-酮基戊二酸、苯基乳酸、乌头酸、4-氧-庚二酸、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸等。本研究利用甲醇提取、甲酯化衍生和GCMS检测，从綦江皱皮木瓜果实中分离出41种有机酸，检出数量远超已往报道。不分流进样保证了不同发育期果实有机酸含量的可比性，恒定线速度保证了后流出化合物峰形和保留时间的稳定。綦江皱皮木瓜主要成分是苹果酸、柠檬酸和乙酰丙酸等，柠苹酸未被检出，而首次检出相对含量较高的乙酰丙酸。乙酰丙酸又名4-氧化戊酸（4-Oxopentanoic acid）、左旋糖酸，或戊隔酮酸，是六糖酸性水解的主要产物，其分子中含有一个羰基、一个梭基和多个α氢，活性很高，而且其不同官能团上的氢原子具有不同的活性，既可作为羧酸又可作为酮参与反应。除以往报道的棕榈酸和油酸外，本研究还检出了大量的C9—C24长链高级脂肪酸类成分，如棕榈油酸、亚油酸、杜鹃花酸、月桂酸。首次通过溶剂提取、甲基化衍生的方法检出L-天冬氨酸与L-苯丙氨酸。
1：草酸；2：丙二酸；3：戊酸；4：富马酸；5：α-酮戊二酸；6：苹果酸；7：琥珀酸；8：反式乌头酸；9：柠檬酸；10：异柠檬酸；11：水杨酸；12：奎尼酸；13：莽草酸；14：棕榈酸；15：亚油酸；16：油酸；17：10,13-二十碳二烯酸；18：10-羟基-十六烷酸；19：7-羟基-十八烷酸；20：十九烷酸；21：二十四烷酸；22：9,10-二羟基-十八烷酸；23：二十一烷酸；24：苯甲酸。底部横座标与左侧纵座标表示两个主成分方差贡献率，顶部模座标与右侧纵座标表示自变量载荷值
The numbers represent the compounds 1: Oxalic acid; 2: Malonic acid; 3: Pentanoic acid; 4: Fumaric acid; 5: α-ketoglutaric acid; 6: Malic acid; 7: Succinic acid; 8: 1-Propene-1,2,3-tricarboxylic acid; 9: Citric acid; 10: 1-hydroxy-1,2,3-Propanetricarboxylic acid; 11: p-Hydroxybenzoic acid; 12: Quinic acid; 13: Shikimic acid; 14: Hexadecanoic acid; 15: 9,12-Octadecadienoic acid; 16: 9-Octadecenoic acid; 17: 10,13-Eicosadienoic acid; 18: 10-hydroxy-Hexadecanoic acid; 19: 7-hydroxy-Octadecanoic acid; 20: Nonadecanoic acid; 21: Tetracosanoic acid; 22: 9,10-dihydroxy-Octadecanoic acid; 23: Heneicosanoic acid; 24: Benzoic acid. The coordinate axis values represents the correlation coefficients between the principal components and the original variables
图5 綦江皱皮木瓜不同发育期果实有机酸特征性成分PCA分析
Fig. 5 PCA analysis based on the common organic acids components of C. speciosa fruit samples during its developing period
图6 綦江皱皮木瓜发育期果实有机酸组成聚类分析树状图
Fig. 6 The fruit organic acids composition cluster analysis dendrogram during Qijiang C. speciosa during its developing period
3.2 綦江皱皮木瓜果实发育期总有机酸变化
以往研究表明成熟果实有机酸的组成与含量不仅受遗传背景控制，也受产地环境和栽培管理方法影响，其积累和变化模式各不相同。多数果树有机酸通常是在果实生长早期积累，在成熟过程中逐步降低。稀释作用、呼吸代谢、合成量减少、输入果实有机酸减少，以及糖异生作用均能导致果实成熟期有机酸含量下降。桃、杏、李、葡萄、柑橘等果实发育过程中有机酸含量逐渐升高，生长停止转入成熟阶段有机酸含量下降。但完熟果实中有机酸含量的多寡最终取决于果实中有机酸的合成、转移、液泡贮藏和分解之间的平衡，这种代谢平衡直接影响着果实酸度。本研究结果表明，重庆綦江皱皮木瓜果实膨大期后期（盛花后100 d），果实总有机酸含量缓慢上升，至膨大后期结束时（盛花后130 d）升至最高点；而进入果实转色期，总有机酸含量再次呈下降趋势变化，到果实完熟时（盛花后160 d），含量降至最低点，结果与以往其他多数果实发育过程总有机酸变化规律相一致。同时本研究结果与靳李娜和李娜报道的药用皱皮木瓜采收期基本一致，但与齐红研究结果有差异，该文采用75%乙醇提取、碱溶酸沉结合电位滴定法检测山东临沂皱皮木瓜，从8月1日（12%）至9月15日（20%）果实总有机酸含量持续增加，9月15日（20%）至9月24日（17%）转为下降。该差异可能是由于重庆与山东的气候差异引起的，相对重庆綦江，山东临沂皱皮木瓜盛花期延迟时间约为45 d。本研究结果与邵文豪等对湖北长阳皱皮木瓜发育期可滴定酸测定结果基本一致，但其报道的长阳皱皮木瓜酸度峰值比重庆早了25 d，约为花后105 d。
3.3 綦江皱皮木瓜果实发育期有机酸代谢规律
有机酸在果实自身代谢中不仅参与了光合作用、吸吸作用，还参与合成酚类、氨基酸、酯类和芳香物质代谢。本研究首次揭示了我国皱皮木瓜发育期果实有机酸组成变化规律，结果表明綦江皱皮木瓜在坐果后，苹果酸和柠檬酸含量极为丰富，属苹果酸-柠檬酸积累型果实；在果实发育期总有机酸与多数有机酸主要组分含量总体呈下降，而如乙酰丙酸等部分有机酸组分却逐渐上升，到果实完熟期乙酰丙酸超过苹果酸和柠檬酸，形成乙酰丙酸-苹果酸-柠檬酸积累型果实。綦江皱皮木瓜苹果酸、柠檬酸、奎尼酸、琥珀酸等主要酸味贡献性成分及油酸、亚油酸、棕榈酸和10-羟基-十六烷酸等弱酸味贡献成分与总有机酸变化规律具有较高的一致性，而乙酰丙酸、草酸、异柠檬酸和硬脂酸的变化规律却与总有机酸截然相反，呈负相关关系。在本文检出的綦江皱皮木瓜特征性共有有机酸成分中，苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸、a-酮戊二酸、乌头酸、异柠檬酸是皱皮木瓜果肉细胞线粒体三羧酸循环代谢途径的合成前体和中间产物，在三羧酸循环途径中，柠檬酸是异柠檬酸的底物，继而生成琥珀酸、α-酮戊二酸、富马酸和苹果酸，但并没有呈现出此消彼长的代谢规律，而是除异柠檬酸外，均呈现出较高的正相关关系，这是否与果实发育过程碳源供应流的变化具有相关性，需要进一步验证。在TCA循环过程中，丙二酸为琥珀酸类似物，是琥珀酸脱氢酶强有力的竞争性抑制物，可通过阻断三羧酸循环而促进琥珀酸积累，但本文在果实发育过程中并未发现丙二酸与琥珀酸积累量的互抑关系。莽草酸和奎尼酸分别是莽草酸循环途径酚酸类成分的最初底物和中间产物，是肉桂酸、芳香族氨基酸和其他多酚化合物的重要前体，在果实发育过程中不断下降，进而促进了果实成熟过程中其他香味物质的合成与含量增加。乙酰丙酸（LA）是新一代平台化合物，其重要衍生素5-氨基乙酰丙酸（5-ALA），是植物体内所有卟啉类化合物合成的关键前体，不仅是一种代谢产物，也参与植物的生长发育，具有类似于植物激素的生理活性，低浓度时能够调节植物生长发育、提高抗性、促进果实着色，但乙酰丙酸在皱皮木瓜果实中出现的生物学意义仍不清楚，有待于进一步深入研究。水杨酸是植物体普遍存在的内源激素，与植物体抗病反应和非生物协迫应答密切相关，在皱皮木瓜果实膨大期含量不断增加，而在转色至完熟期不断下降，可能与皱皮木瓜发育期保障果实克服不良条件并顺利发育成熟关系密切。以长链高级脂肪酸为主的多数弱酸味有机酸成分在果实膨大后期含量上升，从转色期到完熟期含量逐渐下降，这可能是由果实成熟过程中弱极性有机酸向酯类等香气物质转化引起的。
4 结论
从重庆綦江皱皮木瓜（‘大罗’）发育期果实中分离得到共有特征性成分41种，所鉴定成分以低碳羧酸与长链高级脂肪酸为主，还包括一元酚酸、芳香族有机酸和氨基酸，相对含量较高成分主要有油酸（25.136%）、苹果酸（21.473%）、亚油酸（12.079%）、棕榈酸（6.785%）、乙酰丙酸（6.558%）、10-羟基-十六烷酸（5.420%）、柠檬酸（2.776%）、9,10-二羟基-十八烷酸（2.646%）、二十四烷酸（2.411%）、苯甲酸（2.079%）、十九烷酸（1.666%）、二十一烷酸（1.663%）、10,13-二十碳二烯酸（1.269%）、7-羟基-十八烷酸（1.102%）。从盛花后90 d到果实成熟（盛花后160 d），果实总有机酸含量呈现快速下降、缓慢上升再缓慢下降的变化趋势，在整个发育期总强酸性有机酸和总弱酸性有机酸均与总有机酸显著正相关。
綦江皱皮木瓜检出苹果酸、柠檬酸等多数强酸性有机酸均与总强酸性有机酸极显著正相关；綦江皱皮木瓜检出油酸、亚油酸、棕榈酸和10-羟基-十六烷酸等多数弱酸性有机酸均与总弱酸性有机酸极显著正相关。綦江皱皮木瓜果实发育过程中有机酸的积累模式由苹果酸-柠檬酸积累型向完熟期乙酰丙酸-苹果酸-柠檬酸积累型转变，酸积累模式的转变在重庆皱皮木瓜果实酸度与风味品质决定中具有重要作用。
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